« Étude phytochimique et biologique de billia rosea planch

THESE DE DOCTORAT DE L’ETABLISSEMENT UNIVERSITE BOURGOGNE FRANCHE-COMTE

PREPAREE A l’Université de Bourgogne Franche-Comté et l’Universidad Central de Venezuela

Ecole doctorale n°554

École Doctorale ES

Doctorat de Pharmacie

Par M. Luis Antonio De Freitas Fernandez

« Étude phytochimique et biologique de Billia rosea Planch & Lunden, Ulloa & Jorgensen; plante vénézuélienne appartenant à la famille SAPINDACEAE»

Thèse soutenue le 03 Avril 2018

Composition du Jury :

M. POUYSEGU Laurent Professeur, Université de Bordeaux Président

M. CACHET Xavier Professeur, Université Paris Descartes Rapporteur

Mme. PEREZ Alida Professeur, Universidad de Los Andes Rapportrice

M. ROJAS Luis Professeur, Universidad de Los Andes Examinateur

Mme. MITAINE-OFFER Anne-Claire Professeur, Université de Bourgogne Franche-Comté Examinatrice

Mme. RODRIGUEZ María Professeur, Universidad Central de Venezuela Directrice de thèse

Mme. LACAILLE-DUBOIS Marie Aleth Professeur, Université de Bourgogne Franche-Comté Directrice de thèse

i

Agradecimientos

A mi madre y hermanos, gracias por estar siempre a mi lado apoyándome en todos mis

proyectos. Sin ustedes no hubiese logrado esta meta. Los amo.

A Edwin Ruiz, por todas las veces que me ayudaste a retomar la motivación, por siempre

escucharme cada vez que lo necesitaba, por ser mi compañero durante toda esta travesía y por

todas las palabras de aliento que me has dado.

Profesora María Rodríguez, gracias por todo lo que me ha enseñado a lo largo de todos estos

años, usted ha sabido guiarme para formarme profesionalmente. También agradezco mucho toda

la confianza que ha depositado en mí. Considero un honor el haber trabajado con usted.

Mme Marie-Aleth Lacaille-Dubois, merci beaucoup pour votre guide et pour l'opportunité que

vous m'avez donnée. Merci pour tout ce que vous m’avez appris et pour l'effort que vous avez

fait pour m'aider à terminer cette thèse.

Al Prof. Freddy González Mujica y a Sandra Díaz por ayudarme a realizar los ensayos

biólogicos de los compuestos aislados de Billia rosea.

Neydimar, Sofía y Reine, gracias por todas las aventuras que vivimos en el Laboratorio de

Productos Naturales, hicieron muy gratos todos los momentos que viví en el 337.

Jairo Bermudez, por todo lo que me has enseñado, todos los consejos, por las perguntas

díficiles que siempre me hacías que me ayudaron a consolidar conocimientos y a aprender

nuevas cosas.

A Manuel, Ricardo, Diana, Ynes, Lourdes, Daniela y demás personas que formaron o forman

parte del grupo de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias de la UCV.

A Mayra, mi compañera del PCP, gracias por brindarme tu amistad y por todo lo que

compartimos en Dijon. Valoro mucho toda la ayuda que me brindaste y agradezco todo lo que

me enseñaste.

À Stéphanie, David, Anne-Sophie, Mahenina, Maleck et tous mes collègues dans le

Laboratoire de Pharmacognosie, merci pour l'amitié que vous m'avez donnée, pour toutes les

heures que nous avons partagées et pour tous les conseils que vous m'avez donnés.

ii

Al Programa Cooperativo de Postgrado (PCP) Francia-Venezuela, al FONACIT y al Ministère

des Affaires Etrangères por el financiamiento otorgado para este proyecto.

A todas aquellas personas que me brindaron su ayuda durante estos años.

iii

Résumé

Cette thèse s’inscrit dans le cadre de la thématique du Laboratoire de Pharmacognosie de l’UFR

des Sciences de santé, au sein de l’Université de Bourgogne Franche-Comté et du Laboratoire de

Produits Naturels de la Faculté de Sciences, au sein de l’Universidad Central de Venezuela. Elle

vise essentiellement l’étude phytochimique des graines de Billia rosea (Planch. & Linden) C.

Ulloa & P. Jørg, famille des Sapindaceae, qui est utilisé en médecine traditionnelle comme

antidiabétique, analgésique et pour le traitement des hémorroïdes et de la fièvre. L'étude de cette

espèce végétale a conduit à l’isolement et à la caractérisation de 9 saponines triterpéniques parmi

lesquelles 5 sont de structure nouvelle (Billiosides A–E), un analogue connu et une structure a

été proposée pour les 3 autres saponines qui devraient être vérifiées dans des études ultérieures.

Les structures ont été élucidées principalement par l’utilisation de RMN 1D et 2D (1H, 13C,

DEPT, COSY, TOCSY, NOESY, ROESY, HSQC, et HMBC) ainsi que la spectrométrie de

masse comme (3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-glucopyranosyl-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1 / 4)]-β-D-

glucopyranosyl)oxy]-21-[((2E,6S)-2,6-dimethyl-6-hydroxyocta-2,7-dienoyl)oxy]-22-

(acetyloxy)-24-hydroxyolean-12-en-28-oic acid (Billioside A), (3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-

galactopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)oxy]-21,22-dihydroxyolean-12-en-28-yl O-α-L-

arabinopyranosyl-(1 → 4)-β-D-glucopyranoside (Billioside B), (3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-

galactopyranosyl-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1 → 4)]-β-D-xylopyranosyl)oxy]-21,22-

dihydroxyolean-12-en-28-yl O-β-D-glucopyranoside (Billioside C), (3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-

galactopyranosyl-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1 → 4)]-β-D-glucopyranosyl)oxy]-21,22-

dihydroxyolean-12-en-28-yl O-β-Dglucopyranoside (Billioside D), (3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-

galactopyranosyl-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1 → 4)]-β-Dglucopyranosyl)oxy]-21,22-

dihydroxyolean-12-en-28-yl O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 6)-β-D-glucopyranoside (Billioside E),

et dipteroside A.

Les structures proposées pour les 3 autres saponines sont (3β,16α,21β,22α)-3-[(4-O-α-L-

arabinopyranosyl-β-D-glucuronopyranosyl)oxi]-22-(acetyloxy)-16,24,28-trihidroxyolean-12-en-

21-yl-O-(3,4-di-O-angeloyl)-6-Deoxy-β-D-glucopyranoside, (3β,16α,21β,22α)-3-[(4-O- β-D-

galactopyranosyl-β-D-glucuronopyranosyl)oxy]-22-(acetyloxy)-16,24,28-trihidroxyolean-12-en-

21-yl-O-(3,4-di-O-angeloyl)-6-Deoxy-β-D-glucopyranoside et (3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-

galactopyranosyl-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1→4)]-β-D-xylopyranosyl)oxy]-21-acetyl-22-

hidroxyolean-12-en-28-yl-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside.

iv

Billiosides B et C ont été testés en vue d’évaluer leurs capacité à inhiber l'absorption intestinale

du glucose in situ dans des segments d'intestins de rat, et sa capacité à inhiber le glucose-6-

phosphatase, enzyme impliquée dans la formation du glucose. Billiosides B et C ont montré des

effets modérés dans les deux expériences.

v

Resumen

Este trabajo de investigación, realizado en conjunto entre el Laboratorio de Farmacognosia de la

Facultad de Ciencias de la Salud, de la Université de Bourgogne Franche-Comté y el Laboratorio

de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias de la Universidad Central de Venezuela; se

centró en el estudio fitoquímico de las semillas de Billia rosea (Planch. & Linden) C. Ulloa & P.

Jørg, perteneciente a la familia Sapindaceae, utilizada tradicionalmente como antidiabético,

analgésico y para el tratamiento de hemorroides y fiebre. El estudio de esta especie vegetal

condujo al aislamiento y caracterización de 9 saponinas triterpénicas, entre las cuales 5 poseen

una estreuctura nueva en la literatura de productos naturales (Billiosidos A–E), un análogo

conocido, además de 3 propuestas como posibles estructuras a las restantes saponinas aisladas,

que deben ser confirmadas en estudios posteriores.

Las estructuras se elucidaros principalmente mediante el uso de RMN 1D y 2D (1H, 13C, DEPT,

COSY, TOCSY, NOESY, ROESY, HSQC, et HMBC) y espectrometría de masa como ácido

(3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-glucopiranosil-O-[α-L-arabinopiranosil-(1→4)]-β-D-

glucopiranosil)oxi]-21-[((2E,6S)-2,6-dimetil-6-hidroxiocta-2,7-dienoil)oxi]-22-(acetiloxi)-24-

hidroxiolean-12-en-28-oico, (Billiosido A) (3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-galactopiranosil-β-D-

glucopiranosil)oxi]-21,22-dihidroxiolean-12-en-28-il-O-α-L-arabinopiranosil-(1 → 4)-β-D-

glucopiranosido (Billiosido B), (3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-galactopiranosil-O-[α-L-

arabinopiranosil-(1→4)]-β-D-xilopiranosil)oxi]-21,22-dihidroxiolean-12-en-28-il-O-β-D-

glucopiranosido (Billiosido C), (3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-galactopiranosil-O-[α-L-

arabinopiranosil-(1 → 4)]-β-D-glucopiranosil) oxi]-21,22-dihidroxiolean-12-en-28-yl-O-β-D-

glucopiranosido (Billiosido D), (3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-galactopiranosil-O-[α-L-

arabinopiranosil-(1→4)]-β-D-glucopiranosil)oxi]-21,22-dihidroxiolean-12-en-28-il-O-β-D-

glucopiranosil-(1→6)-β-D-glucopiranosido (Billiosido E) y Dipterosido A.

Las estructuras propuestas para las otras 3 saponinas aisladas son (3β,16α,21β,22α)-3-[(4-O-α-L-

arabinopiranosil-β-D-glucoronopiranosil)oxi]-22-(acetiloxi)-16,24,28-trihidroxiolean-12-en-21-

il-O-(3,4-di-O-angeloil)-6-Deoxy-β-D-glucopiranosido, (3β,16α,21β,22α)-3-[(4-O-β-D-

galactopiranosil-β-D-glucoronopiranosil)oxi]-22-(acetiloxi)-16,24,28-trihidroxiolean-12-en-21-

il-O-(3,4-di-O-angeloil)-6-Deoxy-β-D-glucopiranosido y (3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-

galactopiranosil-O-[α-L-arabinopiranosil-(1→4)]-β-D-xilopiranosil)oxi]-21-acetil-22-

hidroxiolean-12-en-28-il-O-α-L-arabinopiranosil-(1→4)-β-D-glucopiranosido.

vi

También se evaluó la actividad inhibitoria de los Billiosidos B y C sobre la absorción intestinal

de glucosa in situ en segmentos de intestinos de ratas, además de la capacidad inhibitoria de

estos compuestos sobre la enzima glucosa-6-fosfatasa, implicada en la formación de glucosa.

Estos Billiosidos mostraron efectos moderados en estos dos experimentos.

vii

Abstract

This thesis was carried out in the the Laboratory of Pharmacognosy, in health department of the

University of Burgundy and in the Laboratory of Natural products of Central University of

Venezuela.This research work focused on the phytochemical study of the sedes of Billia rosea

(Planch. & Linden) C. Ulloa & P. Jørg, Sapindaceae family. Billia rosea seeds have traditionally

been used as antidiabetic, analgesic and for the treatment of hemorrhoids and fever. In the study

of this plant was isolated and characterized 9 triterpene saponins, among which 5 has a new

structure in the literature of natural products (Billiosides A–E), a known analogue and 3

proposals as possible structures to the remaining isolated saponins, which must be confirmed in

subsequent studies.

Their structures were elucidated on the basis of extensive 1D and 2D NMR experiments (1H, 13C,

DEPT, COSY, TOCSY, NOESY, ROESY, HSQC, et HMBC) and mass spectrometry as

(3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-glucopyranosyl-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1 → 4)]-β-D-

glucopyranosyl)oxy]-21-[((2E,6S)-2,6-dimethyl-6-hydroxyocta-2,7-dienoyl)oxy]-22-

(acetyloxy)-24-hydroxyolean-12-en-28-oic acid (Billioside A), (3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-

galactopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)oxy]-21,22-dihydroxyolean-12-en-28-yl O-α-L-

arabinopyranosyl-(1 → 4)-β-D-glucopyranoside (Billioside B), (3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-

galactopyranosyl-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1 → 4)]-β-D-xylopyranosyl)oxy]-21,22-

dihydroxyolean-12-en-28-yl O-β-D-glucopyranoside (Billioside C), (3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-

galactopyranosyl-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1 → 4)]-β-D-glucopyranosyl)oxy]-21,22-

dihydroxyolean-12-en-28-yl O-β-Dglucopyranoside (Billioside D), (3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-

galactopyranosyl-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1 → 4)]-β-Dglucopyranosyl)oxy]-21,22-

dihydroxyolean-12-en-28-yl O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 6)-β-D-glucopyranoside (Billioside E),

and dipteroside A.

The proposed structures for the other 3 isolated saponins are (3β,16α,21β,22α)-3-[(4-O-α-L-

arabinopyranosyl-β-D-glucuronopyranosyl)oxi]-22-(acetyloxy)-16,24,28-trihidroxyolean-12-en-

21-yl-O-(3,4-di-O-angeloyl)-6-Deoxy-β-D-glucopyranoside, (3β,16α,21β,22α)-3-[(4-O- β-D-

galactopyranosyl-β-D-glucuronopyranosyl)oxy]-22-(acetyloxy)-16,24,28-trihidroxyolean-12-en-

21-yl-O-(3,4-di-O-angeloyl)-6-Deoxy-β-D-glucopyranoside and (3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-

galactopyranosyl-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1→4)]-β-D-xylopyranosyl)oxy]-21-acetyl-22-

hidroxyolean-12-en-28-yl-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside.

viii

Billiosides B and C exhibited moderate effects when tested as hepatic glucose-6-phosphatase

inhibitors and as glucose intestinal absorption inhibitors, using in situ rat intestinal segments.

ix

CONTENIDO GENERAL

Introducción General 1

Capítulo 1. Billia rosea Planch & Linden, Ulloa & Jorgensen. Descripción

botánica y antecedentes fitoquímicos. 3

I. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA DE LA ESPECIE Billia rosea PLANCH &

LINDEN, ULLOA & JORGENSEN. 4

II. ANTECEDENTES FITOQUÍMICOS 6

II.A. Generalidades de las saponinas 6

II.B. Saponinas de Aesculus 10

Capítulo 2. Generalidades de la diabetes 19

I. METABOLISMO DE LA GLUCOSA. 20

II. DIABETES MELLITUS 22

Capítulo 3. Hipótesis y objetivos 27

I. HIPÓTESIS 28

II. OBJETIVOS 28

II.A. Objetivo general 28

II.B. Objetivo específico 28

Capítulo 4. Estudio fitoquímico de Billia rosea Planch & Linden, Ulloa &

Jorgensen. 29

I. MATERIALES Y METODOLOGÍA EXPERIMENTAL. 30

I.A. Técnicas generales aplicadas. 30

I.A.1. Cromatografía Líquida al Vacío (VLC). 30

x

I.A.2. Cromatografía de columna (CC) 30

I.A.3. Cromatografía líquida de presión media (MPLC). 31

I.A.4. Cromatografía en Capa Fina (TLC o CCF) y Cromatografía de

Capa Fina de Alta Eficiencia (HPTLC o CCFAE). 31

I.A.5. Determinación de la configuración de los azúcares por

hidrólisis ácida seguida de una cromatografía gaseosa. 32

I.A.6. Espectrometría de masas. 33

I.A.7. Espectrometría de Resonancia Magnética Nuclear. 33

I.B. Metodología aplicada 37

I.B.1. Recolección del material vegetal 37

I.B.2. Obtención de los extractos de Billia rosea. 37

II. RESULTADOS Y DISCUSIONES. 43

II.A. Hidrólisis ácida y análisis GC de azúcares. 43

II.B. Determinación estructural del compuesto 1 44

II.C. Determinación estructural del compuesto 2 53

II.D. Determinación estructural del compuesto 3 58

II.E. Determinación estructural del compuesto 4 64

II.F. Determinación estructural del compuesto 5 70

II.G. Determinación estructural del compuesto 6 77

II.H. Determinación estructural del compuesto 7 84

II.I. Determinación estructural del compuesto 8 91

II.J. Determinación estructural del compuesto 9 97

xi

Capítulo 5. Ensayos biológicos de Billia rosea Planch & Linden, Ulloa &

Jorgensen. 103

I. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL 104

I.A.1. Bioensayos sobre la enzima G-6-Pasa 104

I.A.2. Metodología del ensayo de inhibición de G-6-pasa 104

I.B.1. Absorción intestinal de glucosa 105

I.B.2. Metodología del ensayo de la absorción intestinal de glucosa. 106

II. RESULTADOS 107

CONCLUSIONES 108

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 111

ANEXOS 118

xii

TABLAS

Tabla 1 Desplazamientos químicos de RMN-1H (500 MHz) y 13C (150 MHz) de la

aglicona del Billiosido A (compuesto 1), en piridina-d5. 49

Tabla 2 Desplazamientos químicos de RMN-1H (500 MHz) y 13C (150 MHz) de

los azúcares del Billiosido A (compuesto 1), en piridina-d5. 49


aglicona del Billiosido B (compuesto 2), en piridina-d5. 55


los azúcares del Billiosido B (compuesto 2), en piridina-d5. 55


aglicona del Billiosido C (compuesto 3), en piridina-d5. 60


los azúcares del Billiosido C (compuesto 3), en piridina-d5. 60


aglicona del Billiosido D (compuesto 4), en piridina-d5. 66


los azúcares del Billiosido D (compuesto 4), en piridina-d5. 66


aglicona del Billiosido E (compuesto 5), en piridina-d5. 72


los azúcares del Billiosido E (compuesto 5), en piridina-d5. 72


aglicona del Dipterósido A (compuesto 6), en piridina-d5. 79


los azúcares del Dipterósido A (compuesto 6), en piridina-d5. 79

xiii


aglicona del compuesto 7, en piridina-d5. 87


los azúcares del compuesto 7, en piridina-d5. 87









xiv

FIGURAS

Figura 1 Distribución mundial de Billia rosea. 4

Figura 2 Billia rosea 5

Figura 3 Fotografía de las semillas del espécimen Billia rosea Planch & Linden,

Ulloa & Jorgensen 5

Figura 4 Estructura de la saponina Aescina 6

Figura 5 Aplicación de la regla del isopreno en laformación de diversos terpenos 7

Figura 6a Estructuras de los esqueletos de las geninas esteroidales y triterpénicas 8

Figura 6b Estructuras de los esqueletos de las geninas tipo espirostano y furostano 8

Figura 7 Estructura de la Solasodina 8

Figura 8 Azúcares más comunes encontrados en saponinas 9

Figura 9 Estructura de las principales geninas de las saponinas triterpenoidales 10

