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chinensis et Persea americana en vue de valorisations cosmétiques.

Auteur : Maes, Chloé

Promoteur(s) : Fauconnier, Marie-Laure

Faculté : Gembloux Agro-Bio Tech (GxABT)

Diplôme : Master en bioingénieur : chimie et bioindustries, à finalité spécialisée

Année académique : 2016-2017

URI/URL : http://hdl.handle.net/2268.2/3095

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CONTRIBUTION À L’ÉTUDE PHYTOCHIMIQUE DES ESPÈCES LEEA GUINENSIS, LITCHI

CHINENSIS ET PERSEA AMERICANA EN VUE DE VALORISATIONS COSMÉTIQUES.

CHLOÉ MAES

TRAVAIL DE FIN D’ÉTUDES PRÉSENTÉ EN VUE DE L’OBTENTION DU DIPLÔME DE MASTER BIOINGÉNIEUR EN CHIMIE ET BIOINDUSTRIE

ANNÉE ACADÉMIQUE 2016-2017

PROMOTEUR : MARIE-LAURE FAUCONNIER

I

Copyright © Toute reproduction du présent document, par quelque procédé que ce soit, ne peut être réalisée qu'avec l'autorisation de l'auteur et de l'autorité académique de Gembloux Agro-Bio Tech

Le présent document n'engage que son auteur

I

CONTRIBUTION À L’ÉTUDE PHYTOCHIMIQUE DES ESPÈCES LEEA GUINENSIS, LITCHI

CHINENSIS ET PERSEA AMERICANA EN VUE DE VALORISATIONS COSMÉTIQUES.

CHLOÉ MAES

TRAVAIL DE FIN D’ÉTUDES PRÉSENTÉ EN VUE DE L’OBTENTION DU DIPLÔME DE MASTER BIOINGÉNIEUR EN CHIMIE ET BIOINDUSTRIE

ANNÉE ACADÉMIQUE 2016-2017

PROMOTEUR : MARIE-LAURE FAUCONNIER

I

Remerciements Je tiens à remercier toute l’équipe du CGO de m’avoir accueillie durant les 6 mois qui ont été

nécessaires à la réalisation de ce travail. Je remercie plus particulièrement Matthew Saive de m’avoir

aidée et accompagnée afin de mener à bien ce projet. De plus, un tout grand merci à ma promotrice

Marie-Laure Fauconnier pour ses conseils et relectures, ainsi que de me permettre de continuer ma

route dans le monde de la recherche.

Ensuite, je souhaite remercier Benoit Dupperon du Conservatoire Botanique National du

Mascarin pour la récolte et l’envoi des matières premières, mais aussi Ewa Cieckiewicz et le

laboratoire de pharmacognosie de l’Université de Liège pour leurs conseils quant aux séparations des

fractions et aux analyses structurales.

Il me tient à cœur également de remercier mon papa, ma sœur et mon ami Kevin pour leurs

relectures et conseils quant à la syntaxe de ce texte.

Pour finir je vous remercie vous, membres du Jury, d’avoir accepté de lire et évaluer mon

travail. Je vous souhaite une bonne lecture.

II

Résumé

Dans le cadre de la thèse de Saive M. concernant l’étude phytochimique de plantes mahoraise,

l’étude approfondie de trois activités biologiques sur trois extraits végétaux a été réalisée. Les

activités antityrosinase, antioxydante et anti-inflammatoire ont été sélectionnées compte tenu de leur

intérêt pour la valorisation en cosmétique.

Suite aux études préliminaires réalisées sur l’île Mayotte par Saive M., les feuilles de Persea

americana Mill., les feuilles de Leea guineensis G. Don. et les racines de Litchi chinensis Sonn. ont

été sélectionnées pour cette étude approfondie.

L’étude des activités biologiques citées ci-dessus sur les différents organes végétaux sélectionnés

a été réalisée en plusieurs étapes. Pour commencer, les échantillons ont subi des extractions par la

technique du Soxhlet. Les extraits obtenus ont ensuite subi divers fractionnements par centrifugation

et chromatographie liquide. Afin de tendre vers l’identification des molécules responsables des

activités d’intérêt, les fractions les plus actives lors des mesures spectrophotométriques ont été

sélectionnées tout au long des différentes étapes de fractionnement à l’aide de technique statistique.

Cela a abouti à l’identification de fractions d’intérêt pour chacune des activités ciblées et

l’obtention d’une molécule suffisamment pure pour entamer le travail d’étude structurale.

Mots-clés : phytochimie, valorisation, cosmétique, tyrosinase, lipoxygénase, DPPH,

spectrophotométrie, HPLC, extraction, identification

III

Abstract

As a part of Saive M.'s thesis on the phytochemical study of Mahoran plants, in-depth studies

of three biological activities on three plant extracts were carried out. The antityrosinase, antioxidant

and anti-inflammatory activities were selected as they are interesting for cosmetic valorizations.

Following the preliminary studies carried out on the island of Mayotte by Saive M., the

Persea americana Mill. leaves, the Leea guineensis G. Don. leaves and the Litchi chinensis Sonn.

roots were selected for this in-depth study.

The studies of the biological activities cited above on the organs which have been selected

have been carried out in several stages. To begin, the samples underwent extractions using the

soxhlet technic. Subsequently, they were subjected to various fractionations by centrifugation and

liquid chromatography. In order to identify the molecules responsible for the different biological

activities, the most active fractions were determined using spectrophotometric coupled with

statistical tests, this allowed to focus our work only on the most active fractions.

This resulted in the identification of fractions of interest for each of the targeted activities as

well as obtaining a molecule pure enough to start the structural study.

Key-words : Phytochemistry, valorization, cosmetics, tyrosinase, lipoxygenase, DPPH,

spectrophotometry HPLC, extraction, identification

IV

Abréviations 13-HPOD : 13-Hydroperoxyde 5-HPETE : 5- acide hydroperoxy-eicosatetraenoique 5-LOX : 5-Lipoxygenase AA : Acide arachidonique ACE: Angiotensin Converting Enzyme ANOVA: Analysis of Variance ARNm: Acide ribonucléique messager BCL: Bicuculline BHT: HydroxyToluène Butylé COSY : Correlation Spectroscopy DAD : Diode array detector DHI : 5,6-dihydroxyindole DHICA: Indole-5,6-dihydroxyindole-2-carboxylique DPPH: 2,2-diphényl-1-picryhydrazyl FLAP : Five Lipoxygenase Activating Protein GC-MS: Chromatographie gazeuse suivie d’un spectromètre de masse HAc : Acide acétique HDL: High Density Lipoprotein HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation HPLC : High Performance Liquid Chromatography HSQC: Heteronuclear Single-Quantum Correlation IAR: Informant agreement ratio IC50 : Concentration inhibitrice causant 50% d’inhibition L-DOPA : L- 3,4-dihydroxyphénylalanine LC: Litchi chinensis LDL: Low Density Lipoprotein LG: Leea guineensis LT : Leucotriène MS : Matière sèche NDGA: Acide nordihydroguaiaretique ORAC: Oxygène Radical Absorbance Activity PA: Persea americana PCT: Picrotoxin PKB/akt : Protein Kinase B PTZ: Pentylenetetrazole RMN: Résonance magnétique nucléaire TFA: Acide trifluoroacétique TMS: Tétraméthylesilane Trolox : L'acide 3,4-dihydro-6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthyl-2H-1-benzopyran-2-carboxylique UV-VIS: ultraviolet-visible

V

Table des matières I

Remerciements I

Résumé II

Abstract III

Abréviations IV

1. Introduction 1

2. Généralités 22.1. Mayotte 22.2. Ethnobotanique 32.3. Leea guineensis G. Don 42.4. Litchi chinensis Sonn. 72.5. Persea americana Mill. 10

3. Activités biologiques 133.1. L’activité antityrosinase 13

3.1.1. La mélanogenèse 133.1.2. La tyrosinase 153.1.3. Les inhibiteurs de la tyrosinase 153.1.4. Intérêts 17

3.2. L’activité anti-inflammatoire 173.2.1. La réaction d’inflammation 173.2.2. Les lipoxygénases 183.2.3. Les inhibiteurs de la lipoxygénase 203.2.4. Intérêts 21

3.3. L’activité antiradicalaire 213.3.1. La réaction d’oxydation 213.3.2. Le DPPH (2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl) 223.3.3. Les inhibiteurs de l’oxydation 223.3.4. Intérêts 23

4. Objectifs et stratégies 24

5. Matériel et méthode 255.1. Extraction des molécules actives 25

5.1.1. Matières premières 255.1.2. Extraction par Soxhlet 25

5.2. Séparation des molécules 265.2.1. Centrifugation 265.2.2. Chromatographie liquide à haute performance (analytique et préparative) 275.2.3. Colonne de silice ouverte 28

5.3. Mesure des activités biologiques par spectrophotométrie UV-VIS 295.3.1. Mesure de l’activité anti-inflammatoire 295.3.2. Mesure de l’activité antityrosinase 305.3.3. Mesure de l’activité antiradicalaire 315.3.4. Analyses statistiques 32

5.4. Identification des molécules 335.4.1. Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) 33

6. Résultats et discussion 34

VI

6.1. Fractionnements et activités biologiques 346.1.1. Fractionnement par centrifugations des trois plantes 346.1.2. Approfondissement Leea guineensis 396.1.3. Approfondissement Litchi chinensis 50

6.2. Rendements 656.2.1. Rendements d’extraction 656.2.2. Rendements des fractionnements 65

6.3. Caractérisation structurale 66

7. Discussion générale 69

8. Perspectives 719. Conclusion 73

10. Bibliographie 74

Annexe 1 : Spectres UV-VIS 811.1 Spectre d’inhibition de la tyrosinase par LG P.1 811.2 Spectre d’inhibition de la tyrosinase par LC. 10.3.3 (15 mg/mL) 811.3 Spectre d’inhibition de la lipoxygénase par LC A. 82

Annexe 2 : Spectrométrie RMN 832.1 Spectre RMN 1H 832.2 Spectre RMN 13C 832.3 Spectre RMN COSY 842.4 Spectre RMN HSQC 842.5 Spectre RMN HMBC 85

1

1. Introduction

L’île de Mayotte est connue pour sa faune et sa flore riche et variée. De plus, c’est une île qui

demeure très peu exploitée pour ses ressources. Cependant, les habitants de cette île connaissent les

propriétés des plantes qui les entourent, et énormément de chamans utilisent la médecine

traditionnelle pour soigner leurs compatriotes.

Aujourd’hui, l’île de Mayotte présente le besoin de se développer et de se valoriser

économiquement. Suite à cela, un projet de valorisation a été créé par la préfecture française.

Saive M. a entrepris un travail de valorisation de la flore par une étude phytochimique de celle-ci.

Tout d’abord, une étude ethnobotanique a permis de sélectionner une centaine d’échantillons

différents issus d’environ 20 plantes. Ceux-ci ont été étudiés pour trois activités biologiques :

l’activité antioxydante, l’activité antityrosinase et l’activité anti-inflammatoire. Cette étude a permis

la sélection des espèces et des organes qui ont été étudiés dans le cadre du travail qui va être présenté

ici. Il s’agit des feuilles de Persea americana Mill., des feuilles de Leea guineensis G. Don. et des

racines de Litchi chinensis Sonn. Une description détaillée des points cités ci-dessus sera donnée

dans les deux premières parties.

L’étude des activités biologiques citées ci-dessus sur les fractions qui ont été sélectionnées a pour

but d’identifier les molécules responsables des activités d’intérêt. Celle-ci a été effectuée par

l'extraction des molécules, suivie de plusieurs fractionnements par divers techniques afin d’obtenir

des molécules purifiées.

Pour finir, ces molécules purifiées seront caractérisées structuralement par différentes techniques.

2

2. Généralités

2.1. Mayotte L’île de Mayotte est située dans l’ouest

de l’océan Indien, dans l’archipel des Comores

et s’étend sur une superficie de 374 km2

(Amann C. et al., 2011).

D’origine volcanique (Figure 1), elle possède

un relief accentué qui subit l’érosion et

l’enfoncement de son plateau chaque année

(Préfet de Mayotte, « Découvrir Mayotte,

Population », consulté le 16 mars 2017).

Le sol était à l’origine constitué de laves refroidies et

de cendres où se sont développées des espèces

cryptogames. Ensuite, la dégradation de la roche mère en substrat a permis le développement

d’autres espèces, celles-ci ont ensuite évolué en coopération.

Grâce au climat chaud et humide de Mayotte, les ressources nécessaires à la croissance de ces

espèces sont abondantes. Aujourd’hui, elle abrite une très grande biodiversité, c’est une des régions

du monde ayant le plus grand nombre d’espèces par unité de surface. Plus précisément, 1300 espèces

végétales dont 52 strictement endémiques ont été retrouvées à Mayotte (Amann C. et al., 2011).

Celles-ci sont depuis toujours très utilisées comme médications pour de nombreuses maladies

(Mchangama M. et al., 2012).

La découverte de ces espèces a cependant été très lente, les fortes pentes de l’île rendant

l’accès difficile à certaines zones (Figure 2). Il y a en réalité trois domaines de végétation distincts :

littoral (mangroves et formation littorale), « sec » (forêt sèche) et humide (forêt humide) (Boullet V.

et al., 2011).

Depuis 2009 et suivant la volonté des Mahorais, Mayotte est devenue un département français

(Préfet de Mayotte, « Découvrir Mayotte, Histoire et Géographie », consulté le 16 mars 2017).

Figure 1. Photo du lac du volcan Dziani à Mayotte, vue du ciel, par Gildas Y., 2008

3

Celui-ci est alors également le département français le plus jeune au niveau démographique,

55 % de la population ayant moins de 20 ans. Le chef-lieu de l’île est Mamoudzou et abrite 28 % de

la population (Préfet de Mayotte, « Découvrir Mayotte, Population, consulté le 16 mars 2017). La

forte croissance démographique entraîne une pression sur la conservation des espaces naturels de

Mayotte (Rolland R. et al., 2005). De ce fait, les autorités ont pour objectif la mise en place d’un

plan de développement et de protection de la faune et la flore (Préfet de Mayotte, « Document

stratégique : Mayotte 2025, une ambition pour la république », consulté le 16 mars 2017).

L’étude ethnobotanique et l’étude phytochimique décrite dans les paragraphes suivant prend

tout son sens dans le cadre de ce souhait de valorisation des ressources naturelles.

2.2. Ethnobotanique Une étude ethnobotanique (Saive M. et al., 2014) a permis de sélectionner environ 20 plantes

de l’île de Mayotte afin d’en étudier certaines propriétés biologiques.

L’ethnobotanique est définie comme étant une « Étude des rapports entre tel groupe ethnique et la

flore de l'espace où il vit » (Larousse).

La méthode utilisée dans ce cas-ci est celle donnée par Robert T.

Elle est constituée de trois étapes majeures :

• Identifier les espèces potentielles actives

• Poser les hypothèses de recherche

• Tester les hypothèses

Figure 2. "Esquisse de la zonation altidunale théorique de la végétation de Mayotte", par le Conservatoire Botanique National Mascarin (Boullet V., 2011)

4 Figure 3. Photo de Leea guineensis G. Don à Tawain, par Bodnar L., 2013

Pour l’identification des espèces potentielles actives, plusieurs possibilités sont offertes. Il est

possible de réaliser une étude basée sur le marché, ou d’utiliser une collection d’antécédents et de

données de symptomatologie populaire, ou de se référer à la distribution phytogéographique, ou

encore de faire un screening aléatoire durant lequel il arrive de faire des découvertes accidentelles.

L’utilisation de cette méthode repose alors sur cinq critères indispensables : la base de

données, la portée des données d’entrevue, l’identification taxonomique, le consensus des

informateurs et l’efficacité des matières premières.

Premièrement, la base de données doit être suffisamment grande. Les remèdes visés doivent

être les 25 les plus communs, mais ne doivent concerner qu’une seule espèce de plante.

Deuxièmement, les spécimens utilisés doivent être taxonomiquement identifiés. Ensuite, le

consensus des informateurs doit être évalué, soit par rapport à la fréquence accrue d’occurrences, soit

par l’IAR (informant agreement ratio) celui-ci est lié à une maladie spécifique (plus le résultat est

proche de 1, meilleur est le consensus).

𝐼𝐴𝑅 = 𝑁𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑑𝑒𝑐𝑎𝑠𝑑𝑒𝑚𝑎𝑙𝑎𝑑𝑖𝑒 − (𝑛𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒𝑑𝑒𝑟𝑒𝑚è𝑑𝑒𝑠𝑠é𝑝𝑎𝑟é𝑠𝑝𝑜𝑢𝑟𝑙𝑎𝑚𝑎𝑙𝑎𝑑𝑖𝑒)

𝑛𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑑𝑒𝑐𝑎𝑠𝑝𝑜𝑢𝑟𝑙𝑎𝑚𝑎𝑙𝑎𝑑𝑖𝑒 − 1

Finalement, des tests d’activités pharmacologiques des matières premières sont requis. Dès lors,

il est nécessaire de tester les hypothèses afin de déterminer l’utilité des données de consensus des

informateurs pour identifier de nouvelles plantes potentiellement médicinales (Robert T. et al.,

1986).

De la liste de fractions végétales intéressantes obtenue par cette technique (environ 100 fractions

issues de 20 plantes), un screening phytochimique a été effectué (Saive M, 2015). Celui-ci a permis

de sélectionner les feuilles de Leea guineensis, les feuilles de Persea americana et les racines de

Litchi chinensis pour l’étude approfondie dont ce travail a pour sujet.

2.3. Leea guineensis G. Don

Leea guineensis G. Don (Figure 3),

appelé plus communément bois de sureau, est

un arbuste muni de grandes feuilles et

d’inflorescence globuleuse rouge (Amann C. et

al., 2011). Elle se retrouve dans plusieurs pays

5

de l’Afrique tropicale (Cameroun, Ghana, Côte d’Ivoire) et principalement en Asie (Lavergne R. et

al., 2014). L’origine des plantes traitées dans le cadre de ce travail est l’île de Mayotte. Dans ce

département français, elle est classée en préoccupation mineure sur la liste rouge des espèces

menacées, avec une tendance stable (Kirchner F. et al., 2014).

Le classement systématique de cette plante est depuis toujours discuté entre la famille des

Leeaceae et celle des Vitaceae, en raison du peu de connaissances présentes sur son évolution. Les

études les plus récentes tendent à la classer dans la famille monogénérique des Leeaceae, celle-ci

étant sœur de celle des Vitaceae (Molina J. et al., 2012).

L. guineensis est connue dans de nombreux pays pour ses bienfaits médicinaux comme des

actions antirhumatismaux, anti-inflammatoires ou diurétiques (Lavergne R. et al., 2014). En effet

durant une très longue période, les populations utilisaient des remèdes à base de feuilles ou d’écorces

de L. guineensis pour guérir, par exemple, l’arthrose et les fractures (Mchangama M. et al., 2012).

Ce n’est qu’à la fin des années 1990 que plusieurs scientifiques ont commencé à s’intéresser à

la composition chimique de cette plante possédant des propriétés bénéfiques.

Ainsi, en 1997, Op de Beck P. entreprit l’extraction et l’identification des molécules présentes dans

les feuilles de L. guineensis provenant du Cameroun. Il y découvrit la présence d’un nouveau

flavonoïde, le quercitrin-3’-sulfate (Op de Beck P. et al., 1997). La même année, Adersen A. intégra

L. guineensis à son étude sur les plantes antihypertenseurs et diurétiques de l’île de la Réunion. Cette

plante eut 100 % d’inhibition (0,33 mg/mL) de l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ACE,

Angiotensin Converting Enzyme), qui intervient dans les réactions biologiques entraînant une

augmentation de la pression sanguine et de la diurèse (Adsersen A. et al., 1997).

