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Colteres em Bathysa nicholsonii K. Schum. (Rubiaceae): ultraestrutura, composio protica da
secreo e sua atividade antifngica
Emilio de Castro Miguel
Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro Campos dos Goytacazes
Maro de 2006
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Colteres em Bathysa nicholsonii K. Schum. (Rubiaceae): ultraestrutura, composio protica da
secreo e sua atividade antifngica
Emilio de Castro Miguel Dissertao a ser apresentada ao Centro de Biocincias e Biotecnologia como parte das exigncias do Programa de Ps-graduao em Biocincias e Biotecnologia para a obteno do ttulo de Mestre em Biocincias e Biotecnologia.
Orientadora: Dr. Maura Da Cunha
Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro
Campos dos Goytacazes, RJ
Maro de 2006
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Colteres em Bathysa nicholsonii K. Schum. (Rubiaceae): ultraestrutura, composio protica da
secreo e sua atividade antifngica
Emilio de Castro Miguel Dissertao a ser apresentada ao Centro de Biocincias e Biotecnologia como parte das exigncias do Programa de Ps-graduao em Biocincias e Biotecnologia para a obteno do ttulo de Mestre em Biocincias e Biotecnologia.
Aprovada em 21 de Maro de 2006
Comisso Examinadora
___________________________________________________
Dr. Ulysses Garcia Casado Lins IM-UFRJ
___________________________________________________ Dra. Claudia Franca Barros - IPJBRJ
___________________________________________________
Dra. Ktia Valevski Fernandes - LQFPP-CBB-UENF
___________________________________________________ Dra. Maura Da Cunha
LBCT-CBB-UENF (orientadora)
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Este trabalho foi desenvolvido no Laboratrio de Biologia Celular e Tecidual em
colaborao com o Laboratrio de Bioqumica e Fisiologia de Microorganismos do Centro
de Biocincias e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro, sob orientao da Dr. Maura Da Cunha e com financiamento da CAPES,
PETROBRAS, CNPq e FAPERJ e bolsa de mestrado concedida pela UENF/FAPERJ,
durante a vigncia do curso.
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Agradecimentos Dra. Maura Da Cunha pelo aprendizado, orientao, estmulo, amizade e dedicao durante todo o tempo de nossa convivncia. Dra. Valdirene Moreira Gomes pela ajuda nas anlises bioqumicas e ensaios antifungicos. Ao Dr. Marco Antonio de Oliveira pela ajuda nos microscpios e excelentes dicas tcnicas. Ao Dr. Flvio Costa Miguens, pela criteriosa e bem humorada reviso. Aos membros da Banca Examinadora Dra. Claudia Barros, Dr. Ulysses Lins e Dra. Ktia Valevski, por aceitarem o convite. rica, Isabela, Andr, Felipe e Suzana, pela ajuda no LFBM. Ao Sr. Walter Silva pela ajuda da coleta do material botnico. Ao Msc. Sebastio Jos da Silva Neto pela identificao no material botnico. Ao Laboratrio de Biologia Celular e Tecidual, especialmente na figura dos seus tcnicos, Beatriz Ribeiro; Mrcia Adriana Carvalho; Giovana Alves e Noil Freitas, pelo auxlio nos microscpios e no setor de Preparo de Amostras para Microscopia. Ao Programa Mata Atlntica pelo suporte tcnico, e financeiro atravs da PETROBRAS. Ao IBAMA e ao Dr. Luis Henrique (Diretor da Reserva Biolgica de Tingu), pela permisso para a coleta de material botnico. Aos colegas do nosso grupo de pesquisa. Aos amigos Marcus Vinicius Oliveira e Leandro Mattos. A Lucas Miguel, meu querido irmo. A todos que eu me esqueci de agradecer mas, de alguma forma, foram importantes para a realizao desse trabalho. Vocs sabem como final de tese.....
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Dedicatria
Dedico esse trabalho :
Emil Miguel Rosa, Izaura de Freitas Castro Miguel
Lucas de Castro Miguel
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NDICE 1 INTRODUO ............................................................................................... 01 1.1 Floresta Atlntica ............................................................................... 02 1.2 Famlia Rubiaceae e Bathysa nicholsonii K. Schum ......................... 03 1.3 Estpulas ............................................................................................. 04 1.4 Tecidos secretores em plantas ........................................................... 05 1.5 Colteres .......................... ................................................................. 06 1.6 Aspectos subcelulares do processo de secreo vegetal .................... 08 1.6.1 Sistema endomembranar ........................................................ 09 1.6.2 Transporte de substncias em clulas vegetais ....................... 10 1.6.3 Morte celular programada em plantas .................................... 11 1.7 Parede periclinal externa ................................................................... 13 1.7.1 Passagem de molculas pela parede periclinal externa ......... 13 1.8 Exsudatos vegetais: Caractersticas gerais e propriedades ............... 14 2 OBJETIVOS ..................................................................................................... 16 2.1 Objetivo geral .................................................................................... 16 2.2 Objetivos especficos ......................................................................... 16 3 MATERIAL E MTODOS .............................................................................. 17 3.1 rea de coleta .................... ............................................................... 17 3.2 Material botnico ............................................................................... 17 3.3 Microscopia........................................................................................ 18 3.3.1 Microscopia ptica................................................................. 18 3.3.2 Histoqumica............................................................................ 18 3.3.3 Microscopia Eletrnica de Transmisso.................................. 19 3.3.4 Citoqumica.............................................................................. 19 3.3.5 Microscopia Eletrnica de Varredura...................................... 21 3.3.6 Microanlise de Raio-X (Energia dispersiva de Raios-X)....... 21 3.4 Deteco de protenas totais na secreo (SDS-PAGE)..................... 22 3.5 Deteco de glicoprotenas................................................................ 23 3.6 Deteco de atividade antifngica no extrato total da secreo.......... 23 4. RESULTADOS ............................................................................................... 25 5. DISCUSSO ................................................................................................... 44 6. CONCLUSO ................................................................................................. 52 7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................ 53 8. ANEXO: Artigo aceito para publicao na revista Plant Biology ................... 66
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RESUMO
Os colteres so estruturas secretoras que podem ser encontrados em diversas famlias de
Angiospermae. Por definio, so estruturas secretoras constitudas por um eixo central
alongado, formado por parnquima fundamental, circundado por um estrato epidrmico em
paliada, sendo as clulas epidrmicas responsveis pela secreo. A funo protetora dos
colteres conferida pela sua secreo ainda bastante discutvel e pouco conhecida. A
secreo trata-se de um complexo fenmeno de separao ou isolamento de certas
substncias do protoplasto, podendo incluir processo de sntese, acmulo em determinados
compartimentos intracelulares, assim como liberao ou eliminao extracelular para
dentro de espaos internos prximos ou, ento, para fora da superfcie da planta. Durante
esse processo, alteraes ocorrem no s no citoplasma, mas tambm na parede celular.
Para estudar a anatomia e ultraestrutura dos colteres de Bathysa nicholsonii foram
utilizadas tcnicas de microscopia ptica; eletrnica de varredura, incluindo microanlise
de Raios-X e eletrnica de transmisso. Para a deteco de protenas na secreo foi feita
eletroforese em gel de poliacrilamida na presena de SDS. Foram feitos, ainda, testes de
inibio de crescimento de esporos de fungos fitopatognicos. Na sua anatomia, os
colteres so do tipo cilindriforme, com eixo central parenquimtico e clulas epidrmicas
secretoras, apresentando estruturas lipdicas fortemente marcadas. Diversas fases de
maturao do citoplasma puderam ser notadas. As mudanas citoplasmticas sugerem que
as clulas secretoras passam por um processo de morte celular programada no lisossomal
durante o seu desenvolvimento. A parede periclinal externa tambm apresentou mudanas
em sua organizao durante a maturao. Foram notadas diversas fases, possivelmente
envolvidas com o processo de passagem das molculas para o meio externo. A secreo
mostrou atravs de eletroforese a presena de vrias bandas proticas, com massas
moleculares variando entre 66 e 24 kDa. Foram observadas duas protenas majoritrias com
massas moleculares de aproximadamente 26 e 36 kDa. O efeito da secreo obtida aps
processamento protico sobre a inibio do desenvolvimento dos fungos causou uma
significativa inibio no fungo Coletotrichum lindemuthianum, desde as primeiras horas de
crescimento.