Figura 10 Esqueleto Oleonano 10

Figura 11 Estructuras de los sustituyentes en el grupo hidroxilo de los átomos de

C22 y C21 del esqueleto oleanano en el género Aesculus 11

Figura 12 Estructuras de sustituyentes en el grupo hidroxilo del átomo C21 11

Figura 13 Saponinas identificadas en Aesculus assamica por Liu et al., en el 2005 12

Figura 14 Saponina identificada en Aesculus assamica por Liu et al., 2006 12

Figura 15 Saponinas identificadas en Aesculus assamica por Liu et al., 2008 13

Figura 16 Saponinas identificadas en Aesculus californica por Yuan et al., 2013 14

Figura 17 Saponinas identificadas en Aesculus glabra por Yuan et al., 2012 15

xv

Figura 18 Saponinas identificadas en Aesculus pavia por Lanzotti et al., 2012 16

Figura 19 Saponinas identificadas en Aesculus pavia por Zhang et al. 2006 17

Figura 20 Saponinas identificadas en Aesculus sylvatica por Yuan et al., 2015 18

Figura 21 Regulación de la glucosa en la sangre 22

Figura 22 Estructura de las geninas de las saponinas tipo oleanano (izq) y

damnaramo (der) de Gymnema sylvestre 24

Figura 23 Estructura de la saponina triterpénica Astragalósido IV 25

Figura 24 Correlaciones en los espectros de RMN bidimensionales HMBC,

NOESY/ROESY, HSQC, TOCSY y COSY 36

Figura 25 Pitedulosido J 45

Figura 26 Estructura del Billiosido A (compuesto 1) 47

Figura 27 Principales correlaciones NOESY del compuesto 1 47

Figura 28 Principales corelaciones NOESY de la aglicona del compuesto 1 48

Figura 29 Principales correlaciones HMBC del compuesto 1 48

Figura 30 Espectros HSQC del Billiosido A (compuesto 1) 50

Figura 31 Espectros HMBC del Billiosido A (compuesto 1) 51

Figura 32 Espectros NOESY del Billiosido A (compuesto 1) 52

Figura 33 Estructura del Billiosido B (compuesto 2) 54

Figura 34 Espectros HSQC del Billiosido B (compuesto 2) 56

Figura 35 Espectros HMBC del Billiosido B (compuesto 2) 57

Figura 36 Espectros ROESY del Billiosido B (compuesto 2) 57

Figura 37 Estructura del Billiosido C (compuesto 3) 59

xvi

Figura 38 Espectros HSQC del Billiosido C (compuesto 3) 61

Figura 39 Espectros HMBC del Billiosido C (compuesto 3) 63

Figura 40 Espectros ROESY del Billiosido C (compuesto 3) 63

Figura 41 Estructura del Billiosido D (compuesto 4) 65

Figura 42 Espectros HSQC del Billiosido D (compuesto 4) 67

Figura 43 Espectros HMBC del Billiosido D (compuesto 4) 69

Figura 44 Espectros ROESY del Billiosido D (compuesto 4) 69

Figura 45 Estructura del Billiosido E (compuesto 5) 71

Figura 46 Espectros HSQC del Billiosido E (compuesto 5) 73

Figura 47 Espectros HMBC del Billiosido E (compuesto 5) 75

Figura 48 Espectros ROESY del Billiosido E (compuesto 5) 76

Figura 49 Estructura del Dipterósido A (compuesto 6) 78

Figura 50 Espectros HSQC del Dipterósido A (compuesto 6) 80

Figura 51 Espectros HMBC del Dipterósido A (compuesto 6) 82

Figura 52 Espectros ROESY del Dipterósido A (compuesto 6) 83

Figura 53 Estructura propuesta para el compuesto 7 86

Figura 54 Espectros HSQC del compuesto 7 88

Figura 55 Espectros HMBC del compuesto 7 90



Figura 58 Espectros ROESY del compuesto 8 96

xvii



Figura 61 Espectros HMBC del compuesto 9 102

Figura 62 Espectros ROESY del compuesto 9 102

Figura 63 Estructura de la florizina 105

Figura 64 Transporte de glucosa a través del epitelio intestinal 106

xviii

ESQUEMAS

Esquema 1 Obtención y separación del extracto metanólico de Billia rosea 38

Esquema 2 Aislamiento y purificación del Billiosido A (compuesto 1) de Billia

rosea 38

Esquema 3 Aislamiento y purificación del Dipterósido A (compuesto 6) y de los

compuestos 7 y 8 de Billia rosea 39

Esquema 4 Aislamiento y purificación del Billiosido B (compuesto 2) de Billia

rosea 40

Esquema 5 Aislamiento y purificación de los Billiosido C, D y E (compuestos 3, 4 y

5, respectivamente) de Billia rosea 41

Esquema 6 Aislamiento y purificación del compuesto 9 de Billia rosea 42

xix

ACRÓNIMOS

1D Unidimensional

2D Bidimensional

Ang Ácido angélico o angeloilo

Ac Ácido acético o acetilo

AcGlc Ácido glucorónico

Ara Arabinopiranosa o arabinopiranosilo

br s Broad singlet / singulete ancho

BuOH n-Butanol 13C Isótopo de carbono con una masa de 13 uma

CC Cromatografía en Columna

CCF Cromatografía de Capa Fina

CHCl3 Cloroformo

CH2Cl2 Diclorometano

COSY COrrelated SpectroscopY

δ Desplazamiento químico respecto al TMS medido en ppm

d Doblete

dd Doblete de dobletes

DEPT Distorsionaless Enhancement by Polarization Transfert

ESI ElectroSpray Ionization

Et2O Éter etílico

EtOAc Acetato de etilo

GC Gas Chromatography

Gal Galactosa o galactopiranosilo

Glc Glucosa o glucopiranosilo 1H Hidrógeno (protio)

H2O Agua

H2SO4 Ácido sulfúrico

HMBC Heteronuclear Multiple-Bond Correlation Spectroscopy

HPLC High Performance Liquid Chromatography

HR-ESI High Resolution-ESI

HSQC Heteronuclear Single-Quantum Coherence Spectroscopy

xx

Hz Herzios

IR Espectroscopia Infrarroja

J Constante de acoplamiento (Hz)

μg Microgramo

m Multiplete

MeOH Metanol

mm Milímetro

MPLC Medium Pressure Liquid Chromatography

MS Mass Spectrometry

m / z Relación masa / carga elemental del ion

NOESY Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY

OH Hidróxilo

ppm Partes por millón

Rha Rhamnosa o rhamnopiranosilo

RMN Resonancia Magnética Nuclear

RP Reversed Phase

Quin Quinovosa o 6-Deoxi-Glucosa

s Singulete

Si Sílica

TLC Thin Layer Chromatography

TMS Tetrametilsilano

VLC Vacuum Liquid Chromatography

Xyl Xilosa o xilopiranosilo

1

Introducción General

2

La relación entre las plantas y los humanos ha existido desde el momento en que el hombre

utilizó los vegetales para satisfacer sus necesidades de supervivencia, ya sea como alimento, para

producir calor, para abrigarse, en la construcción, como ornamento y para procurar su salud. A lo

largo de este proceso, el ser humano adquirió conocimientos detallados de la localización y las

características estructurales de la vegetación que aprovechaba. Para la etnobotánica, documentar

el uso de las plantas medicinales, reviste especial interés por su potencial aplicación

farmacológica (Ramos-Hernández et al., 2007).

Las plantas constituyen un recurso valioso en los sistemas de salud de los países en desarrollo.

Aunque no existen datos precisos para evaluar la extensión del uso global de plantas

medicinales, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha estimado que entre el 70% y 90%

de la población de estos países utiliza, rutinariamente, la medicina tradicional para satisfacer sus

necesidades de atención primaria de salud y que gran parte de los tratamientos tradicionales

implica el uso de extractos de plantas o sus principios activos. En algunos países desarrollados,

como Canadá, Francia, Italia y Alemania, el uso de la medicina tradicional es de igual

importancia. De acuerdo a la OMS una planta medicinal es definida como cualquier especie

vegetal que contiene sustancias que pueden ser empleadas para propósitos terapéuticos o cuyos

principios activos pueden servir de precursores para la síntesis de nuevos fármacos. (Robinson y

Zhang, 2011; Bermúdez et al., 2005).

Una de las enfermedades que se ha convertido en una prioridad en el sector de la salud

actualmente es la diabetes mellitus (DM). Se trata de una enfermedad compleja con una

heterogeneidad de mecanismos patogénicos, entre ellos la insuficiencia en la producción de

insulina por parte de las células beta (ß) del páncreas, lo cual ocasiona numerosas alteraciones

metabólicas. El tratamiento de la DM es apoyado por medio de la medicina tradicional con

apoyo de la fitoterapia empírica, que poco a poco ha tomado bases científicas más sólidas. Esta

última opción puede ser de beneficio considerable, porque existe evidencia acerca de la eficacia

en el empleo de fitomedicamentos o suplementos alimenticios sobre la base de vegetales, con

menos efectos secundarios, que son usados como parte de la medicina alternativa (Castro et al.,

2014; Rahmatullah et al., 2012; Patel et al., 2012).

El presente trabajo de investigación pretende realizar el estudio fitoquìmico y biológico Billia

rosea Planch & Lunden, Ulloa & Jorgensen, planta Venezolana usada popularmente para el

tratamiento de la diabetes.

3

Capítulo 1. Billia rosea Planch & Linden, Ulloa & Jorgensen.

Descripción botánica y antecedentes fitoquímicos.

4

I. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA DE LA ESPECIE Billia rosea PLANCH & LINDEN,

ULLOA & JORGENSEN.

Billia rosea (nombre común: Cariseco) es una planta nativa de los bosques húmedos y templados

de las regiones tropicales de Colombia, Costa Rica, Ecuador, Panamá y Venezuela (Figura 1),

donde es conocida como cariseco, usándose las semillas en infusiones por sus propiedades

analgésicas y antidiabéticas (Giraldo et al., 2009). Es utilizada en forma tópica para el

tratamiento de hemorroides y fiebres (Gurib-Fakim, 2003).

Figura 1. Distribución mundial de Billia rosea.

La especie Billia rosea presenta la siguiente clasificación taxonómica:

Reino: Plantae

Clase: Magnoliopsida

Orden: Sapindales

Familia: Sapindaceae

Subfamilia: Hippocastaneae

Género: Billia

Especie: Billia rosea (Planch. & Linden) C. Ulloa & P. Jørg.

La subfamilia Hippocastaneae, perteneciente a la familia Sapindaceae, está conformada por tres

géneros, Aesculus, Handeliodendron y Billia. El género Aesculus está representado por trece

especies distribuidas a través del hemisferio norte. Doce de las trece especies se encuentran en

Asia oriental y América del Norte y una es nativa de Europa (Harris et al., 2016). El género

Handeliodendron solo posee la especie Handeliodendron bodinieri, localizada al suroeste de

China (Harris et al., 2016; Cao et al., 2008). El género Billia está conformado por dos especies,

5

Billia hippocastanum Peyr, distribuida en centro América; y Billia rosea, distribuida en Sur

América (Harris et al., 2016; Forest et al., 2001; Moreno, 1985).

Billia rosea (Figuras 2 y 3) es un árbol que crece hasta aproximadamente 30 metros de altura con

un tronco de 1 m de diámetro y savia amarillenta. Hojas opuestas, trifoliadas de aproximadamente

25 cm de longitud, hojuelas membranáceas y elípticas, inflorescencia en panículas de color

blanco o rosa convirtiéndose en rojo con la edad, fruto subgloboso-periforme, capsular, verdoso

que contiene 1 a 3 gruesas semillas de color café rojizo de sabor amargo con forma hemisférica de

tamaño mediano, miden entre 2 y 4 cm. La corteza del árbol se presenta en trozos de 1-2 mm de

espesor, acalanados, tubulares o en forma de virutas. La superficie externa es de color gris

pardusco. Se caracteriza por su olor débil y su sabor astringente y amargo, además, porque florece

y fructifica a partir de los 15 años (Fonnegra et al., 2007).

Figura 2. Billia rosea (Smithsonian Tropical Research Institute,

http://biogeodb.stri.si.edu/herbarium/species/2612/?search_key=billia)

Figura 3. Fotografía de las semillas del espécimen Billia rosea Planch & Linden, Ulloa & Jorgensen, número

26389 en el Herbario Dr. Víctor Manuel Ovalles (Facultad de Farmacia de la Ciudad Universitaria de Caracas).

6

II. ANTECEDENTES FITOQUÍMICOS

II.A. Generalidades de las saponinas

Las saponinas (del latín ―sapo‖ que significa jabón) son metabolitos secundarios no volátiles

sintetizadas por una gran variedad de plantas (Arif et al., 2009; Moghimipour y Handali, 2015).

Su nombre proviene del latín ―sapo‖ que significa jabón, debido a sus propiedades surfactantes,

ya que reducen la tensión superficial de las soluciones acuosas y, como los jabones, causan la

formación de espumas estables (Anaya, 2003; Evans, 2009; Moghimipour y Handali, 2015).

Tienen diversos usos medicinales, incluyendo actividades antitumorales, hepatoprotectoras,

hemolíticas y antiinflamatorias (Dixon y Summer, 2003; Bink et al., 2003). También disminuyen

el nivel de colesterol en sangre y pueden usarse como coadyuvante en vacunas. Además, las

saponinas se utilizan en la preparación de jabones, detergentes, extintores, champús, cerveza y

cosméticos. Muchas saponinas tienen un sabor amargo y son tóxicas para los peces

(Moghimipour y Handali, 2015).

Las saponinas tienen elevado peso molecular y su aislamiento en estado puro ofrece ciertas

dificultades. A menudo se encuentran como mezclas complejas donde los componentes solo

difieren ligeramente en la naturaleza de los azúcares presentes, o en la estructura de la aglicona.

Se deben emplear varias técnicas cromatográficas para lograr su aislamiento y purificación

(Anaya, 2003; Evans, 2009).

Están formadas por una parte lipofílica (genina o aglicona) y de una parte hidrofílica osídica

(glicona) (Figura 4).

Figura 4. Estructura de la saponina Aescina.

7

Según la estructura de la genina, se conocen dos tipos de saponinas:

- esteroidales (comúnmente triterpenos tetracíclicos (Figura 6a) de esqueleto de

espirostano y furostano (Figura 6b));

- triterpenoidales (triterpenos pentacíclicos) (Figura 6a).

que tienen un origen biogénico común, vía ácido mevalónico y unidades de isoprenos (Figura 5)

(Evans, 2009).

Figura 5. Aplicación de la regla del isopreno en laformación de diversos terpenos (Evans, 2009).

8

Esqueleto esteroideo Esqueleto triterpénico pentacíclico

Figura 6a. Estructuras de los esqueletos de las geninas esteroidales y triterpénicas (Evans, 2009).

Espirostano Furostano

Figura 6b. Estructuras de los esqueletos de las geninas tipo espirostano y furostano (Evans, 2009).

Un subgrupo distinto de las saponinas esteroides es el de los alcaloides esteroideos que

caracterizan a muchos miembros de las solanáceas. Poseen un anillo heterocíclico que contiene

nitrógeno (Figura 7), dando a los compuestos propiedades básicas (Anaya, 2003; Evans, 2009).

Figura 7. Estructura de la Solasodina (Evans, 2009).

9

Generalmente, las geninas están unidas a una o dos porciones glucídicas (saponinas

monodesmosídicas o bisdemosídicas, respectivamente); las más comunes: D-glucosa, ácido D-

gucorónico, D-galactosa, D-xilosa, L-ramnosa y L-arabinosa (Figura 8) (Anaya, 2003; Evans,

2009; Moghimipour y Handali, 2015).

Figura 8. Azúcares más comunes encontrados en saponinas.

Las saponinas esteroidales no están tan ampliamente distribuidas en la naturaleza, como las

triterpenoidales; las saponinas esteroidales abundan especialmente en las monocotiledoneas:

Dioscoraceae, Amarylidaceae, Agavaceae y Liliaceae. También existen saponinas esteroidales en

algunos equinodermos (Anaya, 2003; Evans, 2009).

Estas saponinas poseen un esqueleto de 27 átomos de carbono, proviente de una cetalización

intramolecular de un precursor colestánico (Moghimipour y Handali, 2015).

Las saponinas triterpenoidales, al contrario de las esteroidales, son raras en las

monocotideloneas. Son abundantes en algunas dicotiledóneas, como las cariofiláceas,

sapindáceas, poligaláceas y sapotaceas; también en las fitolacáceas, quenopodiáceas,

ranunculáceas, berberidáceas, papaveráceas, lináceas, zigofilaceas, rutaceas, mirtáceas,

cucurbitáceas, araliáceas, umbelíferas, oleáceas, lobeliáceas, campanuláceas, rubiáceas y

compuestas (Anaya, 2003; Evans, 2009).

Las saponinas triterpenoidales, provenientes de la ciclación del escualeno, se pueden clasificar

principalmente en tres grupos representados por la α-Amirina (esqueleto de ursano), β-Amirina

(esqueleto de oleanano) y Lupeol (Figura 9) (Moghimipour y Handali, 2015).

10

α-Amirina β-Amirina Lupeol

Figura 9. Estructura de las principales geninas de las saponinas triterpenoidales (Evans, 2009).

II.B. Saponinas de Aesculus

Se han realizado numerosos estudios fitoquímicos sobre Aesculus, aislándose saponinas

con núcleo terpénico tipo oleonano (Figura 10), y también flavonoides glicosilados en algunas

especies. El grupo hidroxilo en los átomos de carbono 21 y 22 puede contener varios grupos

poco comunes como se muestra en las figuras 11 y 12 (Liu et al., 2005; Zhang et al., 2006; Liu

et al., 2006; Liu et al., 2008; Lanzotti et al., 2012; Yuan et al., 2012; Yuan et al., 2013; Yuan et

al. 2015).

Figura 10. Esqueleto Oleonano.

11

Ang: angeloil Tig: tigloil Ac: acetil

Mp: 2-metilpropanoil MB: 2-metilbutanoil

Figura 11. Estructuras de los sustituyentes en el grupo hidroxilo de los átomos de C22 y C21 del esqueleto oleanano

en el género Aesculus.

Quinovosa

Fucosa

R1 Ang H R1 Ang Ang

R2 Ang Ang R2 Ang Tig

Figura 12. Estructuras de sustituyentes en el grupo hidroxilo del átomo C21.

Desde 2005 hasta la actualidad se han aislado más de 50 saponinas provenientes de plantas del

género Aesculus. Adicionalmente, en estos estudios se han reportado diferentes actividades

biológicas asociadas a estas saponinas.