En 1999 Op de Beck P., déjà cité précédemment, publia sa thèse concernant « l’étude

phytochimique et biologique de Leea Guineensis G. Don ». Il y étudia donc des spécimens provenus

du Cameroun, et apporta beaucoup d’éléments importants sur cette plante. Plus particulièrement, il a

extrait et identifié toute une série de molécules des feuilles de L. guineensis : sept terpénoïdes

(E-phytol, scalène, lupéol, bêta-amyrine, palmitate de bêta-amyrine, coriolate de bêta-amyrine et

palmitate d’alpha-amyrine), sept flavonoïdes (kaempférol, quercétine, quercitrine, quercitrin

3’-sulfate, quercétine-3,3’-disulfate, quercétine-3,3’,4’-trisulfate et méarnsitrine), un acide gras

(acide palmitique) et deux acides phénoliques (acide gallique et gallate d’éthyle). Il a ensuite montré

que les différentes fractions avaient une cytotoxicité à 10 et à 100 µg/mL et qu’elles n’avaient pas

6

d’activité anti-inflammatoire sur le modèle utilisé (production de prostaglandines 6KF1α). Le

palmitate de β-amyrine montra une activité inhibitrice significative de la production de PG6KF1,α

mais n’eut aucun effet sur l’expression de l’ARNm de la métalloprotéinase MMP-1. Pour finir,

l’étude de l’activité antiradicalaire des extraits et des composés phénoliques a donné des résultats très

positifs, excepté pour les flavonoïdes sulfatés (Op de Beck P. et al., 1999).

Un autre sujet abordé lors de cette thèse et publié dans un article à part entière en 2000 fut

l’étude des composés volatils issus des feuilles et du bois de L. guineensis. À l’aide d’une

hydrodistillation et d’analyses GC-MS, il trouva 69 nouveaux composés jamais trouvés dans cette

plante. Parmi ceux-ci, se trouvent majoritairement des hydrocarbures et leurs dérivés, mais aussi des

terpénoïdes, des phénylpropanoïdes et des composés divers. Il est important de noter que le profil en

terpénoïdes et en phénylpropanoïdes se montra peu semblable entre le bois et les feuilles (Op de

Beck P. et al., 2000).

Le dernier article de Op de Beck P. et al., publié en 2003, détaille l’étude de l’activité

antiradicalaire. Ils y précisent que ce potentiel antioxydant est lié à l’élimination du superoxyde créé

par la xanthine-xanthine oxydase et qu’une inhibition de l’aldose réductase est également observée.

De plus, la présence de sulfate sur la quercitine diminue fortement son pouvoir antioxydant (Op de

Beck P. et al., 2003).

Ensuite, toujours en 2003, Kamanzi Atindehou K. et al. s’intéressèrent aux plantes

médicinales présentes en Côte d’Ivoire, et y évaluèrent l’activité antitrypanosomale et

antiplasmodiale. Leea guineensis montra une faible activité antitrypanosomale et aucune activité

antiplasmodiale (Kamanzi Atindehou K. et al., 2003).

Pour continuer toujours en Afrique, plus précisément au Nigéria, Falodun A. et al. ont

effectué une étude sur l’effet anti-œdémateux des extraits aqueux de L. guineensis. C’est une

méthode in vivo de mesure de l’activité anti-inflammatoire. Dans ce cas-ci, les extraits ont montré

une inhibition de 73 % de l’inflammation (dose = 400 mg/kG). Ils notèrent également la présence de

sucres réducteurs et de saponines, et émis l’hypothèse que cette activité était donnée par ces

dernières (Falodun A. et al., 2007).

Plus récemment, en 2011, Woode E. et al. se sont intéressés aux effets anxiolytiques et

anticonvulsants de l’extrait aqueux des feuilles de L. guineensis issues de Ghana. Ils ont trouvé que

l’effet anxiolytique est similaire au Diazepam1 et une activité anticonvulsante significative. De plus,

1 « Le Diazepam est un anxiolytique appartenant à la classe des 1-4 benzodiazépines. Ses effets sont liés à une action agoniste spécifique sur un récepteur central faisant partie du complexe "récepteurs macromoléculaires GABA-OMEGA", également appelés BZ1 et BZ2 et modulant l'ouverture du canal chlore. » Notice du médicament

7

aucune influence négative sur l’appareil moteur des souris ne fut constatée (Woode E. et al., 2011).

Un certain nombre de propriétés ont donc déjà été étudiées sur des variétés de Leea

Guineensis, mais celles-ci étaient toujours issues de pays du continent africain. Il est intéressant,

comme le mentionne Op de Beck P. dans les perspectives de sa thèse, d’étudier des variétés

d’origines différentes afin de déterminer l’influence du lieu et des conditions de culture des

spécimens.

2.4. Litchi chinensis Sonn. Litchi chinensis Sonn. est un arbre de la

famille des Sapindaceae de 12 à 20 m de haut,

originaire des forêts tropicales à sous-tropicales de

Chine (Amann C. et al., 2011). Il est très connu et

cultivé à travers le monde, principalement pour la

consommation de ses fruits. C’est un arbre qui fleurit

en hiver uniquement si les températures sont assez

basses au début de cette saison. Les fruits mettent

trois mois à se développer, et sont roses – rouges à

maturité (Figure 4). Il existe un grand nombre de

variétés, par exemple le « Tai So » qui est de grande taille, « Souey Tung » qui fleurit tôt dans la

saison et « Wai chi » qui est utilisé pour le semis (Diczbalis Y., 2011).

Depuis très longtemps, les populations utilisent toutes les parties de cet arbre à des fins

thérapeutiques. Par exemple, les racines pour le mal de gorge et la fièvre, les graines pour les

troubles névralgiques et les feuilles pour les maladies cutanées (Ibrahim S. et al., 2015).

Suite à ces utilisations diverses et abondantes, beaucoup de scientifiques se sont intéressés

aux fruits (péricarpe, pulpe et noyau) et aux feuilles de L. chinensis.

Pour commencer, les feuilles ont montré une activité anti-inflammatoire. C’est plus

particulièrement les molécules extraites à l’éther de pétrole qui ont inhibé l’œdème induit par la

carraghénane. Il s’agit donc probablement d’une inhibition de la cyclooxygénase en lien avec le

métabolisme de l’acide arachidonique (Besra S. E. et al., 1996).

Figure 4. Photo de Litchi chinensis., par Asit K.

8

En 2014, Castellain R. et al. se sont intéressés aux propriétés antioxydantes et

antinociceptives (réduction de la douleur) de ces feuilles. Ceux-ci ont utilisé deux solvants

d’extraction (méthanol et éthanol) et ont ensuite effectué des fractionnements avec de l’acétate

d’éthyle. Les fractions extraites de cette façon ont eu des effets antinociceptifs. Trois composés

phénoliques ont pu être isolés et identifiés : l’épicatechine, la procyanidine A2 et la procyanidine B2.

Ces composés avaient déjà été retrouvés dans le péricarpe du fruit de Litchi, cependant la quantité

dans les feuilles est de 3 à 5 fois supérieure à celle du péricarpe (Castellain R. et al., 2014).

La même année, Wen L. et al. ont étudié les flavonoïdes et les activités anticancéreuses des

extraits des feuilles. Ils isolèrent six flavonoïdes dans la fraction acétate d’éthyle, après une

extraction à l’éthanol. Les flavonoïdes retrouvés sont : la lutéoline, l’épicatechin, le kaempferol 3-O-

β-glucoside, kaempferol 3-O-α-rhamnoside, la procyanidine A2 et la rutine. Les analyses effectuées

sur ces molécules montrèrent que la procyanidine A2 possède un haut pouvoir anticancéreux pour le

carcinome cervical (cancer du col de l’utérus) et le cancer du foie, mais un pauvre pouvoir pour le

cancer des poumons et du sein. La luteoline, épicatechine, procyanidine A2 et rutine sont de

meilleurs antioxydants que le BHT (HydroxyToluène Butylé). Pour finir, la lutéoline a un bon

pouvoir antimicrobien contre Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Shigella dysenteriae,

Salmonella et Bacillus thuringiensis (Wen L. et al., 2014).

Très récemment, une dernière découverte sur les propriétés des extraits de feuilles de Litchi

fut celle des propriétés photochemoprotectrices contre les rayons UVA et UVB. De plus, elles

possèdent un SPF (Sunburn Protection Factor) de 18,9 à 1 mg/mL, ce qui leur donnent un bon

potentiel pour faire des produits solaires (Thiesen L. et al., 2017).

Pour ce qui est du fruit, les parties les plus étudiées sont le péricarpe (la peau) et la graine, car

ce sont deux coproduits de l’industrie agroalimentaire de ce fruit. En 2000, Sarni-Manchado P. et al.

se sont intéressés à la composition phénolique du péricarpe. Ils recensèrent que ceux-ci ont une

structure orthodiphénolique, ce qui les rend facilement oxydables. C’est pour cette raison que la

couleur de la peau des fruits change rapidement après la récolte. Les quatre pigments majeurs trouvés

sont la cyanidine-3-rutinoside, la cyanidine glucoside, la quercetine-3-rutinoside (rutine) et la

quercetine glucoside. Ils montrèrent aussi que, comme dans les feuilles, on retrouve de l’epicatechine

et de la procyanidine A2 (Sarni-Manchado P. et al., 2000).

Quelques années plus tard, Zhao M. et al. ont relié ces flavonoïdes à leurs activités

antioxydantes. Il s’est avéré que la proanthocyanidine B2 a un radical hydroxyde plus puissant, et

l’épicatechine a la meilleure activité DPPH ((2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl) (Zhao M. et al., 2006).

En 2012, Jiang G. et al. ont découvert un nouveau composé phénolique : l’acide 2-(2-hydroxy-5-

9

[methoxycarbonyl] phenoxy) benzoïque. Ainsi que sept autres molécules actives : le methyl 3,4-

dihydroxybenzoate, le stigmasterol, l’isolariciresinol, le kaempferol, l’ethyl shikimate et

l’hydroxytoluène butylé. La mesure des activités antioxydantes de ces molécules a montré que seuls

le methyl 3,4-dihydroxybenzoate et l’acide 2-(2-hydroxy-5-[methoxycarbonyl] phenoxy) benzoïque

ont une activité plus forte que le BHT. Pour finir, il a été montré que l’acide 2-(2-hydroxy-5-

[methoxycarbonyl] phenoxy) benzoïque n’a pas d’activité antityrosinase, ni anti α-glucosidase (Jiang

G. et al., 2012).

En 2017, une revue concernant les flavonoïdes du péricarpe de fruit de Litchi a résumé les

informations en précisant que ceux-ci sont divisés en six classes selon leur cycle carbone et groupe

fonctionnel (flavanones, flavones, isoflavonoides, flavanes, flavonols et anthocyanines). Ces

molécules sont de bons antioxydants, mais leur classement dépend du test utilisé. De plus, des effets

sur les maladies cardiovasculaires, cancers, inflammations et allergies ont été largement démontrés

(Li J. et al., 2017).

Le second élément intéressant du fruit de Litchi est sa graine. Pour commencer, un acide gras

non commun, le methyl dihydrosterculate, a été isolé de son huile (Stuart L. et al., 2003).

La première étude sur les graines fut constituée des extractions à l’eau, éthanol et méthanol, ce qui a

permis d’extraire cinq composés phénoliques : l’acide gallique, la procyanidine B2, la

gallocatechine, l’épicatechine et l’épicatéchine-3-galate. Les différents extraits ont montré une

activité antioxydante et antityrosinase, celles-ci étant maximales dans l’extraction éthanol/eau

(50:50) (Nagendra Prasad K. et al., 2009).

En 2011, dans une étude assez semblable, des composés nouveaux ont été extraits à

l’éthanol : le (2α,3α-epoxy-5,7,30,40-tetrahydroxyflavan-[4β-8-catechin], le 2β,3β-epoxy-5,7,30,40-

tetrahydroxyflavan-[4α-8-epicatechin], le litchiol A et le litchiol B. Des composés connus ont aussi

été retrouvés : l’acide 2,5-dihydroxy-hexanoic, la soscopoletine, l’acide coumarique, l’acide

protocatechique, le 2α,3αepoxy-5,7,30,40-tetrahydroxyflavan-[4β_8]-epicatechin, le pterodontriol D-

6-O-β-D-glucopyranoside, la narirutin, la naringin, la dihydrocharcone-40-O-β-D-glucopyranoside et

la pinocembrin-7-rutinoside, pinocembrin-7-neohesperidoside). Des tests au DPPH ont montré que

l’acide protocatechique, (2α,3α-epoxy-5,7,30,40-tetrahydroxyflavan-(4β-8-catechin), le 2α,3αepoxy-

5,7,30,40-tetrahydroxyflavan-(4β_8)-epicatechin et le 2β3βepoxy5,7,30,40 tetrahydroxyflavan-(4α-

8-epicatechin) ont des activités antioxydantes modérées (Wang L. et al., 2010).

Une autre propriété intéressante de celle-ci a été démontrée en 2014, il s’agit de l’activité

antimicrobienne de l’extrait aqueux de la graine contre des bactéries GRAM + et GRAM -.

L’inhibition de croissance la plus importante a été observée sur Streptococcus pyogenes (Bhat R. et

10

al., 2014).

La dernière découverte intéressante fut le potentiel anti-obésité des extraits aqueux de graines

de litchi par l’inhibition de l’adipogenèse in vitro (extraction aqueuse mise dans une pâte de viande)

(Qi S. et al., 2014).

En 2009, une étude sur la pulpe en général a montré que celle-ci avait un pouvoir

antidiabétique (inhibiteur d’aldose réductase) grâce à son contenu en delphinidin 3-O-β-

galactopyranoside-39-O-β-glucopyranoside (Lee S. et al., 2009). Pour terminer, Huang F. a montré

que la pulpe avait aussi des propriétés immunomodulatrices, et que celles-ci étaient mieux

conservées lors d’un séchage à pompe chauffante que lors d’un séchage par congélation (Huang F. et

al., 2014).

Un très grand nombre de molécules et activités sont déjà connues dans ces parties de la

plante. Cependant, aucune recherche ne s’est encore intéressée aux racines. Celle-ci ayant aussi des

utilités dans la médecine populaire (Ibrahim S. et al., 2015), elles seront l’objet de ce travail.

2.5. Persea americana Mill. Persea americana Mill, appelé plus

communément avocatier, est un arbre de la famille

des Lauraceae. Il est originaire du Mexique, et se

développe dans un climat tropical à sous-tropical.

Au naturel, il peut faire jusque 20 mètres de haut.

Son fruit est une drupe. Il a la peau allant du vert

au noir et contient un gros noyau (Figure 5). Il

existe environ 400 cultivars, et il est

majoritairement cultivé à des fins alimentaires. De

plus, de nombreuses propriétés médicinales lui sont

reconnues depuis longtemps, comme l’utilisation comme vermifuge ou contre la fièvre. Aujourd’hui,

beaucoup de pays cultivent cet arbre, mais le Mexique reste le leader. Les pays européens les

importent, car leur climat n’est pas favorable à la culture (Pérez Álvarez S. et al., 2015).

Les feuilles d’avocatier sont vertes et coriaces tandis que les fleurs, vertes aussi, s’ouvrent au

Figure 5. Photo de Persea americana, par Richins Myers V., 2016

11

début de la saison humide. Les organes mâles et femelles n’arrivent pas à maturité en même temps

au sein d’un même arbre, il en faut donc au moins deux proches l’un de l’autre pour avoir des fruits

(Amann C. et al., 2011). Ceux-ci font en moyenne 9 cm de diamètre (Orhevba B. et al., 2011). Ces

fruits, riches en vitamines, sont consommés dans le monde entier alors que l’huile extraite du noyau

est utilisée en cosmétique (Amann C et al.., 2011).

Selon Yasir M. et al., il existe trois variétés d’avocatiers : le mexicain, le guatémalien et

l’indien de l’est. En plus des utilisations déjà citées, ils sont utilisés en médecine traditionnelle pour

soigner l’hypertension et le diabète (Yasir M. et al., 2010). Les composés majoritaires de l’avocat

sont les acides gras, les vitamines et les caroténoïdes. La quantité de lipides est beaucoup plus élevée

que dans les autres fruits. (Ranade S., 2015).

Plusieurs recherches ont trouvé des molécules aux propriétés intéressantes dans le fruit. Pour

commencer, un composé antifongique contre le pathogène Colletotrichum gloesporiode a été

découvert en 2000. Il s’agit du (E, Z, Z) -1-acétoxy-2-hydroxy-4-oxo-hénéicosa-5,12,15-triène et il a

été isolé à partir des idioblastes de l’avocat (Domergue F. et al., 2000). Quatre ans plus tard, Lu Q.

montra que l’avocat est le fruit avec le plus de lutéine, qui représente 70 % de ses caroténoïdes.

Ceux-ci se retrouvent dans l’extraction faite à l’acétone, accompagnés des tocophérols. Cet extrait

permet d’inhiber la croissance des cellules cancéreuses de la prostate in vitro, alors que la lutéine

seule ne le permet pas. De plus, la grande quantité d’acides gras présents dans l’avocat facilitera

l’absorption des caroténoïdes dans le sang, ce qui réduit davantage les risques de cancer (Lu Q.,

2005). En 2007, Ding H. et al. confirmèrent cette découverte en précisant que les molécules

phytochimiques extraites mènent à l’apoptose en ciblant des voies de signalisation multiples et

augmentant l’oxygène réactif intracellulaire (Ding H. et al., 2007). La dernière propriété intéressante

mesurée sur l’avocat est le potentiel antioxydant. Celui-ci est dû aux phénols solubles totaux, la

vitamine C, la vitamine E, le ß-carotène et les caroténoïdes totaux. L’extrait aqueux est 95 fois plus

antioxydant que le lipophilique, ce sont donc les phénols (24,2 mg/100g MF) et la vitamine C (58 %

acide ascorbique) qui sont en majorité responsables de l’activité antioxydante de l’avocat (Corral R.

D. et al., 2008).

Pour ce qui est du noyau, une extraction méthanolique suivie d’un fractionnement a permis de

séparer et d’identifier trois composés d’acide chlorogénique et ses isomères, de l’acide quinique, des

salidrosides, de la proantocuanidines B1 et B2. Des tests in vitro ont montré que ces molécules

avaient des effets d’inhibition et de stimulation sur le keratinocyte et le fibroblaste humain (Ramos-

Jerz M., 2013). D’autres molécules phytochimiques bioactives ont été trouvées et ont pour effet

12

d’améliorer l’hypercholestérolémie, l’inflammation, le diabète et l’hypertension. De plus, des effets

insecticides, fongicides et antimicrobiens ont été encore une fois montrés (Dabas D. et al., 2013).

L’huile extraite de ce noyau est riche en composés insaponifiables qui diminuent l’arthrose par des

propriétés anticataboliques. De plus, elle inhibe la fibrinolyse et favorise la réparation du cartilage.

Pour finir, il a été observé que ces insaponifiables réduisent l’absorption et la biosynthèse de

cholestérol (Christiansen B. et al., 2014).

La dernière partie de Persea americana qui a été fortement étudiée est la feuille. Dès 2002,

des propriétés très intéressantes ont été découvertes. Une étude de l’extrait aqueux sur les souris a

montré de forts effets analgésiques (antidouleurs) et anti-inflammatoires (Adeyemi O. et al., 2002).

Peu après cela, les extraits aqueux des feuilles ont aussi montré une vasorelaxation significative sur

les rats (Owolabi M. et al., 2005). Dans les populations africaines, plusieurs parties de la plante

étaient aussi utilisées pour soigner les convulsions. Des mesures de cet effet anticonvulsant de

l’extrait aqueux sur des crises induites sur des souris par trois composés (pentylenetetrazole [PTZ],

picrotoxin [PCT] et bicuculline [BCL]) ont montré une bonne inhibition pour les deux premiers cas.