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ABSTRACT
Colleters are secretory structures present in many Angiospermae families. These structures
are constituted by an elongated central axis formed by fundamental parenchyma,
surrounded by a palisade epidermis, being the epidermal cells responsible for the secretion.
The protective function of colleters conferred by their secretion is still controvesal. The
secretion is a complex phenomenon of separation and isolation of certain protoplast
substances. It may include synthesis and accumulation process in certain intracellular
compartments, well as liberation and extracelular elimination to nearby inner spaces or to
the outer side of plant surface. During this process, alteration occur not only the cytoplasm
but also in the cell wall. In orther to study the anatomy and ultrastructure of Bathysa
nicholsonii colleters, light microscopy, electron scanning microscopy, including X-Ray
microanalysis, and transmission electron microscopy were utilized. For protein detection,
the secretion was analysed by SDS-PAGE. Tests on the inhibitory potential of secretion on
the spore growth of phytophatogenic fungus were performed. In their anatomy, colleters are
cilindriform, with a parenchymatic central axis and epidermal secretory cells, presenting
lipophylic structures strongly stained. Many cytoplasm maturation phases could be noted.
Cytoplasmic changes, observed in secretory cells are indicative or a possible event of non
lisossomal programmed cell death occurring during the course of their development. The
outer cell wall was also presented organizational changes during maturation. Several phases
were noted, probably involved with molecules passage to the outside media. By
electrophoresis, the presence of different proteins, covering the range of66 to 24 kDa were
visualized in colleters secretion. Two majoritary proteins, with molecular masses of
approximately 26 and 36 kDa were noted. secretion extracted proteins presented a
inhibitory effect ont the growth of Colletotrichum lindemuthianum fungus, since the first
hours of growth.
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1. INTRODUO
Estruturas ou tecidos secretores podem estar presentes em diferentes regies das
plantas e possuir formas variadas (Dickinson, 2000). Partindo do princpio que estruturas
secretoras formam um grupo polifiltico, divergncias evolutivas deram origem a diferentes
mecanismos de sntese e externalizao de variados exsudatos (Dickinson, 2000). Estas
variaes podem ser identificadas na anatomia e ultraestrutura das estruturas secretoras dos
colteres, que so constitudas por um eixo central vascularizado circundado por uma
epiderme secretora, disposta em paliada. Colteres podem estar presentes na base das
estpulas, clices, folhas, flores e pices caulinares.
A morfologia, anatomia e ultraestrutura de colteres em diversos gneros da famlia
Rubiaceae foram recentemente descritas (Klein et al., 2004; Miguel, 2004; Miguel et al.,
2005-submetido; Moraes et al., 2005). Contudo, muitas questes permanecem em aberto.
Dentre estas, a morfofisiologia do processo de secreo em colteres tem sido objetivo do
nosso grupo no setor de Citologia Vegetal LBCT/UENF, contribuir para elucidar os
aspectos anatmicos e ultraestruturais da secreo em plantas, enfocando essas estruturas
em espcies da famlia Rubiaceae que ocorrem na Floresta Atlntica.
O ambiente encontrado em regies de Floresta Atlntica mido, sendo propcio
para o desenvolvimento de microrganismos, que apresentam diversas interaes com estas
plantas, inclusive patogenia. Estudos envolvendo estas relaes microrganismos/plantas so
necessrios para elucidar os mecanismos de interao. Exemplifica esta abordagem, o fato
de que tem sido sugerido que o exsudato de colter apresente papel importante na interao
bactria/planta nos gneros onde pode ser observada nodulao de bactrias (Horner e
Lersten, 1968; Lersten, 1975). Assim, acredita-se que a caracterizao da secreo e a
avaliao de sua atividade biolgica podem proporcionar o melhor entendimento do
envolvimento da secreo no mecanismo de defesa das espcies em questo.
Pelo exposto, o presente estudo tem como objetivo a anlise anatmica e
ultraestrutural dos colteres de Bathysa nicholsonii K. Schum (Rubiaceae), bem como,
analisar parcialmente a composio protica e atividade antifngica da secreo produzida
por estas estruturas secretoras.
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1.1 Floresta Atlntica
O bioma Floresta Atlntica engloba vrios tipos de vegetao (Rizzini, 1997) como
florestas ombrfilas densas ou mistas, florestas estacionais e ecossistemas associados como
restingas e manguezais. uma das formaes vegetais tropicais mais ameaadas do mundo
pelo crescente desmatamento (Myers et al., 2000). Desde o incio da colonizao, com a
ocupao dos primeiros espaos territoriais prximos regio costeira, o Brasil passou por
diferentes ciclos de explorao como: o do pau-brasil; da cana-de-acar; da pecuria; do
ouro; e do caf que contriburam para a perda da cobertura florestal. Tambm a
industrializao e conseqente urbanizao com o surgimento das principais cidades e
metrpoles brasileiras fizeram com que a rea originalmente ocupada pela Floresta
Atlntica fosse reduzida drasticamente (Quinet et al., 2000).
Mundialmente, apenas da dcada de 80 foram extintos cerca de 154 milhes de
hectares de florestas tropicais (FAO, 1993). Na Floresta Atlntica, possuindo altos ndices
de endemismo (WCMC, 1992), estima-se que ocorram cerca de 8000 espcies de plantas
(Conservation International, 2006). No entanto, ainda pouco conhecida em relao
composio florstica e aos processos ecolgicos que envolvem suas comunidades e
populaes. Originalmente, esta formao vegetal ocupava cerca de 1,2 milhes de km2,
hoje ocupa apenas 7 % do territrio original, sendo que desta rea, somente 1-2 % tem
chances de ser preservada (Myers et al., 2000).
Atualmente, a Floresta Atlntica compreende remanescentes de cobertura florestais
bastante diversificadas na sua fisionomia e florstica. Com uma grande populao humana
vivendo em seu domnio, ocorre uma grande presso sobre este conjunto de ecossistemas e
sua biodiversidade. Esta ocupao desordenada acaba por causar utilizao irracional de
recursos naturais. Dentre as principais atividades presentes hoje nesse ecossistema,
resultam da ao direta do homem sobre as florestas: expanso agropecuria e urbana,
inclusive loteamentos clandestinos; empreendimentos de infra-estrutura; explorao
predatria de recursos florestais, sendo exemplos a extrao de madeira e o turismo
desordenado; dentre outras (Fundao SOS Mata Atlntica, 2003).A cobertura atual desta
formao vegetal apresenta uma alta diversidade de famlias botnicas. Em alguns trechos,
a famlia Rubiaceae est dentre aquelas que apresentam grande nmero de indivduos
(Lima e Guedes-Bruni, 1997).
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1.2 Famlia Rubiaceae e Bathysa nicholsonii K. Schum.
A famlia Rubiaceae encontra-se entre as quatro maiores famlias de Angiospermas,
considerando-se o nmero de espcies, depois das famlias Asteraceae, Orchidaceae e
Fabaceae (lato sensu = Leguminosae), com cerca de 13.000 espcies e 650 gneros
(Robbrecht, 2004). No Brasil, segundo Delprete (1998), a famlia compreende
aproximadamente 118 gneros e 1.600 espcies.
