contagem de microrganismos viáveis & método geral de identificação de patógenos ipog -...

Contagem de Microrganismos Viáveis&

Método Geral de Identificação de Patógenos

IPOG - Instituto de Pós-Graduação

MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA

Daiane BridiLeonardo Chaiben

Neura StellaRenata Maggi

CONTAGEM DE MICRORGANISMOS VIÁVEIS EM CONTAGEM DE MICRORGANISMOS VIÁVEIS EM

PRODUTOS QUE NÃO NECESSITAM CUMPRIRPRODUTOS QUE NÃO NECESSITAM CUMPRIR

O TESTE DE ESTERILIDADEO TESTE DE ESTERILIDADE



Fonte: www.umwelt-sc.com.br

Contagem de Microrganismos Viáveis Totais

• Determina o n° de bactérias e fungos em produtos e MP não estéreis;

• Contagem por crescimento visível:• 4 dias – Ágar Caseína-soja(30 -35°)• 7 dias – Ágar Sabouraud-dextrose(20 -25°)

• Determinação:



Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

Fonte: www. hotfrog.com.br



O teste é realizado com a mistura das

amostras.

Diluição das amostras(dentro dos limites)

UFC dentro dos limites do método a ser usado.


unb.br

Fonte: www.unb.br

• Tipos de Membrana» Nitrato de Celulose» Acetato de Celulose

• Cuidados Especiais:» Proteger do contato direto da luz ultravioleta;» Proteger contra aerossóis;» Evitar contaminação;» Utilizar capela de fluxo laminar;» Executar ensaios de contagem de partículas, velocidade e direção do ar;



Método de Filtração Por MembranaMétodo de Filtração Por Membrana

Porosidade máx. 0,45 µm


Fonte: www.typesolution.pt

• Método



Amostra de 10 mL ou diluição que represente 1g

Filtrar imediatamente

Membrana De Nitrato de Celulose

Lavar as Membranas 3 vezes(100 mL de Líquido Estéril)

1º MembranaPlaca de Petry com Meio I

Ágar Caseína-Soja

2º MembranaPlaca de Petry com Meio II Ágar Sabouraud-Dextrose

Incubar 4 dias (30-35°C) Incubar 7 dias (20-25°C)

Calcular o n° de Microrganismos por mL ou g de amostra


Fonte: www. pt.vwr.com

Fonte: www. pt.vwr.com

Preparação das Amostras:

• Substâncias Solúveis em Água

IPOOG - Instituto de Pós-Graduação


Filtrar e lavar as membranas 3 vezes com fluido I

Incubar, contar as colônias e calcular o n° de microrganismos

10 g ou mL de mistura de amostras

+90 mL de Tampão Fosfato(pH 7,2)

Agitar / Ajustar pH6,5 – 7,5

HCL e NaOH 0,1 M

2 x 10 mL Completar 100 mL

+ 90 mL de Fluido I

+ 90 mL de Fluido I

Fluido I: 1 g de digesto peptido de tecido

animal + 1000 mL H2O (pH 7,1 ± 0,2)


Fonte: www.cial-paulinia.com.br



• Substâncias Oleosas Miscíveis em Água:10 g ou mL de mistura de amostras

+90 mL de Fluido II a 45 – 48°C

Agitar / Ajustar pH6,5 – 7,5

HCL e NaOH 0,1 M

Completar 100 mL2 x 10 mL

+ 90 mL de Fluido II

+ 90 mL de Fluido II

Filtrar e lavar as membranas 3 vezes com fluido II


Fluido II: 1 g de digesto peptido de tecido animal + 1 mL de Polissorbato 80 + 1000 mL H2O

(pH 7,1 ± 0,2)





• Substâncias Solúveis em Miristato de Isopropila:6 amostras de 1g ou 1ml de mistura de amostras

Agitar

Completar 100 mL com miristato de isopropila (45 – 48°C)

3 membranas em Placa de Petry

com Meio I


Obs: para produtos de uso tópico – teste adicional – 1 membrana para placa com ágar para fermentação de

anaeróbicos, incubando em jarra para anaeróbicos a

30-35°C por 3 dias.

