SECCIÓN DE POSTGRADO DE CIENCIAS DE LA COMUNICACIÓN

COLORANTES Y COLORACIONES EN MICROBIOLOGIA

OBJETIVOS

• Que el alumno aprenda las técnicas de preparación de frotis, fijación y coloraciones más utilizadas en el estudio microbiológico ya sea a partir de muestras directas o de cultivos bacterianos.

• Identifique las diferentes formas bacterianas y de importancia clínica.

• Conocer el fundamento de las respectivas coloraciones asi como la aplicabilidad de las mismas.

MUESTRA

COLORACION YOBSERVACION MICROSCOPICA

CULTIVO

ANTIBIOGRAMA

IDENTIFICACION DELAGENTE PATOGENO Y

DETERMINACION DE SU SUSCEPTIBILIDAD A

ANTIBIOTICOS

FLUJOGRAMA DEL TRABAJO EN MICROBIOLOGIA MEDICA

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal (100 u- 105nm) que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el campo microscópico , el medio más simple de aumentar el contraste es

la utilización de colorantes.

¿Por qué colorear las muestras?

IMPORTANCIAGracias a las tinciones podemos examinar mejor la forma y el tamaño de los microorganismos lo cual es tarea difícil en una observación directa.Nos permite además, por medio de tinciones especiales, estudiar diferentes estructuras de las células tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células

Son compuestos químicos utilizados para aumentar el contraste

poseen:

grupo cromóforo que otorga color a la molécula y

grupo auxocromo que otorga al colorante la capacidad de disociarse electro-líticamente y por lo tanto formar sales, es el que facilita la unión del colorante a otras sustancias con carga eléctrica.

Los colorantes más usados son sales, constituidas por 1. ion cargado positivamente2. ion cargado negativamentePor ejemplo, azul de metileno es actualmente la sal cloruro azul

de metileno.

Colorantes

COLORANTES: Tipos

a) Sales colorantes: más comúnmente usados básicos: Consisten en un catión coloreado unido a un anión

incoloro. Tiñen la célula bacteriana uniformemente (ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos ) (cromatina nuclear de pro y eucariotas) (más usados en citología bacteriana).• Ej: clorhidrato (-) de azul de metileno (+). la safranina, la fucsina básica,

el cristal violeta

ácidos: Tienen el catión incoloro unido a un anión coloreado. No tiñen la célula bacteriana, pueden usarse como color de contraste (coloración negativa). Tiñen estructuras citoplasmáticas de las células eucariotas(Rx básicas)Ej: eosinato (-) de sodio (+),la fucsina ácida y el rojo Congo.

COLORANTES: Tipos

b) Colorantes liposolubles• Se combinan con los componentes lipídicos de

la célula, usados para revelar la localización de los depósitos de grasa. Ej. Negro Sudán.

TIPOS DE TINCIONES

DIFERENCIALES

Pueden ser

SIMPLES SELECTIVAS

•Un solo colorante•Tiñe o no la célulaEj.:Azul de MetilenoSafraninaNigrosina

•Más de un colorante•Células con diferente•composición química•Importancia taxonómicaEj.:Tinción GRAMTinción AAR

•Uno o más colorantes•Estructuras celularescon distinta composiciónquímicaEj.:Tinción de EsporasTinción de FlagelosTinción de Paredes Cel.Tinción de CorpúsculosMetacromáticos

TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIÓN COLOREADA

a) Frotis o película (extensión)

b) La fijación

c) Coloración.

TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIÓN COLOREADA

a) Frotis o película (extensión)• Utilizar portaobjetos limpios y desengrasados

TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIÓN COLOREADA

b) La fijación:Los microorganismos queden adheridos al portaobjeto ( coagula las sustancias proteicas)

TIPOS– CON CALOR (O MÉTODO DE KOCH)– FIJACIÓN QUÍMICA: alcohol metílico, formalina al 5 % (v/v), licor de Hoffman (partes iguales

de etanol absoluto y éter)

Metanol

TINCIÓN SIMPLE DE AZUL DE METILENO: PROCEDIMIENTO

Tinción

2.- Tomar la muestra con el asa de siembra

3.-Extender sobre el agua y fijar a la llama del mechero

1.- Cubrir la preparación con Azul de Metileno 1’

2.- Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio Micrococcus

luteus

Lunes

Frotis y fijación

MUESTRA

Observación de bacterias en muestras teñidas con coloración simple (colorante Básico azul de metileno)

Observacion de levaduras en muestras teñidas con coloracion simple (colorante acido Nigrosina)

1.- Colocar una gota de Nigrosina en un porta

2.- Tomar muestra del microorganismo con el asa, flamear el tubo y tapar

3.- Mezclar con la Nigrosina y extender por todo el porta. Secar al aire y observar

Tinción negativa.

Lunes

cápsulas tanto bacterianas como de levaduras, esporas que se observan como cuerpos refringentes y espiroquetas

Frotis y fijación

2.- Tomar la muestra con el asa de siembra

3.- Extender sobre el agua y fijar a la llama del mechero

Tinción

1.- Cubrir la preparación con Cristal Violeta 1’

2.- Añadir Lugol (mordiente) durante 1’

3.- Decolorar con Alcohol 96º hasta que no suelte colorante

4.- Lavar con agua 5.- Teñir con Safranina 1’ 6.- Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio

L-3.2.3.- Tinción de Gram

Lunes

MUESTRA

Coloración Gram

Diferencias en las estructura de la pared celular en Gram Positivas y Gram Negativas

Gram positiva Gram negativa

Morfología Bacteriana

Bacterias Esféricas = Cocos

diplococos cocos en cadena Tetradas Sarcinas cocos en racimo

Bacterias Alargadas = Bacilos

Bacilo aislado diplobacilo bacilos en cadena empalizadas bacilos lado con lado o en figuras X Y V

Bacterias En Espiral = Espirilos

Tinción GRAM: Bacterias Gram-Positivas

Cocos Gram-positivos

Racimos: forma típica de Staphylococcus sp, como S. aureus

Cadenas: forma típica de Streptococcus sp, como S. pneumoniae, Streptococcus grupo B

Tetradas: forma típica de Micrococcus sp

Bacilos Gram-positivos

• Gruesos: forma típica de Clostridium sp, como C. perfringens, C. septicum

Finos: forma típica de Listeria sp

Ramificados: forma típica de Actinomycetes y Nocardia, como A. israelii

Tinción GRAM: Bacterias Gram-NegativasCocos Gram-negativos

• Diplococos: forma usual de Neiseria sp, como N. meningitidis• También Moraxella sp y Acinetobacter sp aparecen con morfología de diplococos.

Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae, como E. Coli

Curvados: forma usual de Vibrio sp, como V. cholerae, y

Campylobacter sp, como C. jejuni