A ltima reviso taxonmica da famlia foi feita por Robbrecht (1988). Desde ento,
muitos trabalhos descrevendo novas espcies nessa famlia so encontrados na literatura
como, por exemplo, Devesa e Ortega-Olivencia (2003), Ortega-Olivencia e Devesa (2003),
Markey e de Lange (2003), Norton e de Lange (2003). Tambm so reportadas revises do
gnero Xantophytum (Axelius, 1990); Ernode (NegronOrtiz e Hickey, 1996) e Simira
(Silva Neto, 2000)
Diversas espcies da famlia Rubiaceae apresentam um alto valor importncia (VI)
no bioma Floresta Atlntica. Lima e Guedes-Bruni (1997) demonstraram que
aproximadamente 5 % das espcies catalogadas no remanescente de Floresta Atlntica da
Reserva Biolgica de Maca de Cima pertenciam a esta famlia. Guedes-Bruni (1998)
demonstra a importncia desta famlia em outros remanescentes de Floresta Atlntica do
Estado do Rio de Janeiro.
Desde o incio do sculo XIX, com a extrao e caracterizao da cafena, a famlia
Rubiaceae tem se destacado pela presena de substncias de propriedades teraputicas em
suas estruturas. Atualmente, a famlia Rubiaceae vem se destacando pela produo de
substncias medicinais ou potencialmente medicinais, por exemplo, microbicidas, anti
plasmdio, analgsicos, anti inflamatrios, anti tumores dentre outras (Abdel-Kader et al.,
1997; Capasso et al., 1997; Germano et al., 1999; Staerk et al., 2000; Kayser et al., 2001;
Jayasinghe et al., 2002; Hamerski et al., 2003; Dongmo et al., 2003; Suksamrarn et al.,
2003; Jangde e Bansod, 2004; Gattuso et al., 2004; Lorence et al., 2004).
Muitas caractersticas so marcantes na famlia Rubiaceae como folhas opostas com
estpulas e ovrio nfero, alm da presena de estpulas cobrindo e protegendo o meristema
apical caulinar (Robbrecht, 1988). Embora, seja bem caracterizada como uma famlia, as
delimitaes de subfamlias, de tribos, e de gneros tm sido discutidas em razo da grande
riqueza e da variedade morfolgica de seus caracteres, o que vem provocando muitas
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mudanas na classificao hierrquica infrafamiliar (Andersson e Rova, 1999; Andreasen e
Bremer, 2000; Piesschaert et al., 2000).
O gnero Bathysa representado por cerca de 15 espcies, sendo rvores, arvoretas
ou arbustos, distribudos no Panam, Guiana Francesa, Venezuela, Colmbia, Peru, Bolvia
e Brasil. B. nicholsonii foi escolhida para este estudo pela presena de estpulas grandes
que, em suas bases, apresentam colteres com secreo abundante (Miguel, 2004). Bathysa
nicholsonii K. Schum. uma rvore com at sete metros que apresenta casca castanha, com
placas longitudinais e ramos crassos, possuindo estpulas persistentes. No Estado do Rio de
Janeiro, ocorre no Parque Nacional da Tijuca e na Reserva Biolgica de , onde encontrada
na orla da mata associada com indivduos de B. cuspidata, sendo conhecida vulgarmente
por bapebucu e quina-do-mato. Segundo os critrios da IUNC (International Union for
Nature Conservation), a espcie pode ser considerada rara. Indcios levam a crer que B.
nicholsonii tenha populaes de tamanho reduzido, nos Estados do Rio de Janeiro e Minas
Gerais (Germano-Filho, 1999).
1.3 Estpulas
So apndices presentes aos pares na base do pecolo e, em sua maioria, fusionadas
a uma estrutura interpeciolar em ambos os lados do caule, entre as folhas opostas, podendo
ser de diferentes formas (Robbrecht, 1988). Em determinadas plantas, estas estruturas
podem ser verdes, semelhantes s folhas e tendo capacidade fotossinttica, mas sua
principal funo , de fato, a proteo das folhas jovens em desenvolvimento (Fahn, 1990).
A presena de estpulas uma das caractersticas vegetativas mais importantes da famlia
Rubiaceae. Contudo, pouco se sabe sobre a origem evolutiva e as funes das estpulas em
dicotiledneas (Cronquist, 1968; Rutischauser e Dickinson, 1989).
Em Rubiaceae sabe-se que, aps o crescimento do pice caulinar, as estpulas
podem ser decduas ou persistentes. Ocorrendo no pice caulinar, sendo decduas ou
persistentes, freqentemente, cobrem-no inteiramente. Estpulas persistentes so
encontradas prximas s gemas axilares, cobrindo-as (Robbrecht, 1988). Assim, oferecem
proteo aos meristemas apicais e/ou axilares na forma de uma barreira fsica. Esta forma
de proteo em camadas de estpulas sobre o pice encontrada, principalmente, em
dicotiledneas arbreas (Fahn, 1990). Em diversas espcies, podemos encontrar, na
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superfcie adaxial das estpulas, estruturas secretoras denominadas de colteres.
Ocasionalmente, as estpulas assumem uma tonalidade marrom em seus pices, sendo
indcio de sua senescncia.
1.4 Tecidos secretores em plantas
Estruturas ou tecidos secretores podem estar presentes em diferentes rgos das
plantas, possuindo formas variadas (Dickinson, 2000). A variao de formas destas
estruturas reflete a variao de exsudatos produzidos. Atualmente, a classificao das
estruturas secretoras feita com base na morfologia ou no contedo do exsudato. Tal
classificao discutvel devido ao fato de que tecidos secretores, geralmente, sofrem
transformaes relativamente rpidas. Em funo disto, a estrutura, a ultraestrutura e o
contedo bioqumico das clulas podem ser modificados em dias ou at em horas. Tal fato
dificulta a classificao, pois tecidos iguais podem ser considerados diferentes somente por
se encontrarem em uma etapa diferente da maturao (Fahn, 1979).
Fahn (1988) organizou uma listagem de diferentes tipos de estruturas secretoras de
plantas e classificou-as, principalmente, quanto sua morfologia e composio qumica
da secreo, sendo estas caractersticas complementares. No entanto, senso comum na
literatura que estruturas secretoras formam um grupo polifiltico (Fahn, 1979; Laurence et
al., 2000).
Estudos morfofisiolgicos tm sido realizados sobre estruturas secretoras em
diferentes famlias. Dentre estes, se destacam os estudos de Gaffal e Heimler (1998),
investigando a estrutura do nectrio floral de Digitalis purpurea; Fahn e Shimony (1998),
sobre a ultraestrutura das clulas secretoras de duas espcies de Fagonia (Zygophyllaceae);
Silva e Machado (1999a e 1999b), com relao aos tricomas secretores em folhas de Piper
regnellii (Piperaceae); Fahn (2000), investigando a estrutura e funo das clulas
secretoras; Bottega e Corsi (2000), sobre a estrutura e funo de tricomas glandulares do
clice de Rosmarinus officinalis (Labiatae); Knight et al. (2001), sobre as glndulas de leo
do fruto de Citrus sinensis; Machado e Carmello-Guerreiro (2001), investigando a estrutura
e desenvolvimento de canais secretores em frutos de Schinus terebinthifolius
(Anacardiaceae); Miguel (2004), investigando os colteres de espcies de Bathysa
(Rubiaceae); e Klein et al. (2004), estudando colteres de Simira (Rubiaceae).
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Ultraestruturalmente, tem sido observado que clulas de tecidos secretores so
caracterizadas por conterem numerosas mitocndrias, pequenos vacolos e citoplasma
denso (Fahn, 1988). Segundo Fahn e Shimony (1998), clulas secretoras de Fagonia mollis
(Zygoplhylaceae) possuem ncleo relativamente grande e numerosas mitocndrias
modificadas. Nas clulas secretoras dos ductos de goma de Lannea coromandelica
(Anacardiaceae), o citoplasma rico em ribossomos, retculo endoplasmtico rugoso,
mitocndrias, vacolos, corpos paramurais e incluses lipdicas e, em algumas etapas de
sua diferenciao, foram encontrados dictiossomos em abundncia (Venkaiah, 1992).