Filtrar cada solução com membrana filtrante

(para cada uma)

Lavar as membranas com caldo nutriente esterilizado por filtração e aquecido a 45-48°C

3 membranas em Placa de Petry com Meio II





Método de Contagem em PlacaMétodo de Contagem em Placa

• BactériasDispensar a mistura e

amostras na superfície do meio solidificado na placa

Placas de Petry 100 x 20 + 1 ml de mistura de amostras +

15-20 ml de meio I liquefeito a 45°C

Ou

Obs.: Diluír a amostra para q o n° de colônias não

ultrapasse 300 por placa.

2 placas para cada diluição

Incubar a 30 - 35°C por 4 dias

Contar o n° de colônias e calcular o resultado.






• FungosDispensar a mistura e

amostras na superfície do meio solidificado na placa

Placas de Petry 100 x 20 + 1 ml de mistura de amostras +

15-20 ml de meio II liquefeito a 45°C

Ou

Obs.: Diluír a amostra para q o n° de colônias não

ultrapasse 100 por placa.

2 placas para cada diluição

Incubar a 20 - 25°C por 7 dias

Contar o n° de colônias e calcular o resultado.






Preparação das Amostras:Empregar no método de contagem de placas:

1 mL de preparação de amostra contendo 10 g ou 10 mL, diluídas ou dissolvidas em 100 mL de diluente.

• Cremes e Pomadas solúveis em Miristato de Isopropila:

10 g de mistura de amostras + 90 mL de caldo nutriente com 0,1% de

tetradecilsulfato sódico a 45-48°C

Agitar até homogeneizar

4 alíquotas de 5 mL 4 Placas de Petry

20 x 150 mm

2 Placas 15-20 mL Meio I

2 Placas 15-20 mL Meio II

45°C

Esperar solidificar, incubar, contar as colônias e os

microrganismos

Teste Adicional: 2 x 1 mL da 1º diluição em placas 10 x 100 mm com 15-20 mL de Ágar p/

Fermentação de Anaeróbicos.Incubar me jarra p/ anaeróbicos 30-35°C por 3

dias.Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988




Preparação das Amostras:• Cápsulas Vazias:

90 mL de tampão fosfato(pH 7,2) a 45-48°C

sobre 50 cápsulas

Agitar até suspensão total e completar a 100 mL(5:10)

1 mL da suspensão em 9 mL de Água (5:100)

Se necessário, 1mL p/

9 mL de água (5:1000)1 mL de cada diluição em 4

placas 20x 100 mm

2 placas 15-20 mL Meio I2 placas 15-20 mL Meio II

( liquefeito a 45° C)SolidificarIncubar

Contar as colônias e Calcular o n° de microrganismos

Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988Fonte: www.millipore.com





• Gelatinas: 10 g de mistura de amostras+

90 mL de água estéril a 48°C(1:10)

Repouso por 1 h

Banho-maria a 45°C por 30 min Agitação vigorosaintercalada

1 mL em 9 mL de água estéril (1:100)

Se necessário, 1 mL (1:100) em 9 mL – (1:1000)

Procedimento = cápsulas vazias

Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988Fonte: www.millipore.com





• Demais Subst. Insolúveis ou Parcialmente Solúveis em Água:

10 g ou 10 mL da mistura de amostras

+ 90 mL de tampão fosfato(pH 7,2)

(1:10)

Dissolver e ajustar o pH 6,5-7,5 com Hcl ou NaOH 0,1 M

1 mL + 9 mL água(1:100)

Se necessário : 1mL em 9 mL de água

(1:1000)

Proceder conforme método de cápsulas

vazias

• Aerossóis:

Resfriar 10 recipientes em álcool e gelo seco

por 1h

10 g ou 10 mL + 90 mL de tampão fosfato (7,2)

(1:10)Completar 100 mL

1 mL + 9 mL água(1:100)






• Contagem de Colônias:

Considera-se para registros de resultados as placas que apresentam até:

300 colônias de bactérias: 100 colônias de fungos.