Liu et al. en el 2005 aislaron dos saponinas triterpénicas del extracto etanólico de las semillas de

Aesculus assamica. Estas saponinas son: 28-O-acetil-21-O-(4-O-angeloil)-6-deoxi-β-

glucopiranosil-3-O-[ β-glucopiranosil (1→2)-O-[ β-glucopiranosil (1→4)]- β-glucopiranosil]

protoaescigenina y 21-O-(4-O-angeloil)-6-deoxi-β-glucopiranosil-3-O-[ β-glucopiranosil (1→2)-

O-[ β-glucopiranosyl (1→4)]- β-glucopiranosil] protoaescigenina, la estructura de estos

compuestos se representan como saponinas 1 y 2, respectivamente, en la figura 13.

Estas saponinas mostraron actividad contra el hongo Pyricularia oryzae, el cual constituye el

principal problema fitopatológico del arroz. Además, mostraron una débil citotoxicidad en la línea

12

celular K562 (células humanas de leucémia) y HCT-15 (células humanas de carcinoma de colon)

(IC50>100µg/ml).

Saponina 1 Saponina 2 R1 Ac H R2 Ang Ang

Figura 13. Saponinas identificadas en Aesculus assamica por Liu et al., en el 2005.

En el 2006, Liu et al., aislaron una nueva saponina de las semillas de Aesculus assamica

denominada ácido 21β-angeloilprotoaescigenin-3 β-O-[α-L-rhamnopiranosil-(1-3)] β-D-

glucopiranosiduronico (Figura 14) mostrando actividad contra Pyricularia oryzae.

Figura 14. Saponina identificada en Aesculus assamica por Liu et al., 2006.

Posteriormente en el 2008, Liu et al., aislaron tres nuevas saponinas triterpénicas del extracto

metanólico de las semillas de Aesculus assamica; assamicina VI, assamicina VII y assamicina

VIII (Figura 15).

13

Assamicin VI

Assamicin VII

Assamicin VIII

Figura 15. Saponinas identificadas en Aesculus assamica por Liu et al., 2008.

Observando las estructuras de las saponinas aisladas de Aesculus assamica en estas tres

investigaciones, se aprecia que el C-21 posee principalmente dos tipos de sustituyentes, el grupo

angeloil y quinovosas monosustituida con angeloil en posición 3 o disustituida en los carbono 3 y

4.

De Aesculus califórnica también se han aislado saponinas con este tipo de sustituyentes, tal como

lo evidencian los 15 compuestos aislados por Yuan et al. (2013) del extracto etanólico de la

14

cascara de las semillas de esta planta, denominados Aesculósidos C1–C15 (compuestos 1–15,

respectivamente, en la figura 16). Además, algunas de estas saponinas también presentan al grupo

tigloil unido en C-21, mientras que otras saponinas tienen enlazadas a este carbono una

fucopiranosa con grupos angeloil y tigloil en los carbono 3 y 4, respectivamente. A diferencia de

las saponinas de Aesculus assamica, la mayoría de estos aesculósidos poseen grupos acetilos en el

C-22 de la genina y el aesculósido C14 posee un grupo tigloil en este carbono (Yuan et al., 2013).

Adicionalmente, los aesculiósidos C1-C15 mostraron citotoxicidad contra células tumorales de

pulmón humano (A549) (Yuan et al., 2013).

Compuesto R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 1 H Tig Ac CH2OH COOH Gal H Glc 2 OH Tig Ac CH3 CH2OH Gal H Glc 3 H Tig Ac CH3 COOH Gal H Glc 4 H Tig Ac CH2OH COOH Gal Rha H 5 OH Tig H CH3 CH2OAc Gal H Glc 6 OH Tig Ac CH3 CH2OH Gal Rha H 7 OH Ang Ac CH3 CH2OH Gal Rha H 8 OH Tig H CH3 CH2OAc Gal Rha H 9 OH 3-O-angeloil-4-O-tigloil-β-fucopiranosil Ac CH3 CH2OH Gal Rha H

10 OH 3,4-di-O-angeloil-β-fucopiranosil Ac CH3 CH2OH Gal Rha H 11 OH Tig Ac CH3 CH2OH Xyl Rha H 12 H 3-O-angeloil-4-O-tigloil-β-fucopiranosil Ac CH3 CH2OH Gal Rha H 13 OH Tig H CH3 CH2OAc Xyl Rha H 14 OH Tig Tig CH3 CH2OH Gal Rha H 15 H Tig H CH3 CH2OAc Xyl Rha H

Gal: β-D-galactopiranosil; Glc: β-D-glucopiranosil; Rha: α-L-Rhamnopiranosil; Xyl: β-D-Xilopiranosil

Figura 16. Saponinas identificadas en Aesculus californica por Yuan et al., 2013.

Las saponinas del extracto etanólico de las semillas de Aesculus glabra aisladas por Yuan et al.,

en el 2012 no están glicosiladas en C-21, pero poseen grupos tigloil y angeloil tanto en C-21

como en C-22, así como también grupos acetilos en C-22. Estas saponinas se denominan

aesculiósidos G1-G16 (compuestos 1-16, respectivamente, en la figura 17). Una diferencia con

15

respecto a las saponinas de las otras especies, es que estos aesculiósidos poseen una

arabinofuranosa unida al carbono 3 del ácido glucorónico que está enlazado a C-3 de la genina.

Además, los aesculiósidos G11 y G12 poseen un grupo metoxi en el carbono 6 del ácido

glucorónico.

Estas saponinas mostraron citotoxicidad contra células tumorales de pulmón humano (A549) y

contra células humanas de cáncer de próstata (PC-3). Con estos resultados pudieron evaluar la

relación estructura – actividad biológica de estos aesculósidos, encontrando que las saponinas con

grupos angeloil/tigloil tanto en C-21 como en C-22 poseen una mejor actividad que las saponinas

que poseen solamente uno de estos grupos en C-21 o C-22. Sin embargo, no encontraron que el

grupo metoxi del ácido glucorónico de los aesculiósidos G11 y G12 tenga influencia en la

citotoxicidad (Yuan et al., 2012).

Compuesto R1 R2 R3 R4 R5 R6

1 OH Tig H Ac Gal H 2 OH Ang H Ac Gal H 3 H Tig H Ac Gal H 4 H Ang H Ac Gal H 5 OH Ang H H Gal H 6 OH Tig Ang H Gal H 7 OH Ang Tig H Gal H 8 H Tig Tig H Gal H 9 H Tig Ang H Gal H

10 H Ang Tig H Gal H 11 H Ang Tig H Gal CH3

12 H Ang Ang H Gal CH3

13 OH Tig Ac H Glc H 14 OH Ang Ac H Glc H 15 H Tig Ac H Glc H 16 H Ang Ac H Glc H

Gal: β-D-galactopiranosil; Glc: β-D-glucopiranosil

Figura 17. Saponinas identificadas en Aesculus glabra por Yuan et al., 2012.

16

Las saponinas aisladas del extracto metanólico de las ramas y hojas de Aesculus pavia por

Lanzotti et al., 2012, también poseen grupos angeloil y tigloil en C-21, además del grupo acetilo

en C-22 (Figura 18).

Compuesto R1 R2 R3 R4 R5 1 Tig H OH H CH2OH 2 Ang H OH H CH2OH 3 Tig H H OH CH2OH 4 Ang H H OH CH2OH 5 Tig H OH H H 6 Ang H OH H H 7 Tig OH OH H H 8 Ang OH OH H H

Figura 18. Saponinas identificadas en Aesculus pavia por Lanzotti et al., 2012.

Sin embargo, Zhang et al. en el 2006, lograron aislar 12 saponinas nuevas del extracto etanólico

de los frutos de Aesculus pavia, donde tres de estos compuestos poseen un grupo 2-metilbutanoil

enlazado en C-22. Estas saponinas se denominan aesculiósidos Ia-Ie, IIa-IId y IVa-IVc

(compuestos 1-5, 6-9 y 10-12, respectivamente, en la figura 19.

17

Compuesto R1 R2 R3 R4 R5 1 OH H H CH3 Gal 2 OH H H CH2OH Glc 3 H H H CH3 Gal 4 H H H CH2OH Glc 5 H H H CH2OH H 6 OH Ang H CH3 Gal 7 H Ang H CH2OH Glc 8 H Ang H CH3 Gal 9 H Ang H CH2OH H

10 OH Ang MB CH3 Gal 11 H Ang MB CH2OH Glc 12 H Ang MB CH3 Gal


Figura 19. Saponinas identificadas en Aesculus pavia por Zhang et al. 2006.

En el año 2015, Yuan et al. aislaron 16 saponinas del extracto metanólico de las semillas de

Aesculus sylvatica. Estas saponinas poseen grupos tigloil y angeloil tanto en C-21 como en C-22,

así como también grupos acetilos en C-22. Estas saponinas se denominan aesculiósido S1,

aesculiósido S2, aesculiósido IIe, aesculiósido IIf, aesculiósido IIg, aesculiósido IIh, aesculiósido

IIk, aesculiósido IIj, aesculiósido IIId, aesculiósido IIIe, aesculiósido IIIf, aesculiósido G6,

xanifolia-Y8, aesculiósido G9, aesculiósido G10 y xanifolia-Y10 (compuestos 1-16,

respectivamente, en la figura 20). Además, Yuan et al. reportaron que los aesculiósidos S1 y S2

mostraron citotoxicidad moderada contra células humanas de cáncer de pulmón (A549) y células

de cáncer de próstata (PC3).

18

Compuesto R1 R2 R3 R4 R5 1 H Tig Tig OH Glc 2 H Tig Ang OH Glc 3 OH Tig Ac OH Glc 4 OH Tig Ac H Gal 5 OH Ang Ac H Gal 6 H Tig Ac OH Glc 7 H Ang Ac H Gal 8 H Tig Ac H Gal 9 OH Tig Tig OH Glc

10 OH Tig Ang OH Glc 11 OH Tig Tig H Gal 12 OH Tig Ang H Gal 13 H Ang Ang OH Glc 14 H Tig Ang H Gal 15 H Ang Tig H Gal 16 H Ang Ang H Gal


Figura 20. Saponinas identificadas en Aesculus sylvatica por Yuan et al., 2015.

Otras características generales que se puede observar en las saponinas aisladas del género

Aesculus, es que están glicosiladas en C-3, los carbono 15, 16, 21, 22, 24 y 28 pueden estar

hidroxilados, además, el carbono 28 puede estar acetilado.

A pesar de las numerosas investigaciones fitoquímicas realizadas a especies del género Aesculus,

no existen estudios fitoquímicos previos realizados a Billia rosea ni a Handeliodendron.

19

Capítulo 2. Generalidades de la diabetes

20

I. METABOLISMO DE LA GLUCOSA.

El organismo humano precisa energía para mantener una actividad funcional normal. Como

fuentes energéticas tenemos carbohidratos, grasas y proteínas. Una vez ingerida la energía

exógena procedente de la alimentación diaria, el cuerpo humano puede utilizar inmediatamente

esta energía o almacenarla en forma de grasas o glucógeno. Este último puede ser almacenado

únicamente en el hígado o en células de músculo esquelético, acción facilitada por la insulina

(hormona secretada por las células beta (ß) del páncreas). El glucógeno almacenado puede

producir hasta 1.000-2.000 Kcal, mientras que los triglicéridos pueden llegar a producir hasta

250.000 Kcal. Las proteínas también pueden utilizarse como fuente energética mediante la

conversión de aminoácidos a glucosa en fases de ayuno prolongado, pero la pérdida de un 40%

de proteína del cuerpo humano puede dar lugar a consecuencias fatales. Por lo tanto, son las

grasas y los carbohidratos las fuentes de energía más importantes, y se utilizarán unas u otros en

función de las condiciones de ese momento de consumo (López y López, 2008).

La glucosa es un hidrato de carbono simple, necesario para el funcionamiento normal del cuerpo

humano. Los eritrocitos, la médula renal, el cerebro y los testículos utilizan la glucosa como

fuente exclusiva de energía. Esta energía se obtiene mediante el catabolismo de la glucosa

denominada glucólisis. En la misma se degrada la glucosa para obtener ATP y suministrar

precursores para la biosíntesis de componentes celulares. La glucólisis se desarrolla íntegramente

en el citoplasma y en ella una molécula de glucosa se escinde para dar lugar a dos moléculas de

piruvato, generando ATP y NADH (Gil, 2010).

En general, todos los hidratos de carbono deben convertirse en sus correspondientes formas

activadas para poder ser metabolizados, en la mayoría de las rutas, incluida la glucosa, la

activación consiste en la obtención de la forma fosforilada. Por tanto, la fosforilación de la

glucosa es la primera etapa de la glucólisis. En esta reacción irreversible la glucosa se fosforila

por una quinasa a expensas de ATP para convertirse en glucosa 6-fosfato. De esta forma, además

de activarse para su degradación natural, se evita que la glucosa salga de la célula. La glucosa-6-

fosfato después de múltiples reacciones, es convertida en dióxido de carbono y agua (CO2 y

H2O), obteniéndose energía química en el proceso (Gil, 2010).

Los niveles de glucosa sanguínea (glucemia), se deben mantener para permitir el metabolismo de

aquellos tejidos que utilizan glucosa como sustrato primario. Esto se consigue mediante una

regulación entre la captación periférica y la producción hepática de glucosa, manteniéndose en

ayunas unos niveles de glucosa en sangre de 60-110 mg/dl (López y López, 2008; Gil, 2010).

21

La regulación de la glucemia se encuentra principalmente bajo control hormonal, siendo la

insulina y el glucagón las principales hormonas responsables. La elevación de la glucemia

(hiperglucemia) tras el aporte de alimentos causa, de inmediato, un aumento de la secreción

pancreática de insulina e inhibición de la secreción de glucagón. La insulina se trata de una

hormona favorecedora del almacenamiento de la energía y actúa estimulando la absorción de la

glucosa mediante el transportador GLUT4 y el metabolismo de la glucosa, e inhibiendo la

producción de la misma en el hígado. La glucosa después de entrar a la célula, se convierte en

glucosa-6-fosfato por medio de la acción de una enzima que dependiendo del tejido puede ser la

hexoquinasa (todos los tejidos menos hígado) o la glucoquinasa (hígado). La insulina incrementa

la velocidad de las vías metabólicas que utilizan glucosa, tales como la glucólisis y la

glucogenogénesis (López y López, 2008; Gil, 2010).

Durante períodos de ayuno se pueden originar episodios leves y transitorios de hipoglucemia

(descenso en los niveles de glucosa en sangre). Habitualmente estos episodios transitorios de

hipoglucemia son regulados y anulados con la producción endógena de glucosa por el hígado

(paso de glucosa del hígado a la sangre), acción facilitada por el glucagón (hormona secretada

por el páncreas), para volver a niveles normales de glucosa en sangre. Así, en condiciones de

ayuno se observa un aumento en los niveles de producción de glucagón por el páncreas para

mantener niveles de glucemia mediante la producción de glucosa por el páncreas a través de la

gluconeogénesis (producción de glucosa a partir de lactato, piruvato, glicerol y aminoácidos) y la

glucogenólisis (ruptura de glucógeno para la producción de glucosa). Durante episodios de

ayuno muy prolongado, la producción de glucosa por el hígado cesa, si esto ocurriera sería la

muerte por fallo en la función del cerebro, y entran en juego las grasas como fuente energética

principal (Figura 21) (López y López, 2008).

Cuando una persona sufre diabetes mellitus, la insulina no se secreta en cantidades suficientes o

no se produce una liberación o recepción eficiente de la misma, por lo tanto las células

músculares y adiposas ―ayunan‖, ya que la entrada de la glucosa en las células se ve afectada. En

estos casos, el glucagón, disponible en un relativo exceso, conduce a la activación de la

gluconeogénesis en el hígado y al mismo tiempo bloquea la glucólisis. En este caso, la reacción

final es catalizada por la enzima Glucosa-6-fosfatasa, la cual hidroliza la glucosa-6-fosfato a

glucosa y fosfato inorgánico (Pi), elevando la glicemia a concentraciones mayores de 160mg/dl.

El organismo no responde a este defecto como una concentración de glucosa en la sangre que no

logra entrar a la célula, sino que responde como si en realidad los niveles de azúcar en la sangre

22

son bajos por lo que se activan los mecanismos productores de glucosa en el organismo y se

produce el alza de los niveles de glucosa en sangre (Peretó et al., 2007; Müller, 2008).

Figura 21. Regulación de la glucosa en la sangre (Curtis et al., 2006).

II. DIABETES MELLITUS

El término diabetes mellitus se refiere a un grupo de enfermedades que se caracterizan por la

elevación de la concentración de glucosa en sangre (hiperglucemia) como consecuencia de

defectos de la secreción de insulina, de la acción de la insulina o de ambos. La diabetes mellitus

se clasifica en cuatro tipos de diabetes (Gil, 2010; Giner y Castillo, 2003):

Diabetes Mellitus tipo 1: Tiene un inicio predominante en la infancia y adolescencia. Se

caracteriza por la destrucción autoinmune de las células β de los islotes del páncreas.

Representa el 5-10% de los casos de diabetes.

Diabetes Mellitus tipo 2: Este tipo de diabetes se debe a la insensibilidad a la insulina

combinada con un fracaso de la secreción de esta hormona para superar esta

insensibilidad mediante la hipersecreción, con lo que produce un déficit relativo de la

misma. Es más frecuentes en personas con más de 45 años, representa el 90-95% de los

casos.

23

Diabetes Gestacional: incluye cualquier tipo de diabetes diagnosticada durante el

embarazo, independientemente del origen y si persiste o no después del parto. Las

mujeres que presentan este tipo de diabetes tienen una elevada probabilidad de

desarrollar diabetes tipo-2.

Otros tipos de Diabetes: Otros tipos de diabetes menos frecuentes son formas

secundarias a enfermedades endocrinas, a enfermedades pancreáticas, a fármacos

hiperglucemiantes, o debidas a una alteración genética definida.

El incremento en la incidencia de la diabetes a nivel mundial es preocupante. La Organización

Mundial de la Salud, en el 2017, indicó que:

El número de personas con diabetes ha aumentado de 108 millones en 1980 a 422

millones en 2014.

La prevalencia mundial de la diabetes en adultos (mayores de 18 años) ha aumentado del

4,7% en 1980 al 8,5% en 2014.

La prevalencia de la diabetes ha aumentado con mayor rapidez en los países de ingresos

medianos y bajos.

La diabetes es una importante causa de ceguera, insuficiencia renal, infarto de miocardio,

accidente cerebrovascular y amputación de los miembros inferiores.

Se estima que en 2015 la diabetes fue la causa directa de 1,6 millones de muertes. Otros

2,2 millones de muertes fueron atribuibles a la hiperglucemia en 2012.

Aproximadamente la mitad de las muertes atribuibles a la hiperglucemia tienen lugar

antes de los 70 años de edad. Según proyecciones de la OMS, la diabetes será la séptima

causa de mortalidad en 2030.

Los tratamientos son diversos, tanto farmacológicos (hipoglicemiantes orales e insulina) como

modificación de los estilos de vida (alimentos, actividad física). Sin embargo, para el tratamiento

de diversas enfermedades crónicas –entre ellas la diabetes- se ha incluido terapias alternativas y

naturales, como el uso de diversas plantas medicinales o metabolitos secundarios (Rodrigo et al.,

2011; Murillo et al., 2006).