Werker e Kislev (1978) argumentam que a produo de secreo, em tricomas secretores da
raiz de Sorghum, est relacionada ao complexo de Golgi.
1.5 Colteres
So estruturas secretoras que podem ser encontradas em diversas famlias de
Angiospermae. Por possurem forma e funes variadas e estarem presentes em diversos
grupos taxonmicos, estas estruturas foram descritas sob vrios nomes. Os mais usuais so:
squamallae (Ramayya e Bahadur, 1968); glndulas estipulares (Van Hove e Kagoyre
(1974); nectrio extra-floral (Dave e Patel, 1975); e glndula de resina (Curtis e Lersten,
1980).
Colteres tm sido definidos como estruturas secretoras constitudas por um eixo
central alongado, formado por parnquima fundamental, circundado por um estrato
epidrmico em paliada, sendo as clulas epidrmicas responsveis pela secreo (Thomas,
1991; Da Cunha e Vieira, 1997). Essas estruturas foram inicialmente, descritas em 1848,
por Hanstein (apud Thomas, 1991). Curiosamente, estes no constam na classificao de
estruturas secretoras, proposta por Fahn (1988); embora sejam reconhecidos como
estruturas secretoras por outros autores (Esau, 1974). O termo colter deriva do termo
grego colla, que quer dizer cola e refere-se secreo pegajosa que o mesmo libera
(Thomas, 1991). Lersten (1974a; 1974b) caracterizou morfologicamente dois tipos de
colteres em Rubiaceae, o "dendroid" e o "brushlike", classificando o tipo mais comum
(padro) como "standard". Da Cunha (2005) subdividiu morfologicamente o tipo standard
em: cilindriforme e claviforme. Para a distino de famlias, as variaes dos colteres
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afazem-se pouco teis, mas em termos de gneros e subgneros em Rubiaceae, esta
caracterstica se torna bastante consistente (Robbrecht, 1988).
De acordo com Thomas (1991), este tipo de estrutura secretora encontrado na face
adaxial de diferentes rgos de membros de 60 famlias de Angiospermae. Robbrecht
(1988) aponta que os colteres podem ocorrer tambm em partes florais de Rubiaceae,
Loganiaceae, Apocynaceae e outras famlias. Gonzlez (1998) mostra que os colteres de
diferentes espcies da famlia Turneraceae esto distribudos nos primrdios foliares.
O nmero de colteres e a sua distribuio nos rgos so variveis. Estas estruturas
podem estar; cobrindo o interior da estpula e/ou do clice, com gradao varivel; na
estpula podem estar localizadas na borda ou podem estar inseridos em uma fileira nica na
base, sendo a ltima a ocorrncia mais freqente. Klein et al. (2004) mostraram que os
colteres de Simira pikia se encontram distribudos em uma linha na base da estpula
enquanto o conjunto dos colteres de S. glaziovii forma dois tringulos na base da estpula.
Miguel (2004) mostrou que os colteres em trs espcies de Bathysa so distribudos na
base das estpulas.
A variao de formas, que acarreta uma variao de nomenclatura, pode ser
claramente notada na literatura. Robbrecht (1988) aponta que as estruturas secretoras
pluricelulares que ocorrem no interior das estpulas e em outros rgos, como encontrado
em partes florais, de Rubiaceae, Loganiaceae, Apocynaceae e outras famlias de Asteridae,
j foram chamadas por uma longa srie de termos, como Squamallae por Ramayya e
Bahadur (1968), "glndulas estipulares" por Van Hove e Kagoyre (1974), nectrio
extrafloral por Dave e Patel (1975) ou glndulas de resina por Curtis e Lersten (1980).
Gonzlez (1998) reconhece a variao de formas nos colteres de Turneraceae e adiciona
termos, classificao, para os colteres observados em gneros de Turnera e Piriqueta.
Colteres do tipo "standard" se mostram similares em muitos aspectos , contudo,
descrita uma grande diversidade de tamanhos, formatos, grau de desenvolvimento e
dimetro relativo do eixo central alm da presena ou no do desenvolvimento da
constrio basal (Robbrecht, 1988; Klein, 2002; Miguel, 2004). H, ainda, estruturas
vascularizadas e outras no vascularizadas. Tal fato discutido por Thomas (1991) e
Apezzato-da-Gloria e Estelita (2000), devido a sua importncia para a nutrio da estrutura.
Estas variaes podem apresentar valor taxonmico (Robbrecht, 1988).
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Em relao ultraestrutura dos colteres, Miller et al. (1983) mostram que as
clulas secretoras dos colteres de Allamanda cathartica (Apocynaceae) possuem retculo
endoplasmtico perinuclear, numerosas mitocndrias, vacolos ocupando grandes reas do
citoplasma, complexo de Golgi e plastdeos. Em Bathysa gymnocarpa, h evidncias de
que as clulas secretoras dos colteres apresentam complexo de Golgi com cisternas mais
abundantes do que B. stipulata (Miguel, 2004). Idioblastos cristalferos e tanferos foram
observados no eixo central de colteres de Psychotria kirkii (Rubiaceae) (Thomas e Dave,
1989) e P. nuda (Moraes et al., 2005).
Tem sido proposto que a funo protetora dos colteres conferida pela sua
secreo (Mueller, 1985; Williams et al., 1982; Ramayya e Bahadur, 1968). De acordo com
estes autores, o exsudato protege o meristema, que fica, algumas vezes, completamente
coberto por secreo. Em espcies de Rubiaceae, esta secreo pode estar envolvida na
formao de ndulos de bactrias (Horner e Lersten, 1968). No entanto, no elucidada
ainda a nodulao nestas plantas.
Paralelamente ao desenvolvimento do meristema apical, os colteres tendem a
senescer. Durante este processo, sua colorao torna-se gradativamente marrom. O
processo de senescncia inicia-se na epiderme da parte apical da estrutura e finda na basal
central. A lignificao, intimamente ligada ao processo de senescencia dos colteres, um
fenmeno centrpeto iniciando-se pelas paredes celulares da epiderme (Thomas e Dave,
1989; Miguel, 2004). A anatomia dos colteres durante o processo de senescncia encontra-
se parcialmente descrita. No entanto, persiste a lacuna quanto s descries ultraestruturais.
1.6 Aspectos subcelulares do processo de secreo vegetal
A secreo um fenmeno complexo que, usualmente, envolve sntese,
compartimentalizao intracelular, liberao ou secreo propriamente dita para o
apoplasto e, alternativamente, para a superfcie da planta (Castro, 2000; Machado, 2000).
Por isso, tm sido descritas peculiaridades intracelulares no processo de secreo. Dentre
estas, Machado (2005) descreve caractersticas das clulas secretoras durante a secreo.
Entre as organelas que mostram variaes considerveis, ao longo do processo secretor,
esto os plastdios dos tricomas glandulares no gineceu de Zeyheria digitalis
19
(Bignoniaceae) (Machado et al., 1995) e os cloroplastos no parnquima secretor de
Citharexylum mirianthum (Verbenaceae) (Machado, 1999).
Considerando, ainda, que a secreo um processo que envolve peculiaridades
intracelulares, o estudo detalhado das clulas secretoras permite avaliar tanto a dinmica do
processo secretor, como fazer correlaes entre a estrutura e o funcionamento de
determinadas organelas envolvidas na secreo.