L’effet anticonvulsant serait alors dû à une augmentation de la neurotransmission et/ou à l’action

gabaergique dans le cerveau (Ojewole J. et al., 2006). Comme pour le noyau, il a été montré que les

feuilles de P. americana ont des effets bénéfiques sur le cholestérol. En effet, leur extrait aqueux et

méthanolique sur des rats hypercholestérolémiques ont réduit le LDL (Low Density Lipoprotein) et

ont augmenté le HDL (High Density Lipoprotein) (Brai B. et al., 2007). Ensuite, il a été montré que

l’extrait aqueux avait aussi un effet antiulcère, mais celui-ci n’est pas dû à un effet direct sur l’acide

gastrique, mais plutôt à une inhibition de la sécrétion d’acide, celle-ci étant stimulée par l’histamine

(Oluwole F. et al., 2011). De plus, l’extrait hydroalcoolique de feuille a des propriétés

antidiabétiques, car il régule le niveau de glucose dans le sang et dans le foie par la voie PKB/akt

(Lima C. et al., 2012). La dernière propriété majeure démontrée est l’effet antidiarrhéique (réduction

de l’humidité et de la fréquence de défécation). Ces résultats sont comparables aux médicaments

portant les mêmes propriétés (Odo C. et al., 2013).

Persea americana est donc une plante qui a déjà été énormément étudiée et qui possède un

grand nombre de propriétés médicamenteuses.

13

3. Activités biologiques

Une étude plus approfondie de certaines activités biologiques (Saive M. et al., 2015) a permis de

sélectionner ces trois plantes.

Les activités sélectionnées sont l’activité antityrosinase, anti-inflammatoire, et antiradicalaire.

Ces trois activités ont été sélectionnées dans un but de valorisations cosmétiques. La première

permet la correction du teint de la peau. En effet, de nouveaux inhibiteurs de tyrosinase sont très

demandés dans l’industrie cosmétique (Parvez S. et al., 2007). De plus, aucune étude sur cette

activité n’a encore été réalisée sur les plantes sélectionnées.

La seconde est effective dans un grand nombre de cas, car énormément de « désagréments »

physiques sont accompagnés d’une réaction d’inflammation des tissus (Prigge ST. et al., 1997).

Pour finir, la troisième activité possède elle aussi un grand nombre d’applications, car ralentir

l’oxydation des cellules permet de réduire le vieillissement de celle-ci, et par la même occasion

l’apparition de rides (CNRS, « Les radicaux libres », consulté le 5 avril 2017).

3.1. L’activité antityrosinase

3.1.1. La mélanogenèse

La mélanine est l’un des pigments les plus répandus chez les animaux, plantes et humains.

Plus précisément, c’est un polyphénol hétérogène à structure complexe et il donne une couleur

variant de jaune à noir (Kim Y.-J., 2005). De plus, elle a un rôle clé pour la protection contre

différents rayonnements, et aussi pour l’absorption des radicaux libres du cytoplasme (Parvez S. et

al., 2007). Trois enzymes sont impliquées dans la mélanogenèse : la tyrosinase (influence la

quantité), la TYRP1 et la dopachrome taulomérase (influence le type de mélanine synthétisée) (Ando

H. et al., 2007). La mélanogenèse (Figure 5) a lieu dans les mélanocytes de la couche basale de

l’épiderme. Deux types de mélanines peuvent y être produites : l’eumélanine (noir ou brune) et la

pheomélanine (rouge ou jaune) (Kim Y.-J. et al., 2005).

Les premières étapes sont communes aux deux composés et sont la formation de L-DOPA

puis de dopaquinone au départ de tyrosine. (Parvez S. et al., 2007). Elles ont pour cosubstrat

l’oxygène moléculaire et elles sont les réactions limitantes d’un point de vue cinétique (Garcia-

carmona F. et al., 1982).

Pour l’eumélanogenèse, une addition 1,4 intramoléculaire a lieu sur le cycle benzène de la

dopaquinone ce qui entraîne la formation de leucodopachrome. Une autre dopaquinone oxyde alors

14

cette molécule afin de former du dopachrome. Durant cette réaction, la dopaquinone est réduite en L-

DOPA (Figure 6). Une autre alternative à la formation de dopachrome est l’addition d’eau au cycle

benzénique avec l’aide de quinones (Kim Y.-J. et al., 2005). Le dopachrome est très stable et

détectable à 475 nm (Garcia-carmona F. et al., 1982). Ensuite, plusieurs voies enzymatiques et

chimiques sont possibles pour mener à la synthèse d’eumélanine.

Le premier cas débute par la décarboxylation du dopachrome en 5,6-dihydroxyindole (DHI)

suivi de son oxydation en indol-5,6-quinone. Celui-ci donnera des mélanines noires et floconneuses.

Le cas suivant consiste en une transformation enzymatique du dopachrome en indole-5,6-

dihydroxyindole-2-carboxylique (DHICA) catalysé par la dopachrome tautomérase. Le DHICA peut

directement mener à l’eumélanine ou bien être précédemment oxydé en acide indole-5,6-quinone

carboxylique par une réaction redox avec la dopaquinone. Les eumélanines produites dans ces deux

dernières possibilités seront plus brunes-jaunâtres et dispersées (Kim Y.-J. et al., 2005).

Pour la phéomélanogenèse, une attaque nucléphophile de la dopaquinone par le groupe thiol

de composés sulfhydryl a lieu principalement sur la position 5 (parfois d’autres positions). Les

composés formés dépendent de celui qui effectue l’attaque nucléophile, par exemple une attaque

Figure 6. Schéma de la mélanogenèse issu de Kim Y.-J. et al., 2005

15

nucléophile par la cystéine engendrera un cysteinyldopa qui subira ensuite une cyclisation et

polymérisation afin de produire de la phéomélanine (Kim Y.-J. et al., 2005).

3.1.2. La tyrosinase

La tyrosinase (EC 1.14.18.1) est une enzyme oxydase contenant du

cuivre (Kim Y-J. et al., 2005). Elle a déjà été extraite de beaucoup de

mammifères et plantes (Parvez S. et al., 2007). Comme expliqué dans le

paragraphe précédent c’est une enzyme indispensable à la mélanogenèse.

En effet, la tyrosinase catalyse l’hydroxylation de la tyrosine en L-DOPA

(Kim Y-J. et al., 2005) et ensuite l’oxydation de la L-DOPA en dopachrome

(Golicnik M. et al., 2003).

Le site actif de la tyrosinase est représenté par trois différents états,

mais dans tous les cas il contient deux atomes de cuivre. Les trois formes de

tyrosinase sont met-, oxy- et deoxytyrosinase (Figure 7). Elles utilisent

l’oxygène moléculaire comme cosubstrat (Kim Y.-J. et al., 2005).

La tyrosinase possède deux mécanismes d’action : le cycle

monophénolase et le cycle diphénolase. Dans le premier cas le monophenol

ne réagit qu’avec la forme oxytyrosinase et induit des réarrangements

menant à un o-diphénol. Pour le deuxième cas, la forme met- et

oxytyrosinase réagit avec le diphénol formé pour alors l’oxydé en o-quinone

(Kim Y.-J. et al., 2005).

Trois groupes de substrats sont utilisés par la tyrosinase. Le premier est constitué de

molécules cyclisables et qui peuvent accepter une addition 1,4 intramoléculaire sur leur cycle

benzénique. Le deuxième est celui des molécules non cyclables, mais qui peuvent subir une addition

d’eau. Le troisième regroupe les molécules stables tout au long de la réaction (Parvez S. et al., 2007).

3.1.3. Les inhibiteurs de la tyrosinase

Plusieurs voies d’inhibition sont connues pour la tyrosinase.

La première est l’inhibition de la transcription de l’ARNm de la tyrosinase. Cela est effectué par la

ceramine et la piperlonguminine. Deuxièmement, une aberration de la glycosylation de la tyrosinase

empêche celle-ci de prendre sa conformation finale, ce qui inhibe son activité catalytique. Le

glutathion, la glucosamine et la ferritine ont ce pouvoir. Le troisième type d’inhibition est l’inhibition

Figure 7. Activation de la tyrosinase extrait de Yang J., 2014

16

de l’activité catalytique au sens propre. Celle-ci peut donc être compétitive ou non. De plus, un effet

cytotoxique sur les mélanocytes est parfois observé. Par exemple, l’hydroquinone est compétitive et

cytotoxique et l’arbutine est uniquement compétitive. Plusieurs modes d’action sont possibles quant

à l’inhibition non compétitive. Tout d’abord, l’acide kojique agit en chélatant le cuivre, ensuite l’a-

tocophéryle agit comme antioxydant et finalement une réduction de la phosphorylation de la

tyrosinase empêche celle-ci de s’activer (Ando H. et al., 2007). Il a également été montré que

l’utilisation d’inhibiteurs d’action différente (un compétitif et un non compétitif) avait un effet

synergique sur l’inhibition de la tyrosinase (Jin Y. et al., 1999).

La quatrième voie d’inhibition de la tyrosinase est l’accélération de sa dégradation soit par

acidification, soit par l’utilisation de facteurs tels que l’acide linoléique et la phospholipase D2. Pour

finir, une régulation indirecte de l’activité de la tyrosinase peut être effectuée en inhibant la

signalisation entre le kératinocyte et le mélanocyte, responsable de l’activation de la mélanogenèse

(Ando H. et al., 2007).

Un certain nombre d’inhibiteurs issus d’extraits végétaux ont déjà été identifiés. Ceux-ci sont

d’abord des polyphénols, plus précisément des flavonoïdes comme le kaempferol et la quercétine

puisqu’ils sont capables de chélater le cuivre (Kubo I. et al., 1999). Par contre, d’autres flavonoïdes,

comme la catéchine agissent comme cofacteurs ou substrats de la tyrosinase. Ensuite, des aldéhydes

tels que l’anisaldéhyde ont montré une inhibition de la tyrosinase également. Des métabolites

produits par des champignons sont présents dans les différents types d’inhibitions. En effet, l’acide

azélaïque est un inhibiteur compétitif de la tyrosinase et est mélanocytotoxique. L’acide kojique, déjà

cité précédemment comme étant un chélateur de cuivre, est en fait produit par Apsergillus niger.

Pour ce qui est des dérivés de composés naturels, la longueur de la chaîne carbonée semble

influencer l’activité anti-tyrosinase. Pour finir, des inhibiteurs d’origine synthétique tels que le

captoprile (non compétitif et irréversible) et la tropolone ont été développés (Kim Y.-J. et al, 2005).

Une étude sur des extraits de feuilles de Morus alba séchées a révélé que celles-ci avaient

pour effet d’inhiber la tyrosinase lors de la réaction d’oxydation de la L-DOPA en dopachrome. De

cet extrait a ensuite été isolée et identifiée la molécule Mulberroside F (moracine M-6, 39-di-O-b-D-

glucopyranoside) comme étant l’agent inhibiteur de la tyrosinase. Cette molécule extraite est alors un

bon candidat quant au développement d’un nouveau produit cosmétique blanchissant la peau (Lee S.

et al., 2002).

17

3.1.4. Intérêts

L’inhibition de la tyrosinase est très recherchée dans le domaine agroalimentaire et dans le

domaine cosmétique.

Dans le domaine agroalimentaire, le brunissement enzymatique cause la dégradation des

aliments lors du stockage et de la transformation, ce qui entraîne la perte de qualité nutritionnelle

(destruction acides aminés essentiels) et la production de composés indésirables (Kim Y-J. et al.,

2005).

Dans le domaine cosmétique et médical, les problèmes pigmentaires tels que l’hyper- et

l’hypopigmentations sont très répandus. Ce type de pathologie entraîne des dommages esthétiques,

mais peut aussi engendrer des mélanomes. Les produits traitant ces dysfonctionnements peuvent

viser chacune des étapes de la mélanogenèse. L’hydroquinone fut durant très longtemps utilisée dans

les produits cosmétiques, mais il n’est plus utilisé maintenant, car c’est un composé mutagène.

L’extrait de citron réduit aussi la pigmentation, mais il a le désavantage d’irriter la peau à trop grande

concentration. L’acide kojique et l’arbutine sont les composés les plus utilisés dans les produits

cosmétiques actuels (Smit N. et al., 2009).

3.2. L’activité anti-inflammatoire

3.2.1. La réaction d’inflammation Chez les mammifères, la réaction d’inflammation a lieu en réaction à une agression externe

ou interne. Cette réaction se manifeste par la production de leucotriènes (Andreou A. et al., 2009).

Le mot « leucotriène » vient du fait qu’elles sont produites dans les leucocytes et qu’elles

contiennent trois doubles liaisons conjuguées. Elles sont issues d’une réaction de l’acide

arachidonique (AA) avec l’aide de la 5-lipoxygénase (5-LOX) qui rentre dans la cellule lorsqu’elle

est activée par un stimulus (Peters-Golden M.D. et al, 2007).

18

En réalité, la 5-LOX catalyse les deux

premières étapes de la réaction (Figure 8). Tout

d’abord, l’acide arachidonique est oxydé en 5-

HPETE (acide hydroperoxy-eicosatetraenoique),

celui-ci est ensuite déshydraté en leucotriène A

(intermédiaire instable). D’autres réactions

enzymatiques mènent alors à chaque type de

leucotriène (Charlier C. et al., 2003).

C’est le leucotriène B qui a le rôle le plus important

dans la réaction inflammatoire. Celui-ci aide les

cellules inflammatoires à migrer vers leurs cibles en

les orientant (agent chimiotactique). De plus, il

active les neutrophiles, augmente leur adhérence et

aide à leur infiltration dans les tissus. Les autres

leucotriènes jouent un rôle dans des maladies telles

que l’asthme, la polyarthrite rhumatoïde, la maladie

inflammatoire de l'intestin et la colite ulcéreuse

(Charlier C. et al., 2003).

3.2.2. Les lipoxygénases

Les lipoxygénases forment une superfamille d’enzymes ayant des origines et des activités

différentes. (Brash A. R., 1999). Plus de 50 lipoxygénases ont été recensées (Prigge ST. et al., 1997).

Au fur et à mesure des années, différentes façons de les classifier sont apparues : selon leur pH

d’activité, selon leur localisation subcellulaire ou encore selon leur spécificité de position de

l’oxygénation des acides gras (Andreou A. et al., 2009). Dans tous les cas, les lipoxygénases sont des

enzymes contenant du fer et utilisant de l’oxygène moléculaire comme cosubstrat (Prigge ST. et al.,

1997).

Dans ce travail, nous allons nous concentrer sur la lipoxygénase humaine (5-LOX,

responsable de l’inflammation) et la lipoxygénase du soja (EC.1.11.13.12), utilisée pour tester

l’activité biologique des extraits végétaux. Il a été prouvé que la lipoxygénase du soja était efficace

pour étudier le potentiel d’inhibition de l’inflammation humaine d’un produit suite à la détermination

Figure 8. Voie de la 5-LOX issu de Charlier C. et al., 2003. Légende : LT = leucotriènes

19

par diffraction aux rayons X de sa structure (Prigge ST., 1997). De plus, cette famille de

dioxygénases agit toujours sur le fragment 1,4-cis-pentadiène d’un acide gras afin de catalyser la

production de dérivés hydroperoxydes. Un atome de fer non-heme permet de différencier la forme

activée (Fe3+) de la forme désactivée (Fe2+).

Il est important de noter que les êtres humains possèdent en réalité trois isoenzymes (5-, 12-

et 15-LOX), mais les deux dernières sont peu connues et il semblerait que la 5-LOX soit majoritaire

dans l’organisme humain. (Charlier C. et al., 2003). Récemment, des études sur la 5-LOX ont montré

qu’en plus d’agir dans les cas de maladie inflammatoire chronique, elle a une influence sur certains

cancers (Radmark O. et al., 2007).

La lipoxygénase du soja a pour substrats l’acide linoleique et l’acide linolenique et le produit

de leur oxydation est le 9- et le 13-hydroperoxyde (Figure 9). Plusieurs isoenzymes ont été détectés,

mais plus particulièrement trois ont été identifiés : la 1-LOX, 2-LOX et 3-LOX. Elles peuvent être

séparées selon leur pH optimum. De celles-ci, c’est la 1-LOX qui est majoritaire (Fauconnier M.-L.

et al., 1996). La lipoxygénase du soja a été énormément étudiée notamment pour sa production

d’arômes. De plus, le 13-HPOD est un précurseur de traumatine (inducteur de division cellulaire) et

d’acide jasmonique.

Figure 9. Voie de la lipoxygénase du soja extrait de Fauconnier M.-L. et al., 1996

20

3.2.3. Les inhibiteurs de la lipoxygénase

Plusieurs modes d’action existent pour inhiber la 5-lipoxygénase. D’un point de

vue inhibition directe, il est d’abord possible d’utiliser des inhibiteurs redox ou des antioxydants afin

d’empêcher la 5-LOX d’effectuer des réactions d’oxydation. Ensuite, il est possible de chélater le fer

ou encore d’utiliser une molécule qui se lie au site actif de la 5-LOX (prenant la place de l’acide

arachidonique). Des inhibitions indirectes peuvent aussi être utilisées, comme une inhibition de la

protéine de liaison de la 5-LOX (la FLAP, Five Lipoxygenase Activating Protein) ce qui inhibera

toute la synthèse de leucotriène (Charlier C. et al., 2003).

De nombreuses molécules anti-inflammatoires ont d’ores et déjà été trouvées dans des

extraits végétaux. Deux flavonoïdes anti-inflammatoires ont été trouvés dans Tanatecum

mimpbyllum : la centaurérine (5,7,3'-trihydroxy-3,6,4 'trirnethoxyflavone) et le 5,3' - dihydroxy -4'-

méthoxy-7 carbométhoxyflavonol (Abad M. et al., 1993). De plus, l’extrait aqueux et l’huile

essentielle de Foeniculum vulgare inhibent la 5-LOX avec un IC502 de 27 ± 1 µg / mL et 68 ± 2 µg /

mL, respectivement (Albano S. et al., 2012). De plus, la protéine Aloe extraite du gel des feuilles

d’Aloe vera possède une inhibition de 84,6 % de la lipoxygénase pure (1 mole de protéine d’Aloe

pour 1 mole de LOX) (Das S. et al., 2010). C’est une des raisons pour lesquelles cette plante est très

répandue en cosmétique. Un métabolite de mammifère, l’oxyde nitrique, a également montré un

pouvoir anti-inflammatoire grâce à sa capacité à réduire le fer et d’être compétitif pour le site actif.

De plus il entraîne des oxydations du milieu qui ralentissent celle de l’acide arachidonique (Kanner J.

et al., 1992).

Si on s’intéresse aux lipoxygénases du soja, plusieurs inhibiteurs ont été découverts tels que

la Quercetin. Celle-ci possède une inhibition non compétitive de la 1-lipoxygénase avec un IC50 de

1,45 mg/mL. Cette inhibition agit d’abord en réduisant le fer du site actif (désactivation de l’enzyme)

puis en le chélatant (empêche la réactivation). La rutine et le kaempferol ont les mêmes propriétés,

mais dans une moindre importance (Ha T. J. et al., 2010). Les antioxydants phénoliques sont

également de bons inhibiteurs de la lipoxygénase du soja (Fauconnier M.-L. et al., 1997). Parmi

ceux-ci, le NDGA (acide nordihydroguaiaretique) possède l’activité la plus forte (Yasumoto B. K.,

1970).