• Contagem de Colônias:

Calcula-se a média aritmética de cada diluição em relação as placas;

Calcula-se o n° de microrganismos por g ou mL para cada diluição;

Resultados expressos em Unidades Formadoras de Colônias ( UFC)

Exemplo:

Diluição Colônias p/ placa UFC / g ou mL

1: 100 293 2,93 x 104

1: 100 100 1,00 x 104

1: 1000 41 4,1 x 104

1: 1000 12 1,2 x 104

Média: (2,93 + 1,0 + 4,1 + 1,2) x 104

4

Média : 2,3 x 104

Resultados:N° de colônias nas placas < 20 = menor diluição

em UFC/ g ou mL.

Placas não apresentam colônias = < que diluição menor (< 10 UFC / g ou mL.


Fonte: www.unb.br



Método dos Tubos MúltiplosMétodo dos Tubos Múltiplos

• Método utilizado quando se espera que o produto apresente densidade bacteriana baixa.

• Preparação diferenciada para amostras sólidas e amostras líquidas.

Preparação das Amostras:Diluição 1:10

Amostras Sólidas Amostras Líquidas

10 g de amostra + 90 mL de diluente

1 mL de amostra + 9 mL de caldo de

caseina-soja

Pode ser adicionado de emulsificantes e neutralizantes

Para volumes maiores25 g + 225 mL de

diluente

Partindo-se da diluição 1:10, preparar 1:100 / 1:1000 a partir de




Método dos Tubos MúltiplosMétodo dos Tubos Múltiplos

Preparação das Amostras: 12 Tubos com 10 mL de caldo caseína-soja

Tubos 1 / 2 / 3

1 mL de amostra(1:10)

Tubos 4 / 5 / 6



Tubos 7 / 8 / 9 Tubos 10 / 11 / 12

Incubar a 30-35°C4 dias

1 mL de diluente

Sem crescimento microbiano

• Tubos com crescimento = Positivos;

• Amostras que turvam o meio :• confirmação de crescimento;

Alçada de cada tubo p/ novo

tubo

caldo caseína-soja/semear em meio sólido

Incubar novamente




Meios e Diluentes Utilizados em Contagem de Microrganismos Segundo a Farmacopéia

Brasileira

• Ágar Caseína-Soja (Meio I);

• Ágar Sabouraud-Dextrose (Meio II);

• Ágar para Fermentação de Anaeróbicos;

• Caldo Caseína-Soja;

• Caldo Nutriente;

• Fluido I;

•Fluido II;

•Tampão Fosfato pH 7,2;

• Tampão Cloreto de Sódio-Peptonado pH 7,0.


Fonte: www.hotfrog.com.br

Fonte: www.interlabdist.com.br

Fonte: www.hotfrog.com.br

- Instituto de Pós-Graduação


MÉTODO GERAL PARA PESQUISA E

IDENTIFICAÇÃO DE PATÓGENOSSalmonella

Escherichia coliPseudomonas aeruginosa

Staphylococcus aureus;

Detecção de células viáveis de:

Produtos Farmacêuticos não estéreis

MP de uso direto em fabricação

Via Oral:Bacillus cereusEnterobacter spCandida albicansAspergillus flavus e parasiticus

Tópica:Serratia marcescensKlebsiella spPseudomonas cepaciaPseudomonas maltophiliaPseudomonas stutzeriStreptococcus sp, grupo B

Nasal ou Respiratória:Enterobacter spSerratia marcescensKlebsiella spCandida albicansProteus spAcinetobacter spPseudomonas cepaciaPseudomonas maltophiliaPseudomonas stutzeri

Intramamária:Staphylococcus spStreptococcus sp, grupo BBacillus cereusSerratia marcescensCorynebacterium pyogenesKlebsiella spMycoplasma spEnterobacter spPseudomonas spCitrobacter spNocardia spProteus spCryptococcus neoformansCandida sp