Estruturas secretoras, como tricomas glandulares e nectrios, podem combinar
simplicidade estrutural com atividade secretora intensa, mostrando-se modelos adequados
para a investigao de questes fundamentais da biologia celular de plantas. Dentre estas,
transporte curta distncia; sntese e transporte intracelular de macromolculas; origem de
vacolos de estocagem ou com funo lisossomal (Silva e Machado 1999a; Machado,
1999). Ultraestruturalmente, estas clulas possuem caractersticas particulares. Segundo
Fahn e Shimony (1998), as clulas secretoras de Fagonia mollis (Zygoplhylaceae) possuem
ncleo relativamente grande e numerosas mitocndrias modificadas. Nas clulas secretoras
dos ductos de goma de Lannea coromandelica (Anacardiaceae), o citoplasma rico em
ribossomos, retculo endoplasmtico rugoso, mitocndria, vacolos, corpos paramurais e
gotas lipdicas e em algumas etapas de sua diferenciao foram encontrados complexos de
Golgi (Venkaiah, 1992). Werker e Kislev (1978) argumentam que a produo de secreo,
em tricomas secretores da raiz de Sorghum (Poaceae), est relacionada com o complexo de
Golgi.
1.6.1 Sistema endomembranar
O retculo endoplasmtico uma projeo do envelope nuclear para as regies
corticais da clula e pode ser subdividido em domnios funcionais distintos (Staehelin,
1997). O retculo endoplasmtico o ponto de entrada no sistema endomembranar para
protenas recm sintetizadas. Depois da remoo da seqncia sinal, por peptidases do
lmem do retculo, as protenas mudam sua estrutura com a ajuda de chaperonas (Vitale e
Denecke, 1999). Protenas defeituosas parecem ser reconhecidas por um mecanismo de
controle de qualidade, sendo transportadas para o citosol, onde so degradadas (Brandizzi
et al., 2003). A glicosilao de protenas tem um papel fundamental na entrada destas no
retculo (Vitale e Denecke, 1999). Arabidopsis mutantes, defeituosas para N-glicosilao
20
ou faltando -glicosidase I, so letais no embrio (Lukowitz et al., 2001; Gillmor et al.,
2002; Boisson et al., 2001). Protenas residentes do retculo so retidas nessa organela ou
recicladas de volta do complexo de Golgi (Vitale e Denecke, 1999). O retculo
endoplasmtico segrega, ainda, compartimentos de membrana para seqestro de lipdios ou
protenas, alguns desses evoluem para vacolo de estocagem (Chrispeels e Herman, 2000).
O complexo de Golgi conhecido desde 1843, quando foi descrito por Camillo
Golgi. Em microscopia eletrnica de transmisso, foi visualizado nos anos 50. Essa
organela no foi alvo de muitos estudos nas dcadas seguintes, contudo, a partir da dcada
de 90, foi redescoberta (Mollenhauer e Morr, 1994). Em clulas vegetais, formado por
vrias pequenas pilhas de cisternas, reconhecidas, individualmente, tambm pelo nome de
dictiossomos (Dupree e Sherrier, 1998). A quantidade dessas pilhas pode variar muito de
acordo com a funo da clula em questo. A variao notada no somente na quantidade
das cisternas, mas tambm na sua morfologia. Essas pilhas so polarizadas
individualmente, diferenciando as faces cis e trans. Essa organela extremamente dinmica
e mvel no citoplasma da clula, principalmente, no inicio do processo de diviso celular
(Nebenfhr e Staehelin, 2001) tendo grande importncia na sntese de precursores de
parede celular.
Dentre as muitas funes atribudas ao complexo de Golgi se destacam, alm da
sntese de polissacardeos da parede celular, a modificao de protenas, como, por
exemplo, protenas de estocagem ou enzimas, que sero subseqentemente distribudas para
outras partes da clula como o vacolo e a membrana plasmtica. Para exercer com
preciso essas funes, a organela possui compartimentalizao bioqumica, sendo as
cisternas da face cis diferentes das da face trans. Pakelka e Robinson (2003) confirmam a
existncia de relao estrutural e funcional do complexo de Golgi com o retculo
endoplasmtico.
1.6.2 Transporte de substncias em clulas vegetais
O movimento intracelular de molculas de vital importncia na manuteno da
identidade e funcionalidade dos compartimentos intercelulares (Jrgens, 2004). O
transporte e endereamento de protenas para os vrios compartimentos foram estudados
extensivamente em clulas vegetais (Jrgens, 2004). Estes estudos permitiram a
21
identificao de vrias seqncias de sinais de endereamento. Essas seqncias so
especificas no s para organelas, mas tambm para seus subcompartimentos.
O trfego vesicular entre retculo endoplasmtico, complexo de Golgi, vacolo e
membrana plasmtica complexo, podendo seguir muitas vias diferentes do transporte das
vesculas (Hawes et al., 1999). Diferentes tipos de estresse podem afetar essas vias e
modific-las de vrias formas. Estes efeitos podem ser suprimidos por mecanismos
celulares (Levine, 2002). Os mecanismos de trfego vesicular em plantas tm se
demonstrado semelhantes aos de mamferos e fungos com respeito ao transporte, ao
ancoramento e a fuso vesicular. Contudo, molculas nicas de vegetais tambm controlam
esse fenmeno (Ueda e Nakano, 2002). Estudos mostram o envolvimento do gradiente de
concentrao de ons, especialmente clcio e cloro, no processo de exocitose de clulas
animais (Marengo, 2005) e em clulas vegetais (Zonia et al., 2001).
1.6.3 Morte celular programada em plantas
O processo de morte celular programada (MCP) muda a ultraestrutura e dinmica da
clula vegetal (Doorn e Woltering, 2005). Durante esse processo as vias metablicas so
desviadas; ou seja, toda a maquinaria celular que funciona para a manuteno celular, e/ou
processos secretores, passa ser direcionada para suprir as necessidades do processo de MCP
(Rose et al., 2006). Tal processo de fundamental importncia no desenvolvimento,
resposta de defesa contra patgenos (McCabe e Leaver, 2000) e senescncia (Doorn e
Woltering, 2005).
De um modo geral, dois tipos de MCP so predominantes: autofagia e apoptose. H,
ainda, uma forma incomum, chamada de morte celular programada no-lisossomal (Doorn
e Woltering, 2005). Uma das abordagens na diferenciao entre autofagia e apoptose
baseada na ultraestrutura das clulas durante o processo e pelas organelas que esto
envolvidas.
Resumidamente, autofagia um processo altamente regulado, durante o qual
materiais citoplasmticos so envolvidos por vesculas, constitudas de dupla membrana,
que so ento destinadas aos vacolos ou lisossomos para degradao (Levine e Klionsky,
2004).
22
Em linhas gerais, a autofagia um mecanismo pelo qual a clula degrada parte ou o
citoplasma completo, exceto ncleo (Aubert et al., 1996). Esse processo pode ocorrer em
todos os organismos eucariontes, seja como um processo natural, no curso do
desenvolvimento ou em reposta aos estresses ambientais, como, por exemplo, depleo de
nutrientes (Rose et al., 2006).
A via do processo autofgico envolve o seqestro de pores do citoplasma por
endomembranas, formando ento o vacolo autofgico. Em seguida, ocorre a degradao
das estruturas capturadas por essas endomembranas, ao invs de sua reciclagem para
manter as funes essenciais e homeostase celular (Rose et al., 2006). Podem existir
variaes, e outras classificaes para o processo de autofagia em plantas, como a micro e
macroautofagia (Doorn e Woltering, 2005).