2 IC50 = concentration ayant 50% d’inhibition.

21

3.2.4. Intérêts

Comme expliqué précédemment, la 5-LOX est responsable de la production de médiateurs

inflammatoires (les leucotriènes) qui interviennent dans des pathologies comme l’asthme, la rhinite

allergique, des maladies cardiovasculaires et certains cancers. Cependant, il n’existe aujourd’hui

aucun médicament présentant une inhibition efficace de cette réaction. Le développement

d’inhibiteurs de la FLAP pourrait être bientôt créé pour le traitement de l’asthme, mais d’autres voies

et molécules inhibitrices naturelles restent à découvrir pour le traitement des autres pathologies

visées (Hofmann B. et al., 2013).

3.3. L’activité antiradicalaire

3.3.1. La réaction d’oxydation

Les radicaux libres sont des atomes ou

molécules ayant perdu ou gagné un électron. Ils sont

responsables de nombreux dégâts dans le corps

humain (CNRS, « Les radicaux libres », consulté le 5

avril 2017).

La réaction d’oxydation (Figure 10) est divisée

en trois étapes : l’initiation, la propagation et la

terminaison. Lors de l’initiation, un radical libre

arrache un électron à une molécule, qui devient alors

elle-même un radical instable et s’attaque à d’autres

molécules lors de la propagation. La terminaison a lieu lorsque deux radicaux libres se lient pour

former un composé stable, mais souvent indésirable (Bondet V. et al., 1997).

Dans les cellules du corps humain, une cause de la création de ces molécules est la

respiration cellulaire qui transforme le dioxygène moléculaire en superoxyde. Celui-ci est alors

instable et propage le phénomène jusqu’à l’obtention de molécules stables (CNRS, « Les radicaux

libres », consulté le 5 avril 2017). Les lipides sont également très sensibles à ce type de réaction et

forment des hydroperoxydes. La dégradation de ces hydroperoxydes produit des composés volatils

(Bondet V. et al., 1997).

Figure 10. Schéma général de la réaction d'oxydation radicalaire

22

3.3.2. Le DPPH (2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl) Beaucoup de méthodes de mesure de l’activité antioxydante existent. Celle utilisée dans le

cadre de ce travail est celle du DPPH. Il est important de noter que la réaction entre l’antioxydant et

le DPPH dépend de la structure du premier. De ce fait, ce ne sera pas une mesure exacte, mais plutôt

une indication du pouvoir (Bondet V. et al., 1997).

3.3.3. Les inhibiteurs de l’oxydation

De nombreux antioxydants de sources très variées existent. Du point de vue des molécules

synthétiques, le BHT est un antioxydant très puissant tandis que l’eugénol et l’isoeugénol, deux

composés naturels, le sont tout autant (Bondet V. et al., 1997).

Les différents inhibiteurs montrent des cinétiques et des stœchiométries de réactions

différentes. Ainsi, l’acide ascorbique et l’acide isoascorbique agissent directement alors que l’acide

rosmarinique et le 6-tocophérol mettent 30 minutes à être stables. L'acide caféique, l'acide génitique

et l'acide gallique ont un coefficient stœchiométrique élevé (1 pour 4 à 6 molécules de DPPH oxydé)

par rapport aux composés cités précédemment (1 pour 1 à 3 molécules de DPPH oxydé) (Brand-

Williams W. et al., 1994).

Le corps humain possède naturellement un certain nombre d’antioxydants. L’a-amyloïde

monomérique est une protéine trouvée dans les fluides physiologiques qui a une activité

antioxydante sur les neurones (Zou K. et al., 2002). Les cellules de façon plus générale contiennent

du glutathion (tripeptide g-L-glutamyl et cystinylglycine) qui protège de l’oxydation (étude effectuée

sur une levure) (Duncan W.S. et al., 1996).

Ensuite, les extraits de plantes ont montré un fort potentiel en tant que source d’antioxydant.

En effet, les composés phénoliques ont la capacité d’intercepter les radicaux libres et de leur donner

un électron libre, ce qui empêche l’oxydation des autres molécules (Rice-Evans C.A. et al., 1999).

Notamment, les tanins ont montré une inhibition de l’oxydation 15 à 30 fois supérieure à celle de

composés phénoliques simples (Hagerman A.E. et al., 1998). La quercétine, l’apigénin et la lutéoline

sont également très efficaces, car ce sont des flavonols qui possèdent une structure particulièrement

favorable à l’activité antioxydante (Dai J. et al., 2010 et Topçu G. et al., 2007). Certains composés

phénoliques possèdent une inhibition indirecte de l’activité antioxydante, car ils possèdent des

groupes dihydroxy qui fixent les métaux essentiels à certaines oxydations (Dai J. et al., 2010).

23

3.3.4. Intérêts

Le vieillissement de la peau, certains cancers et des maladies cardiovasculaires sont en partie

engendrés par les réactions radicalaires (Molyneux. et al., 2004). Il est fréquent d’incorporer des

molécules antiradicalaires dans la composition de crème afin de ralentir ce vieillissement (CNRS,

« Les radicaux libres », consulté le 5 avril 2017). Il est donc très intéressant de trouver de nouvelles

molécules naturelles et antioxydantes.

D’un point de vue agroalimentaire, l’oxydation des lipides diminue leurs qualités

nutritionnelles, car des acides gras essentiels sont détruits. De plus, des composés volatils sont

produits, mais ceux-ci altèrent généralement la qualité organoleptique du produit (Molyneux. et al.,

2004).

24

4. Objectifs et stratégies

Comme il a été expliqué dans les paragraphes précédents, les plantes utilisées dans cette étude

ont été sélectionnées sur base des pratiques traditionnelles des populations de l’île de Mayotte.

Cependant, les molécules actives responsables des propriétés conférées à ces espèces n’ont pas

encore été identifiées.

Cette identification est donc entamée dans ce travail. En raison du temps limité, il est évident

qu’une identification de toutes les molécules présentes dans les trois plantes sélectionnées n’est pas

envisageable.

De ce fait, une logique de sélection a été suivie : à chaque fractionnement, les analyses

spectrophotométriques ont permis d’identifier les fractions « les plus intéressantes » pour des

purifications ultérieures. Celles-ci ont été sélectionnées à l’aide de tests statistiques.

Cela a abouti à la caractérisation structurale d’une molécule inhibitrice de la tyrosinase extraite

des racines de Litchi chinensis.

25

5. Matériel et méthode

5.1. Extraction des molécules actives La première étape du travail au laboratoire a été le traitement des matières premières brutes suivi

de l’extraction des molécules actives.

5.1.1. Matières premières Les plantes ont été récoltées sur l’île de Mayotte par Benoit Dupperon, botaniste du

Conservatoire Botanique National du Mascarin. Elles y ont ensuite été séchées naturellement au

soleil.

Pour les feuilles de Persea americana et les racines de Litchi chinensis, les échantillons ont été

prélevés sur un seul individu dans le jardin du Conservatoire Botanique National Mascarin à une

altitude de 101 mètres.

Les feuilles de Leea guineensis ont été prélevées sur onze individus différents, situés au Chaungui-

piemont à une altitude de 293 mètres.

Lorsque les échantillons séchés sont arrivés à Gembloux, les feuilles de L. guineensis et P.

americana ont immédiatement été broyés à l’aide d’un Broyeur d’analyse IKA A11, tandis que les

racines de L. chinensis ont d’abord été découpées en morceaux de 2 cm sur 2 cm avec un sécateur

manuel, et ont ensuite été broyées avec un broyeur laboratoire à marteaux, type BOA (tamis à trous

circulaires de 6 mm).

Les échantillons ont alors été conservés sous forme de poudre à -22°C dans des barquettes en

aluminium.

5.1.2. Extraction par Soxhlet

Les molécules ont été extraites des végétaux broyés à l’aide de la technique du Soxhlet sur une

période de 6 heures.

Deux volumes de Soxhlet ont été utilisés : 30 mL lors des analyses du premier fractionnement et

200 mL lors des fractionnements ultérieurs.

Dans le premier cas, environ exactement 2 g de matière sèche (MS) broyée ont été extraits dans

26

des cartouches en papier (cellulose extraction thimbles, Whatman) à l’aide de 60 mL d’acétone

HPLC grade (Sharlau) et d’un ballon de récolte de 100 mL.

Dans le deuxième, environ exactement 20 g de matière sèche (MS) broyée ont été extraits à l’aide de

400 mL d’acétone et d’un ballon de récolte de 500 mL.

Le ballon du Soxhlet a été chauffé à l’aide d’un chauffe ballon (Electrothermal) réglé sur le niveau 4.

Après 6 heures, le Soxhlet a été arrêté et l’acétone a été évaporée entièrement à l’aide d’un

évaporateur rotatif (Heidolph, Laborota 4003). Ces échantillons secs ont ensuite été conservés à -

22°C.

5.2. Séparation des molécules Plusieurs techniques ont été utilisées en série afin de fractionner les échantillons jusqu’à

l’obtention de molécules quasi pures.

À de nombreuses reprises, il a été nécessaire d’évaporer le solvant dans lequel se trouvait

l’échantillon. Pour ce faire, un évaporateur rotatif (Heidolph, Laborota 4003) a été utilisé. La

température du bain a été fixée à 50°C pour toutes les évaporations, tandis que la pression a été

adaptée au solvant ciblé à chaque fois.

5.2.1. Centrifugation

Les échantillons obtenus au point 5.1.2 ont été une première fois fractionnés par centrifugation.

Dans le ballon de récolte, 5 ou 100 mL de dichlorométhane HPLC grade (Scharlau) ont été ajoutés

(en fonction du petit ou grand ballon). La matière sèche a été décollée le plus possible de la paroi à

l’aide d’un bain à ultrason (Bandelin Sonorex Super).

Ensuite, l’échantillon est transvasé dans un tube à essai en verre ou dans un tube à centrifugeuse en

téflon (fonction du volume). Le tube à essai a été centrifugé à 3000 rpm durant 10 minutes dans une

centrifugeuse Heraeus Labofuge 200 Centrifuge (Thermo scientifique). Le tube à centrifugeuse en

téflon a été centrifugé à 5000 rpm durant 30 minutes dans une centrifugeuse Avanti J-E (Beckman

Coulter).

Après centrifugation, le surnageant liquide a été récupéré à l’aide d’une pipette pasteur en verre

dans un ballon de volume adapté. Cette fraction sera appelée « fraction apolaire » (Figure 11) pour

tous les échantillons. Elle a été évaporée et conservée à -22°C.

27

La fraction solide restant dans le fond du tube a été solubilisée dans du méthanol à l’aide du bain

à ultrason et ensuite remise dans le ballon utilisé pour l’extraction Soxhlet (ceci a été fait afin de

limiter les pertes, car une partie de la fraction polaire restait souvent collée à la paroi du ballon).

Pour les extractions de grandes échelles, le méthanol a été évaporé et ensuite cette fraction, qui

sera appelée « Fraction polaire » (Figure 11), a été conservée à – 22°C.

Pour les extractions de petites échelles (Soxhlet de 30 mL), une faible fraction restait insoluble.

Ce mélange a alors été à nouveau centrifugé dans un tube à essai à 3000 rpm durant 10 minutes dans

une centrifugeuse Heraeus Labofuge 200 Centrifuge (Thermo scientifique).

Le surnageant a alors été prélevé, et le méthanol a été évaporé. Cette fraction sera appelée « Fraction

méthanol » (Figure 11).

La fraction solide restante a ensuite été solubilisée dans de l’eau distillée toujours à l’aide du bain à

ultrason. L’eau a ensuite été évaporée et cette fraction sera appelée « Fraction aqueuse » (Figure 11).

5.2.2. Chromatographie liquide à haute performance (analytique et préparative) La chromatographie liquide à haute performance (HPLC) permet de séparer les différents

composants d’un échantillon. Deux appareils ont été utilisés lors de ce travail, mais le principe reste

le même dans les deux cas. L’échantillon en solution à une concentration donnée en fonction de la

colonne utilisée a été filtré à l’aide d’un filtre (0.22 µm) et injecté. Ensuite, un gradient de solvant a

été déterminé afin d’optimiser la séparation des pics. Le détecteur a été dans les deux cas un

Extrait sec soxhlet + dichloromethane

centrifugation

Surnageant liquide : “fraction apolaire”

Culot solide : “fraction polaire” + méthanol

centrifugation

Surnageant liquide : “fraction méthanol”

Culot solide : “fraction aqueuse”

Figure 11. Schéma des fractionnements par centrifugation des extraits de plantes obtenus par la technique du Soxhlet

28

détecteur permettant d’analyser des longueurs d’onde dans l’ultraviolet (Multi Wave detector pour

l’analytique, DAD pour la preparative).

Les deux appareils sont munis d’une fonction « récolte », ce qui a permis de récupérer les

fractions d’intérêt.

La différence entre les deux appareils a été le volume des échantillons injectés.

L’HPLC Hewlett-Packard Agilent 1200 est utilisée pour de faibles quantités (injection de 10 µL

d’échantillon concentré 10 mg/mL) alors que l’HPLC PuriFlash 430 Interchim est utilisée pour de

plus grandes quantités (injection de 2 mL d’échantillon concentré à 100 mg/mL).

Les fractions polaires le L. chinensis et L. guineensis ont été séparées à plusieurs reprises par ces

techniques HPLC. L’optimisation des différents gradients de solvant sera présentée dans les résultats.

Pour L. chinensis, les colonnes utilisées en HPLC analytique ont été la « Inertsil® ODS-2 C18

(5 µm 2,1x250 mm, GL Sciences) » et la « Uptisphere strategy C8-2 (5µm 4x250mm, Interchrom) ».

Les colonnes utilisées en HPLC préparative ont été la « Uptisphere Strategy C18-2 prep column (5

µm-250x21,2 mm, Interchrom) », la « Strategy C8-2 prep column (5 µm 21,2x150 mm,

Interchrom) » et la « protein C4 214TP1022™ (Vydac) ». Les solvants d’élutions utilisés dans les

deux cas ont été l’acetonitrile, l’eau à 0.01 % d’acide trifluoroacétique et l’eau à 2 % d’acide

acétique.

Pour L. guineensis, la colonne utilisée en HPLC analytique fut la Inertsil® ODS-2 C18 (5 µm

2,1x250 mm, GL Sciences) et en HPLC préparative la Uptisphere Strategy C18-2 prep column

(5 µm-250x21,2 mm, Interchrom). Les solvants d’élution dans ces cas-ci furent le méthanol et l’eau

à 2 % d’acide acétique.

5.2.3. Colonne de silice ouverte Les fractions apolaires de L. chinensis et L. guineensis ont été séparées sur colonne de silice

ouverte.

Dans les deux cas, une colonne de 500x30 mm a été utilisée.

La phase fixe a été préparée avec 15 g de silice Silicagel 60 (Merck) solubilisés dans 45 mL de

dichlorométhane. Les échantillons ont été solubilisés dans un dichlorométhane à une concentration

29

de 20 mg/mL. La colonne a ensuite été conditionnée avec 50 mL de dichlorométhane HPLC grade

(Sharlau). 10 mL de la solution d’échantillon sont alors déposés sur la colonne.

L’optimisation des différents gradients de Dichloromtéhane:Méthanol et Hexane:Acétate d’éthyle

sera présentée dans les résultats.

5.3. Mesure des activités biologiques par spectrophotométrie UV-VIS Les trois activités biologiques ciblées ont été évaluées par des tests enzymatiques requérant des

mesures spectrophotométriques.

L’appareil utilisé est un spectrophotomètre UV visible double faisceau Ultrospec 9000

(Biochrom). Celui-ci a été muni d’un PCB 1500 Water peltier system qui a permis de régler

l’enceinte de mesure sur 35°C pour toutes les analyses. Cette température a été choisie en tenant

compte de la température corporelle, puisque ce sera celle des applications cosmétiques visées.

Étant donné les différentes longueurs d’onde d’analyses, des cuvettes spectrophotométriques en

quartz de 1,4 mL ont été utilisées (Hellma Suprasil® quartz absorption cuvette, Sigma-Aldrich).

Il a été défini de façon arbitraire que le « témoin positif » serait l’échantillon dans lequel la

réaction étudiée est inhibée et que le « témoin négatif » serait l’échantillon dans lequel la réaction

étudiée a bien lieu.

Toutes les mesures ont été réalisées en trois répétitions.

5.3.1. Mesure de l’activité anti-inflammatoire

Principe

L’activité anti-inflammatoire a été évaluée par une mesure de l’inhibition de l’enzyme catalysant

la réaction inflammatoire : la lipoxygénase (EC.1.11.13.12). Cette mesure se base sur l’apparition

des hydroperoxydes (HPOD) ayant des doubles liaisons conjuguées qui absorbent à 234 nm. Lorsque

la réaction est inhibée, les HPOD ne sont pas synthétisés et l’absorbance n’augmente pas.

Réactifs

Les réactifs utilisés étant sensibles à la chaleur, ils sont conservés dans un bain de glace durant

les analyses.

L’enzyme lipoxygenase de Glycine max (soybean) (Sigma-aldricht) est en concentration de

0,1 mg/mL.

30

Le substrat de la réaction est l’acide linoléique3.

Le milieu est la solution de borate 0,1 M pH 9,5 (Merck). Celui-ci est oxygéné en faisant buller

de l’oxygène gazeux durant 30 minutes puisque l’O2 est un cosubstrat de l’enzyme.

Le NDGA et la quercetin sont deux inhibiteurs de la LOX qui ont été testés pour être utilisés

comme témoin négatif de ce test. Cependant, quelque soit le solvant utilisé pour les solubilisés, ils

ont tous deux une absorbance supérieure à 1 lors des mesures à 234 nm. De ce fait le témoin

« négatif » (réaction inhibée) n’a pas pu être réalisé, et a été remplacé par une cuvette contenant toute

la réaction excepté l’acide linoléique. De ce fait, la réaction n’avait pas lieu. Le témoin « positif »

(réaction non inhibée) est réalisé en utilisant la solution de borate 0,1 M pH 9,5 (Merck) comme

échantillon.

Afin d’être analysées, les fractions polaires ont été solubilisées dans de l’eau distillée tandis que

les échantillons apolaires ont été solubilisés dans du 2-propanol reagent grade (Scharlau). Des

dilutions allant de 10-1 à 10- 3 ont été faites dans la solution borate 0,1 M pH 9,5 (Merck).

Analyse

Pour commencer, 100 µL d’échantillon4, 35 µL de lipoxygénase et 800 µL de la solution de

borate (oxygéné au préalable durant 30 minutes) ont été mis dans la cuvette. Ce mélange a incubé

durant 15 minutes. Ensuite 35 µL d’acide linoléique ont été ajoutés, ceci a été suivi d’une agitation

rapide par retournement de la cuvette et la mesure est démarrée directement.

Une mesure cinétique sur une période de 5 minutes à 234 nm a été effectuée. Durant cette

période, une mesure a été prise toutes les 20 secondes.

5.3.2. Mesure de l’activité antityrosinase

Principe

La mesure de l’activité anti-tyrosinase a été évaluée par une mesure de l’inhibition de l’enzyme

tyrosinase (EC 1.14.18.1).

Au départ de L-DOPA, la tyrosinase synthétise du dopachrome qui sera détecté à 475 nm.

Réactifs

Les réactifs utilisés étant sensibles à la chaleur, ils sont conservés dans un bain de glace durant la

3 Dans un petit bécher, peser 140 mg d’acide linoléique et 18 mg de tween 80. Ajouter 5 mL d’eau désoxygénée et mélanger vigoureusement pendant 5 minutes (faire une émulsion). Transvaser dans un ballon jauger de 50 mL et porter au trait avec de l’eau désoxygénée. 4 Le terme « échantillon » a été utilisé dans ce cas pour le témoin positif, le témoin négatif ou l’analyte lui-même, en fonction du cas.

31

durée des analyses.

L’enzyme tyrosinase (de champignons, Sigma-aldrich) est en concentration de 625 U/mL de

K3PO4 0,05M pH 6,5 (UCB).