Patógenos devem ser Ausentes




Enriquecimento Não-seletivoEnriquecimento Não-seletivo

Subst. Solúveis em Água

10 g ou 10 mL de amostra + 90 mL de Tampão fosfato 7,2

Filtrar em membrana e lavar com 100 mL

de Fluido I

Membrana em 300mL de caldo de

enriquecimento

Incubar (30-35°C) 24 – 48 h

Subst. Oleosas Miscíveis em Água

10 g ou 10 mL de amostra + 90 mL de Fluido II a 45-48°C

Filtrar em membrana e lavar com 100 mL de

Fluido II

Subst. Solúveis em Miristato de Isoproprila

6 porções de 1 g ou 1 mL + 100 mL de Miristato de Isoproprila a

45-48°C

Filtrar em membrana e lavar com 100 mL de

caldo nutriente a 45-48°C

Membrana em 300 mL de caldo de enriquecimento

Incubar (30-35°C) 24 – 48 h


Fonte: www.millipore.com



Enriquecimento Não-seletivoEnriquecimento Não-seletivo

Pomadas e Cremes Insolúveis em Miristato

de Isoproprila

2 porções de 5 g ou 5 mL + 300 mL de caldo de

enriquecimento com 0,1% de polissorbato 80

Se necessário ajustar pH 6,5-7,5 com HCl ou

Na OH

Incubar (30-35°C) 24 – 48 h

Gelatinas

10 g de amostra + 300 mL de

caldo de enriquecimento

Deixar a 48 °C por 1 h

Incubar (30-35°C) 24 – 48 h

Banho-maria a 45°C30 min Agitando

em intervalos

Subst. Insolúveis ou Parcialmente Solúveis em Água

10 g ou 10 mLde amostra + 300 mL de

caldo de enriquecimento

Se necessário ajustar o pH a 6,5-7,5 com HCl ou

NaOH 0,1 M

Incubar (30-35°C) 24 – 48 h

Na ausência de um Sistema de Filtração em Membrana, pode se proceder como “ Subst. Insolúveis ou Parcialmente Solúveis em Água”




Fase Seletiva e Testes de ConfirmaçãoFase Seletiva e Testes de Confirmação

Pseudomonas aeruginosa

Confirmação

• Citocromo oxidase:

1 gt de cloridrato de N,N-dimetil-p-fenilenodiamina .

Rósea para marrom, vermelho escuro e negro em

10 a 30 min.

• Produção de Fluorescência: em ágar inclinado para deteccção de fluoresceína. Incubar a 30-37°C por 24 h.Fluorescência do ágar em luz UV a 328-210 nm.99% das cepas apresentam fluorescência.

• Crescimento a 41°C:

em ágar inclinado de

infusão cérebro e coração.

Incubar em banho-maria ou

estufa por 48 h.

99% crescem a 41°C.

Ágar cetrimida + material enriquecido em meio não seletivo Método de Estrias em Superfície





Staphylococcus aureus

Material enriquecido em meio não seletivo + ágar sal

manitol-vermelho de fenol ou ágar de vogel johnson

Método de Estrias em Superfície

Incubar a 36°C por 48h

• Ágar sal manitol: colônias amareladas, lisas,

circundada por zona diferente(amarelo forte);

• Ágar vogle johnson: colônias negro brilhante

circundade por zona amarela.

Confirmação

• Coloração de Gram: cocos gram positivos; formato de cacho de uva.

• Coagulase: reconstituição liofilizada com plasma de coelho ou cavalo em água estéril; controle positivo e negativo em paralelo; tubo incubados em banho a 30-37°C(verificar formação de gel); verificar tubos em 2 / 4 / 24h; formação de gel em 24h: teste positivo

•Desoxirribose: ágar para teste de desoxirribose com verde de metila; repicar-se a colônia no meio; Incuba-se a 30-37°C por 24-48h;Fazer controle positivo;

formação de zona incolor ao redor do crescimento: desoxirribose nuclease positiva;

Deve ser positivo.




Salmonela


Repicar a colônia do meio não- seletivo p/ placa de ágar-verde

brilhante

Inocular colônia em 100 mL de caldo de digestivo pancreático

de caseína

Incubar a 30-37°C por 24-48h

Adicionar 0,5 mL do reagente Kovac e agitar

suavemente

Reação positiva de cor vermelha intensa. A salmonella sp. indol

negativa.

Confirmação

• Ágar Tríplice açúcar-ferro:

Inocular a colônia;

Fura-se a base não inclinada com fio reto retirando e

passando na superfície inclinada;

incuba-se a 30-37°C por 24h;

Colônias apresentam: reação alcalina( cor vermelha), parte

superior inclinada e ácida na base( cor amarelada)

Se as reações forem positivas, prosseguir com demais

testes.