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), aproximadamente el 80% de la población

mundial utiliza actualmente las hierbas medicinales en la curación de diversas dolencias

(Robinson y Zhang, 2011). Entre las especies estimadas de 400.000 plantas, sólo el 6% ham sido

estudiadas para la actividad biológica, y alrededor del 15% han sido investigadas

24

fitoquímicamente. Esto demuestra la necesidad de la actividad guiada de evaluación

fitofarmacológica prevista de medicamentos a base de hierbas (Smith et al., 2012).

Existen numerosas especies vegetales con posible actividad hipoglucemiante procedentes de

diferentes medicinas tradicionales, entre ellas, Gymnema silvestre, Heinsia crinata, Astragalus

membranaceus, Momordica cimbalaria y Garcinia kola Heckel (López, 2006).

Gymnema Sylvestre es una planta trepadora de los bosques tropicales del centro y el sur de la

India y en partes de África. Los metabolitos secundarios mayoritarios en esta planta son

saponinas triterpénicas del tipo oleanano (ácidos gymnemicos y gymnemasaponinas) y

dammarano (gymnemasidos) (Figura 22) (Vaidya, 2011).

Figura 22. Estructura de las geninas de las saponinas tipo oleanano (izq) y damnaramo (der) de Gymnema sylvestre.

Se ha demostrado que los ácidos gimnénicos estimulan las células de los islotes de Langerhans

pancreáticos, incrementando el nivel de insulina. En otros experimentos in vitro se ha observado

que el aumento en la secreción de insulina se debe más al aumento de la permeabilidad de las

células beta pancreáticas, que a la estimulación de la exocitosis de insulina. Además actúan en la

cavidad oral uniéndose a los receptores presentes en las papilas gustativas e impidiendo su

activación por la glucosa, y sobre la pared intestinal impidiendo la absorción de glucosa (Vaidya,

2011).

Por lo tanto, la actividad hipoglucemiante es debida por una parte a una disminución de la

absorción intestinal de la misma y por otra a un aumento en la producción de insulina por el

páncreas (Vaidya, 2011).

Miikue-Yob et al., en el 2013, estudiaron el efecto antidiabético del extracto acuoso de hojas de

Heinsia crinata sobre las actividades de las enzimas hexoquinasa, la glucoquinasa y

fosfosfructoquinasa, y los niveles de glucógeno hepático en ratas diabéticas. La glucoquinasa

25

cataliza la fosforilación de las D-glucosa, la hexoquinasa fosforila las hexosas incluida la D-

glucosa y la fosfofructoquinasa permite la fosforilación de la fructosa-6-fosfato.

Estos investigadores encontraron que el potencial contra la diabetes del extracto se debe

predominantemente por su contenido de saponinas que actúa mediante la estimulación de las

actividades de las enzimas glucolíticas clave hacia un aumento del flujo de glucosa para la

utilización de la energía celular en lugar de la producción de glucógeno.

La fosforilación de estos azucares son puntos irreversibles conocidos como puntos de regulación

y las enzimas que catalizan esos puntos se consideran enzimas clave del metabolismo de

carbohidratos. La actividad de estas enzimas se ve afectada en condiciones diabéticas ya que

están reguladas por la insulina. Es por ello que estas enzimas y la glucosa-6-fosfatasa se

consideran objetivos potenciales para fármacos antidiabéticos (Miikue-Yob et al., 2013).

Lo anterior, fue la base de la investigación de Lv et al., en el 2010. Estos investigadores

trabajaron con el Astragalósido IV (Figura 23), una saponina triterpénica aislada de Astragalus

membranaceus, para evaluar su efecto sobre estas enzimas, descubriendo que posee un efecto

hipoglucémico en ratones diabéticos mediante la inhibición de las actividades hepáticas de la

glucógeno fosforilasa hepática y la glucosa-6-fosfatasa.

Figura 23. Estructura de la saponina triterpénica Astragalósido IV.

Otra saponina triterpénica, en este caso aislada de Momordica cimbalaria, posee actividad

antidiabética potencial con respecto a la secreción de insulina, atribuida a la modulación de los

canales de calcio, y el rejuvenecimiento de las células beta (Koneri et al., 2014).

26

El extracto de saponinas de la raíz de Garcinia kola mostró actividad antidiabética en ratas

albinas Wistar. Se postula que el efecto antidiabético se debe en parte a la liberación de insulina

por las células existentes del páncreas (Smith et al., 2012)

Las saponinas presentes en estas plantas poseen actividad antidiabética asociada al efecto que

ejercen sobre diferentes procesos del metabolismo de la glucosa. Así, pueden modular la

absorción intestinal de glucosa, actuar sobre las células betas del páncreas encargadas de liberar

la insulina o sobre las enzimas que permiten la fosforilación de la glucosa y otros glicósidos. Es

por ello que en este trabajo se pretendió aislar las saponinas presentes en Billia rosea y

determinar sus posibles propiedades antidiabéticas, para esto, se utilizaron dos modelos; se

evaluó la capacidad de inhibición de estos compuestos sobre la glucosa-6-fosfatasa y sobre la

absorción de glucosa a nivel intestinal.

27

Capítulo 3. Hipótesis y objetivos

28

I. HIPÓTESIS

En vista de que los antecedentes muestran que las especies pertenecientes a la familia

Sapindaceae biosintetizan saponinas triterpènicas, es de esperar que la especie Billia rosea

Planch & Lunden, Ulloa & Jorgensen resulte ser una fuente de metabolitos secundarios

estructuralmente relacionados con los reportados para esta familia. Más aún, debido a las

propiedades antihiperglicémicas que se atribuyen a algunas de las especies del género Aesculus,

es de esperarse que exista una relación entre el contenido de saponinas en Billia rosea y su

actividad sobre el sistema glucosa-6-fosfatasa.

II. OBJETIVOS.

II. A. Objetivo general

Realizar el estudio fitoquímico y evaluar la actividad sobre el sistema enzimático G-6-

Pasa y la absorción intestinal sobre ratas Sprague Dawley de los metabolitos secundarios

presentes en la especie Billia rosea Planch & Lunden, Ulloa & Jorgensen.

II.B. Objetivos específicos

Aislar los metabolitos secundarios mayoritarios de la especie Billia rosea Planch &

Lunden, Ulloa & Jorgensen.

Purificar los metabolitos secundarios aislados de Billia rosea Planch & Lunden, Ulloa &

Jorgensen por técnicas cromatográficas como CC, MPLC y HPLC.

Caracterizar los metabolitos secundarios aislados de Billia rosea Planch & Lunden, Ulloa

& Jorgensen por métodos espectroscópicos y espectrofotométricos como RMN, IR, UV,

masas.

Medir la posible actividad de los metabolitos secundarios aislados de Billia rosea Planch

& Lunden, Ulloa & Jorgensen; sobre el sistema enzimático glucosa-6-fosfatasa y evaluar

la absorción intestinal de glucosa sobre ratas Sprague Dawley.

29

Capítulo 4. Estudio fitoquímico de

Billia rosea Planch & Linden, Ulloa & Jorgensen.

30

I. MATERIALES Y METODOLOGÍA EXPERIMENTAL.

I.A. Técnicas generales aplicadas.

I.A.1. Cromatografía Líquida al Vacío (VLC).

La cromatografía líquida al vacío (VLC por sus siglas en inglés, Vacuum Liquid

Chromatography) es una técnica preparativa que utiliza el vacío para agilizar el paso de solvente

por la fase estacionaria. Es utilizada normalmente como separación previa a otras fases de

separación y purificación más exhaustivas como MPLC y HPLC (Hostettman et al., 1998). La

VLC se efectúa con ayuda de un embudo de placa porosa relleno de fase estacionaria, por la cual

se hace pasar la fase móvil aplicando vacío al embudo.

Condiciones cromatográficas.

Fase estacionaria

- Fase normal: se empleó Sílice (60 Å, 60–200 μm, Silicycle).

- Fase reversa: se utilizó Sílice RP-18 Spherical C18 (300 Å, 75–200 μm, Silicycle).

Fase móvil

- Fase normal: CH2Cl2/MeOH/H2O (60:35:5) (v/v)

MeOH/H2O (90:10) (v/v)

Con estas condiciones los taninos quedan retenidos en la sílice y los compuestos de interés son

eluidos.

- Fase reversa: MeOH/H2O (0:100, 50:50, 100:0) (v/v).

Estas condiciones permiten eliminar los azúcares con la fase acuosa, mientras que las saponinas

y otros compuestos (flavonoides, terpenos, etc) son eluidos con las soluciones metanólicas.

I.A.2. Cromatografía de columna (CC).

La cromatografía en columna (CC) utiliza una columna de vidrio vertical que se llena con fase

estacionaria, en la cual se deposita la muestra en la parte superior y se eluye con la fase móvil,

por efecto de la gravedad, permitiendo separar los compuestos de la muestra por las diferentes

interacciones de estos compuestos con las dos fases.

31

Fase estacionaria

- Fase normal: Silica gel 60 (60 Å, 60–200 μm, Merck).

- Fase reversa: Silica gel RP-18 (40–63 mm, Merck).

Fase móvil

- Fase normal:

Hexano/CH2Cl2 (30:70), CH2Cl2, CH2Cl2/MeOH (70:30), MeOH.

CH2Cl2/MeOH/H2O (80:20:2, 70:30:3, 65:35:5, 60:32:7).

- Fase reversa: gradiente de MeOH:H2O (0:100 → 100:0)

I.A.3. Cromatografía líquida de presión media (MPLC).

La cromatografía líquida de mediana presión (MPLC, por sus siglas en inglés, Medium Pressure

liquid chromatography) permite la separación y purificación de los compuestos presentes en una

mezcla. Esta técnica utiliza fase estacionaria de tamaño de partícula más pequeño que la CC, por

lo que debe utilizar bombas para agilizar el paso de la fase móvil por la columna.

Materiales: se utilizaron columnas Büchi (46 x 1,5 cm y 23 x 1,5 cm), con precolumnas Büchi

(110 x 15 mm). La bomba fue una HPLC pump, marca ALLTECH modelo 426. También se

utilizó un colector de fracciones Pharmacia Biotech Superfrac.

Fase estacionaria: Sílice para fase normal (60 Å, 15–40 μm, Merck).

Fase móvil: Diferentes proporciones de la mezcla ternaria CHCl3/MeOH/H2O 80:20:2, 70:30:5

y/o 60:32:7.

I.A.4. Cromatografía en Capa Fina (TLC o CCF) y Cromatografía de Capa Fina de Alta

Eficiencia (HPTLC o CCFAE).

La cromatografía de capa fina es una técnica analítica que permite separar e identificar sustancias

químicas. Es una técnica rápida, simple y eficaz para análisis cualitativos. Esta técnica permite

analizar, de forma general, la polaridad de los compuestos de una mezcla, en función de su

afinidad con la fase móvil y la fase estacionaria, facilitando la selección de un sistema de

32

solvente para una etapa de separación cromatográfica posterior. Además, también permite

monitorear el progreso de separación y purificación de una mezcla de compuestos.

Condiciones cromatográficas.

Fase estacionaria: Para CCF y CCFAE se utilizaron placas de sílica gel 60 F254 de la casa

comercial Merck®.

Fase móvil: Las placas se desarrollaron con diferentes proporciones de la mezcla de

CHCl3:MeOH:H2O:AcOH.

Revelado

Las placas fueron observadas con una lámpara UV a 254 nm y 360 nm antes de revelarlas. El

proceso de revelado consistió en rociar la placa con una solución de vainillina/ácido sulfúrico

(VS), que consiste en una mezcla de H2SO4 2% y Vainillina 1% en etanol en proporción 50:1.

Posteriormente se calentó a 110ºC las placas durante unos segundos y se evaluaron en el visible.

I.A.5. Determinación de la configuración de los azúcares por hidrólisis ácida seguida de

una cromatografía gaseosa.

Esta técnica permite la liberación de todas las unidades osídicas implicadas en enlaces O-

glicosídicos, permitiendo la identificación de las unidades de monosácaridos por comparación

con estándares.

La metodología consistó en someter 2 mg de los compuestos 1–6 a una hidrólisis ácida (2 N de

CF3COOH) por calentamiento (95 ºC), durante 3 horas, para romper los enlaces osídicos.

Después de una extracción con CH2Cl2, la fase acuosa fue neutralizada por evaporaciones

sucesivas utilizando methanol (MeOH), lo azúcares liberados se analizaron mediante TLC en

sílica gel (CHCl3/MeOH/H2O 8:5:1) por comparación con estándares de azúcares (Haddad et al.,

2003 ; Acharya et al., 2009; Hara et al., 1987).

Los residuos de azúcares se disolvieron en piridina anhidra (100 µl), y se añadió L-Cisteína

clorhidrato de éster metílico (0.06 mol/L). Luego de una agitación a 60 °C durante 1 hora, se

añadió 150 µl de HMDS-TMCS (hexametildisilazano-trimetilclorosilano 3:1), y se agitó

nuevamente a 60 °C por otros 30 min. El precipitado se centrifugó y el sobrenadante se

concentró mediante un flujo de N2. El residuo se sometió a partición en n-hexano y agua (0.1 ml

cada uno) y la capa de hexano (1 µl) se analizó por cromatografía de gases (GC). Por lo tanto, los

tiempos de retención de los picos permitieron determinar la configuración de los azúcares (Hara

et al., 1987).

33

Materiales y condiciones

Cromatógrafo de gases Thermoquest con:

- Columna capilar DB-1701 (30 m x 0.25 mm),

- Detector FID (T° de detección a 250 °C),

- Gas de helio (He),

- Temperatura de inyección a 230 °C,

- Temperatura inicial mantenida a 80 °C durante 5 min y luego elevada hasta 270 °C (15 °C /

min).

I.A.6. Espectrometría de masas.

La espectrometría de masas (EM) es una técnica de análisis que proporciona información sobre

la masa molecular y la fórmula molecular de un compuesto. En esta técnica, las moléculas se

rompen en fragmentos (neutros o iónicos) al hacer incidir partículas de alta energía sobre las

mismas. Los fragmentos cargados, al entrar en contacto con el detector, se registran en el

espectro de masas según la relación de masa/número de cargas (m/z, donde z = 1 generalmente)

(Gross, 2004). Ademas, existe la espectrometría de masas de alta resolución (EMAR o HRMS)

que permite obtener la fórmula molecular real de un compuesto utilizando pequeñas cantidades

del mismo.

Existen varios métodos de ionización, pero la utilizada en este trabajo es la ionización por

electro-neubolización.

Materiales: Para los espectros de HRESIMS (ion positivo) se usó un Bruker micrOTOF

spectrometer; para los espectros ESIMS (ion positivo) un instrumento Finnigan LCQ Deca

spectrometer.

I.A.7. Espectrometría de Resonancia Magnética Nuclear.

La espectrometría de resonancia magnética nuclear (RMN) es una herramienta muy útil en la

determinación estructural de compuestos orgánicos. En esta técnica, la sustancia de interés es

sometida a una radiación de una frecuencia dada (4MHz a 750 MHz), en el seno de un campo

magnético exterior, absorbiendo energía para cambiar la orientación de los núcleos (de sus

momentos magnéticos). Esta absorción de energía se registra en un espectrograma o espectro de

34

RMN. Pueden analizarse una amplia variedad de núcleos, sin embargo los más estudiados en

Química Orgánica son 1H y 13C.

Los datos de RMN se pueden representar en espectros unidimensionales (1D) o bidimensionales

(2D); con estos últimos pueden observarse correlaciones homonucleares (entre dos núcleos

iguales) o heteronucleares (entre dos núcleos diferentes).

Material: Los espectros de RMN 1D (1H, 13C) y 2D (COSY, TOCSY, NOESY, HSQC y

HMBC) se registraron en un espectrómetro Bruker Avance con una frecuencia de

funcionamiento de 500 MHz para el compuesto 1.

Los espectros RMN 1D (1H, 13C) y 2D (COSY, TOCSY, ROESY, HSQC y HMBC) se

registraron en un espetrómetro Varian VNMR-S 600 MHz para los compuestos 2–9. En estos

equipos, los espectros de RMN 1H se registraron a 500MHz y 600 MHz, respectivamente,

mientras que los de 13C se realizaron a 150 MHz; el solvente utilizado para la realización de los

espectros fue la piridina deuterada (piridina-d5) a una temperatura de 35 ºC, reportando los

resultados en ppm. Se empleó las señales de la piridina-d5 como estándar interno (δH = 7.21, δC =

123.5 ppm).

RMN 1H: Este tipo de espectro da información sobre el número y los tipos de hidrógenos

presentes en la molécula. Los distintos desplazamientos químicos (posición en el espectro)

corresponden a diferentes tipos de protones en la molécula, es decir, protones con entornos

químicos diferentes; por lo tanto, permite obtener información sobre los grupos funcionales a los

que pertenecen o que están cerca (Günther, 1994).

El espectro de RMN-1H de una saponina presenta tres zonas de resonancia (Massiot y Lavaud,

1995):

- De 0,5 a 3,0 ppm: los hidrógenos de la genina, en particular los metilos.

- De 3,0 a 4,5 ppm: los hidrógenos de los azúcares excepto los anoméricos, así como

aquellos hidrógenos de la genina ubicados en carbonos con grupos oxigenados.

- De 4,5 a 6,0 ppm: los hidrógenos anoméricos de los azúcares en forma de singuletes

anchos o dobletes y los hidrógenos olefínicos del aglicón.

RMN-13C: al igual que en 1H, el desplazamiento químico da información de los grupos

funcionales. Dependiendo del tipo de experimento realizado se puede obtener información del

35

número de hidrógenos unidos a cada carbono. Uno de estos experimentos es el DEPT, que es un

técnica que permite aumentar la sensibilidad con núcleos poco sensibles que estén acoplados con

otro núcleo activo de mayor sensibilidad (1H generalmente). Así, para 13C se hace posible

discriminar entre CH, CH2, CH3 y los C cuaternarios (no aparecen en el DEPT) se deducen por

diferenciación con el espectro de banda ancha.

El espectro de RMN-13C de una saponina se observan las siguientes zonas (Massiot y Lavaud,

1995):

Zona del aglicón: comprendida de 10 a 68 ppm se ubican los carbonos de la genina.

Zona de los azúcares: entre 60 y 90 ppm se localizan los carbonos correspondientes a

alcoholes primarios y secundarios de los azúcares así como del aglicón.

Zona anomérica: después de 90 ppm se encuentran principalmente los carbonos

anoméricos de los azúcares (90-111 ppm) y los carbonos olefínicos y carbonilos del

aglicón.

HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): En este experimento se observan las

correlaciones entre los carbonos y sus respectivos hidrógenos, es decir los acoplamientos H-C

directos (1JH-C).

El HSQC permite identificar todos los carbonos y sus correspondientes hidrógenos tanto de la

genina como de los azúcares (Figura 24).