A apoptose tem sido alvo de algumas revises recentes (Yoshida et al., 2005; Doorn
e Woltering, 2005; Selga et al., 2005). Trs caractersticas principais podem ser observadas
durante esse processo: fragmentao nuclear; formao de corpos apoptticos; e
engolfamento e degradao dos corpos apoptticos nos lisossomos de outras clulas
(Clarke, 1990). Outras caractersticas tambm so marcantes na apoptose como, por
exemplo, a participao das caspases e a condensao da cromatina com degradao do
DNA (Doorn e Woltering, 2005). J que a apoptose inclui a degradao dos corpos
apoptticos em outras clulas, alguns autores argumentam que a apoptose verdadeira no
ocorre em plantas (Doorn e Woltering, 2005).
Alguns exemplos de MCP em clulas de mamferos mostram uma morfologia
intermediria. Em algumas clulas, o processo autofgico precede a formao dos corpos
apotticos (Doorn e Woltering, 2005).
O processo de morte celular programada menos comum a morte celular
programada no lisossomal, que se diferencia das demais por no envolver lisossomos. A
clula se mata, aparentemente, pela inibio das principais vias biossintticas, pela
desestabilizao das membranas, ou por vias ainda no elucidadas (Doorn e Woltering,
2005). Esse processo tambm chamado morte celular programada necrosis-like (Doorn e
Woltering, 2005). Por ser menos freqente, pouco se sabe sobre esse processo.
23
1.7 Parede periclinal externa
A parede periclinal externa a fronteira entre a planta e o ambiente. Esta estrutura
formada por macromolculas e constitui uma barreira ao fluxo bidirecional em grande parte
dos tecidos de revestimento nas plantas. A parede periclinal externa tem sido relacionada
tambm proteo contra radiao, danos mecnicos, patgenos e pragas. A variedade de
funes dessa estrutura tem sido associada sua estrutura, complexidade e diversidade. A
distribuio de seus componentes, usualmente, heterognea. A nomenclatura de seus
estratos tem sido baseada nesta peculiaridade. Tenberge (1992) prope que a parede celular
dividida em cera epicuticular e trs camadas distintas: a cutcula propriamente dita, as
camadas cuticulares, divididas em camada reticulada e camada arborescente, e camada rica
em polissacardeos. Outros autores tambm utilizam esta nomenclatura (Barros e Miguens,
1998; Klein et al., 2004 e Miguel, 2004, Moraes et al., 2005). A composio e estrutura das
paredes celulares vegetais podem variar durante o crescimento e a diferenciao da clula e
em resposta a fatores ambientais (Barros e Miguens, 1998; Marques, 1998). No entanto, a
morfologia e fisiologia, sobretudo os mecanismos de secreo, da parede periclinal externa
tm sido considerados espcie-especficas.
1.7.1 Passagem de molculas pela parede periclinal externa
O transporte de molculas pela parede periclinal externa ainda no foi elucidado. A
maioria dos trabalhos, que se referem de alguma forma a passagem de molculas pela
parede periclinal externa, utilizou microscopia eletrnica de transmisso, e apenas citam a
presena ou ausncia de cutcula. Quanto ao mecanismo de secreo, Ascenso e Pais
(1998) relatam o acmulo da secreo no espao periplasmtico. A secreo passa pela
parede celular e se deposita em um espao subcuticular, formado pelo deslocamento da
cutcula. Esse espao recebe o nome tambm de espao subcuticular (Possobom e
Machado, 2005).
Kim e Mahlberg (1997), utilizando tcnicas de imunolocalizao, marcaram o
Tetra-hidro-canabinol na parede periclinal externa de tricomas criofixados, reafirmando a
funo dessa cavidade na passagem de substncias pela parede. Os mesmos autores
descreveram a formao de vesculas secretoras em tricomas de espcies da famlia
24
Cannabacea (Kim e Mahlberg, 2003). Mesmo assim ainda ficam duvidas com relao a esta
passagem.
Mahlberg e Kim (1992) e Kim e Mahlberg (1995 e 2000) sugerem que, em tricomas
glandulares de Cannabis, a passagem da secreo atravs da parede periclinal externa
feita atravs de cavidades secretoras na parede que servem para a sada do exsudado aps
toda a passagem pelo trfego de vesculas, sendo a parede celular o meio de exteriorizao
da secreo. Alguns aspectos dessa passagem ainda permanecem obscuros, pois nenhum
estudo mostrou de maneira convincente todo esse processo em clulas de estruturas
secretoras de vegetais. Estruturas semelhantes a essas cavidades secretoras forma
descritas na parede periclinal externa dos colteres de B. nicholsonii (Miguel, 2004). Estas
estruturas tiveram a sua formao descrita (Miguel et al., 2005) e aparentemente esto
envolvidas no processo de trfego da secreo pela parede periclinal externa. No entanto,
Jefree (1996) aponta outros mecanismos para este trfego, dentre os quais, microcanais
perpendiculares ao maior eixo da parede periclinal e acmulo da secreo nas camadas
cuticulares da parede celular. Esse acmulo acaba por levar a ruptura fsica dessa camada.
1.8 Exsudatos vegetais: Caractersticas gerais e propriedades
Os exsudatos vegetais, que so classificados de acordo com sua composio
qumica, tm uma ampla distribuio entre as famlias de vegetais superiores chamando a
ateno de muitos pesquisadores, no s pela sua funo na planta, como tambm pelo seu
aproveitamento econmico. Os materiais secretados podem exercer vrias funes na
prpria planta e, aps serem eliminados das estruturas secretoras, geralmente no so
reutilizados nos processos metablicos do organismo produtor (Fahn, 1979). Diferentes
espcies exsudam diferentes produtos, como pode ser visto ao se comparar os trabalhos de
Curtis e Lersten (1974; 1980) e Durkee et al. (1984), em que o exsudato, nas espcies
estudadas, classificado como uma resina. Mueller (1985) classifica o exsudato de Alstonia
scholaris como sendo semelhante ao ltex. Os trabalhos de Dexheimer e Guenin (1981) e
Horner e Lersten (1968) em Psychotria bacteriophila (Rubiaceae) e Miller et al. (1983) em
Psychotria kirkii (Rubiaceae) mostram que os colteres destas espcies secretam
substncias mucilaginosas. Ramayya e Bahadur (1968) caracterizaram o exsudato do
colter de Allamanda cathartica (Anacardiaceae) como uma substncia parda e
25
transparente, considerada como resina de grandes polmeros. Ao investigar esta mesma
secreo, Thomas e Dave (1989) no encontraram aminocidos, no entanto, acharam alguns
acares (glicose e rhamanose) e caracterizaram seus elementos qumicos majoritrios: Na
(25 %), Fe (14 %) e Zn (13 %). A presena de protenas na secreo dos colteres foi
identificada por Klein et al. (2004). Kristen (1976) aponta a necessidade de anlises
bioqumicas para determinao da composio de mucilagens.
O uso dos exsudatos vegetais na medicina popular bastante amplo. Por isso, a
etnofarmacologia pode crescer bastante nos ltimos anos. O exsudato de Plectranthus
(Lamiaceae) utilizado em casos de dores de cabea, dores de garganta, queimaduras,
dermatite, nuseas e, at, picadas de escorpio (Riviera Nuez e bon de Castro, 1992 e
Bown, 1995). O extrato foliar de Piper regnellii (Piperaceae) utilizado no tratamento de
dores, infeces, febres reumticas j que apresenta uma forte propriedade analgsica (Di
Stasis, 1987 apud Silva e Machado, 1999b). Muitas espcies de Plectranthus so cultivadas
como plantas ornamentais e como fontes de leos essenciais utilizados na culinria, pelo
seu sabor (Asceno et al., 1999). Existem registros do uso da secreo dos colteres de
Bathysa como cicatrizante (Sr. Walter Silva, comunicao pessoal). A utilizao em
medicina popular dos exsudatos vegetais sugere o potencial teraputico destas secrees.
26
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Caracterizar a anatomia e a ultraestrutura dos colteres de Bathysa nicholsonii K.