• Lisina-descarboxilase:

Inocular em ágar lisina-ferro;

Incubar a 30-37°C por 24h;

Colônias apresentam: cor purpurea.




Confirmação

Salmonela


• Crescimento Citrato de Carbono:

Repica-se a cultura em ágar citrato de simmons inclinado;

Incuba-se a 30-37°C por 4 dias;

Colônias apresentam: cor da parte inclinada azul.

• Urease:

Repica-se a cultura em ágar uréia

inclinado;

Incuba-se a 30-37°C por 4 dias;

Colônias : típicas não produzem urease.

• Fermentação da Lactose:

Repica-se a cultura em caldo lactose;

Incuba-se a 30-37°C por 24h;

Colônias: maioria das cepas não fermenta

lactose, permanecendo o meio inalterado






Escherichia coli

Repicar meio não-seletivo em ágar mac conkey

Incubar a colônia em ágar peptona-ferro

Inocular furando a base não inclinado com fio reto / retirar e passar pela superfície inclinada

Incubar a 30-37°C por 24h

Se houver crescimento heterogêneo

Transferir colônias vermelho tijolo para nova placa com

ágar mac conkey

Confirmação

• Ágar de eosina-cloreto de metiltionímio:

Colônia incubada em ágar mac conkey para placa contendo

ágar de eosina cloreto de metiltionímio;

Incuba-se a 30-37°C por 24h;

Colônias Podem evidenciar escherichia coli quando

apresentarem cor preta, esverdeadas e brilhantes.

Escherichia coli não produz gás H2S





Escherichia coli

Confirmação

• Ágar Tríplice açúcar-ferro:

Colônia em ágar de eosina cloreto de metiltionímio inoculada em ágar tríplice açúcar-ferro;

Segue-se procedimento como a salmonella;

Colônias apresentam:

Reação alcalina(cor vermelha) e ácida(amarela) na parte superior (inclinada) ;

Ácida (amarela) na base;

Pode formar gás H2S.

• Teste de Indol:

Inocular tubo contendo caldo de digesto pancreático de caseína com colônia em ágar de eosina-

cloreto de metiltionímio;


Adicinar 0,5 mL de reagente kovac;

Colônias apresentam: cor vermelha intensa(presença de indol) Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988





Confirmação

Escherichia coli

• Teste de vermelho de Metila:

Colônia em caldo vermelho de metila-voges-proskauer inoculada em ágar de eosina-cloreto de

metiltionímio;

Incubar a 30-37°C por 18-48h;

Adicionar 5-6 gts de indicador vermelho de metila SI por 5 mL de cultura;


Cor vermelho brilhante – reações positivas fortemente ácidas;

Vermelha-alaranjadas – reações fracamente positivas;

Amarela – reações negativas

Escherichia coli é vermelho de metila positivo.


Fonte: www.farturaalimentos.org.br



Escherichia coli

Confirmação


• Teste de Voges-Proskauer:

Colônia em caldo vermelho de metila-voges-proskauer inoculada em ágar de eosina-cloreto de

metiltionímio;


Adicionar 4 mL de indicador vermelho de metila SI por 5 mL de cultura;



Cor vermelha – presença de diacetila;

Escherichia coli é voges-proskauer negativa.





Escherichia coli


Confirmação

• Crescimento a partir de Citrato de Carbono como única fonte de carbono:

Colônia em ágar eosina-cloreto de metiltionímio inoculada em ágar citrato de simmons inclinado;

Incubar a 30-37°C por 4 dias;Escherichia coli não utiliza citrato como fonte única de carbono, não ocorrendo crescimento

Esterilização e Acondicionamento dos Meios de Cultura

Meios de Cultura

Esterilizar a 121°C por 15 min.

Placas estéreis de 100 x 20

mm

Incubar a 30-35°C por 24h

Conservar sob refrigeração

Meios em

Tubos

Dissolver os ingredientes

Tubos 18 x 150 mm

10 mL25 x 200 mm

15-20 mLFonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988



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