Le substrat de la réaction est la L-DOPA 1mM H2O (Sigma-aldricht).

Le milieu est un tampon K3PO4 0,05M pH 6,5 (UCB) qui sera oxygéné par de l’oxygène gazeux

durant une demi-heure puisque l’O2 est un cosubstrat de l’enzyme.

L’inhibiteur choisi comme « témoin positif » est l’acide kojic 1mM H2O (Nutritional

biochemicals corporation) alors que le tampon K3PO4 0,05M pH 6,5 (UCB) a été utilisé comme

échantillon pour le « témoin négatif ».

Les fractions polaires ont été solubilisées dans de l’éthanol tandis que les fractions apolaires ont

été solubilisées dans du Dimethyl sulfoxide (Scharlau). Les dilutions allant de 10-1 à 10- 2 ont été

faites dans le tampon K3PO4 0,05M pH 6,5 (UCB).

Analyse

Pour commencer, 100 µL d’échantillon5, 50 µL de tyrosinase et 250 µL de tampon K3PO4

0,05M pH 6,5, (UCB) oxygéné ont été mis dans la cuvette. Ce mélange a incubé durant 15 minutes.

Ensuite 400 µL de L-DOPA 1mM H2O (Sigma-aldricht) ont été ajoutés, ceci a été suivi d’une

agitation rapide par retournement de la cuvette et la mesure directement.

Une mesure cinétique sur une période de 5 minutes à 475 nm a été effectuée. Durant cette

période, une mesure a été prise toutes les 15 secondes.

5.3.3. Mesure de l’activité antiradicalaire

Principe

L’évaluation de l’activité antiradicalaire a été faite à l’aide du test au DPPH. Ce test a été

effectué par une mesure ponctuelle de l’absorbance à 517 nm. Le DPPH est mauve lorsqu’il est

oxydé (état naturel, composé de radicaux libres stables) et devient transparent-jaune lorsqu’il est

réduit (en présence d’antioxydant).

Réactifs

Le DPPH (Sigma-Aldricht) est préparé à une concentration de 2.10-4 M dans du méthanol

technique (VWR). Celui-ci sera ensuite conservé dans le noir à 4°C (sensibilité à la chaleur et à la

lumière). 5 Le terme « échantillon » a été utilisé dans ce cas pour le témoin positif, le témoin négatif ou l’analyte lui-même, en fonction du cas.

32

L’inhibiteur utilisé comme « témoin positif » a été le Trolox 2.10-3 M (Sigma-Aldricht) dans du

méthanol technique (VWR), tandis que le « témoin négatif » a été réalisé avec du méthanol

technique (VWR) comme échantillon.

Les fractions polaires ont été solubilisées dans du méthanol technique (VWR) alors que les

fractions apolaires ont été solubilisées dans la plus petite quantité d’acétate d’éthyle HPLC grade

(Scharlau) possible. Les dilutions 10-1 et 10-2 ont été faites du méthanol technique (VWR).

Analyse

Dans la cuvette, 500 µL d’échantillon6 ont été mélangés avec 500 µL de DPPH 2.10-4 M (Sigma-

Aldricht).

Une mesure ponctuelle à 517 nm a été effectuée après 30 minutes d’incubation.

5.3.4. Analyses statistiques

Pour tous les résultats de mesure d’activité biologique, une analyse de variance à un facteur

(« one-way ANOVA ») a été effectuée afin de déterminer les fractions à sélectionner dans un groupe.

Ces analyses ont été faites à l’aide du programme Minitab.

Pour utiliser cette technique, il a fallu d’abord vérifier que le paramètre étudié suit une

distribution normale et que les variances des populations sont égales. De plus, les échantillons ont été

prélevés de façon aléatoire et indépendante. Pour toutes les analyses, 3 répétitions ont été effectuées

(n=3). Ceci est en dessous de la norme (n>10) pour vérifier la normalité d’une population, mais cela

a été considéré comme représentatif pour le cas ici présent.

Ensuite, les hypothèses du test d’égalité des moyennes seront H0 : toutes les moyennes sont

égales, H1 : une des moyennes est différente des autres.

Le facteur a de significativiter a été fixé à 0,05. Lorsque l’hypothèse nulle du test d’égalité de

moyennes a été rejetée, une structuration des moyennes a été réalisée à l’aide d’un test de Fisher.

Dans tous les cas, l’hypothèse nulle est acceptée si la p-valeur est supérieure à 0,05 et rejetée dans le

cas contraire.

6 Le terme « échantillon » a été utilisé dans ce cas pour le témoin positif, le témoin négatif ou l’analyte lui-même, en fonction du cas.

33

5.4. Identification des molécules Les molécules isolées ont été analysées par plusieurs méthodes afin de caractériser leur structure.

5.4.1. Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) Les analyses RMN H1, C13, COSY, HSQC et HMBC ont été effectuées à l’aide d’un Bruker 700

ultrashield™ équipé d’une cryosonde Bruker cryoplatform.

Les échantillons ont été solubilisés dans une flapule de 700 µL méthanol deutéré (CD3OD,

Euriso top®) avec 0,03 % de TMS comme référence interne, à une concentration d’environ

exactement 10 mg/700µL.

Paramètres d’analyse :

Proton : 16 scans

Carbone : 4000 scans

COSY : 1 scans

HSQC : 2 scans

HMBC : 8 scans

Les spectres RMN ont ensuite été analysés à l’aide du programme MestReNova.

34

6. Résultats et discussion Les résultats seront divisés en deux grandes parties : la première partie concernera le

fractionnement et les mesures d’activités biologiques tandis que la deuxième partie concernera

l’analyse structurale d’une molécule active isolée.

Ainsi dans un premier temps, les différents fractionnements et leurs activités biologiques vont

être présentés pour chaque plante. Ceux-ci seront accompagnés de données statistiques qui ont

permis de sélectionner les fractions dites « intéressantes », qui sont en réalité celles qui sont

significativement plus actives que les autres. De plus, les méthodes de séparations optimisées ayant

mené à ces fractions seront détaillées. Cette première partie sera également constituée de la

détermination de l’IC507 de la molécule active isolée. Ensuite, certains rendements d’extraction et de

fractionnement seront exposés.

Dans un second temps, la caractérisation structurale d’une molécule active sera développée par

l’analyse des spectres RMN.

6.1. Fractionnements et activités biologiques Les résultats vont être présentés selon la logique de sélection qui a été utilisée pour ce travail. De

ce fait, les fractions obtenues par centrifugation pour les trois plantes ont d’abord été comparées

l’une à l’autre pour chaque activité. Ceci a permis de sélectionner les fractions qui ont subi ensuite

des fractionnements supplémentaires. Les sous-fractions ainsi obtenues ont alors été comparées

uniquement entre elles.

De ce fait, une première partie présentera les résultats des fractions obtenues par centrifugations

pour toutes les plantes et une deuxième partie présentera les approfondissements des fractions

intéressantes pour chaque plante individuellement.

6.1.1. Fractionnement par centrifugations des trois plantes

Schéma général de fractionnement

Le schéma général de fractionnement (Figure 12) montre que trois fractions ont été obtenues par

centrifugations pour chacune des plantes.

7 Concentration de l’inhibiteur causant 50% d’inhibition

35

Les trois activités biologiques ont été testées pour chacune de ces fractions, et ont ensuite été

comparées par activité à l’aide d’une analyse de variance à un facteur (ANOVA) afin d’identifier les

fractions qui ont été approfondies. Chaque fraction d’une plante correspond à une population.

Activités antityrosinases

Pour l’activité antityrosinase, les extraits bruts issus du fractionnement par centrifugations ont

tous été dilués 10 fois. Le test de normalité de chaque population a mené à des p-valeurs supérieures

à 0,100 (Tableau 1). L’hypothèse nulle est donc acceptée, les populations sont normales. Ensuite, la

seconde condition a été vérifiée par un test d’égalité de variance. Celui-ci a également été validé par

une p-valeur de 0,815.

Suite à ces résultats, l’analyse de variance à un facteur (ANOVA) a été effectuée. Lors de celle-

ci, la p-valeur de 0,000 a entraîné un rejet de l’hypothèse nulle : les moyennes sont significativement

différentes.

De ce fait, la structuration de moyenne par le test de Fisher a été effectuée et a permis de mettre

en évidence les différences entre les moyennes : celles qui ne partagent pas la même lettre (Tableau

1) sont significativement différentes. De plus, ces lettres sont attribuées par ordre décroissant de

performance.

Extrait soxhlet

centrifugation

Fraction apolaire Fraction polaire

centrifugation

Fraction méthanol Fraction aqueuse

Figure 12. Schéma du fractionnement par centrifugation

36

Tableau 1. Activités antityrosinases des fractions obtenues par centrifugations de Persea americana (PA), Leea guineensis (LG) et Litchi chinensis (LC) et analyses statistiques

Ce résultat indique que la fraction méthanol de Leea guineensis est significativement la plus

active avec 92,4% d’inhibition (Tableau 1). Ensuite, la « fraction méthanol » et « la fraction

aqueuse » de Litchi chinensis sont significativement plus actives que les autres avec 85,1 et 85,9 %

d’inhibition respectivement (Tableau 1).

Pour l’activité antityrosinase, les fractions polaires de Leea guineensis et Litchi chinensis seront

donc sous-fractionnées.

Aucune référence bibliographique n’a été trouvée pour comparer ces résultats. Il semble que ce

soit la première fois que ces activités ont été étudiées dans ces plantes.

Activités anti-inflammatoires

Dans le cas de l’activité anti-inflammatoire, tous les échantillons ont été dilués 100 fois, car les

échantillons dilué 10 fois avaient une coloration trop importante pour ces analyses. Les activités

mesurées sont donc moins élevées, mais cela est en concordance avec cette dilution.

Le test de normalité a montré que toutes les populations étaient normales (Tableau 2) et le test

d’égalité de variance a obtenu une p-valeur de 0,898.

À nouveau, l’analyse de la variance à un facteur (ANOVA) a révélé que les moyennes étaient

significativement différentes, la p-valeur étant de 0,000.

Dilution

% Inhibition

(n=3)

Écart-type

(n=3) P-valeur Normalité Classement Fisher

PA Apolaire 10-1 0 0 >0,100 E

PA MeOH 10-1 61,1 4,88 >0,100 C

PA H2O 10-1 22,2 0,89 >0,100 D

LG Apolaire 10-1 2,5 4,30 >0,100 E

LG MeOH 10-1 92,4 0,26 >0,100 A

LG H2O 10-1 27,8 4,37 >0,100 D

LC Apolaire 10-1 3,6 6,19 >0,100 E

LC MeOH 10-1 85,1 0,69 >0,100 B

LC H2O 10-1 85,9 1,82 >0,100 B

37

La structuration des moyennes par le test de Fisher (Tableau 2) a permis de mettre en avant la

différence significative de la fraction apolaire de Litchi chinensis. En effet, celle-ci a une inhibition

de 45 % de l’activité anti-inflammatoire (Tableau 2).

Ce sera donc cette fraction apolaire de Litchi chinensis qui sera sous-fractionnée dans le but

d’isoler une molécule ayant une activité anti-inflammatoire.

Ce résultat est en concordance avec celui trouvé par Besra S. E. et al. lors de leur étude sur

l’inhibition de l’œdème induit par la carraghénane. En effet les molécules extraites à l’éther de

pétrole avaient une forte activité inhibitrice (ce qui correspond également à une fraction apolaire)

(Besra S. E. et al., 1996).

De plus, il est important de noter que la technique d’analyse utilisée ici ne permet pas de couvrir

tous les types d’inflammation possibles, puisque par exemple Falodun A. et al. avaient trouvé en

2007 lors d’un test in vivo que les extraits aqueux de feuilles de Leea guineensis avaient une

inhibition de 73% de l’inflammation (dose 400mg/Kg) (Falodun A. et al., 2007).

Adeyemi O. et al. avaient également trouvé un pouvoir anti-inflammatoire in vivo pour l’extrait

aqueux de Persea americana (Adeyemi O. et al., 2002).

Dilution

% Inhibition

(n=3)

Écart-type


PA Apolaire 10-2 22,6 9,16 >0,100 B

PA MeOH 10-2 4,3 5,46 >0,100 D

PA H2O 10-2 8,4 5,00 >0,100 C D

LG Apolaire 10-2 14,9 9,04 0,099 B C

LG MeOH 10-2 7,3 5,85 >0,100 C D

LG H2O 10-2 2,8 3,55 >0,100 D

LC Apolaire 10-2 45,0 2,80 >0,100 A

LC MeOH 10-2 9,2 4,69 >0,100 C D

LC H2O 10-2 20,0 1,42 >0,100 B

Tableau 2. Activités anti-inflammatoires des fractions obtenues par centrifugations de Persea americana (PA), Leea guineensis (LG) et Litchi chinensis (LC) et analyses statistiques

38

Activités antioxydantes

Pour le test au DPPH visant à déterminer l’activité antioxydante, les échantillons ont été dilués

10, 100 ou 1000 fois selon la coloration des échantillons bruts (Tableau 3). Les tests de normalité

des populations ont montré qu’elles étaient toutes normales (Tableau 3), et l’égalité des variances a

été acceptée par une p-valeur de 0,570.

De ce fait, l’analyse de la variance à un facteur (ANOVA) a été effectuée et l’hypothèse nulle a

été rejetée par une p-valeur de 0,000.

La structuration des moyennes par le test de Fisher ne permet pas dans ce cas de faire ressortir une

ou deux fractions (Tableau 3). En effet, dans ce cas d’activité antioxydante, les différences sont

moins marquées. Ainsi, les fractions méthanol des trois plantes, les fractions aqueuses de Persea

americana et Litchi chinensis et la fraction apolaire de Litchi chinensis sont les plus actives, mais ne

sont pas significativement différentes l’une de l’autre. Toutes ces activités antiradicalaires ont déjà

été citées dans un certain nombre de travaux (Op de Beck P. et al., 2003 ; Zhao M. et al., 2006 ;

Corral R. D. et al., 2008)

De plus, il est important de noter que le peu d’activités retrouvé dans la fraction apolaire de Leea

guineensis peut être dû à la grande dilution qui lui a été appliquée (Tableau 3). De ce fait, il a été

décidé de sous-fractionner cette fraction afin de pouvoir effectuer les analyses d’activités

antioxydantes dans de meilleures conditions.

Tableau 3. Activités antioxydantes des fractions obtenues par centrifugations de Persea americana (PA), Leea guineensis (LG) et Litchi chinensis (LC) et analyses statistiques

Dilution

% Inhibition

(n=3)

Écart-type


PA Apolaire 10-2 93,2 0,06 >0,100 B C

PA MeOH 10-2 94,7 0 >0,100 A B C

PA H2O 10-1 95,8 2,03 >0,100 A B

LG Apolaire 10-3 1,7 0,15 >0,100 D

LG MeOH 10-2 98,6 0,1 >0,100 A

LG H2O 10-1 89,9 5,31 >0,100 C

LC Apolaire 10-1 98,2 0 >0,100 A B

LC MeOH 10-2 98,7 0,23 >0,100 A

LC H2O 10-1 94,4 6,64 0,06 A B C

39

Discussion

Les résultats des analyses des séparations par centrifugations permettent une importante

première sélection des fractions d’intérêt.

En effet, les fractions polaires de Leea guineensis et de Litchi chinensis sont sélectionnées pour leurs

activités antityrosinases et antioxydantes.

Ensuite, la fraction apolaire de Litchi chinensis est sélectionnée pour ses activités anti-

inflammatoires et antioxydantes.

Pour finir, il a été décidé de sous-fractionner la fraction apolaire de Leea guineensis car celle-ci était

très riche et colorée, ce qui entravait le bon déroulement des analyses à ce stade, mais cela pouvait

révéler des sous-fractions intéressantes.

De plus, ces résultats ont montré que Persea americana possédait des activités moins importantes

que les autres plantes. Les analyses concernant cette plante s’arrêteront donc ici.

6.1.2. Approfondissement Leea guineensis


Dans le cas de Leea guineensis, le schéma général de fractionnement (Figure 13) montre que

plusieurs sous-fractionnements par chromatographie liquide ont été réalisés.

Comme il a été montré au point précédent, la fraction polaire (méthanol et eau) a été sélectionnée

pour ses activités antioxydantes et antityrosinases. De ce fait, un fractionnement par HPLC a été

établi. Celui-ci a permis d’obtenir cinq fractions distinctes dont les résultats seront discutés au

paragraphe suivant.

Ensuite, bien que les résultats de la fraction apolaire n’aient pas montré d’activités

significativement importantes, une séparation sur colonne de silice ouverte a été réalisée et a donné

10 fractions. En effet, cette fraction était très colorée et nécessitait donc d’être très diluée pour de ne

pas influencer les mesures spectrophotométriques. De ce fait, il a été décidé d’effectuer ce

fractionnement afin d’être dans de meilleures conditions pour tester les activités biologiques. Les

activités de ces sous-fractions seront également développées au paragraphe suivant. Les sous-

fractions LG A.1 et LG A.5 ont également été fractionnées par colonne de silice ouverte.

40

Activités biologiques des sous-fractions polaires et apolaires

• Sous-fractions polaires

Pour le test antioxydant, les échantillons ont tous été dilués 10 fois (Tableau 4). Les tests de

normalités des populations ont montré qu’elles étaient toutes normales (Tableau 4), et l’égalité des

variances a été acceptée par une p-valeur de 0,160.

Ensuite, l’hypothèse nulle de l’analyse de la variance à un facteur (ANOVA) a été acceptée par

une p-valeur de 0,628. Les échantillons ne sont pas significativement différents à cette concentration,

donc une analyse de ceux-ci dilués 100 fois a été effectuée pour envisager une sélection.

Extrait soxhlet

Fraction méthanol

+ Fraction eau


LG P.1 LG P.2 LG P.3 LG P.4 LG P.5 (Tableau 4, 5 et 6)

LG A.1

LG A.2

LG A.3

LG A.4

LG A.5

LG A.6

LG A.7

LG A.8

LG A.9

LG A.10 (Tableau 7)

LG A 1.1 LG A 1.2 LG A 1.3 LG A 1.4 LG A 1.5 LG A 1.6 LG A 1.7 (Tableau 8) LG A 5.1

LG A 5.2 LG A 5.3 LG A 5.4 LG A 5.5 LG A 5.6 LG A 5.7 LG A 5.8 LG A 5.9 LG A 5.10 LG A 5.11 LG A.5.12 (Tableau 9 et 10)

Figure 13. Schéma du fractionnement de Leea guineensis

41

.

La première information importante dans le Tableau 5 est que les écarts-types des échantillons

sont élevés (16,6 pour LG P.4). Ceci est probablement dû à une solubilité peu homogène dans le

solvant d’analyse. Les populations étaient toujours normales à cette dilution (Tableau 5) et le test

d’égalité de variance a à nouveau été accepté (p-valeur de 0,781).

Dans ce cas, l’analyse de la variance à un facteur (ANOVA) a mené à un rejet de l’hypothèse

nulle par une p-valeur de 0,002. Les moyennes sont significativement différentes, et la structuration

de celles-ci par le test de Fisher est visible dans le Tableau 5. Les échantillons ne partageant pas la

même lettre sont significativement différents, ce qui permet de voir que les fractions LG P.1, LG P.2

et LG P.5 sont significativement plus importantes que les autres (98,6, 89,8 et 85,2%

respectivement).