Schum., bem como analisar o perfil protico da secreo e sua ao antifngica.
2.2 Objetivos especficos
Descrever a anatomia e ultraestrutura de colteres de B. nicholsonii;
Caracterizar morfolgica e temporalmente as clulas da epiderme secretora dos
colteres de B. nicholsonii;
Caracterizar citoquimicamente as clulas da epiderme secretora de coleteres de B.
nicholsonii;
Investigar preliminarmente a presena de protenas na secreo dos colteres de B.
nicholsonii;
Examinar a atividade antifngica do extrato protico da secreo dos colteres de B.
nicholsonii;
27
3. MATERIAL E MTODOS
3.1 rea de coleta
O material foi coletado na Reserva Biolgica de Tingu, com licena concedida
pelo IBAMA (171/2003). Esta reserva localiza-se na poro central da cadeia da Serra do
Mar, no trecho compreendido pelas serras do Tingu, de So Pedro e do Macuco (2228 e
2239 S, 2235' e 4334 W), municpios de Nova Iguau e Duque de Caxias. Os desnveis
altimtricos da reserva variam entre 220 e 1.600 metros, destacando-se o macio do Tingu
como a maior elevao. O solo representado pelos tipos Cambissolos, Latossolos e
Podzlicos. A temperatura mdia anual de 21,6 C e pluviosidade mdia anual de 2.268
mm. A vegetao local reconhecida como Floresta Ombrfila Densa. A Reserva
Biolgica de Tingu foi criada pelo Decreto de Lei Federal nmero 30.97.780 de 1989;
sendo considerada Reserva de Biosfera pela Unesco em 1992. a maior reserva florestal
do Estado do Rio de Janeiro e, sofre srios problemas com caa predatria, despejo de lixo,
grileiros e extrativismo, representado principalmente pela presena de palmiteiros e
madeireiros (SOS Mata Atlntica, 2002).
3.2 Material botnico
pices caulinares de indivduos adultos, incluindo as estpulas e o meristema apical
caulinar, de Bathysa nicholsonii K. Schum. (Rubiaceae) foram coletados com o auxlio de
podo. Amostras testemunhas foram depositadas no Herbrio do Jardim Botnico do Rio de
Janeiro. As estpulas foram dissecadas dos pices caulinares com o emprego de bisturis e
pinas. Para microscopia, este material foi fixado quimicamente no local de coleta; e, para
extrao da secreo as estpulas foram levadas ao laboratrio, acondicionadas de maneira
a preservar as estruturas a temperatura ambiente, para os procedimentos. Na identificao
das estpulas, seguiu-se descrio proposta por Klein (2002); o par de estpulas mais
prximo ao meristema apical caulinar foi denominado estpulas do primeiro n e o par
seguinte, como do segundo n.
28
3.3 Microscopia
3.3.1 Microscopia ptica
Fragmentos da base da estpula, contendo colteres, foram fixados em soluo
aquosa contendo glutaraldedo 2,5 %, formaldedo 4,0 % diludos em tampo cacodilato de
sdio 0,05 M, pH ~ 7,2, sob temperatura ambiente, durante 2 horas. Aps serem lavados
por 45 minutos no mesmo tampo, os fragmentos foram ps-fixados em soluo aquosa
contendo tetrxido de smio 1,0 % diludo em tampo cacodilato de sdio 0,05 M, pH ~
7,2, temperatura ambiente, durante 1 hora na ausncia de luz. Aps trs lavagens de 45
minutos no mesmo tampo, os fragmentos foram submetidos srie cetnica ascendente
[50 %, 70 %, 90 %, 100 % (3X)], durante 1 hora em cada etapa, para desidratao. Ento,
os fragmentos foram infiltrados com resina epxi (Epon Polibed), utilizando-se serie
crescente de resina em propanona. A polimerizao da resina foi realizada a 60 C. Cortes
semifinos, aproximadamente 1 m de espessura, foram obtidos com navalhas de vidro em
ultramicrtomo (REICHERT ULTRACUT-S). A colorao foi realizada com soluo
aquosa de azul de toluidina 1,0 % acrescido de 0,1% de Brax. Lminas permanentes foram
montadas com Entellan. A documentao analgica foi realizada em microscpio ptico
Axioplan ZEISS (Oberkohen, Germany), utilizando-se filme fotogrfico Kodalit, 35 mm,
32 ASA (Kodak, USA); dados digitais foram obtidos no mesmo equipamento, utilizando-se
cmera digitalizadora Hamamatsu C3077 e software Analysis- LINK/ISIS/ZEISS
(Oxford, UK).
3.3.2 Histoqumica
Os testes histoqumicos da estpula foram realizados em cortes a mo livre de
material recm coletado. A documentao analgica e digital foi realizada conforme
descrito anteriormente.
Carboidratos (hidroxilas vicinais)
Cortes a mo livre de pices caulinares foram lavados em gua destilada e imersos
em soluo aquosa de cido peridico de Schiff 1,0%, durante 5 minutos a temperatura
ambiente. Aps lavagem em gua destilada, estes foram imersos em reagente de Schiff
29
durante 15 minutos, a temperatura ambiente, sendo ento, lavados em gua destilada,
durante 5 minutos a temperatura ambiente (Hotchkiss, 1948).
Protenas totais
Protenas totais foram evidenciadas em cortes expostos a soluo aquosa de Azul
Brilhante de Coomassie G 0,25 % contendo 5 % de cido actico, durante trinta minutos.
Este procedimento foi seguido de lavagem em soluo aquosa de cido actico 5 % por trs
vezes, durante 5 minutos em cada etapa. Lminas permanentes foram obtidas com glicerina
50%.
3.3.3 Microscopia Eletrnica de Transmisso
Para microscopia eletrnica de transmisso foram utilizados os mesmos
procedimentos que para microscopia ptica, exceto a ultramicrotomia e a contrastao.
Cortes ultrafinos, com aproximadamente 70 nm de espessura, foram obtidos, utilizando-se
navalha de diamante (Diatome) em ultramicrtomo (REICHERT ULTRACUT-S); os
cortes, foram coletados em grades de cobre de 300 mesh. A contrastao foi realizada em
soluo aquosa saturada de acetato de uranila, durante 40 minutos, seguida de lavagem em
gua destilada e de 5 minutos em citrato de chumbo 1% (Reynolds, 1963). A documentao
analgica foi realizada em microscpio eletrnico de transmisso (ZEISS EM 900),
operando a uma acelerao de voltagem de 80 kV, em chapas fotogrficas, 6 x 9, Kodak
4489.
3.3.4 Citoqumica
As caractersticas ultraestruturais evidenciadas pelos mtodos citoqumicos
empregados foram documentadas como descrito no tpico anterior, relativo a microscopia
eletrnica de transmisso.
Carboidratos (hidroxilas vicinais)
Para deteco de hidroxilas vicinais, predominantemente carboidratos, foi utilizado
o mtodo de Thiry (1967), utilizando-se tiosemicarbazida-proteinato de prata (PATAg).
Cortes ultrafinos, das amostras processadas para microscopia eletrnica de transmisso,
30
foram coletados em grades de ouro de 300 mesh e tratados com soluo aquosa de cido
peridico 1 %, durante 30 minutos. Aps lavagem em gua destilada, as grades foram
sobrepostas em gotas de soluo aquosa de tiosemicarbazida 1 % contendo cido actico a
10 %, durante 72 horas; segue-se uma srie decrescente de cido actico (10 %, 5 %, 2 %
em gua destilada). Ento, os cortes ultrafinos foram expostos soluo aquosa de
proteinato de prata 1 %, durante 30 minutos, seguindo-se lavagem em gua destilada. O
controle foi realizado pela excluso do tratamento com soluo aquosa de cido peridico.