HMBC (Heteronuclear Multiple-Bond Correlation): este experimento 2D permite tener

información sobre las correlaciones H-C a través de dos o tres enlaces (2JH-C y 3JH-C). En

ocasiones se puede llegar a observar correlaciones hasta cuatro enlaces.

El HMBC es crucial en la determinación de la estructura del aglicón en las saponinas y además

permite determinar la secuencia de los azúcares y los puntos de unión entre el aglicón y las

cadenas glicosídicas (Figura 24).

COSY (COrrelated SpectroscopY): con los experimentos 1H-1H COSY se pueden observar los

acoplamientos entre hidrógenos vecinales (2JH-H) y geminales y (3JH-H).

El COSY es utilizado para determinar el orden de los hidrógenos en un esqueleto de un azúcar

(Figura 24).

36

TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY): permite conectar todos los protones mutuamente

apareados con el mismo sistema de spin, además verifica las correlaciones de los protones

establecidos mediante el experimento 1H-1H COSY.

El TOCSY, a diferencia del COSY, permite observar e identificar la resonancia de otros

hidrógenos en un azúcar, permitiendo de esta manera establecer el tamaño del anillo glicosídico

entre otras características (Figura 24).

NOESY (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY): Fundamentalmente, el espectro en dos

dimensiones de NOESY muestra todas las combinaciones posibles de protones en la molécula.

Un cruce de picos indica que la pareja de protones está separada por menos de 5Å, mientras que

la ausencia de pico indica una distancia mayor.

El ROESY y el NOESY tienen como objeto determinar la estereoquímica de los carbonos

asimétricos del aglicón, la secuencia de los azúcares y la posición de los enlaces glicósido-genina

(Figura 24).

Figura 24. Correlaciones en los espectros de RMN bidimensionales HMBC, NOESY/ROESY, HSQC, TOCSY y

COSY.

37

I.B. Metodología aplicada

I.B.1. Recolección del material vegetal

Las semillas secas de B. rosea (Planch. & Linden) C. Ulloa & P. Jørg, fueron compradas en la

localidad de Río Claro, Municipio Juárez, Estado Lara, Venezuela; en el mes de junio de 2008.

Estas semillas provienen del Parque Nacional Yacambú, Distrito Andrés Eloy Blanco, Estado

Lara, Venezuela; e identificadas por el Dr. Stephen Tillett, Botánico del Herbario Dr. Víctor

Manuel Ovalles, Facultad de Farmacia, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela;

depositándose un espécimen bajo el número 26389, en el herbario mencionado.

I.B.2. Obtención de los extractos de Billia rosea.

Un total de 679,89 g de las semillas de B. rosea fueron molidas y sometidas a percolación con

metanol frio (3 x 4 L), obteniéndose 115,03 g del extracto metanólico frio (EMBi). Siguiendo la

metodología, 43,16 g de este extracto se suspendieron en 500 mL de H2O, en un embudo de

separación y se extrajeron con AcOEt (2 x 250 mL), obteniendo las fracciones de AcOEt (7.49 g

EABi) y H2O (31.1 g EACBi). La fracción EABi (5.6 g) se sometió a CC, utilizando silica gel

60, eluida sucesivamente con Hexano/CH2Cl2 30:70, CH2Cl2, CH2Cl2/MeOH 70:30 y MeOH,

obteniendo 8 fracciones (EABi1–EABi8). La fracción EABi7 (1.8 g) se separó mediante

cromatografía de columna rellena con silica gel 60, eluida sucesivamente con

CH2Cl2/MeOH/H2O 80:20:2, 70:30:3 y 65:35:5, obteniendo 3 fracciones (EABi71–EABi73).

Posteriormente, la fracción EABi72 (0.35 g) se separó mediante cromatografía de columna con

silica gel 60, eluida con CHCl3/MeOH/H2O 60:32:7, obteniendo el compuesto 1 (30.3 mg)

(Esquemas 1 y 2).

El extracto acuoso EACBi (31.1 g) se suspendió en 500 ml de H2O en un embudo de separación

y se se extrajo 2 veces con 250 mL de n-BuOH, obteniéndose 8,00 g del extracto acuoso

(EACBi2) y 20,97 g, del extracto butanólico (EBBi). Los 20,97 g de EBBi se solubilizaron en

40mL de MeOH, adicionándole Et2O (2 x 100 mL) obteniéndose 13,31 g de una pasta marrón,

que se denominó ―Crudo de saponinas de B. rosea‖ (CsBi) (Esquema 1).

38

Esquema 1. Obtención y separación del extracto metanólico de Billia rosea.

Esquema 2. Aislamiento y purificación del Billiosido A (compuesto 1) de Billia rosea.

39

13,31 g de CSBi fueron separados por VLC sobre silica gel utilizándose como eluyentes

CH2Cl2/MeOH/H2O 65:35:5 y MeOH/H2O 90:10, obteniendo dos fracciones (2.31 g) y CSBi2

(7.45 g). El extracto CSBi2 (7,45 g) se separó por cromatografía de columna en fase reversa (RP-

18, 40–63 µm), utilizándose como eluyente un gradiente de MeOH/H2O (0:100→100:0),

obteniendo 4 fracciones (CSBi2a–CSBi2d). La fracción CSBi2d (203.5 mg) se separó por MPLC

en fase normal (Silica gel 60) utilizando como eluyente CHCl3/MeOH/H2O 75:26:3 y 70:30:5,

obteniendo los compuestos 6 (4.9 mg), 7 (7.9 mg) y 8 (2.6 mg). La fracción CSBi2d se sometió a

un proceso de separación similiar, obteniendo los compuestos 7 (2.7 mg) y 8 (1.4 mg) (Esquema

3).

Esquema 3. Aislamiento y purificación del Dipterósido A (compuesto 6) y de los compuestos 7 y 8 de Billia rosea.

40

Una porción del estracto metanólico (2.9 g) se sometió a VLC en RP-18, utilizando mezclas de

MeOH/H2O (0:100, 50:50, 100:0) como eluyente, obteniendo 3 fracciones (F1, F2 y F3). La

fracción F2 (150 mg) se sometió a MPLC en silica gel 60 (CHCl3/MeOH/H2O 60:40:8),

posteriormente en MPLC en RP-18 (gradiente de MeOH/H2O 10:90→100:0), obteniendo el

compuesto 2 (5.4 mg) (Esquema 4).

Esquema 4. Aislamiento y purificación del Billiosido B (compuesto 2) de Billia rosea.

Otra porción del EMBi (4.0 g) se separó mediante VLC en RP-18 (gradiente de MeOH/H2O

10:90→100:0), obteniendo tres fracciones (A, B y C). La fracción B se sometió a sucesivas

separaciones mediante MPLC en silica gel 60 (15–40 mm), utilizando como eluyente mezclas

ternarias de CHCl3/MeOH/H2O (80:20:2, 70:30:5 y 60:32:7), obteniendo los compuestos 3 (5.4

mg), 4 (4.4 mg) y 5 (4.4 mg) (Esquema 5).

41

Esquema 5. Aislamiento y purificación de los Billiosido C, D y E (compuestos 3, 4 y 5, respectivamente) de Billia

rosea.

Por último, otra fracción del extracto EMBi (350 mg) se sometió a tres etapas sucesivas de

MPLC en fase normal, utilizando CHCl3/MeOH/H2O (80:20:2) como eluyente para las dos

primeras separaciones y CHCl3/MeOH/H2O (70:30:5) para la tercera separación, obteniendo el

compuesto 9 (4.5 mg) (Esquema 6).

42

Esquema 6. Aislamiento y purificación del compuesto 9 de Billia rosea.

43

II. RESULTADOS Y DISCUSIONES.

Partiendo del extracto metanólico de las semillas de B. rosea se logró aislar 10 productos puros

(compuestos 1–9). Estos productos, mostraron una polaridad relativamente alta y revelaron como

manchas purpuras-azules en vainillina-ácido sulfúrico, sugiriendo su naturaleza de triterpenos

glicosilados (Hiai et al., 1976). Por lo tanto, se siguió una metodología basada principalmente en

procedimientos cromatográficos para la separación de saponinas.

En este trabajo se discutirá la identidad de los compuestos 1–6. Las estructuras de los

compuestos 7–9 no se lograron elucidar por completo debido a la ausencia de algunas señales en

los espectros de RMN, por lo tanto, solo se realizará una proposición de las posibles estructuras

de estos productos.

II.A. Hidrólisis ácida y análisis GC de azúcares.

Luego de la hidrólisis ácida que permitió liberar los azúcares de los compuestos 1–6, descrita en

I.A.5, se identificó los monosacáridos de estos compuestos por comparación en TLC con

estándares. Los resultados indicaron la identidad de los azúcares como:

- Compuesto 1: D-glucosa, L-arabinosa.

- Compuesto 2: D-glucosa, D-galactosa, L-arabinosa.

- Compuesto 3: D-glucosa, D-galactosa, L-arabinosa, D-xilosa.



- Compuesto 6: D-glucosa, L-arabinosa.

Estos resultados se confirmarion por GC mediante la comparación de los tiempos de

retención por la co-inyección de los hidrosilatos de los azúcares de las muestras con el de los

estándares:

- D-xilosa: 13.4 min

- D-galactosa: 19.6 min

- D-glucosa: 18.6 min

- L-arabinosa: 11.9 min

44

II.B. Determinación estructural del compuesto 1

Espectrometría de masa

El compuesto 1 se aisló como un sólido blanco amorfo soluble en solventes polares como agua,

metanol y etanol. El HRESIMS (modo ion positivo) de 1 mostró un pico de ion molecular a m/z

1191.5911 [M+Na]+ consistente con la formula molecular C59H92O23. El espectro ESIMS (modo

ion positivo) muestra un pico de ion molecular a m/z 1169 [M+H]+ confirmando el peso

molecular de 1168.

Espectroscopía de RMN

Naturaleza de la aglicona

Los espectros de RMN de 1H y 13C de 1 (Tabla 1) mostraron seis singletes a δH 1.33, 0.59, 0.87,

1.24, 1.07, 1.26, que se correlacionaron mediante señales HSQC (Figura 30) a seis carbonos a δC

22.6, 15.3, 17.2, 26.3, 29.3, 19.9, respectivamente; un singlete ancho a δH 5.42, típico del protón

de Δ12 del esqueleto de oleanano, confirmado por la señal δC 122.8 (C-12) y 143.9 (C-13) en el

especto de RMN-13C y por correlación HMBC de δH/δC 1.24 (H3-27)/143.9 (C-13) (Figuras 29 y

31); señales de un alcohol primario a δH 3.30, 4.25 (2H, ambos m, Agly H2-24); tres protones de

metinos enlazados a oxígenos a δH 3.33 (Agly H-3), 5.54 (Agly H-21), 6.03 (d, J = 10.4 Hz, Agly

H-22), respectivamente; y un resto de ácido carboxílico a δC 178.0 (Agly C-28).

La estereoquímica de las posiciones 3, 23, 21, 22 y 24 se determinaron por la conexiones

observadas en el espectro NOESY como H-3α/H-5α, H-3α/H-23α, H-21α/H-29α, H-22β/H-30β

and H-22β /H-18β (Figura 27, 28 y 32). La correlación NOESY entre H-23α/H-5α revela la

orientación β del alcohol primario en C-24. Estos datos permitieron la identificación de la genina

como ácido 3β,21β,22α,24-tetrahidroxi-olean-12-en-28-oico, encontrado previamente como

genina del aesculósido C1 en Aesculus califórnica (Yuan et al., 2013) y del dipterósido A en

Dipteronia dyeriana (Guo et al., 2008).

Adicionalmente, un análisis exaustivo de los espectros RMN permitió la elucidación de un resto

monoterpenico (MT) (Tabla 1, Figuras. 27, 29–32). Algunas correlaciones características en el

espectro HMBC de MT a δH/δC 1.98 (H3-9)/(168.0) C-1, 1.98 (H3-9)/127.5 (C-2), 168.0 (C-1),

143.9 (C-3), y 7.15 (H-3)/12.6 (C-9) permitió localizar un doble enlace en MT C-2 y las

correlaciones HMBC de MT δH/δC 5.54 (H-8a)/146.6 (C-7), 72.1 (C-6), 5.14 (H-8b)/72.1 (C-6),

6.10 (H-7)/72.1 (C-6) y 1.43 (H3-10)/72.1 (C-6), 146.6 (C-7) confirmaron la posición del

segundo doble enlace a MT C-7. Estas posiciones fueron confirmadas por la observación de las

45

correlaciones NOESY entre los protones H3-9/H-4a, H3-9/H-3, H-8a/H-7 y H-8b/H7 de MT (Fig.

3). Los desplazamientos químicos de RMN-13C de MT C-5, MT C-6, MT C-7, MT C-10 a δC

41.6, 72.1, 146.6, y 28.6, respectivamente, son casi superponibles con los del MT del compuesto

Pitedulósido J (Figura 25), el cual mostró una configuración S en C-6 del MT terminal

(Yoshikawa et al.,1997). Por lo tanto, se deduce que la configuración de C-6 del MT es S. Los

isómeros 6R reportados en la literatura muestran diferencias en los desplazamientos químicos, en

comparación con los isómeros 6S, con C-5 (-1.6 ppm), C-4 (0.6 ppm), y C-8 (0.6 ppm) (Kiuchi

et al., 1997). Además, se dedujo que la configuración del doble enlace trisustituido Δ2 de MT es

2E debido a la observación de la señal NOESY δH/δH 1.98 (H3-9)/2.50 (H2-4) (Figura 27, 28 y

32). Por lo tanto, el grupo MT se identificó como ácido (2E,6S)-2,6-dimetil-6-hidroxi-2,7-

octadienoico, conocido en la literatura como ácido (6S)-mentiafólico (Kiuchi et al., 1997). La

observación del desplazamiento de una acilación en C-21 de la aglicona en δH/δC 5.54/76.7

permitió localizar la unidad de monoterpeno en esta posición.

Además, se observaron señales características de RMN de un grupo acetilo (δH 2.05; δC 21.1,

168.8) que se asignaron por HSQC y HMBC. El desplazamiento químico de campo bajo de δH

6.03 (d, J = 10.4 Hz, Agly H-22) indicó una acilación en C-22 por un grupo acetilo.

Figura 25. Pitedulosido J (Yoshikawa et al.,1997)

46

Determinación de la naturaleza de los azúcares, su secuencia y conexión con la aglicona

Con respecto al oligosacárido, el espectro HSQC mostró señales cruzadas de tres

protones/carbonos anoméricos a δH/δC 4.73/104.5, 5.63/104.3 y 4.99/105.7, respectivamente

indicando la presencia de tres unidades de azúcares.

La asignación completa del sistema de hidrógenos de cada monosacárido se realizó con los

espectros COSY y TOCSY del compuesto, los átomos de carbono para cada azúcar se asignaron

con los espectros HSQC y HMBC; y por último, la estereoquímica de cada monosacárido se

determinó con el NOESY. La comparación de la data reportada en la bibliografía con los valores

de los desplazamientos químicos obtenidos para los monosacáridos del compuesto 1 permitió

identificar las azúcares como dos unidades de Glc (GlcI y GlcII), y una de Ara (Tabla 2).

Debido a la observación de la correlación en el espectro HMBC de δH/δC 4.73 (GlcI H-1)/91.0

(Agly C-3), se encontró que la unidad de GlcI está unida al C-3 de la aglicona. El espectro

HMBC también mostró correlaciones a δH/δC 5.63 (GlcII H-1)/80.1 (GlcI C-2), y δH/δC 4.99 (Ara

H-1)/80.2 (GlcI C-4), probando la unión (1 → 2) entre GlcII y GlcI; y la unión (1 → 4) entre Ara

y GlcI (Figuras 29 y 31). Estas uniones se confirmaron por la observación de señales NOESY de

Ara-1/GlcI-4, GlcII-1/GlcI-2 y GlcI-1/Agly-3 (Figura 27 y 32).

Conclusión

Por lo tanto, en base a estos resultados, se estableció la estructura de 1 como ácido (3β,21β,22α)-

3-[(2-O-β-D-glucopiranosil-O-[α-L-arabinopiranosil-(1→4)]-β-D-glucopiranosil)oxi]-21-

[((2E,6S)-2,6-dimetil-6-hidroxiocta-2,7-dienoil)oxi]-22-(acetiloxi)-24-hidroxiolean-12-en-28-

oico, llamado Billiosido A (Figura 26).

Esta saponina es un nuevo compuesto en la bibliografía de productos naturales. Vale destacar

que ninguna de las saponinas aisladas hasta el momento de las plantas de la subfamilia

Hippocastanaceae poseen en su estructura un resto de ácido monoterpénico (MT).

47

Figura 26. Estructura del Billiosido A (compuesto 1).

Figura 27. Principales correlaciones NOESY del compuesto 1.

48

Figura 28. Principales corelaciones NOESY de la aglicona del compuesto 1.

Figura 29. Principales correlaciones HMBC del compuesto 1.

49

Tabla 1. Desplazamientos químicos de RMN-1H (500 MHz) y 13C (150 MHz) de la aglicona del Billiosido A (compuesto 1), en piridina-d5.

Aglicona del Billiosido A (compuesto 1)

Pos. δC δH Pos. δC δH 1 38.4 0.79, 1.28 22 74.6 6.03 d (10.4) 2 26.7 1.78, 2.16 m 23 22.6 1.33 s 3 91.0 3.33 24 63.4 3.30, 4.25 4 43.7 - 25 15.3 0.59 s 5 56.2 0.79 26 17.2 0.87 s 6 17.4 1.16, 1.48 m 27 26.3 1.24 s 7 33.2 1.18 m, 1.35 28 178.0 - 8 39.7 - 29 29.3 1.07 s 9 47.8 1.52 30 19.9 1.26 s 10 36.6 - MT-1 168.0 - 11 24.2 1.72 m, 1.83 2 127.5 - 12 122.8 5.42 br s 3 143.9 7.15 t (7.3) 13 143.9 - 4 24.0 2.44 m, 2.50 m 14 42.3 - 5 41.6 1.77, 1.80 15 28.5 1.05, nd 6 72.5 - 16 20.9 2.10, 2.35 7 146.6 6.10 dd (17.3, 10.8) 17 52.5 - 8 111.7 5.14 dd (10.8, 1.5),

5.54 18 43.7 3.57 m 9 12.6 1.98 s 19 46.5 1.43, 2.20 m 10 28.5 1.43 s 20 36.5 - Ac-1 168.8 - 21 76.7 5.54 2 21.1 2.05 s

Tabla 2. Desplazamientos químicos de RMN-1H (500 MHz) y 13C (150 MHz) de los azúcares del Billiosido A (compuesto 1), en piridina-d5.

Azúcares del Billiosido A (compuesto 1) Pos. δC δH Pos. δC δH Pos. δC δH 3-O- GlcI-1 104.5 4.73 d (7.6) GlcII-1 104.3 5.63 d (7.5) Ara-1 105.7 4.99 d (7.5) 2 80.1 4.13 2 75.7 4.10 2 72.5 4.46 3 76.7 4.25 3 78.4 4.27 3 74.6 4.10 4 80.2 4.25 4 69.8 4.50 4 69.6 4.24 5 76.6 3.75 5 78.4 3.75 5 67.8 3.78, 4.30 6 61.7 4.30, 4.45 6 61.8 4.45, 4.54

50

Figura 30. Espectros HSQC del Billiosido A (compuesto 1).