Pour ce qui est de l’activité antityrosinase, les échantillons ont été testés après avoir été dilués 10

fois (Tableau 6). À nouveau, les écarts-types sont très élevés (26,0 pour LG P.2). Il serait judicieux

ici de déterminer un solvant plus adéquat à la polarité des échantillons. Cependant, les tests de

Dilution

% Inhibition

(n=3)

Écart-type

(n=3) P-valeur Normalité

LG P.1 10-1 96,9 0,12 0,096

LG P.2 10-1 97,9 1,4 >0,100

LG P.3 10-1 97,9 0,87 >0,100

LG P.4 10-1 97,4 0,79 >0,100

LG P.5 10-1 95,6 4,2 >0,100

Tableau 4. Activités antioxydantes des sous-fractions polaires de Leea guineensis (LG P.) diluées 10 fois et analyses statistiques.

Dilution

% Inhibition

(n=3)

Écart-type


LG P.1 10-2 98,6 0,9 >0,100 A

LG P.2 10-2 89,8 16,0 >0,100 A

LG P.3 10-2 51,1 10,1 >0,100 B

LG P.4 10-2 54,5 16,6 >0,100 B

LG P.5 10-2 85,2 10,7 >0,100 A

Tableau 5. Activités antioxydantes des sous-fractions polaires de Leea guineensis (LG P.) diluées 100 fois et analyses statistiques

42

normalités ont validé l’hypothèse nulle pour toutes les populations (Tableau 6), et le test d’égalité de

variance a été accepté avec une p-valeur de 0,643.

De ce fait, l’analyse de la variance à un facteur (ANOVA) a été effectuée et a montré que les

moyennes étaient significativement différentes (p-valeur de 0,000). De ce fait, le test de Fisher a

permis de structurer les moyennes (Tableau 6), et ainsi de déterminer que la fraction LG P.1 était

significativement plus active que les autres, avec 85,5 % d’inhibition de la tyrosinase.

Les résultats des activités antioxydantes et antityrosinases permettent donc de sélectionner la

fraction LG P.1 pour un fractionnement supplémentaire puisqu’elle a les 98,6% d’inhibition du

DPPH et 85,5% de la tyrosinase (Annexe 1.1).

Ce sous-fractionnement n’a pas été fait dans le cadre de ce travail, mais il pourra être fait par

HPLC analytique aussi, probablement sur une colonne C8 vu sa faible rétention sur la colonne C18

utilisée pour ce premier fractionnement.

• Sous-fractions apolaires

La fraction apolaire a été fractionnée afin d’être dans de meilleures conditions pour effectuer les

analyses biologiques. Ici, c’est l’activité antioxydante qui a été visée.

Les sous-fractions obtenues étaient encore toutes assez riches et colorées. De ce fait elles ont été

diluées 10, 100 ou 1000 fois selon chaque cas (Tableau 7). Cependant, la fraction LG A.5 demeurait

trop riche pour obtenir des résultats utilisables. Cette fraction a donc été encore une fois sous-

fractionnée. La fraction LG A.1 a également été sous-fractionnée, car elle présentait deux phases non

miscibles.

Dilution

% Inhibition

(n=3)

Écart-type

(n=3)

P-valeur

Normalité Classement Fisher

LG P.1 10-1 85,5 1,52 >0,100 A

LG P.2 10-1 67,4 26,0 0,086 B

LG P.3 10-1 2,93 5,07 >0,100 C

LG P.4 10-1 2,14 2,60 >0,100 C

LG P.5 10-1 7,50 21,4 0,069 C

Tableau 6. Activités antityrosinases des sous-fractions polaires de Leea guineensis (LG P.) diluées 10 fois et analyses statistiques

43

Les tests de normalité des populations ont tous révélé que celles-ci étaient normales (Tableau 7),

et le test d’égalité des variances a obtenu une p-valeur de 0,172 qui a permis d’accepter l’hypothèse

nulle.

L’analyse de la variance à un facteur (ANOVA) a alors été effectuée, et a montré que les

moyennes étaient significativement différentes (p-valeur de 0,000). La structuration de moyenne par

le test de Fisher (Tableau 7) a ensuite permis de montrer que les sous-fractions LG A.2 et LG A.3

étaient significativement plus actives que les autres (84,9 et 86,2% d’inhibition respectivement). De

plus, la fraction LG A.3 était diluée 1000 fois. Cette fraction est donc très active et mérite un sous-

fractionnement supplémentaire. Celui-ci n’a pas été effectué dans le cadre de ce travail, mais il

pourra être fait sur colonne de silice ouverte à nouveau, avec un gradient d’hexane et d’acétate

d’éthyle.

• Sous-fractions LG A.1

La fraction LG A.1. a été fractionnée en 7 sous-fractions qui sont toutes des populations

normales en dilution 10 fois (Tableau 8). Le test d’égalité des variances a également été accepté par

une p-valeur de 0,813.

L’analyse de la variance à un facteur (ANOVA) a été effectuée et a montré que les moyennes

étaient significativement différentes (p-valeur = 0,000). La structuration de moyennes (Tableau 8) a

montré que la sous-fraction LG A.1.3 est significativement plus active que les autres. Cependant, on

peut voir que celle-ci a une activité de 23,4%, ce qui est bien moins élevé que l’activité de la fraction

Tableau 7. Activités antioxydantes des sous-fractions apolaires de Leea guineensis (LG A.) diluées 10, 100 ou 1000 fois et analyses statistiques

Dilution % Inhibition

(n=3)

Écart-type

(n=3)

P-valeur


LG A.1 10-1 67,2 9,61 >0,100 B

LG A.2 10-1 84,9 4,95 >0,100 A

LG A.3 10-3 86,2 0,74 >0,100 A

LG A.4 10-1 20,3 2,83 >0,100 C

LG A.5 / / / / /

LG A.6 10-2 3,55 1,18 >0,100 D

LG A.7 10-1 5,12 1,24 >0,100 D

LG A.8 10-1 4,35 3,84 >0,100 D

LG A.9 10-1 2,59 1,62 >0,100 D

LG A.10 10-1 0,113 0,195 >0,100 D

44

LG A.3 par exemple (86,2). Il n’est donc pas prioritaire d’approfondir ces sous-fractions dans le

cadre d’une recherche d’activités antioxydantes.

• Sous-fractions LG A.5

La fraction LG A.5 a été sous-fractionnée, car elle était trop riche et colorée pour permettre au

test spectrophotométrique de fonctionner correctement. Douze sous-fractions ont été obtenues par

une séparation sur colonne de silice ouverte.

Ces sous-fractions ont d’abord été diluées 10 fois (Tableau 9). Les cinq premières sous-fractions

étaient encore trop colorées pour être analysées par la technique du DPPH. Les autres sous-fractions

étaient toutes des populations normales et le test d’égalité de variance a été validé par une p-valeur

de 0,441. L’analyse de la variance à un facteur (ANOVA) a donc été réalisée, et a révélé que les

moyennes étaient significativement différentes (p-valeur de 0,000). La structuration de moyennes par

Fisher (Tableau 9) a ensuite montré que les sous-fractions LG A.5.6 et LG A.5.8 étaient

significativement plus actives que les autres, mais avec des activités de seulement 23,4 et 23,6 %

d’inhibition.

Les sous-fractions de LG A.5 ont également été analysées en dilution 100 fois afin d’essayer

d’obtenir des résultats pour toutes les sous-fractions (Tableau 10). Cependant, les sous-fractions LG

A.5.2 à LG A.5.5 demeuraient trop colorées. Le test au DPPH n’est pas vraiment adéquat pour ce

type d’échantillon. Plusieurs solutions sont à explorer, d’abord un autre test telle que la méthode

automatisée ORAC8 (Oxygen Radical Absorbance Activity) pourrait être utilisée (Ou B. et al.,

2001). Ensuite, une purification de l’échantillon visant à éliminer ces molécules colorées qui sont

8 Méthode utilisée traditionnellement pour mesurer le pouvoir antioxydant des aliments

Dilution

% Inhibition

(n=3)

Écart-type

(n=3)

P-valeur


LG A.1.1 10-1 2,26 1,31 >0,100 D E

LG A.1.2 10-1 4,47 1,57 >0,100 C D

LG A.1.3 10-1 23,4 3,03 >0,100 A

LG A.1.4 10-1 11,0 1,92 0,085 B

LG A.1.5 10-1 5,53 0,544 >0,100 C

LG A.1.6 10-1 0,833 0,732 >0,100 E

LG A.1.7 10-1 4,04 0,981 >0,100 C D

Tableau 8. Activités antioxydantes des sous-fractions de la fraction apolaire n°1 de Leea guineensis (LG A.1) diluées 10 fois et analyses statistiques

45

probablement des chlorophylles est envisageable également. Ceci peut être fait à l’aide de la

technique présentée par Iriyama K. et al. (Iriyama K. et al., 1974).

Les autres sous-fractions qui ont pu être analysées sont toutes de populations normales (Tableau

10), et le test d’égalité de variance a été accepté avec une p-valeur de 0,278.

L’analyse de la variance à un facteur (ANOVA) a permis de déterminer que les moyennes

étaient significativement différentes (p-value de 0,000). La structuration de Fisher (Tableau 10) a

alors montré que la sous-fraction LG A.5.8 est significativement plus active que les autres.

Comme pour les sous-fractions de LG A.1, ces activités demeurent moins importantes que pour

la fraction LG A.3. Il ne semble donc pas prioritaire d’approfondir les analyses antioxydantes pour

cette fraction.

Dilution

% Inhibition

(n=3)

Écart-type

(n=3) P-valeur


LG A.5.1 10-1 / / / /

LG A.5.2 10-1 / / / /

LG A.5.3 10-1 / / / /

LG A.5.4 10-1 / / / /

LG A.5.5 10-1 / / / /

LG A.5.6 10-1 23,4 0,192 >0,100 A

LG A.5.7 10-1 17,9 0,137 >0,100 B

LG A.5.8 10-1 23,6 3,52 >0,100 A

LG A.5.9 10-1 3,65 2,29 >0,100 D

LG A.5.10 10-1 3,76 2,29 0,052 D

LG A.5.11 10-1 6,39 2,30 >0,100 D

LG A.5.12 10-1 10,3 0,594 >0,100 C


46

Optimisations des séparations chromatographiques

• HPLC analytique de la fraction polaire

La mise au point de la séparation par HPLC a d’abord été effectuée sur l’HPLC analytique. La

colonne utilisée est l’Inertsil® ODS-2 C18 (5 µm 2,1x250 mm, GL Sciences). Un gradient de

méthanol et H2O+ 2%HAc a été optimisé (Tableau 11). Le volume d’injection était de 10 µL pour un

échantillon concentré à 10 mg/mL. La longueur d’onde du détecteur a été fixée à 280nm.

Temps (min) Méthanol (%) H2O + 2%HAc (%)

0 1 99 4 1 99 5 5 95 7 5 95 9 28 72 19 32 68 21 40 60 31 40 60 33 55 45 43 55 45

Dilution

% Inhibition

(n=3)

Écart-type

(n=3)

P-valeur


LG A.5.1 10-2 2,80 0,152 >0,100 D E

LG A.5.2 10-2 / / / /

LG A.5.3 10-2 / / / /

LG A.5.4 10-2 / / / /

LG A.5.5 10-2 / / / /

LG A.5.6 10-2 6,00 1,90 >0,100 B

LG A.5.7 10-2 5,27 0,04 >0,100 B C

LG A.5.8 10-2 17,6 0,159 >0,100 A

LG A.5.9 10-2 2,07 1,71 0,059 E

LG A.5.10 10-2 2,13 0,130 >0,100 E

LG A.5.11 10-2 4,06 0,153 >0,100 C D

LG A.5.12 10-2 5,42 0,105 >0,100 B C


47

48 100 0 58 100 0 62 1 99 64 1 99

Tableau 11. Gradient de solvant utilisé pour la séparation par HPLC de la fraction polaire de Leea guineensis

Le chromatogramme obtenu (Figure 14) contient un premier grand pic avec un temps de

rétention de 2’34’’, suivi de quatre autres pics moins intenses et beaucoup plus larges (28’56’’,

36’28’’, 46’37’’, 56’21’’). Il est évident sur ce graphe qu’un grand nombre de molécules sont

présentes dans l’échantillon. Cette richesse rend alors difficile d’avoir à ce stade des pics

correctement séparés et résolus. De ce fait, il a été choisi de procéder par plusieurs séparations

successives, et cette première séparation en cinq fractions fut conservée et transposée en HPLC

préparative.

Figure 14. Chromatogramme de la fraction polaire de Leea guineensis (LG P.) obtenu par HPLC analytique avec un détecteur à 280 nm.

48

• HPLC préparative pour la fraction polaire

Le gradient de solvant a été adapté à l’aide du logiciel « HPLC calculator V3.0 ». Le résultat

obtenu était quasi identique, donc le gradient utilisé fut le même que celui utilisé pour l’HPLC

analytique (Tableau 11).

La colonne qui a été utilisée est la Uptisphere Strategy C18-2 prep column (5 µm-250x21,2 mm,

Interchrom). Le volume injecté était de 2 mL pour un échantillon concentré à 100 mg/mL.

Lors de l’HPLC préparative, les 5 fractions identifiées (Figure 15) ont été récoltées. Ce

fractionnement avec récolte a ensuite été réalisé en 3 répétitions.

Figure 15. Chromatogramme de la fraction polaire de Leea guineensis (LG P.) obtenu par HPLC préparative avec un détecteur à 280nm

• Colonne ouverte de silice pour la fraction apolaire

- Fraction LG A.

L’échantillon déposé sur la colonne avait un volume de 10 mL et une concentration de

20 mg/mL. Il a été solubilisé dans du dichlorométhane. Un gradient de dichlorométhane et méthanol

a été utilisé (Tableau 12). 10 fractions de 25 mL ont été récoltées.

LG P.1

LG P.2

LG P.3 LG P.4

LG P.5

49

Volume (mL) Dichlorométhane (%) Méthanol (%)

50 95 5 50 85 15 50 75 25 50 65 35 50 50 50

Tableau 12. Gradient de solvant de la séparation sur colonne de silice ouverte de la fraction apolaire de Leea guineensis

- Fraction LG A.1

Pour le sous-fractionnement de la fraction apolaire 1, un gradient d’hexane et d’acétate d’éthyle a

été utilisé (Tableau 13). 7 fractions de 25 mL ont été récupérées.

L’échantillon posé avait un volume de 5 mL à une concentration de 20 mg/mL, solubilisé dans de

l’hexane.

Volume (mL) Hexane (%) Acétate d’éthyle (%)

50 60 40 50 55 45 50 50 50 25 45 55

Tableau 13. Gradient de solvant de la séparation sur colonne de silice ouverte de la fraction apolaire 1 de Leea guineensis

- Fraction LG A.5

Pour le sous-fractionnement de la fraction apolaire 5, un gradient d’hexane et d’acétate d’éthyle a

été utilisé (Tableau 14). 12 fractions de 25 mL ont été récupérées

L’échantillon posé avait un volume de 5mL a une concentration de 20mg/mL, solubilisé dans de

l’hexane.

Volume (mL) Hexane (%) Acétate d’éthyle (%)

50 70 30 50 65 35 50 60 40 50 55 45 50 50 50 50 45 55

Tableau 14. Gradient de solvant de la séparation sur colonne de silice ouverte de la fraction apolaire 5 de Leea guineensis

50

Extrait soxhlet

Fraction méthanol

+ Fraction eau


LC A.1 LC A.2 LC A.3 LC A.4 (Tableau 15, 16 et 17)

LC P.1 LC P.2 LC P.3 LC P.4 LC P.5 LC P.6 LC P.7 LC P.8 LC P.9 LC P.10 LC P.11 LC P.12 LC P.13 LC P.14 LC P.15 LC P.16 LC P.17 (Tableau 18, 19 et 20)

LC P.10.1 LC P.10.2 LC P.10.3 LC P.10.4 LC P.10.5 (Tableau 21)

LC P.10.3.1 LC P.10.3.2 LC P.10.3.3 LC P.10.3.4 LC P.10.3.5 (Tableau 22 et 23)

RMN

6.1.3. Approfondissement Litchi chinensis


Les racines de Litchi chinensis sont les extraits qui ont été les plus étudiés dans le cadre de ce

travail. Les résultats très intéressants quant à l’activité antityrosinase ont entraîné la décision de se

focaliser sur la fraction polaire. Ainsi, plusieurs fractionnements successifs par HPLC ont abouti en

une molécule quasi pure. Le schéma général de fractionnement (Figure 16) présente de façon

synthétique tous les fractionnements qui ont été opérés sur cette plante.

Figure 16. Schéma général du fractionnement de Litchi chinensis

51

Les séparations de la fraction polaire ont toutes eu lieu par HPLC tandis que la séparation de la

fraction apolaire a été réalisée à l’aide d’une colonne de silice ouverte.

Résultats des analyses des activités biologiques des sous-fractions polaires et apolaires

• Sous-fractions apolaires

Les sous-fractions apolaires ont été étudiées pour une activité antioxydante et anti-

inflammatoire.

Pour commencer, elles ont été diluées 10 fois afin d’être analysées pour une activité

antioxydante. Toutes les populations ainsi obtenues étaient normales (Tableau 15) et le test d’égalité

de variance a été accepté par une p-valeur de 0,398. L’analyse de la variance à un facteur (ANOVA)

a ensuite permis d’accepter l’hypothèse nulle (p-valeur de 0,079). Les moyennes n’étant donc pas

significativement différentes, une analyse à une dilution 100 fois a été effectuée.

Il est important de noter que les écarts-types des quatre fractions sont très élevés (Tableau 15).

La séparation est encore à optimiser afin d’obtenir une meilleure répétabilité.

Les populations diluées 100 fois furent toujours normales (Tableau 16) et le test d’égalité de

variance accepté par une p-valeur de 0,866. Ensuite, l’analyse de la variance à un facteur (ANOVA)

a permis de déterminer que la fraction LC A.1 est significativement plus active que les autres avec

56,1% d’inhibition, (Tableau 16). Cependant, il sera tout de même important d’optimiser cette

séparation avant d’envisager de sous-fractionner l’une des fractions.

Dilution

% Inhibition

(n=3)

Écart-type

(n=3)

P-valeur

Normalité

LC A.1 10-1 83,4 7,94 >0,100

LC A.2 10-1 83,9 10,5 >0,100

LC A.3 10-1 58,5 32,6 >0,100

LC A.4 10-1 38,6 22,5 >0,100

Tableau 15. Activités antioxydantes des sous-fractions apolaires de Litchi chinensis (LC A.) diluées 10 fois et analyses statistiques

Tableau 16. Activités antioxydantes des sous-fractions apolaires de Litchi chinensis (LC A.) diluées 100 fois et analyses statistiques

Dilution

% Inhibition

(n=3)

Écart-type

(n=3)

P-valeur


LC A.1 10-2 56,1 20,2 >0,100 A

LC A.2 10-2 19,8 9,92 >0,100 B

LC A.3 10-2 8,64 8,94 >0,100 B

LC A.4 10-2 15,5 21,7 0,097 B

52

L’activité anti-inflammatoire était également ciblée pour ces sous-fractions apolaires. Pour la

mesurer, les échantillons ont été dilués 10 fois. Les populations ainsi obtenues étaient toutes

normales exceptée la LC A.2 (Tableau 17). Ceci reflète à nouveau la nécessité d’optimiser cette

séparation avant de procéder à des sous-fractionnements supplémentaires.

Le test d’égalité des variances a néanmoins été réalisé et accepté par une p-valeur de 0,452, et

l’analyse de la variance à un facteur (ANOVA) a montré que les moyennes étaient significativement

différentes (p-valeur de 0,029) et que la fraction LC A.1 était significativement plus active que les

autres (Tableau 17) avec 99% d’inhibition de la lipoxygénase (Annexe 1.3).

Cette fraction semble donc contenir les molécules actives de l’échantillon, celles-ci sont donc

plutôt fortement apolaires. L’optimisation du fractionnement permettra de le confirmer.