51

Figura 30 (continuación). Espectros HSQC del Billiosido A (compuesto 1).

Figura 31. Espectros HMBC del Billiosido A (compuesto 1).

52

Figura 32. Espectros ROESY del Billiosido A (compuesto 1).

53

II.C. Determinación estructural del compuesto 2



metanol y etanol. La formula molecular del compuesto 2 se determinó como C53H88O23 mediante

el pico de ion molecular en HRESIMS a m/z 1115.5623 [M+Na]+. El espectro ESIMS (modo ion

positivo) mostró un pico de ion molecular a m/z 1093 [M+H]+ confirmando la masa molecular de

1092.



El 1H-NMR mostró siete singletes a at δH 1.30, 1.10, 0.87, 0.98, 1.29, 1.25, 1.22, asignados a

siete grupos metilos en la aglicona, los cuales mostraron correlación en HSQC con δC 28.2, 16.8,

15.7, 17.0, 26.3, 30.3, 19.3, respectivamente (Figura 34, Tabla 3); también mostró señales

características de un oximetil correspondiente a un alcohol primario de δH 4.14 (Agly Ha-28), y

tres señales de protones de oximetinos característicos de alcoholes secundarios de δH 3.22 (dd, J

= 11.6, 4.3 Hz, Agly H-3), 3.78 (d, J = 10.0 Hz, Agly H-21), 4.42 (Agly H-22), respectivamente.

La configuración de H-3, H-21 y H-22 de la aglicona se determinó mediante la observación de

las correlaciones en el espectro ROESY: H-3α/H-5α, H-3α/H-23α, H-21α/H-29α, H-22β/H-30β y

H-22β/H-18β (Figura 36). Por lo tanto, se identificó la aglicona como un triterpeno tipo

tetrahidroxioleanano de nombre olean-12-ene-3β,21β,22α,28-tetrol, previamente reportado como

16-deoxibarringtogenol C o saniculagenina C (Errington y Jefferies, 1988; Li et al., 2008; Li et

al., 2013; Yu et al., 2012).


Las correlaciones HSQC a δH/δC 4.79/104.9, 5.24/106.6, 4.97/105.4 y 4.99/105.5, reveló la

presencia de cuatro unidades de azúcares en 2. Estos sacáridos se identificaron mediante análisis

de RMN 1D y 2D como unidades de GlcI, GlcII, Gal y Ara (Tabla 4).

La correlación en el espectro HMBC entre δH 3.22 (Agly H-3) y δC 104.9 (GlcI C-1) (Figura 35)

y la correlación en el espectro ROESY entre δH 3.22 (Agly H-3) y δH 4.79 (GlcI H-1) (Figura 36)

indicó que GlcI está unida a C-3 de la aglicona. Las señales en el espectro HMBC a δH/δC 5.24

(Gal H-1)/82.6 (GlcI C-2) sugiere que la secuencia en C-3 es 2-O-β-D-galactopiranosil-β-D-

54

glucopiranosil, lo cual se confirmó por las correlaciones ROESY a δH/δH 5.24 (Gal H-1)/4.22

(GlcI H-2).

Además, las correlaciones en el espectro HMBC a δH/δC 4.14 (Agly Ha-28)/105.4 (Glc II C-1) y

4.99 (Ara H-1)/80.1 (GlcII C-4) permitió determinar la secuencia de C-28 como α-L-

arabinopiranosil-(1 → 4)-β-D-glucopiranosil, lo cual se confirmó con la correlación ROESY de

δH/δH 4.99 (Ara H-1)/4.26 (GlcII H-4).

Conclusión

Todos estos datos indicaron que 2 es consistente con la estructura de (3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-

galactopiranosil-β-D-glucopiranosil)oxi]-21,22-dihidroxiolean-12-en-28-il-O-α-L-

arabinopiranosil-(1 → 4)-β-D-glucopiranosido, nombrado Billiosido B (Figura 33). Esta

saponina es un nuevo compuesto en la bibliografía de productos naturales.

Figura 33. Estructura del Billiosido B (compuesto 2).

55 Tabla 3. Desplazamientos químicos de RMN-1H (600 MHz) y 13C (150 MHz) de la aglicona del Billiosido

B (compuesto 2), en piridina-d5.

Aglicona del Billiosido B (compuesto 2) Pos. δC δH Pos. δC δH 1 38.9 0.86, 1.45 16 18.5 1.95 m, 2.27 br d (13.4) 2 26.5 1.80 m, 2.10 17 43.6 - 3 89.1 3.22 dd (11.6, 4.3) 18 41.9 2.65 dd (13.8, 4.1) 4 40.2 - 19 46.6 1.31, 2.14 t (13.8) 5 55.8 0.72 d (11.8) 20 36.2 - 6 18.5 1.30, 1.49 21 76.9 3.78 d (10.0) 7 32.9 1.25, 1.45 m 22 74.8 4.42 8 39.5 - 23 28.2 1.30 s 9 47.9 1.60 t (8.5) 24 16.8 1.10 s 10 36.8 - 25 15.7 0.87 s 11 23.9 1.88, 1.90 26 17.0 0.98 s 12 123.1 5.33 t-like 27 26.3 1.29 s 13 143.5 - 28 74.3 4.14, nd 14 42.2 - 29 30.3 1.25 s 15 25.8 1.06 br d (11.9), 1.81 30 19.3 1.22 s

Tabla 4. Desplazamientos químicos de RMN-1H (600 MHz) y 13C (150 MHz) de los azúcares del Billiosido B (compuesto 2), en piridina-d5.

Azúcares del Billiosido B (compuesto 2) Pos. δC δH Pos. δC δH 3-O- GlcI-1 104.9 4.79 d (6.9) Gal-1 106.6 5.24 d (7.3) 2 82.6 4.22 2 74.7 4.54 3 76.3 4.24 3 76.8 4.05 4 71.8 4.21 4 69.6 4.68 br d (2.8) 5 76.2 3.75 5 76.2 3.74 6 62.8 4.39, 4.50 6 61.9 4.40, 4.48

28-O- GlcII-1 105.4 4.97 d (7.7) Ara-1 105.5 4.99 d (7.3)

2 75.1 4.03 2 72.5 4.44 3 78.7 4.18 3 74.5 4.10 dd (9.1, 3.4) 4 80.1 4.26 4 69.5 4.24 5 78.4 3.94 m 5 67.7 3.73, 4.26 6 61.5 4.39, 4.59

56

Figura 34. Espectros HSQC del Billiosido B (compuesto 2).

57

Figura 35. Espectros HMBC del Billiosido B (compuesto 2).

Figura 36. Espectros ROESY del Billiosido B (compuesto 2).

58

II.D. Determinación estructural del compuesto 3



metanol y etanol. Este compuesto mostró un pico de ion molecular a m/z 1085.5516 [M+Na]+ en

HRESIMS, correspondiente a la fórmula molecular C52H86O22. El ESIMS (modo ion positivo)

mostró un pico de ion molecular a m/z 1063 [M+H]+ confirmando el peso molecular de 1062.



El análisis de los espectros de RMN del compuesto 3 (Figuras 38–40) permitió constatar que la

zona de la aglicona es aproximadamente superponible a la del compuesto 2. Las correlaciones

HMBC, HSQC y ROESY permitieron identificar la genina del compuesto 3 como

saniculagenina C, idéntica a la del compuesto 2 (Tabla 5).


Las correlaciones HSQC a δH/δC 4.75/105.4, 5.17/107.1, 4.83/103.6 y 4.97/105.4 (Figura 38),

revelaron la presencia de cuatro unidades de azúcares. Estos monosacáridos se caracterizaron

mediante espectros de RMN como Xyl, Ara, Glc, y Gal (Tabla 6).

La correlación en el espectro HMBC a δH/δC 3.21 (Agly H-3)/105.4 (Xyl C-1), 5.17 (Gal H-

1)/83.6 (Xyl C-2) y 4.83 (Ara H-1)/76.3 (Xyl C-4) (Figura 39) permitió establecer la secuencia

en C-3 como 2-O-β-D-galactopiranosil-O-[α-L-arabinopiranosil-(1 → 4)]-β-D-xilopiranosil, la

cual se confirmó por las correlaciones ROESY de δH/δH 3.21 (Agly H-3)/4.75 (Xyl H-1), 5.17

(Gal H-1)/4.12 (Xyl H-2) y 4.83 (Ara H-1)/4.29 (Xyl H-4) (Figura 40).

La correlación δH/δC 4.97 (Glc H-1)/74.3 (Agly C-28) en el espectro HMBC y la correlación

δH/δH 4.97 (Glc H-1)/4.15 (Agly H-28) en el espectro ROESY, indicaron la unión de Glc en C-28

de la aglicona.

59

Conclusión

Así, en base a estos resultados, se estableció que la estructura de 3 es (3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-

galactopiranosil-O-[α-L-arabinopiranosil-(1→4)]-β-D-xilopiranosil)oxi]-21,22-dihidroxiolean-

12-en-28-il-O-β-D-glucopiranosido, nombrado Billiosido C (Figura 37).

Esta saponina es un nuevo compuesto en la bibliografía de productos naturales. Además,

ninguna de las saponinas aisladas hasta los momentos en la subfamilia Hippocastanaceae posee

una β-D-xilopiranosa unida a C-3.

Figura 37. Estructura del Billiosido C (compuesto 3).

60

Tabla 5. Desplazamientos químicos de RMN-1H (600 MHz) y 13C (150 MHz) de la aglicona del Billiosido C (compuesto 3), en piridina-d5.

Aglicona del Billiosido C (compuesto 3) Pos. δC δH Pos. δC δH 1 38.9 0.90, 1.53 m 16 18.5 1.95 m, 2.27 br d (13.6) 2 26.6 1.87, 2.06 m 17 43.6 - 3 88.6 3.21 dd (11.6, 4.4) 18 41.8 2.66 dd (13.2, 4.0) 4 39.6 - 19 46.6 1.31, 2.14 t (13.6) 5 55.8 0.74 d (12.8) 20 36.2 - 6 18.5 1.29, 1.48 21 76.9 3.78 d (10.0) 7 32.8 1.24, 1.45 22 74.7 4.42 8 40.2 - 23 28.1 1.27 s 9 47.9 1.61 t (8.6) 24 16.8 1.09 s 10 36.8 - 25 15.7 0.90 s 11 23.9 1.88, 1.90 26 17.0 0.99 s 12 123.5 5.33 t-like 27 26.3 1.28 s 13 143.5 - 28 74.3 4.15, nd 14 42.2 - 29 30.4 1.26 s 15 25.8 1.05 m, 1.83 m 30 19.3 1.23 s

Tabla 6. Desplazamientos químicos de RMN-1H (600 MHz) y 13C (150 MHz) de los azúcares del Billiosido C (compuesto 3), en piridina-d5.

Azúcares del Billiosido C (compuesto 3) Pos. δC δH Pos. δC δH Pos. δC δH 3-O- Xyl-1 105.4 4.75 d (7.2) Gal-1 107.1 5.17 d (7.6) Ara-1 103.6 4.83 d (7.2) 2 83.6 4.12 2 74.6 4.56 2 71.6 4.44 3 75.4 4.20 3 74.9 4.18 3 74.3 4.12 4 76.3 4.29 4 69.6 4.69 d (3.6) 4 69.3 4.30 5 63.9 3.59 dd (11.4, 9.4), 4.37 5 76.9 4.07 5 67.2 3.75 br d (11.3),

6 61.3 4.39, 4.59 4.33 dd (12.4, 3.0)

28-O- Glc II-1 105.4 4.97 d (7.6) 2 75.1 4.04 3 78.6 4.19 4 71.8 4.22 5 78.4 3.94 m 6 62.8 4.39, 4.51 dd (9.6, 3.6)

61

Figura 38. Espectros HSQC del Billiosido C (compuesto 3).

62

Figura 38 (continuación). Espectros HSQC del Billiosido C (compuesto 3).

63

Figura 39. Espectros HMBC del Billiosido C (compuesto 3).

Figura 40. Espectros ROESY del Billiosido C (compuesto 3).

64

II.E. Determinación estructural del compuesto 4



metanol y etanol. Este compuesto posee una fórmula molecular de C53H88O23 deducida del pico

de ion molecular de HRESIMS de valor m/z 1115.5620 [M+Na]+. El ESIMS (modo ion positivo)

mostró un pico de ion molecular de m/z 1093 [M+H]+ confirmando el peso molecular de 1092.



El análisis de los espectros de RMN del compuesto 4 permitió constatar que la zona de la

aglicona es aproximadamente superponible a la de los compuestos 2 y 3. Las correlaciones

HMBC, HSQC y ROESY (Figuras 42–44, respectivamente) permitieron identificar la genina del

compuesto 4 como saniculagenina C, idéntica a la del compuesto 2 y 3 (Tabla 7).


En el espectro HSQC se encontró señales a δH/δC 4.78/104.9, 5.23/106.6, 4.98/105.5 y

4.96/105.4, correspondientes al protón/carbono anomérico de 4 azúcares. Estos se identificaron

como GlcI, GlcII, Gal, y Ara, mediante espectroscopía de RMN de dos dimensiones (Tabla 8).

Un análisis exhaustivo de los espectros de RMN-2D mostró que el compuesto 4 difiere de 3 solo

por la naturaleza del primer azúcar unido a C-3 de la aglicona el cual es Glc en el compuesto 4 y

Xyl en el compuesto 3.

La asignación de Glc en C-3 de la aglicona se realizó debido a la correlación de δH/δC 4.78 (GlcI

H-1)/89.1 (Agly C-3) en el espectro HMBC, confirmado por la señal δH/δH 3.22 (Agly H-3)/4.78

(GlcI H-1) en el espectro ROESY.

65

Conclusión

Por lo tanto, en base a estos datos, se descubrió que la estructura de 4 es (3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-

D-galactopiranosil-O-[α-L-arabinopiranosil-(1 → 4)]-β-D-glucopiranosil) oxi]-21,22-

dihidroxiolean-12-en-28-yl-O-β-D-glucopiranosido, nombrado Billiosido D (Figura 41). Esta

saponina es un nuevo compuesto en la bibliografía de productos naturales.

Figura 41. Estructura del Billiosido D (compuesto 4).

66

Tabla 7. Desplazamientos químicos de RMN-1H (600 MHz) y 13C (150 MHz) de la aglicona del Billiosido D (compuesto 4), en piridina-d5.

Aglicona del Billiosido D (compuesto 4) Pos. δC δH Pos. δC δH 1 38.9 0.86, 1.44 br d (9.6) 16 18.5 1.93 m, 2.26 br d (13.2) 2 26.5 1.79, 2.09 17 43.6 - 3 89.1 3.22 dd (11.4, 4.2) 18 41.9 2.64 dd (13.6, 3.6) 4 39.5 - 19 46.6 1.30, 2.13 t (13.6) 5 55.8 0.72 d (11.2) 20 36.2 - 6 18.5 1.29, 1.47 21 76.9 3.78 d (10.0) 7 32.8 1.22, 1.44 m 22 74.8 4.41 8 40.2 - 23 28.2 1.29 s 9 47.9 1.58 24 16.8 1.09 s 10 36.8 - 25 15.7 0.86 s 11 23.9 1.86, 1.89 26 17.0 0.97 s 12 123.5 5.32 br t (3.6) 27 26.3 1.28 s 13 143.5 - 28 74.3 4.14, nd 14 42.2 - 29 30.3 1.24 s 15 25.8 1.04 m, 1.81 m 30 19.3 1.21 s

Tabla 8. Desplazamientos químicos de RMN-1H (600 MHz) y 13C (150 MHz) de los azúcares del Billiosido D (compuesto 4), en piridina-d5.

Azúcares del compuesto 4 Pos. δC δH Pos. δC δH Pos. δC δH 3-O- GlcI-1 104.9 4.78 d (6.8) Gal-1 106.6 5.23 d (7.6) Ara-1 105.5 4.98 d (7.6) 2 82.6 4.21 2 74.7 4.54 2 72.5 4.43 3 76.3 4.22 3 74.8 4.17 3 74.5 4.09 4 80.1 4.24 4 69.6 4.67 br s 4 69.5 4.22 5 76.2 3.74 5 76.9 4.05 5 67.6 3.73 br d (12.0), 4.25 6 61.9 4.43, 4.48 6 61.4 4.39, 4.58 dd (10.6, 7.6)

28-O- Glc II-1 105.4 4.96 d (8.0) 2 75.2 4.02 3 78.6 4.18 4 71.8 4.20 5 78.4 3.93 6 62.8 4.38, 4.49

67

Figura 42. Espectros HSQC del Billiosido D (compuesto 4).

68

Figura 42 (continuación). Espectros HSQC del Billiosido D (compuesto 4).

69

Figura 43. Espectros HMBC del Billiosido D (compuesto 4).

Figura 44. Espectros ROESY del Billiosido D (compuesto 4).

70

II.F. Determinación estructural del compuesto 5



metanol y etanol. Este compuesto exhibió un pico de ion molecular en HRESIMS a m/z

1277.6135 [M+Na]+, y un pico de ion molecular en ESIMS (ion modo positivo) a m/z 1255

[M+H]+, consistentes con la fórmula molecular de C59H98O28.




aglicona es aproximadamente superponible a la de los compuestos 2, 3 y 4. Las correlaciones

HMBC, HSQC y ROESY (Figuras 46–48, respectivamente) permitieron identificar la genina del

compuesto 5 como saniculagenina C, idéntica a la del compuesto 2, 3 y 4 (Tabla 9).


El espectro HSQC mostró señales a δH/δC 4.75/104.8, 5.20/106.5, 4.95/105.4, 4.89/105.4 y

5.02/105.3, características de correlaciones de protones y carbonos anoméricos, indicando la

presencia de cinco azúcares, los cuales fueron identificados, mediante el análisis de espectros de

RMN de una y dos dimensiones, como tres unidades de glucosa (GlcI, GlcII y GlcIII), una de

Gal y otra de Ara (Tabla 10). El análisis de los espectros de RMN-2D mostró que los

compuestos 5 y 4 solo difieren en la presencia en 5 de una unidad de Glc enlazada a C-6 de la

glucosa unida a C-28 de la aglicona. Por lo tanto, la secuencia de azúcares en C-28 es O-β-D-

glucopiranosil-(1 → 6)-β-D-glucopiranosil, confirmado por la observación de una señal en el

espectro HMBC de δH/δC 5.02 (GlcIII H-1)/70.0 (GlcII C-6) y una señal en el espectro ROESY a

δH/δH 5.02 (GlcIII H-1)/4.30 (GlcII H-6).

71

Conclusión

En vista de la evidencia obtenida de estos espectros, se encontró que la estructura de 5 es

(3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-galactopiranosil-O-[α-L-arabinopiranosil-(1→4)]-β-D-

glucopiranosil)oxi]-21,22-dihidroxiolean-12-en-28-il-O-β-D-glucopiranosil-(1→6)-β-D-

glucopiranosido, denominado Billiosido E (Figura 45). Esta saponina es un nuevo compuesto en

la bibliografía de productos naturales.

Figura 45. Estructura del Billiosido E (compuesto 5).

72

Tabla 9. Desplazamientos químicos de RMN-1H (600 MHz) y 13C (150 MHz) de la aglicona del Billiosido E (compuesto 5), en piridina-d5.

Aglicona del Billiosido E (compuesto 5) Pos. δC δH Pos. δC δH 1 38.9 1.43 br d (9.6), nd 16 18.3 nd 2 26.5 2.06, nd 17 43.7 - 3 89.1 3.18 dd (11.6, 4.4) 18 41.9 2.58 dd (13.0, 4.0) 4 39.5 - 19 46.6 1.26, 2.10 t (13.6) 5 55.8 0.70 br d (10.9) 20 36.2 - 6 18.4 1.45, nd 21 76.9 3.74 d (10.0) 7 32.8 nd 22 75.3 4.39 8 40.1 - 23 28.1 1.26 s 9 47.9 1.56 t (8.8) 24 16.8 1.08 s 10 36.8 - 25 15.7 0.86 s 11 23.9 1.84 br d (9.6), 1.87 26 17.0 0.96 s 12 123.5 5.30 t-like 27 26.2 1.25 s 13 143.5 - 28 74.8 4.12, nd 14 42.1 - 29 30.3 1.20 s 15 25.8 1.02 br d (12.1), nd 30 19.3 1.22 s

Tabla 10. Desplazamientos químicos de RMN-1H (600 MHz) y 13C (150 MHz) de los azúcares del Billiosido E (compuesto 5), en piridina-d5.

Azúcares del Billiosido E (compuesto 5) Pos. δC δH Pos. δC δH Pos. δC δH 3-O-

GlcI-1 104.8 4.75 d (7.2) Gal-1 106.5 5.20 d (7.6) Ara-1 105.4 4.95 d (7.6) 2 82.6 4.18 2 74.6 4.49 d (7.6) 2 72.5 4.40 3 76.2 4.20 3 74.8 4.15 3 74.5 4.06 4 80.0 4.22 4 69.5 4.64 4 69.5 4.20 5 76.1 3.72 5 76.8 4.01 5 67.6 3.70, 4.22 6 61.8 4.40, 4.45 6 61.4 4.35 dd (10.4, 5.2)

4.54 dd (10.4, 7.6) 28-O- Glc II-1 105.4 4.89 d (7.6) Glc III-1 105.3 5.02 d (7.6) 2 74.8 3.94 t (8.2) 2 75.2 3.99 3 78.4 4.08 3 78.3 4.17 4 71.5 4.09 4 71.6 4.17 5 77.1 4.02 5 78.3 3.88 6 70.0 4.30, 4.74 6 62.7 4.31,4.44

73

Figura 46. Espectros HSQC del Billiosido E (compuesto 5).

74

Figura 46 (continuación). Espectros HSQC del Billiosido E (compuesto 5).

75

Figura 47. Espectros HMBC del Billiosido E (compuesto 5).

76

Figura 48. Espectros ROESY del Billiosido E (compuesto 5).

77

II.G. Determinación estructural del compuesto 6



metanol y etanol. Este compuesto exhibió un pico de ion quasimolecular en HRESIMS a m/z

1107.5323 [M+Na]+, y un pico de ion quasimolecular en ESIMS (ion modo positivo) a m/z 1085

[M+H]+, consistentes con la fórmula molecular de C54H84O22.




aglicona es aproximadamente superponible a la del compuesto 1 (Tabla 11), identificando la

genina como ácido 3β,21β,22α,24-tetrahidroxi-olean-12-en-28-oico.

Un análisis exahustivo de los espectros de RMN de dos dimensiones (Figuras 50–52) mostró que

el compuesto 6 difiere del compuesto 1 solamente en la presencia de un grupo angeloil en la

posición C-21, tal como muestra la observación de las señales a δH 6.00 (Ang H-3), 2.06 (Ang H-

4) y 1.95 (Ang H-5); y δC 167.5 (Ang C-1), 128.3 (Ang C-2), 138.1 (Ang C-3), 15.9 (Ang C-4)

and 20.8 (Ang C-5). El espectro HMBC mostro una correlación entre δH 5.55 (Agly H-21) y δC

167.5 (Ang C-1), confirmando la posición del grupo angeloil en C-21.


El espectro HSQC de los azúcares del compuesto 6 mostraron correlaciones a δH/δC 4.74/104.4,

5.60/104.3 y 4.99/105.6, indicando la presencia de tres monosacáridos (Figura 50). Estos fueron

caracterizados por analisis exahustivos de los espetros de RMN 1D y 2D y mediante análisis de

GC como dos β-D-glucopiranosil (GlcI y GlcII) y una α-L-arabinopiranosil (Ara) (Tabla 12).

78

Conclusión

En base a estos resultados, la estructura del compuesto 6 corresponde a la saponina triterpénica

de nucleo de oleanano denominada Dipterósido A (Guo et al., 2008), ácido 3-O-{α-L-

arabinopiranosil-(1→4)-[β-D-glucopiranosil-(1→2)]-β-D-glucopiranosil}-21-angeloil-22-acetil-

3 β,21β,22α,24-tetrahidroxi-olean-12-en-28-oico (Figura 49).

Figura 49. Estructura del Dipterósido A (compuesto 6).

79

Tabla 11. Desplazamientos químicos de RMN-1H (600 MHz) y 13C (150 MHz) de la aglicona del Dipterósido A (compuesto 6), en piridina-d5.

Aglicona del Dipterósido A (compuesto 6) Pos. δC δH Pos. δC δH 1 38.4 0.81, 1.36 20 36.3 - 2 26.5 1.82, 2.20 21 76.1 5.55 3 91.1 3.36 dd (11.2, 4.4) 22 74.9 5.96 d (10,8) 4 43.7 - 23 22.6 1.36 s 5 56.2 0.84 24 63.4 3.33, 4.26 6 18.6 1.19, 1.52 25 15.3 0.64 s 7 33.2 1.24, 1.37 26 17.2 0.88 s 8 39.7 - 27 26.3 1.26 s 9 47.7 1.55 28 177.1 - 10 36.5 - 29 29.1 1.05 s 11 23.9 1.78, 1.84 30 19.9 1.24 s 12 123.8 5.45 br s Ang-1 167.5 - 13 142.8 - 2 128.3 - 14 42.2 - 3 138.1 6.00 q (7,2) 15 27.8 1.19, 2.20 4 15.9 2.06 16 19.1 2.02, 2.60 5 20.8 1.95 s 17 52.5 - Ac-1 170.5 - 18 42.4 3.56 2 20.9 2.07 s 19 46.1 1.44, 2.20

Tabla 12. Desplazamientos químicos de RMN-1H (500 MHz) y 13C (150 MHz) de los azúcares del Dipterósido A (compuesto 6), en piridina-d5.

Azúcares del compuesto 6 Pos. δC δH Pos. δC δH Pos. δC δH 3-O- GlcI-1 104.4 4.74 d (7.6) GlcII-1 104.3 5.60 d (7.6) Ara-1 105.6 4.99 d (7.6) 2 80.2 4.14 2 75.7 4.09 2 72.5 4.46 3 76.7 4.25 3 78.3 4.24 3 74.5 4.12 4 80.2 4.24 4 69.8 4.48 4 69.5 4.25 5 76.5 3.77 5 78.4 3.77 5 67.8 3.78, 4.28 6 61.6 4.45, 4.51 6 61.7 4.33, 4.44

80

Figura 50. Espectros HSQC del Dipterósido A (compuesto 6).

81

Figura 50 (continuación). Espectros HSQC del Dipterósido A (compuesto 6).

82

Figura 51. Espectros HMBC del Dipterósido A (compuesto 6).

83

Figura 52. Espectros ROESY del Dipterósido A (compuesto 6).

84

II.H. Determinación estructural del compuesto 7



metanol y etanol. Este compuesto posee un pico de ion molecular de HRESIMS de valor m/z

1189.6331 [M+Na]+. El ESIMS (modo ion positivo) mostró un pico de ion molecular de m/z

1167 [M+H]+ confirmando el peso molecular de 1166.



El 1H-NMR mostró seis singletes a δH 1.34, 0.74, 0.95, 1.81, 1.46, 1.31, asignados a seis grupos

metilos en la aglicona, los cuales mostraron correlación en HSQC con δC 22.7, 15.7, 16.8, 27.5,

29.8, 20.0, respectivamente (Figura 54, Tabla 13); un singlete ancho a δH 5.46, típico del protón

de Δ12 del esqueleto de oleanano, confirmado por la señal δC 123.6 (C-12) y 142.9 (C-13) en el

especto de RMN-13C y por correlación HMBC de δH/δC 1.81 (H3-27)/142.9 (C-13) (Figura 55);

también mostró señales características de dos oximetilos, correspondientes a dos alcoholes

primarios, uno a δH 3.36, 4.26 (Agly H2-24) y el otro a δH 4.27, 4.36 (Agly H-28), y cuatro

señales de protones de oximetinos característicos de alcoholes secundarios de δH 3.37 (Agly H-

3), 4.83 (Agly H-16), 4.76 (Agly H-21), 4.37 (Agly H-22), respectivamente. Estos datos

permitieron la identificación de la genina como olean-12-ene-3β,16α,21β,22α,24,28-hexol,

reportado previamente como protoaescigenina (Liu et al., 2005; Liu et al., 2006; Zhang et al.

2006; Liu et al., 2008; Lanzotti et al., 2012; Yuan et al., 2015).

Además, se observaron señales características de RMN de un grupo acetilo (δH 2.04; δC 20.8,

170.7) que se asignaron por HSQC y HMBC. La posición de este grupo se asignó a C-21 debido

al desplazamiento químico de δH 4.37 (Agly H-22), indicativo de una acilación.

La configuración de H-22 de la aglicona se determinó mediante la observación de las

correlaciones en el espectro ROESY: H-22β/H-30β y H-22β/H-18β. Las configuraciones de H-

3α, H-16β, H-21α y la del alcohol primario en C-24 (configuración β), se asignaron de acuerdo a

las configuraciones descritas en la literatura en las saponinas aisladas en las plantas del genero

Aesculus, debido a que no se observaron correlaciones en el ROESY que permitan definirlas

(Zhang et al., 2006; Liu et al., 2006; Liu et al., 2008; Lanzotti et al., 2012; Yuan et al., 2012;

Yuan et al., 2013; Yuan et al., 2015).

85


Las correlaciones HSQC a δH/δC 4.75/104.4, 5.32/104.8 y 4.91/105.7, reveló la presencia de tres

unidades de azúcares en 7 (Tabla 14). Estos azúcares corresponden a una unidad de Quinovosa

(Quin) o 6-Deoxy-Glucopiranosa, una unidad de Ácido glucorónico (AcGlc) y una unidad de

Arabinosa (Ara).

La asignación completa del sistema de hidrógenos de Quin se realizó con los espectros COSY y

TOCSY, los átomos de carbono se asignaron con los espectros HSQC y HMBC (Figuras 54 y

55, respectivamente); y por último, la estereoquímica de este monosacárido se determinó con el

ROESY.

Además, en los espectros de RMN 1D y 2D se observó señales características de dos grupos

angeloil (AngI y AngII), que se asignaron a las posiciones C-3 y C-4 de la Quin debido a las

correlaciones HMBC de δH/δC 5.76 (Quin H-3)/167.4 (AngI C-1) y 5.24 (Quin H-4)/166.8

(AngII C-1).

La correlación en el espectro HMBC de δH/δC 4.91 (Quin H-1)/91.8 (Agly C-21) permitió

concluir que la unidad de Quin está unida al C-21 de la aglicona.

La diferencia del peso molecular de la genina + Ac + Quin + AngI + AngII con respecto al peso

molecular de la estructura da como resultado un valor de 309, lo cual coincide con un peso

molecular faltante de C11H17O10, por ello se planteó que el compuesto 7 posee un AcGlc y y una

Ara en su estructura. Además, se observaron en los espectros RMN 1D y HSQC señales

características de estos azúcares (Tabla 14).

Los espectros HMBC y ROESY no porporcionaron suficiente información que permita asignar

la posición de Ara y AcGlc. Por lo tanto, debido a que los antecedentes fitoquímicos del género

Aesculus presentan varias saponinas con AcGlc unidos al C-3 de la genina, se realizó la misma

asignación para el AcGlc del compuesto 7 (Liu et al., en el 2005; Liu et al., 2006; Liu et al.,

2008; Yuan et al., 2012; Lanzotti et al., 2012; Zhang et al. 2006; Yuan et al., 2015). Por otra

parte, los Billiosidos A, los Billiosidos C–E y el Dipterósido A contienen una arabinosa unida a

C-4 del monosacárido que está enlazado a C-3 de la aglicona, es por ello que se asignó la Ara del

compuesto 7 a la posición C-4 del AcGlc.

86

Conclusión

En base a estos resultados, se propone la estructura del compuesto 7 como (3β,16α,21β,22α)-3-[(4-O-

α-L-arabinopiranosil-β-D-glucoronopiranosil)oxi]-22-(acetiloxi)-16,24,28-trihidroxiolean-12-en-21-il-

O-(3,4-di-O-angeloil)-6-Deoxy-β-D-glucopiranosido (Figura 53). Hacen falta más estudios para

confirmar esta estructura.

Figura 53. Estructura propuesta para el compuesto 7.

87 Tabla 13. Desplazamientos químicos de RMN-1H (600 MHz) y 13C (150 MHz) de la aglicona del compuesto 7, en

piridina-d5.

Aglicona del compuesto 7 Pos. δC δH Pos. δC δH 1 38.8 0.77, 1.39 17 47.7 - 2 26.9 1.42, 1.70 18 40.5 2.80 3 90.6 3.37 19 47.7 1.39, 3.09 4 44.0 - 20 37.0 - 5 56.3 0.83 21 91.8 4.76 6 18.6 1.27, 1.54 22 73.5 4.37 7 33.2 1.25, 1.52 23 22.7 1.34 s 8 40.0 - 24 63.2 3.36, 4.26 9 46.8 1.65 25 15.7 0.74 s 10 36.4 - 26 16.8 0.95 s 11 24.1 1.82 27 27.5 1.81 s 12 123.6 5.46 br s 28 66.5 4.27, 4.36 13 142.9 - 29 29.8 1.46 s 14 41.8 - 30 20.0 1.31 s 15 34.7 1.60, 1.91 Ac-1 170.7 - 16 67.9 4.83 2 20.8 2.04 s

Tabla 14. Desplazamientos químicos de RMN-1H (600 MHz) y 13C (150 MHz) de los azúcares del compuesto 7, en piridina-d5.

Azúcares del compuesto 7 Pos. δC δH Pos. δC δH Pos. δC δH 3-O- GlcAc-1 104.4 4.73 Ara-1 104.8 5.32 2 74.8 4.04 2 71.6 4.37 3 76.4 4.22 3 73.4 4.25 4 79.7 4.22 4 70.2 4.14 5 78.1 4.23 5 67.4 4.23, 3.69 6 175.8 -

21-O- Quin-1 105.7 4.91 d (6,8) AngI-1 167.4 - AngII-1 166.8 - 2 73.2 4.10 2 128.3 - 2 127.7 - 3 75.5 5.76 3 137.6 5.88 3 138.9 5.98 4 73.8 5.24 4 15.8 1.95 4 15.7 1.97 5 70.2 3.68 5 20.6 1.87 s 5 20.5 1.90 s 6 17.7 1.21

88

Figura 54. Espectros HSQC del compuesto 7.

89

Figura 54 (continuación). Espectros HSQC del compuesto 7.

90

Figura 55. Espectros HMBC del compuesto 7.

91

II.I. Determinación estructural del compuesto 8



metanol y etanol. Este compuesto posee un pico molecular de HRESIMS de valor m/z 1219.6467

[M+Na]+. El ESIMS (modo ion positivo) mostró un pico de ion molecular de m/z 1197 [M+H]+

confirmando el peso molecular de 1196.




aglicona es aproximadamente superponible a la del compuesto 7. Las correlaciones HMBC,

HSQC y ROESY permitieron identificar la genina del compuesto 8 como protoaescigenina,

idéntica a la del compuesto 7 (Figuras 57 y 58, Tabla 15).

También se observaron señales característicasde RMN de un grupo acetilo (δH 2.04; δC 20.8,

170.7) que se asignaron por HSQC y HMBC a C-22.


Las correlaciones HSQC a δH/δC 4.82/105.3, 5.42/105.5, y 4.94/105.2 (Figura 61), reveló la

presencia de tres unidades de azúcares en 8 (Tabla 16).

Mediante un análisis exahustivo de los espectros de RMN 1D y 2D, se identificó uno de estos

sacáridos como una unidad de Quinovosa (Quin) o 6-Deoxy-Glucopiranosa, con dos grupos

angeloil, uno enlazado en C-3 y otro en C-4 de la quinovosa; tal como se observó en el

compuesto 7.

La diferencia del peso molecular de la genina + Ac + Quin + AngI + AngII con respecto al peso

molecular de la estructura da como resultado un valor de 340, lo cual coincide con el peso

molecular de una unidad de Ácido glucorónico (AcGlc) y de una Galactosa (Gal). Además, se

observaron en los espectros RMN 1D y HSQC señales características de estos azúcares (Tabla

16). Estos monosacáridos se asignaron al carbono C-3 de la genina, ya que mostró valores de

δH/δC 3.47/91.1, característicos de una glicosilación en esta posición.

92

Los espectros HMBC y ROESY no porporcionaron suficiente información para asignar la

posición de Gal. Por lo tanto, debido al desplazamiento a campo bajo de C-4 de AcGlc, se asignó

la Gal a ese carbono.

Conclusión

En base a estos resultados se propone la estructura del compuesto 8 como (3β,16α,21β,22α)-3-

[(4-O-β-D-galactopiranosil-β-D-glucoronopiranosil)oxi]-22-(acetiloxi)-16,24,28-trihidroxiolean-

12-en-21-il-O-(3,4-di-O-angeloil)-6-Deoxy-β-D-glucopiranosido (Figura 56). Sin embargo, se

necesitarán más estudios para terminar de definir la estructura de esta saponina.


93 Tabla 15. Desplazamientos químicos de RMN-1H (600 MHz) y 13C (150 MHz) de la aglicona del compuesto 8, en

piridina-d5.