• Sous-fractions polaires

Les sous-fractions polaires ont été testées pour des activités antioxydantes et antityrosinases.

Tout d’abord, elles ont été diluées 10 fois afin d’effectuer l’analyse de l’activité antioxydante. Dans

ce cas, toutes les populations étaient normales (Tableau 18) et le test d’égalité des variances a été

accepté par une p-valeur de 0,548. L’analyse de la variance à un facteur (ANOVA) a alors été

réalisée, et a révélé que les moyennes étaient significativement différentes (p-valeur de 0,000). Pour

finir, le classement de Fisher (Tableau 18) a permis d’affirmer que les fractions LC P.1, LC P.5, LC

P.6, LC P.8, LC P.9, LC P.10, LC P.11, LC P.13 étaient significativement plus actives que les autres.

Cette dilution ne permet donc pas de faire une sélection efficace puisque 8 fractions sur 17 ne sont

significativement pas différentes. De ce fait, l’analyse a également été effectuée sur des dilutions 100

fois.

Dilution % Inhibition

(n=3)

Écart-type

(n=3)

P-valeur


LC A.1 10-1 99,0 1,0 >0,100 A

LC A.2 10-1 21,9 8,97 0,043 B

LC A.3 10-1 19,9 9,40 >0,100 B

LC A.4 10-1 26,1 15,3 >0,100 B

Tableau 17. Activités anti-inflammatoires des sous-fractions apolaires de Litchi chinensis (LC A.) diluées 10 fois et analyses statistiques

53

Ces populations diluées 100 fois étaient également toutes normales (Tableau 19) et le test

d’égalité des variances a été accepté par une p-valeur de 0,530.

L’analyse de la variance à un facteur (ANOVA) a ensuite permis de confirmer que les moyennes

étaient significativement différentes (p-valeur de 0,000) et le classement de Fisher a permis d’affiner

le classement de celles-ci (Tableau 19).

En effet la fraction LC P.9 n’est pas significativement différente de LC P.1, LC P.7, LC P.8, LC

P.10, LC P.11, LC P.13 et LC P.14, mais elle est la seule à être significativement différente des

autres fractions. Celle-ci est donc la plus active avec 98,8% d’inhibition.

Dilution

% Inhibition

(n=3)

Écart-type

(n=3)

P-valeur


LC P.1 10-1 98,2 0,705 >0,100 A

LC P.2 10-1 86,8 2,36 >0,100 D

LC P.3 10-1 87,8 3,16 >0,100 D

LC P.4 10-1 69,1 2,63 >0,100 E

LC P.5 10-1 97,8 0,211 >0,100 A

LC P.6 10-1 97,1 0,370 >0,100 A

LC P.7 10-1 86,7 2,47 >0,100 D

LC P.8 10-1 98,1 0,369 >0,100 A

LC P.9 10-1 98,4 1,11 >0,100 A

LC P.10 10-1 97,8 0,149 >0,100 A

LC P.11 10-1 97,4 0,220 >0,100 A

LC P.12 10-1 62,0 2,96 >0,100 F

LC P.13 10-1 96,1 0,072 >0,100 A B

LC P.14 10-1 92,9 0,379 >0,100 B C

LC P.15 10-1 92,3 0,142 >0,100 C

LC P.16 10-1 86,0 2,09 >0,100 D

LC P.17 10-1 51,2 4,48 >0,100 G

Tableau 18. Activités antioxydantes des sous-fractions polaires de Litchi chinensis (LC P.) diluées 10 fois et analyses statistiques

54

Dans un deuxième temps, l’activité antityrosinase a été testée en diluant 10 fois les échantillons.

Les populations restèrent toujours normales (Tableau 20) et le test d’égalité des variances a été

validé par une p-valeur de 0,574. L’analyse de la variance à un facteur (ANOVA) a ensuite permis

d’affirmer que les moyennes sont significativement différentes (p-valeur de 0,000) et la structuration

de moyennes par Fisher (Tableau 20) indique que les fractions LC P.7 et LC P.10 ne sont pas

significativement différentes, mais que LC P.10 est significativement plus active que toutes les autres

fractions.

La fraction LC P.10 semble donc fortement intéressante puisqu’elle possède la plus grande

activité antityrosinase, et qu’elle fait partie des fractions les plus antioxydantes. De ce fait, elle est

sélectionnée pour un sous-fractionnement supplémentaire.

Dilution

% Inhibition

(n=3)

Écart-type

(n=3)

P-valeur


LC P.1 10-2 97,7 0,532 >0,100 A B

LC P.2 10-2 59,6 5,16 >0,100 E

LC P.3 10-2 56,8 7,05 >0,100 E F

LC P.4 10-2 3,43 1,76 >0,100 H

LC P.5 10-2 91,2 4,40 >0,100 B C D

LC P.6 10-2 50,8 3,75 >0,100 F

LC P.7 10-2 96,4 0,744 0,054 A B C D

LC P.8 10-2 95,6 0,401 >0,100 A B C D

LC P.9 10-2 98,8 0,551 >0,100 A

LC P.10 10-2 97,1 0,719 >0,100 A B C

LC P.11 10-2 97,5 0,659 >0,100 A B C

LC P.12 10-2 22,1 5,35 >0,100 G

LC P.13 10-2 97,5 0,329 >0,100 A B C

LC P.14 10-2 96,8 0,640 >0,100 A B C

LC P.15 10-2 90,0 9,19 >0,100 D

LC P.16 10-2 89,0 9,91 >0,100 C D

LC P.17 10-2 16,9 4,39 >0,100 G

Tableau 19. Activités antioxydantes des sous-fractions polaires de Litchi chinensis (LC P.) diluées 100 fois et analyses statistiques

55

• Sous-fractions LC P.10

Seule l’activité antityrosinase a été mesurée sur les sous-fractions de LC P.10 afin de préserver

les échantillons qui étaient disponibles en faible quantité.

Les sous-fractions ont alors été diluées 10 fois, ce qui a donné des populations normales

(Tableau 21) et dont l’égalité des variances a été avérée par une p-valeur de 0,770.

L’analyse de la variance à un facteur (ANOVA) a révélé que les moyennes étaient

significativement différentes (p-valeur de 0,000), et la structuration de moyennes de Fisher (Tableau

21) a permis de montrer que la fraction LC P.10.3 était significativement plus active que les autres.

De ce fait, cette fraction LC P.10.3 a été sélectionnée pour un sous-fractionnement

supplémentaire.

Dilution

% Inhibition

(n=3)

Écart-type

(n=3)

P-valeur


LC P.1 10-1 37,4 3,69 >0,100 E

LC P.2 10-1 12,7 8,75 >0,100 G H

LC P.3 10-1 11,0 1,74 >0,100 H

LC P.4 10-1 20,8 15,7 0,052 F G

LC P.5 10-1 28,6 7,30 >0,100 E F

LC P.6 10-1 0,03 0,06 >0,100 I

LC P.7 10-1 78,6 0,739 >0,100 A B

LC P.8 10-1 76,9 5,42 >0,100 B

LC P.9 10-1 55,2 1,32 >0,100 D

LC P.10 10-1 87,4 0,854 >0,100 A

LC P.11 10-1 65,2 1,16 >0,100 C

LC P.12 10-1 6,35 1,07 >0,100 H I

LC P.13 10-1 35,8 4,45 >0,100 E

LC P.14 10-1 77,2 0,187 >0,100 B

LC P.15 10-1 75,6 2,32 >0,100 B

LC P.16 10-1 28,1 1,71 >0,100 E F

LC P.17 10-1 0,00 0,00 >0,100 I

Tableau 20. Activités antityrosinases des sous-fractions polaires de Litchi chinensis (LC P.) diluées 10 fois et analyses statistiques

56

• Sous-fractions LC P.10.3

Les sous-fractions de LC P.10.3 ont été testées pour leur activité antioxydante et antityrosinase.

Pour la première, les échantillons ont été dilués 10 fois. Ceci a mené à des populations normales

(Tableau 22), et dont l’égalité des variances a été respectée (p-valeur de 0,790).

L’analyse de la variance à un facteur (ANOVA) a permis de déterminer que les moyennes

étaient significativement différentes et la structuration des moyennes par Fisher (Tableau 22) a

montré que la fraction LC P.10.3.3 était significativement plus active que les autres avec 72,6%

d’inhibition.

L’analyse de l’activité antityrosinase a également été menée sur des échantillons dilués 10 fois.

Ceux-ci étaient toujours des populations normales (Tableau 23) dont les variances étaient égales (p-

valeur de 0,224).

L’analyse de la variance à un facteur (ANOVA) a ensuite indiqué que les moyennes n’étaient

pas significativement différentes (p-valeur de 0,146).

Dilution

% Inhibition

(n=3)

Écart-type

(n=3)

P-valeur


LC P.10.1 10-1 35,8 4,45 >0,100 D

LC P.10.2 10-1 57,1 0,895 >0,100 B

LC P.10.3 10-1 82,4 0,874 >0,100 A

LC P.10.4 10-1 52,5 3,35 >0,100 B C

LC P.10.5 10-1 51,9 3,14 >0,100 C

Tableau 21. Activités antityrosinases des sous-fractions de la fraction polaire 10 de Litchi chinensis (LC P.10.) diluées 10 fois et analyses statistiques

Dilution

% Inhibition

(n=3)

Écart-type

(n=3)

P-valeur


LC P.10.3.1 10-1 28,6 13,2 >0,100 B

LC P.10.3.2 10-1 18,0 5,07 >0,100 B

LC P.10.3.3 10-1 72,6 10,19 >0,100 A

LC P.10.3.4 10-1 35,3 22,7 >0,100 B

LC P.10.3.5 10-1 32,0 15,28 >0,100 B

Tableau 22. Activités antioxydantes des sous-fractions de la fraction polaire 10.3 de Litchi chinensis (LC P.10.3.) diluées 10 fois et analyses statistiques

57

Ceci est dû au fait que les échantillons étaient faiblement concentrés, mais on peut voir tout de

même qu’une activité semble être présente dans la fraction LC P.10.3.3 puisqu’elle a une inhibition

proche de 10 % dans cette concentration.

À la vue de ces résultats et de ceux de l’activité antioxydante, il a été décidé de récolter en masse

cette fraction LC P.10.3.3 afin d’en calculer l’IC50 pour l’activité antityrosinase et d’effectuer des

analyses structurales par spectrométrie RMN.

• Calcul de l’IC50 de la fraction LC P.10.3.3 pour l’activité antityrosinase

La mesure de l’absorbance a été réalisée sur trois échantillons de concentration différente

(Annexe 1.2). Ensuite, ces résultats ont permis de dessiner une courbe d’inhibition (Figure 17). Sur

cette courbe, l’IC50 a été identifié graphiquement. Il s’agit de la concentration indiquée par la courbe

lorsque l’inhibition est à 50% : IC50 = 11,8 mg/mL.

Ce résultat peut être comparé à celui de l’inhibiteur de référence, l’acide Kojic.

En effet, l’acide Kojic a un IC50 allant de 0,00142 mg/mL à 0,04263 mg/mL (Neeley E. et al.,

2009). L’IC50 de la fraction LC P.10.3.3 est donc 200 à 10 000 fois plus faible que celui de

l’inhibiteur témoin. Néanmoins, il sera expliqué au paragraphe 6.3 que les échantillons analysés

semblent moins concentrés en la molécule active que ce qu’il a été pesé. De grandes traces des

solvants d’élutions restent présentes dans l’échantillon qui était considéré comme « sec », ce qui

fausse la pesée effectuée.

De plus, les échantillons étant créés par un grand nombre répétitions de la récolte par HPLC

analytique, ceux-ci sont sujets à beaucoup de contaminations et pertes dues aux manipulations.

Il est donc certain que la fraction LC P.10.3.3 contient une molécule active quant à l’activité

antityrosinase, mais l’IC50 calculé ici est probablement surestimé.

Dilution

% Inhibition

(n=3)

Écart-type

(n=3)

P-valeur

Normalité

LC P.10.3.1 10-1 0,0 0,0 >0,100

LC P.10.3.2 10-1 0,0 0,0 >0,100

LC P.10.3.3 10-1 8,44 9,59 >0,100

LC P.10.3.4 10-1 1,18 1,21 >0,100

LC P.10.3.5 10-1 0,0 0,0 >0,100

Tableau 23. Activités antityrosinases des sous-fractions de la fraction polaire 10.3 de Litchi chinensis (LC P.10.3.) diluées 10 fois et analyses statistiques

58

Figure 17. Courbe de l'inhibition de la tyrosinase en fonction de la concentration de la fraction LC P.10.3.3 et identification de l'IC50

Optimisations des séparations

• HPLC analytique LC polaire

Comme pour Leea guineensis, la première étape fut de mettre au point une méthode en HPLC

analytique. La colonne utilisée a été l’Inertsil® ODS-2 C18 (5 µm 2,1x250 mm, GL Sciences).

Cette fois-ci, ce fut à l’aide d’un gradient d’acétonitrile et d’eau avec 0,05 % acide trifluoroacétique

(Tableau 24). Le volume d’injection était de 10 µL pour un échantillon concentré à 10 mg/mL

La longueur d’onde du détecteur a été fixée à 280 nm.

Temps (min) Acetonitrile (%) H2O + 0,05%TFA (%)

0 0 100 50 20 80 55 20 80 65 60 40 75 0 100

Tableau 24. Gradient de solvant utilisé pour la séparation par HPLC de la fraction polaire de Litchi chinensis

IC50

59

On peut voir sur le chromatogramme obtenu (Figure 17) qu’un grand nombre de pics sont

présents. Certains sont bien résolus (pic à 30’23’’), mais d’autres beaucoup plus larges (pic à

62’14’’).

Un grand nombre de sous-fractions étaient d’ores et déjà séparables, donc ce gradient a été

retenu pour une application en HPLC préparative.

Figure 18. Chromatogramme de la fraction polaire de Litchi chinensis (LC P.) obtenu par HPLC analytique avec un détecteur à 280 nm

• HPLC préparative LC polaire

Cette méthode a alors été appliquée à l’HPLC préparative afin de récupérer et tester les 17

fractions identifiées (Figure 18). La colonne utilisée a été la Uptisphere Strategy C18-2 prep column

(5 µm-250x21,2 mm, Interchrom) et le gradient fut donc celui du Tableau 24.

Les fractions ont les temps de rétention suivants :

LC P.1 : 4’32’’ ; LC P.2 : 5’15’’ ; LC P.3 : 14 ;46’’ ; LC P.4 : 19’57’’ ; LC P.5 : 23’29’’ ; LC P.6 :

26’51’’ ; LC P.7 : 29’01’’ ; LC P.8 : 32’07’’ ; LC P.9 : 34’02’’ ; LC P.10 : 37’38’’ ; LC P.11 :

39’46’’ ; LC P.12 : 41’47’’ ; LC P.13 : 44’28’’ ; LC P.14 : 54’06’’ ; LC P.15 : 62’18’’ ; LC P.16 :

63’37’’ ; LC P.17 : 67’56’’.

Les analyses des résultats de ce fractionnement ont permis de sélectionner la fraction LC

P.10. Le gradient a donc été adapté afin que ce pic soit mieux séparé de ses voisins (Figure 19), et

récolté en un temps réduit (Tableau 25).

60

Figure 19. Chromatogramme de la fraction polaire de Litchi chinensis (LC P) obtenu par HPLC préparative à 280 nm et identification des fractions récoltées

Figure 20. Chromatogramme de la fraction polaire de Litchi chinensis (LC P.) obtenu par HPLC préparative avec un détecteur à 280 nm

LC P.1

LC P.2

LC P.3 LC P.4 LC P.5

LC P.6

LC P.7

LC P.8

LC P.9

LC P.10

LC P.11

LC P.12

LC P.13

LC P.14

LC P.15

LC P.16

LC P.17

LC P.10

61

Temps (min) Acetonitrile (%) H2O + 0,05%TFA (%)

0 0 100 6’15’’ 3 97

7 10 90 28 20 80 35 20 80

35’10’’ 100 0 45’10’’ 100 0 45’20’’ 0 100 55’20’’ 0 100

Tableau 25. Gradient de solvant utilisé pour la séparation par HPLC de la fraction polaire de Litchi chinensis et la récupération de la sous-fraction LC P.10

• HPLC analytique LC P.10

Comme expliqué précédemment, la fraction 10 a été sélectionnée. L’échantillon a tout d’abord

été analysé avec la même colonne Uptisphere Strategy C18-2 prep column (5 µm-250x21,2 mm,

Interchrom). Aucune sous-fraction n’a pu être séparée de cette façon puisque l’entièreté de

l’échantillon est passée sur la colonne sans aucune rétention (moins de 1 minute).

Une nouvelle méthode de séparation a alors été établie avec la colonne Uptisphere strategy C8-2

(5µm 4x250mm, Interchrom). Le gradient (Tableau 26) a été optimisé de façon à avoir la meilleure

séparation des pics possible (Figure 21).

Plusieurs pics majoritaires (2’01’’ ; 6’37’’ ; 13’51’’ ; 15’22’’ ; 16’06’’) ont été remarqués.

Temps (min) Acetonitrile (%) H2O + 2% HAc (%)

0 0 100 50 40 60 55 0 100

Tableau 26. Gradient de solvant utilisé pour la séparation par HPLC analytique de la fraction polaire 10 de Litchi chinensis

62

Figure 21. Chromatogramme de la fraction polaire 10 de Litchi chinensis (LC P.10) obtenu par HPLC analytique avec un détecteur à 280 nm

• HPLC préparative LC P.10

Encore une fois, cette méthode a été adaptée en HPLC préparative, mais la rétention sur la

colonne Strategy C8-2 prep column (5 µm 21,2x150 mm, Interchrom) était quasi nulle.

De ce fait, la « protein C4 214TP1022™ (Vydac) » a été utilisée. Le gradient (Tableau 27) a

été adapté afin d’obtenir 5 fractions (Figure 22).

Ces fractions ont les temps de rétention suivant : 5’21’’ (LC P.10.1) ; 5’47’’ (LC P.10.2) ;

15’03’’ (LC P.10.3) ; 19’06’’ (LC P.10.4) ; 22’11’’ (LC P.10.5).

Temps (min) Acetonitrile (%) H2O + 2%HAc (%)

0 0 100 5 0 100 10 5 95 55 30 70 57 0 100

Tableau 27. Gradient de solvant utilisé pour la séparation par HPLC préparative de la fraction polaire 10 de Litchi chinensis

Les analyses de ces sous-fractions ont permis de sélectionner la LC P.10.3 qui a alors été

fractionnée par HPLC analytique.

63

Figure 22. Chromatogramme de la fraction polaire 10 de Litchi chinensis (LC P.10) obtenu par HPLC préparative avec un détecteur à 280 nm

• HPLC analytique LC P.10.3

La fraction LC 10.3 a été sélectionnée et encore une fois séparée, mais cela eut lieu uniquement

par HPLC analytique car elle était obtenue en faible quantité.

La colonne utilisée a été la Uptisphere strategy C8-2 (5µm 4x250mm, Interchrom), et un

gradient d’acetonitrile et d’eau a été mis au point (Tableau 28).

Temps (min) Acetonitrile (%) H2O + 2%HAc (%)

0 0 100 10 0 100 55 20 80 57 100 40 59 0 100

Tableau 28. Gradient de solvant utilisé pour la séparation par HPLC analytique de la fraction polaire 10.3 de Litchi chinensis

LC P.10.1

LC P.10.2

LC P.10.3

LC P.10.4

LC P.10.5

64

Figure 23. Chromatogramme de la fraction polaire 10.3 de Litchi chinensis (LC P.10.3) obtenu par HPLC analytique avec un détecteur à 280 nm

Le système de récolte de l’HPLC analytique a alors été utilisé, et a permis de récolter 5 fractions

(Figure 23). Ces pics ont les temps de rétention suivant : 40’41’’ (LC P.10.3.1), 42’31’’ (LC

P.10.3.2), 43’36’’ (LC P.10.3.3), 45’24’’ (LC P.10.3.4) et 47’09’’ (LC P.10.3.5).

Les analyses ont permis de déterminer que la fraction LC P.10.3.3 contenait l’activité. La récolte

de cette fraction a alors été répétée une trentaine de fois afin d’avoir assez de quantité pour analyser

cette molécule en RMN.

• Colonne de silice ouverte de la fraction apolaire

L’échantillon déposé sur la colonne avait un volume de 10 mL et une concentration de

20 mg/mL. Il a été solubilisé dans du dichlorométhane. Un gradient de dichlorométhane et méthanol

a été utilisé (Tableau 12). Les 5 fractions récoltées faisaient chacune 50 mL.

Volume (mL) Dichlorométhane (%) Méthanol (%)

50 95 5 50 50 50 50 5 95 50 0 100

Tableau 29. Gradient de solvant de la séparation sur colonne de silice ouverte de la fraction apolaire de Litchi chinensis

LC P.10.3.1

LC P.10.3.2

LC P.10.3.3

LC P.10.3.4

LC P.10.3.5

65

6.2. Rendements Quelques rendements ont été calculés : les rendements d’extractions de Litchi chinensis et Leea

guineensis pour les « grands » Soxhlet (200mL), le rendement de la séparation par centrifugation de

Litchi chinensis, et finalement celui de l’obtention par HPLC préparative de la fraction LC P.10 au

départ de la fraction LC P.

6.2.1. Rendements d’extraction

Pour les Soxhlet de grande taille (200 mL), les rendements obtenus pour Leea guineensis et

Litchi chinensis sont différents (Tableau 30). Cela s’explique par le fait que ce sont les feuilles qui

sont utilisées dans le cas de Leea guineensis tandis que les racines ont été utilisées pour le Litchi

chinensis. Il est tout de même remarqué que ces rendements sont peut élevés (moins de 20% de

matières extraites). Il est donc ici judicieux d’explorer des méthodes différentes d’extractions, telle

que la macération du marc dans des solvants de polarités différentes, ainsi que de déterminer si une

extraction plus longue ne permettrait pas d’augmenter ce rendement. De plus, il est intéressant de

déterminer si une extraction avec un plus grand rendement permettra d’obtenir les mêmes molécules

en plus grandes quantités ou si d’autres molécules seront extraites.

Rendement extraction (g/100g MS)

(n=3)

Écart-type

(n=3)

Leea guineensis 15,86 0,99

Litchi chinensis 7,23 0,38

Tableau 30. Rendements des extractions par soxhlet des feuilles de Leea guineensis et des racines de Litchi chinensis

6.2.2. Rendements des fractionnements

Fractionnement par centrifugation de Litchi chinensis

L’extrait du soxhlet a ensuite été divisé selon la solubilité, et on a ainsi obtenu 87,5 % +/-

0,43 % de fraction polaire et 6,81 % +/- 0,43 % de fraction apolaire. Ce résultat est retranscrit par

rapport à la quantité de matière sèche brute dans le Tableau 31.

Il y a donc une perte d’environ 5,69 % lors de la séparation par centrifugation ce qui est assez faible

si on considère les différentes étapes de changements de récipients lors de la centrifugation.

66


(n=3)

Écart-type

(n=3)

LC Apolaire 0,50 0,04

LC Polaire 6,40 0,32

Tableau 31. Rendement de la séparation par centrifugation de Litchi chinensis

Récupération de la fraction LC P.10 par HPLC préparative

La fraction polaire de Litchi chinensis, ayant été identifiée comme intéressante, a été fractionné à

plusieurs reprises par HPLC préparative. Lors de la première de ces séparations, c’est la fraction LC

P.10 qui a été sélectionnée pour un sous-fractionnement supplémentaire.

La quantité de LC P.10 a donc été calculée : 4,58 +/- 0,42 g de LC P.10 sont obtenus par 100 g de

LC P. Ce résultat retranscrit par rapport à la matière sèche de racine de Litchi se trouve dans le

Tableau 32.


(n=3)

Écart-type

(n=3)

LC P.10 0,293 0,03

Tableau 32. Rendement d'extraction de la fraction LC P.10

On sait maintenant que deux sous-fractionnements supplémentaires ont été nécessaires à

l’obtention d’une molécule quasi pure. Le résultat du rendement de LC P.10 montre déjà que cette

molécule active est présente en très faible quantité dans la matière sèche, et explique la difficulté de

l’obtenir en grande quantité.

6.3. Caractérisation structurale

Résonnance Magnétique Nucléaire

Un début de caractérisation structurale a été effectué à l’aide de différentes mesures par

spectrométrie RMN. Cependant, l’échantillon analysé ne contenait qu’une faible quantité de la

molécule (environ 10 mg), et celui-ci a été plutôt malmené par une grande série de séchage, le

transport et une conservation trop longue.

67

Tout cela entraîne que les spectres RMN obtenus (Annexe 4) ne contiennent que des pics de

faible intensité, et le manque de signaux d’interactions en COSY et HSQC laisse penser que ceux-ci

ne sont pas complets.

Le temps limité de ce travail n’a pas permis d’obtenir suffisamment de matière pour effectuer

une identification complète.

RMN 1H

Pour commencer, on peut observer que le pic de solvant (CD3OD à 3,31ppm) est beaucoup plus

important que les autres (Annexe 2.1), ce qui confirme l’hypothèse du manque de concentration de

la molécule. De plus, des traces de solvant d’élutions sont également présentes avec des pics de

grande intensité (Acide acétique à 1,96 ppm et eau à 4,87 ppm). Cela indique que l’évaporation à sec

n’avait pas été optimale. Ensuite, on peut voir environ 26 pics allant de 0,91 à 6,97 ppm. Il n’y a

donc pas de pic aux déplacements élevés (de 8 à 10 ppm), ce qui peut indiquer qu’il n’y a pas de

composé aldéhytique. Les sept derniers pics du spectre se trouvent dans la zone de déplacement

pouvant correspondre à des alcènes ou à des composés aromatiques. De plus, les pics sont en

majorité des singulets, et des doublets ainsi que quelque quadruplet, ce qui laisse penser que la

structure de la molécule est assez linéaire et contient un grand nombre de doubles liaisons.

RMN 13C

Comme pour le spectre proton, le pic du solvant (47,59 ppm) est très important par rapport aux

autres pics et orienté vers le haut (Annexe 2.2).

23 pics ont été observés, dont la majorité est des CH ou CH3 (vers le bas), ce qui correspond à

l’hypothèse du grand nombre de doubles liaisons (-CH=CH-). De plus, les déplacements vont de

20,29 ppm à 156,59 ppm ce qui indique la présence d’hydrocarbure et d’alcène, et confirme les

hypothèses qu’il n’y a pas de fonction complexe contenant des oxygènes (ester, acide carboxylique,

cétones, aldéhydes). Cependant, les déplacements allant de 95 à 165 ppm sont susceptibles de

correspondre à un composé aromatique ou à un alcène.

RMN 2D COSY

Sur le spectre bidimensionnel proton, très peu d’interactions ont été observées en dehors de la

diagonale qui relie les pics identiques et des trainées engendrées par les pics de solvants (Annexe

2.3). De ce fait, il paraît évident qu’un pic plus résolu (augmentation du nombre de scan) est essentiel

à son interprétation.

68

Les interactions présentent sont les suivantes :

- 1,28 ppm avec 0,91 ppm

- 1,43 ppm avec 0,95 ppm

- 4,17 ppm avec 2,84, 2,87, 2,74 et 2,72 ppm.

Ce dernier pic à 4,17 ppm a donc une interaction avec quatre autres pics. Cela laisse penser qu’il

s’agit d’un carbone quaternaire.

RMN 2D HSQC

Le spectre bidimensionnel d’interaction entre les protons et les carbones fournit plus

d’informations (Annexe 2.4)

Notamment, plusieurs pics protons interagissent avec deux à trois carbones. Cela peut signifier

qu’une certaine répétition des fonctions est présente, et engendre une superposition des pics protons.

Les signaux relevés sont les suivants :

d 1H d 13C d 13C d 13C

1,87 20,29 2,05 20,29 2,72 78,49 98,61 2,74 78,41 98,63 2,84 98,61 2,87 98,63 3,21 47,59 3,31 47,59 4,81 113,88 117,94 130,875,91 94,93 98,61 155,94 5,93 94,44 98,61 156,26 6,75 130,87 6,77 144,54 6,79 144,37 6,8 78,49 113,88 6,97 117,94 144,54 Tableau 33. Interactions montrées par le spectre RMN bidimensionnel HSQC

De plus, certains pics de 13C comme celui à 20,29 ppm et celui à 98,61 ppm interagissent

avec plusieurs pics 1H. Cela fait pensé qu’il y ait des CH2 contenant des protons qui ont des

déplacements différents. Cela peut être dû à une asymétrie de la fonction.

69

RMN 2D HMBC

Le spectre bidimensionnel d’interaction entre les protons et carbones adjacents n’a donné que

trois signaux pour un même carbone : le pic de carbone 27,86 ppm avec les pics protons de 2,72,

2,74 et 2,84 ppm (Annexe 2.5).

7. Discussion générale

Pour rappel, le but de ce travail était de fractionner des extraits végétaux afin d’obtenir des

molécules actives pour diverses activités biologiques.

Plusieurs étapes ont été nécessaires afin de mener à bien ce projet, et des conclusions ont pu être

tirées de chacune des étapes.

Pour commencer, les matières sèches et broyées ont été extraites par la technique du Soxhlet. En

considérant les rendements obtenus, cette partie du travail est à optimiser selon différents

paramètres que sont le solvant, la durée et la technique. De plus, la mise en place d’une extraction

complète par application successive de différentes techniques comme Op de Beck P. le fait sur les

feuilles de Leea guineensis paraît judicieux pour atteindre une identification complète de la

composition des extraits végétaux étudiés (Op de Beck P., 2009).

Ensuite, la première étape de fractionnement a été réalisée par centrifugation. Les rendements

calculés montrent que celle-ci est assez optimale (environ 5% de perte). De plus, elle permet de

diviser chaque extrait en deux fractions de polarités différentes, ce qui fut judicieux pour le choix des

techniques de séparation ultérieures. Du point de vue des activités biologiques, cette première

séparation a permis d’identifier quelle fraction sera approfondie et pour quelle activité.

Ainsi, la décision de ne pas approfondir les extraits de Persea americana a été prise. Comme il

avait été décrit dans la partie « Généralités », Persea americana est une plante qui possède

énormément de vertus connues aujourd’hui. Les premières analyses ont confirmé ces informations en

montrant des inhibitions supérieures à 50 % pour presque chacune des fractions et chacune des

activités. Cependant, ces résultats ont été révélés moins intéressants que ceux obtenus pour les autres

plantes par les tests statistiques. Il est fort probable que cela soit dû à une technique d’extraction non

optimale pour cet échantillon.

Afin d’avoir au moins une fraction d’intérêt par activité biologique étudiée, les fractions polaires

et apolaires de Leea guineensis et Litchi chinensis ont été approfondies. Tout d’abord, la fraction

70

apolaire de Leea guineensis a été étudiée pour une activité antioxydante, mais principalement parce

que la richesse de l’extrait (épais et opaque) faussait les résultats initiaux. Les résultats des sous-

fractionnements n’ont pas été à la hauteur de ceux des sous-fractions polaires, cette fraction n’a donc

pas donné de molécule d’intérêt. Ensuite, la fraction polaire de cette même plante a été étudiée pour

une activité antioxydante et antityrosinase. Un premier fractionnement par HPLC a permis d’obtenir

une sous-fraction riche en ces activités. Cette sous-fraction n’a pas été plus étudiée dans le cadre de

ce travail, mais il est évident qu’une ou plusieurs molécules actives contre la tyrosinase sont

présentes dans celle-ci et mériteraient d’être identifiées.

Pour finir, les fractions de racines de Litchi chinensis sont celles qui ont le plus retenu

l’attention. Ceci fut la conséquence d’une part des activités importantes mesurées, et d’autre part de

l’originalité de cet extrait végétal. La sous-fraction apolaire a donc été étudiée pour une activité

antioxydante et une activité anti-inflammatoire. Le fractionnement par colonne de silice ouverte n’a

cependant pas pu être optimisé dans le cadre de ce travail. La répétabilité du fractionnement fut très

faible et celui-ci doit être optimisé avant d’opérer des sous-fractionnements supplémentaires, mais

une très grande activité anti-inflammatoire de la partie la plus apolaire fut observée. Une ou plusieurs

molécules actives contre la lipoxygénase sont donc encore à identifier. C’est alors la fraction polaire

de Litchi chinensis qui a reçu l’étude la plus approfondie. En effet, celle-ci a montré dès les

premières analyses un très grand pouvoir inhibiteur de la tyrosinase. De plus, un premier

fractionnement par HPLC a montré que cette activité était concentrée dans une seule des 17 sous-

fractions. Cette sous-fraction LC P.10 a donc été fractionnée à plusieurs reprises afin d’obtenir un

extrait qui s’apparentait à une molécule purifiée (LC P.10.3.3). Pour arriver à cela, quatre séparations

ont été nécessaires. Bien que celle-ci ait été correctement optimisée, les rendements étaient faibles à

chaque étape. De ce fait, il a fallu faire un très grand nombre de répétitions pour obtenir

suffisamment de matière pour effectuer les analyses de caractérisations structurales.

Malgré cela, la qualité des spectres RMN obtenus n’est pas suffisante pour permettre une

identification, et les spectres de masse et infrarouge initialement planifiés n’ont pas pu être réalisés.

71

8. Perspectives

Ce travail a permis la mise en avant de fractions d’intérêt pour des activités anti-inflammatoire et

antityrosinase dans les feuilles de Leea guineensis et les racines de Litchi chinensis récoltées sur l’île

de Mayotte. Dans le contexte actuel dans lequel se trouve l’île, ce sont des découvertes très

appréciées et à valoriser dans le cadre du projet de valorisation des matières végétales de Mayotte par

la préfecture française (Préfet de Mayotte, « Document stratégique : Mayotte 2025, une ambition

pour la république », consulté le 16 mars 2017).

D’un point de vue opérationnel, un certain nombre d’optimisations à réaliser ont été recensées

notamment au niveau de l’extraction et des séparations. Ensuite, une identification complète des

molécules actives trouvées sera nécessaire. Les molécules ayant un grand potentiel de valorisation

sont celles responsables de l’activité antityrosinase dans la fraction polaire de Leea guineensis et de

Litchi chinensis (Tableau 6 et Tableau 21), et celles responsables de l’activité anti-inflammatoire

dans la fraction apolaire de Litchi chinensis (Tableau 17). Il est important de noter que ces fractions

possèdent également une activité antioxydante (Tableau 5, Tableau 16 et Tableau 22), ce qui est

toujours apprécié pour des applications cosmétiques.

Lorsque ces molécules auront été identifiées, une étude toxicologique permettra de déterminer si

celles-ci sont valorisables dans des produits cosmétiques. Si cela est avéré, un nouveau travail de

formulation de produits entrera en jeu. Celui-ci devra déterminer quelles fractions des extraits seront

utilisées ainsi que leur mode de production. En effet, plusieurs pistes sont ouvertes : bien qu’un mode

d’extraction et de purification de la molécule aura été établi à petite échelle, il peut être envisagé

d’utiliser des extraits moins purifiés dans le produit cosmétique. Cela aurait l’avantage de nécessiter

moins de traitements, et éventuellement de bénéficier d’autres bienfaits que contiennent ces plantes.

Il est donc évident qu’un grand nombre de possibilités s’ouvrent à l’île de Mayotte quant à la

valorisation de ces matières végétales. Ce travail a permis d’identifier les possibilités pour Leea

guineensis et Litchi chinensis, qui sont en accord avec les utilisations traditionnelles de l’île.

L’organisation mondiale de la santé fournit également toute une série de lignes directrices quant aux

perspectives de valorisation de la médecine traditionnelle (Kasilo O. et Nikiema J.-B., 2014). De

plus, les activités visées sont très utiles à la population locale : le climat entraîne une exposition au

soleil intense qui est favorable aux pathologies d’hyperpigmentation, ce qui pourra être traité avec un

72

produit cosmétique à base de Leea guineensis ou Litchi chinensis. De plus, un produit anti-

inflammatoire est utile à un grand nombre de maux : piqure d’insecte, blessure, coup de soleil, …

L’utilisation de matériel végétal proposée ci-dessus sera un challenge à cause de la variabilité

du matériel végétal et de sa disponibilité. Comme l’explique Feiter U., la commercialisation de

plantes nouvelles implique de répondre à un grand nombre de questions. Premièrement, le potentiel

commercial devra être confirmé par une étude du marché sur l’île de Mayotte. Deuxièmement, une

étude du contexte légal pour l’introduction sur le marché d’une nouvelle crème à base de molécules

végétales sera indispensable. Lorsque la possibilité légale et économique du projet sera avérée, il

faudra s’intéresser à la culture de la plante d’intérêt : cycle de développement, variabilité génétique,

coût et lieux de production, rendement agronomique… En conclusion, la création d’un nouveau

produit médicinal à base végétale est un long travail qui peut durer de 5 à 15 ans (Feiter U., 2014).

La première étape de ce projet est amorcée ici par la découverte des activités antityrosinases, anti-

inflammatoire et antioxydants dans Leea guineensis et Litchi chinensis.

73

9. Conclusion

Cette contribution à l’étude phytochimique de plantes mahoraises a abouti par l’identification de

fractions d’intérêts et la purification d’une de celles-ci. Ce travail avait pris part dans la thèse de

M. Saive concernant l’étude de la flore de l’île de Mayotte afin de développer des applications

cosmétiques. Les trois extraits végétaux (feuilles de Persea americana, feuilles Leea guineensis et

racines de Litchi chinensis) ainsi que les activités ciblées avaient été déterminées au préalable par

M. Saive.

Les différentes parties de ce travail ont permis de décrire les potentielles de valorisation de

plusieurs fractions.

Premièrement, la fraction polaire des feuilles de Leea guineensis possède une activité

antityrosinase et antioxydante importante. L’étude de l’activité antioxydante avait d’ores et déjà été

effectuée par Op de Beck P., mais l’activité antityrosinase n’avait pas encore été recensée dans la

littérature.

Deuxièmement, la fraction apolaire des racines de Litchi chinensis possède une activité anti-

inflamatoire valorisable.

Dernièrement, la fraction polaire des racines de Litchi chinensis possède une activité

antityrosinase qui a pu être attribuée à une sous-fraction purifiée. L’analyse structurale de cette

fraction ne permet pas d’affirmer des éléments de se conformation, mais donne des pistes telles que

la présence de doubles liaisons, c’est une molécule avec une vingtaine de carbone et qu’elle ne

semble pas posséder de fonction aldéhydique.

Le potentiel de valorisation cosmétique des feuilles de Leea guinensis et des racines de Litchi

chinensis a ainsi été confirmé, tandis que les feuilles de Persea americana n’ont pas révélé le même

intérêt.

74

10. Bibliographie

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81

Annexe 1 : Spectres UV-VIS

1.1 Spectre d’inhibition de la tyrosinase par LG P.1

1.2 Spectre d’inhibition de la tyrosinase par LC. 10.3.3 (15 mg/mL)

82

1.3 Spectre d’inhibition de la lipoxygénase par LC A.

83

Annexe 2 : Spectrométrie RMN

2.1 Spectre RMN 1H

2.2 Spectre RMN 13C

84

2.3 Spectre RMN COSY

2.4 Spectre RMN HSQC

85

2.5 Spectre RMN HMBC

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