Aglicona del compuesto 8 Pos. δC δH Pos. δC δH

1 38.7 0.82, 1.39 17 47.8 - 2 26.4 1.95, nd 18 40.0 3.04 3 91.1 3.47 19 47.9 1.36, 3.04 4 43.8 - 20 37.8 - 5 56.3 0.86 21 86.4 5.02 6 18.6 1.22, 1.54 22 74.1 6.14 7 33.3 1.26, 1.53 23 22.8 1.38 s 8 40.0 - 24 63.3 3.40, 4.30 9 46.8 1.66 25 15.7 0.73 s

10 36.4 - 26 16.8 0.82 s 11 24.1 1.84 m 27 27.5 1.82 s 12 123.6 5.40 br s 28 64.0 3.60, 3.42 13 143.1 - 29 30.1 1.44 s 14 41.6 - 30 20.1 1.36 s 15 34.7 1.56, 1.84 Ac-1 171.7 - 16 68.7 4.47 2 21.9 2.28 s


Azúcares del compuesto 8 Pos. ΔC δH Pos. ΔC δH Pos. ΔC δH 3-O- AcGlc-1 105.3 4.82 Gal-1 105.5 5.42 2 75.3 4.06 2 73.5 4.44 3 78,4 nd 3 75.8 4.06 4 78.5 4.28 4 71.0 4.38 5 78.7 4.30 5 77.1 3.98 6 nd - 6 62.8 4.26, 4.45

21-O- Quin-1 105.2 4.94 AngI-1 167.5 - AngII-1 167.0 - 2 73.5 4.02 2 128.5 - 2 127.9 - 3 75.6 5.80 3 137.4 5.87 3 138.8 5.99 4 74.5 5.26 4 15.7 1.94 4 15.7 1.99 5 70.0 3.72 5 20.6 1.88 s 5 20.6 1.94 s 6 18.3 1.29

94


95


96

Figura 58. Espectros ROESY del compuesto 8.

97

II.J. Determinación estructural del compuesto 9



metanol y etanol. Este compuesto posee un pico de ion molecular de HRESIMS de valor m/z

1257.7224 [M+Na]+. El ESIMS (modo ion positivo) mostró un pico de ion molecular de m/z

1237 [M+H]+ confirmando el peso molecular de 1236.




aglicona es aproximadamente superponible a la de los compuestos 2, 3, 4 y 5. Las correlaciones

HSQC, HMBC y ROESY (Figuras 60–62, respectivamente) permitieron identificar la genina del

compuesto 9 como saniculagenina C, idéntica a la del compuesto 2, 3 y 4 (Tabla 17).

Un análisis exahustivo de los espectros de RMN de dos dimensiones del compuesto 9 mostró la

presencia de un grupo acetil en la posición C-21, tal como mostró la observación de las señales a

δC 172.5 (Ac C-1) y δH (Ac H-2). La asignación de Ac en C-21 se realizó mediante la correlación

HMBC entre δH 5.50 (Agly H-21) y δC 172.5 (Ac C-1).


Las correlaciones HSQC a δH/δC 4.76/105.4, 5.17/107.1, 4.83/103.5, 4.99/105.6 y 4.99/105.6

(Figura 60), revelaron la presencia de cinco unidades de azúcares. Estos monosacáridos se

caracterizaron mediante espectros de RMN como Xyl, AraI, Glc, Gal y AraII (Tabla 18).

Un análisis exhaustivo de los espectros de RMN-2D mostró que la identidad de los azúcares del

compuesto 9 difiere del compuesto 4 por la presencia de una arabinosa extra.

Aún queda por definir la ubicación de AraII dentro de la estructura debido a la falta de

información en los espectros RMN 1D y 2D. Sin embargo, AraII mostró una correlación en

HMBC de δH/δC 4.99/80.1, que podría indicar que está unida a C-4 de una glucosa, por lo que se

debe revisar en posteriores estudios si C-4 de Glc posee este valor de carbono en vez de 71.8.

Cabe destacar, que una saponina con la genina y los azúcares propuestos anteriormente,

98

corresponde con el peso molecular de 1236. En la estructura mostrada en la Figura 59 se

propone que la Ara está unida a C-4 de Glc.

Conclusión

Así, en base a estos resultados, se estableció que la estructura del compuesto 9 corresponde a


xilopiranosil)oxi]-21-acetil-22-hidroxiolean-12-en-28-il-O-α-L-arabinopiranosil-(1→4)-β-D-

glucopiranosido, (Figura 59). Se necesitarán más estudios para terminar de definir la estructura

de esta saponina.


99

Tabla 17. Desplazamientos químicos de RMN-1H (600 MHz) y 13C (150 MHz) de la aglicona del compuesto 9, en piridina-d5.

Aglicona del compuesto 9

Pos. δC δH Pos. δC δH 1 38.5 0.90, 1.52 17 44.2 - 2 26.6 1.85, 2.06 18 41.2 2.80 3 88.6 3.22 dd (11.4, 4.4) 19 46.3 1.34, 2.21 4 39.6 - 20 36.2 - 5 55.8 0.72 21 79.7 5.50 d (10.4) 6 18.5 1.29¸1.48 22 71.0 4.67 7 32.8 1.20, 1.43 23 28.1 1.27 s 8 40.2 - 24 16.7 1.09 s 9 47.9 1.59 25 15.7 0.89 s 10 36.8 - 26 17.0 0.96 s 11 23.9 1.88 27 26.2 1.24 s 12 124.0 5.37 t-like 28 73.0 4.15, nd 13 143.0 - 29 29.7 1.14 s 14 42.0 - 30 20.1 1.21 s 15 25.7 1.00, 1.72 Ac-1 172.5 - 16 19.4 2.03, nd 2 nd 2,87 s


Azúcares compuesto 9 Pos. δC δH Pos. δC δH Pos. δC δH 3-O- Xyl-1 105.4 4.76 d (7.2) Gal-1 107.1 5.17 d (7,6) AraI-1 103.5 4.83 2 83.6 4.13 2 74.6 4.56 2 71.6 4.44 3 75.5 4.19 3 74.9 4.18 3 74.3 4.13 4 76.2 4.29 4 69.6 4.70 4 69.3 4.30 5 63.9 3.60, 4.38 5 76.9 4.07 5 67.2 4.32, 3.76

6 61.3 4.40, 4.59

28-O- Glc-1 105.4 4.94 Ara II-1 105.6 4.99 2 75.2 4.03 2 72.6 4.45 3 78.6 4.14 3 nd 4.11 4 71.8 4.20 4 69.6 4.24 5 78.2 3.88 5 67.2 4.32, 3.78 6 62.8 4.38, 4.48

100


101


102

Figura 61. Espectros HMBC del compuesto 9.

Figura 62. Espectros ROESY del compuesto 9.

103

Capítulo 5. Ensayos biológicos de

Billia rosea Planch & Linden, Ulloa & Jorgensen.

104

I. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL

I.A.1. Bioensayos sobre la enzima G-6-Pasa

La enzima glucosa – 6 – fosfatasa (G-6-Pasa) cataliza el paso final de los procesos de

neoglucogénesis y glucogenólisis, produciendo glucosa y fosfato inorgánico; la reacción se

puede medir mediante la desaparición del sustrato (Glucosa-6-fosfato) o la aparición de los

productos (Glucosa o Pi) (Burchell y Waddell, 1991).

G-6-P Glucosa + Pi

G-6-Pasa

La actividad de la G-6-Pasa se puede determinar siguiendo la formación de fosfato (Pi), que en

medio ácido en presencia de heptamolibdato de amonio forma un complejo azul, cuya

absorbancia se mide a una longitud de onda de 820 nm (Burchell y Waddell, 1991).

12(NH2)2Mo7O4 + 27H+ + 12SO4 2- + (PO4) 2- → [H3PO4(MoO3)12] + 12H2O + 12 (NH4)2SO4

La principal ventaja en el uso de este método es que, además de ser económico y rápido, el

reactivo utilizado para formar el complejo coloreado también detiene la reacción (Burchell y

Waddell, 1991).

Para diferenciar si el inhibidor actúa sobre el transportador T1 o directamente sobre la subunidad

catalítica, se utilizan microsomas intactos y microsomas rotos; los primeros son vesículas en las

cuales la membrana limitante actúa como una barrera de permeabilidad selectiva, mientras que

los segundos carecen de dicha selectividad y el sustrato tiene libre acceso a la subunidad

catalítica. Los microsomas rotos se obtienen mediante la incorporación de histonas durante el

ensayo; estas son proteínas básicas que rompen la integridad de las estructuras microsomales

(Burchell y Waddell, 1991).

I.A.2. Metodología del ensayo de inhibición de G-6-pasa

Se utilizó microsomas de hígado de ratas Sprague dawley en ayunas durante 24 horas,

purificados mediante el método de (Marcucci et al., 1983). La concentración de proteína se

estimó utilizando la modificación del método de Lowry descrito por Markwell et al., 1978. El

ensayo de G-6-Pasa de microsomas intactos y rotos usando Histona II A (Sigma Chemical Co.

EE.UU.) se realizó siguiendo el método de Burchell et al., 1988. En resumen, el ensayo se llevó

105

a cabo usando 40 µl (5 mM) de glucosa-6-fosfato como sustrato en ausencia (control) o en

presencia de 40 µl (5 mM) del compuesto puro en DMSO al 10% y finalmente 20 µl (20—30

µg) de la proteína microsomal para dar un volumen final de 100 µl. La reacción se llevó a cabo

en baño de agua a 30 °C durante 10 min. La reacción fue detenida añadiendo 0.9 ml de

molibdato de amonio 0.28 %, dodecilsulfato sódico 1.11 % y ácido ascórbico 1.11% en ácido

sulfúrico 0.33 M. La mezcla se incubó a 47 °C durante durante 20 min y la absorción del

complejo coloreado se registró a 820 nm. La florizina (Figura 63) se utilizó como control

positivo. El resultado se expresó como porcentaje de inhibición en comparación con el control.

I.B.1. Absorción intestinal de glucosa

La absorción intestinal es uno de los mecanismos que aportan glucosa a la sangre y ocurre en dos

etapas. La primera etapa es mediada por el transportador Na+-glucosa (SGLT1) que transporta la

glucosa a través de la membrana apical hacia el interior del enterocito (Motta y González, 2010;

Márquez et al., 2002; Castrejón et al., 2007).

La segunda está a cargo del transportador de glucosa 2 (GLUT 2) que transporta glucosa a través

de la célula hasta la membrana basolateral, donde por difusión facilitada, llega al plasma (Figura

64) (Motta y González, 2010; Márquez et al., 2002; Castrejón et al., 2007).

La acción de SGLT1 es inhibida por polifenoles, flavonoides e isoflavonoides. Un flavonoide

que ha sido utilizado para el tratamiento de la diabetes por su actividad inhibidora de SGLT1 es

la florizina. Saponinas, como los ácidos gymnemicos, han mostrado actividad inhibitoria

semejante a la de la florizina (Motta y González, 2010; Márquez et al., 2002; Castrejón et al.,

2007).

Figura 63. Estructura de la florizina.

106

Figura 64. Transporte de glucosa a través del epitelio intestinal.

I.B.2. Metodología del ensayo de la absorción intestinal de glucosa.

La absorción intestinal de glucosa se midió mediante el método descrito por González-Mujica et

al., (2003) en ratas Sprague dawley anestesiadas con fenobarbital sódico (60 mg/kg de peso

corporal). El intestino de las ratas se expuso y se dividió in situ en segmentos de 4 cm mediante

ligaduras; posteriormente, se inyectó 1 ml de glucosa 10 mM, NaCl 0.9 % y DMSO 2 %, en

ausencia o en presencia del compuesto puro (0.1 mM). Luego de 30 minutos, se extrajo el

contenido del segmento de intestino sin pérdidas significativas y se midió la cantidad de glucosa

mediante el método de la glucosa oxidasa/peroxidasa (Trinder, 1969). Se utilizó la florizina

como control positivo. Los resultados se expresaron como porcentaje de inhibición en

comparación con el control.

107

II. RESULTADOS.

Dado que las semillas de Billia rosea han sido utilizadas tradicionalmente debido a sus

propiedades analgésicas y antidiabéticas (Giraldo et al., 2009), se evaluó a los Billiosidos B y C

(2, 3) como inhibidores de la absorción intestinal de glucosa utilizando el método descrito por

Gonzalez-Mujica et al., (2003) y como inhibidores de la Glucosa-6-fosfatasa (G-6-pasa)

utilizando microsomas intactos y rotos de acuerdo al método de Burchell et al., 1988. Los

compuestos 2 y 3 mostraron inhibición estadísticamente significante (p < 0.05) de 36 % y 36 %,

respectivamente, de la G-6-pasa en microsomas intactos, y mostraron inhibición de 29 % y 42 %,

respectivamente, en microsomas rotos. El efecto es bajo en comparación al 59.2 % de inhibición

de la G-6-pasa en microsomas intactos obtenido por la florizina, un conocido inhibidor del

transportador T1 de la G-6-pase, pero la inhibición del compuesto 3 es mayor en comparación al

29.4 % de inhibición de la G-6-pase en microsomas rotos obtenido por la florizina (Rodríguez et

al., 2008).

Estos resultados sugieren que los compuestos 2 y 3 inhiben el transportador T1 pero también

afectan la subunidad catalítica del transportador fosfato/pirofosfato (T2) del sistema G-6-pasa.

Además, los compuestos 2 y 3 mostraron inhibición estadísticamente significativa (p < 0.03) de

18 % y 14 %, respectivamente, en la absorción intestinal de glucosa, pero el efecto es bajo en

comparación a la florizina (25 %), conocido inhibidor del transportador SGLT1 (Rodríguez et

al., 2010).

108

Conclusiones Generales

109

En el transcurso del presente trabajo, se realizó el estudio fitoquímico de las semillas de Billia

rosea (Planch. & Linden) C. Ulloa & P. Jørg, perteneciente a la familia Sapindaceae, que

permitió la separación y purificación de 9 compuestos diferentes mediante el empleo de diversas

técnicas cromatográficas y su posterior identificación con técnicas espectroscópicas (RMN 1D y

2D) y espectrométricas (espectrometría de masas).

El análisis fitoquímico de estas semillas permitió la obtención de 5 nuevos compuestos en la

bibliografía de productos naturales, denominados Billiosidos A–E, y un compuesto conocido,

Dipterósido A, todos ellos saponinas triterpénicas derivadas del oleanano:

Billiosido A: (3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-glucopiranosil-O-[α-L-arabinopiranosil-(1→4)]-

β-D-glucopiranosil)oxi]-21-[((2E,6S)-2,6-dimetil-6-hidroxiocta-2,7-dienoil)oxi]-22-

(acetiloxi)-24-hidroxiolean-12-en-28-oico.

Billiosido B: (3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-galactopiranosil-β-D-glucopiranosil)oxi]-21,22-

dihidroxiolean-12-en-28-il-O-α-L-arabinopiranosil-(1 → 4)-β-D-glucopiranosido.

Billiosido C: (3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-galactopiranosil-O-[α-L-arabinopiranosil-

(1→4)]-β-D-xilopiranosil)oxi]-21,22-dihidroxiolean-12-en-28-il-O-β-D-glucopiranosido

Billiosido D: (3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-galactopiranosil-O-[α-L-arabinopiranosil-(1 →

4)]-β-D-glucopiranosil) oxi]-21,22-dihidroxiolean-12-en-28-yl-O-β-D-glucopiranosido.

Billiosido E: (3β,21β,22α)-3-[(2-O-β-D-galactopiranosil-O-[α-L-arabinopiranosil-

(1→4)]-β-D-glucopiranosil)oxi]-21,22-dihidroxiolean-12-en-28-il-O-β-D-glucopiranosil-

(1→6)-β-D-glucopiranoside.

También se propuso las posibles estructuras de 3 compuestos, que mostraron ser saponinas

triterpénicas derivadas del oleanano:

(3β,16α,21β,22α)-3-[(4-O-α-L-arabinopiranosil-β-D-glucoronopiranosil)oxi]-22-

(acetiloxi)-16,24,28-trihidroxiolean-12-en-21-il-O-(3,4-di-O-angeloil)-6-Deoxy-β-D-

glucopiranosido.

(3β,16α,21β,22α)-3-[(4-O-β-D-galactopiranosil-β-D-glucoronopiranosil)oxi]-22-

(acetiloxi)-16,24,28-trihidroxiolean-12-en-21-il-O-(3,4-di-O-angeloil)-6-Deoxy-β-D-

glucopiranosido


xilopiranosil)oxi]-21-acetil-22-hidroxiolean-12-en-28-il-O-α-L-arabinopiranosil-(1→4)-

β-D-glucopiranosido.

110

Estos compuestos aislados evidencia que las semillas de Billia rosea son ricas en saponinas

triterpénicas, lo cual se esperaba según lo reportado en la literatura de fitoquímica para las

especies del género Aesculus, perteneciente a la subfamilia Hippocastanaceae, al igual que el

género Billia y Handeliodendron,.

Es importante destacar la variedad estructural de estas saponinas, ya que se encontraron

diferentes tipos de monosacáridos unidos no solo al carbono C-3, sino también en C-28 o C-21;

diferentes grupos funcionales como angeloilos, restos de monoterpenos, acetilos y grupos

hidroxilos. Además, es primera vez que se reporta una saponina con un resto monoterpénico en

la subfamilia Hippocastanaceae. También es primera vez que se reporta en esta subfamilia,

saponinas con xilopiranosas enlazadas a C-3 de la genina.

Los efectos inhibitorios moderados de los Billiosidos B y C sobre la glucosa-6-fosfatasa y la

absorción intestinal de glucosa mostraron que la actividad antidiabética asociada

tradicionalmente a estas semillas se debe posiblemente a su contenido de saponinas. Esto debe

ser confirmado en futuras investigaciones.

Los resultados obtenidos demuestran que se debería continuar el estudio fitoquímico de Billia

rosea, con el propósito determinar la composición química de otras estructuras morfológicas de

la planta como hojas, ramas, flores, etc. También se debería continuar con los estudios

biológicos a fin de determinar la inhibición de la glucosa-6-fosfatasa y la inhibición intestinal de

glucosa de los Billiosidos A, D y E; del Dipterósido A y de las demás saponinas triterpénicas

aisladas. También sería importante efectuar otros estudios biológicos en los compuestos aislados;

por ejemplo, determinar la actividad antitumoral y citotóxica.

111

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118

Anexos

119

LISTAS DE PUBLICACIONES Y POSTERS

Publicaciones:

De Freitas L., Jimenez D., Pimentel S., Mitaine-Offer A.C., Pouysegu L., Quideau S., Paululat

T., Gonzales-Mujica F., Rojas L.B., Rodriguez M., Lacaille-Dubois M.A. (2017). Triterpene

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Posters:

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Universidad Central de Venezuela. ―Aislamiento y caracterización de dos compuestos del

extracto metanólico de las semillas de Billia rosea Planch & Linden (Hipocastanaceae –

Sapindaceae)‖. Código del trabajo: Salud-5-520.

LXV Convención Anual de ASOVAC, 30 de noviembre al 3 de diciembre de 2015. Universidad

Simón Bolivar – Sede Litoral. ―Aislamiento y caracterización de dos compuestos del extracto

metanólico de las semillas de Billia rosea Planch & Linden (Hipocastanaceae – Sapindaceae)‖.

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