Deteco de lipdios insaturados
Objetivando detectar lipdios insaturados foi utilizada a tcnica de tetrxido de
smio-imidazol (Angermller e Fahimi, 1982). Para tanto, fragmentos da base da estpula,
contendo colteres, foram fixados em uma soluo aquosa contendo glutaraldedo 2,5 %,
formaldedo 4,0 % diludos em tampo cacodilato de sdio 0,05 M, pH ~ 7,2, em
temperatura ambiente, durante 24 horas. Posteriormente, imersos em tampo imidazol 0,05
M, pH 7,2, temperatura ambiente, durante 24 horas, sendo, ento, ps-fixados em soluo
aquosa de tetrxido de smio 1,0 % e tampo imidazol 0,05 M, por 72 horas, na ausncia
do espectro visvel da radiao eletromagntica. Em seguida, as amostras foram lavadas no
mesmo tampo e, posteriormente, em tampo cacodilato de sdio 0,05 M As etapas
subseqentes foram as mesmas utilizadas para anlise por microscopia eletrnica de
transmisso. No material controle, o tampo imidazol 0,05 M foi substitudo por tampo
cacodilato de sdio 0,05M.
Deteco de molculas orgnicas insaturadas
Fragmentos, aps a fixao descrita anteriormente, foram tratados com soluo
aquosa contendo tetrxido de smio 1,0 % e iodeto de potssio 1,0 % diludos em gua
destilada, durante 48 horas na ausncia do espectro visvel da radiao eletromagntica, a
temperatura ambiente. Em seguida, as amostras foram lavadas, por duas vezes, em soluo
aquosa de iodeto de potssio 1,0% diludo em gua destilada, durante 1 hora na ausncia do
espectro visvel da radiao eletromagntica, a temperatura ambiente (Locke e Huie, 1983).
Seguiram-se, ento, os procedimentos para microscopia eletrnica de transmisso, descrita
anteriormente. O controle foi realizado pela excluso do iodeto de potssio.
31
3.3.5 Microscopia Eletrnica de Varredura
Foram utilizados para a microscopia eletrnica de varredura os procedimentos para
microscopia eletrnica de transmisso como descrito anteriormente. Aps a desidratao, as
amostras foram secas pelo mtodo do ponto crtico de CO2 utilizando o aparelho CPD-030
BAL-TEC (Liechtenstein). Fragmentos secos de estpula e pices contendo colteres foram
aderidos com fita adesiva de carbono dupla-face (3M) e cola de carbono em suportes
adequados. As amostras foram cobertas por sputtering com uma camada de
aproximadamente 20 nm de ouro, utilizando-se aparelho SCD-050 BAL-TEC
(Liechtenstein). A observao e documentao digital (512X480 TIFF) foram realizadas
em microscpio eletrnico de varredura (DSM 962 ZEISS), a uma acelerao de
voltagem de 15 kV ou 25 kV.
3.3.6 Microanlise de Raio-X (Energia Dispersiva de Raios-X)
A anlise qualitativa dos elementos qumicos constituintes presentes na secreo
dos colteres e das estpulas foi realizada pela deteco da energia dispersiva de Raios-X
em microscopia eletrnica de varredura. Estpulas, de pices caulinares recm coletados,
foram congeladas em nitrognio lquido, por aproximadamente um minuto e, em seguida,
liofilizadas. Pequenos fragmentos de estpula foram aderidos em suportes em fita adesiva
de carbono dupla-face e com adesivo lquido a base de carbono e cobertos com carbono em
aparelho XCD-010 BAL-TEC (Liechtenstien).
A anlise qualitativa e o mapa de distribuio dos elementos foram realizados em
microscpio eletrnico de varredura DSM 962 ZEISS (Oberkohen, Germany), acoplado a
detector de raios-x de silcio/ltio OXFORD Microanalysis Group (Oxford, UK) com
resoluo nominal de 138 eV, operando nas condies apresentadas abaixo (Quadro 1). Os
resultados foram analisados em software LINK-ISIS, OXFORD Microanalysis Group
(Oxford, UK).
32
Quadro 1
Microscpio Eletrnico de Varredura DSM 962 ZEISS
EDX - condies de operao
Parmetro Configurao
Acelerao de voltagem 30 KeV (SE)
Distncia de trabalho 12-16 mm
Detector de Si/Li 1024 canais 0 - 15 KeV
Tempo de captao da microanlise 300 seg
Janela do detector UTW
Calibrao EDX 99.9 Cu
MEV Imagens SE e BSE
3.4 Deteco de protenas totais na secreo (SDS-PAGE)
A secreo foi analisada com relao ao perfil protico utilizando o mtodo de
eletroforese em gel de poliacrilamida na presena de SDS (SDS-PAGE) em sistema de gel
descontnuo como descrito por Laemmli (1970). Para tanto, aproximadamente 70 pices
caulinares, que se encontravam visualmente mais cobertos pela secreo, tiveram as
estpulas dissecadas. A parte interna das estpulas foi lavada em soluo contendo tampo
Tris-HCl 0,1 M e Triton X-100 0,1 %, pH 8,0, para extrair a secreo. As amostras
resultantes foram filtradas em papel de filtro e submetidas precipitao de protenas com
soluo aquosa de sulfato de amnio 90 %. Aps 16 horas do tratamento de precipitao, as
amostras foram centrifugadas a 10.000 g, por 30 minutos sendo o sobrenadante descartado
e o precipitado diludo em gua destilada. A suspenso foi ento dialisada com membrana
de dilise Merck, a 4 oC por 48 horas e, posteriormente liofilizado.
Para eletroforese, as protenas liofilizadas, extradas de 1 mL de secreo foram
ressuspendidas em 100 L de tampo de amostra (Tris-HCl 0,1 M em pH 8,0 contendo
SDS 2 %, sacarose 10% e azul de bromofenol 0,025 %) com e sem a presena de 5 % de -
mercaptoetanol. As amostras foram aquecidas por 5 min a 100 C e centrifugadas a 16 000
rpm por 3 min. Aps este procedimento, 25 L das amostras foram aplicadas no gel 15 %
33
de concentrao. A corrida do gel se processou a uma corrente constante de 100 V por 2
horas.
A colorao foi realizada por imerso em soluo corante de Azul brilhante de
Coomassie R 0,05 %, durante 1 hora. Aps este perodo, o corante foi retirado e o gel
mantido em uma soluo descorante de cido actico glacial 10 %, metanol 20 % em gua
destilada, at visualizao das bandas proticas.
3.5 Deteco de glicoprotenas
Para a deteco de glicoprotenas, os procedimentos foram realizados de
acordo com as recomendaes do fabricante do kit de deteco de glicoprotenas, SIGMA
ALDRICH. Os gis obtidos foram fixados em metanol 100 %, durante 30 minutos,
seguindo-se de lavagem em gua mili-Q, durante de 20 minutos, por duas repeties. Em
seguida, o gel foi exposto soluo de oxidao (acido peridico), durante 30 minutos.
Aps lavagem em gua mili-Q, durante de 20 minutos, por duas vezes, a colorao do gel
foi realizada com soluo corante por 2 horas, na ausncia do espectro visvel da radiao
eletromagntica. Subseqentemente, os gis foram expostos uma soluo aquosa de
reduo (metabisulfito de sdio) e estocados em soluo aquosa de acido actico 5 % por
12 horas. A documentao fotogrfica foi realizada com cmera digital SONY P-63, com
3,2 megapixels/polegada2.
3.6 Deteco de atividade antifngica no extrato total da secreo
Para o ensaio de atividade antifngica do extrato total da secreo, amostras de
fungos filamentosos fitopatognicos foram retirados de culturas mantidas no Laboratrio de
Fisiologia e Bioqumica de Microrganismos. Foram inicialmente colocados para crescer em
placas de Petri contendo o meio gar Saboraud durante 10 dias a temperatura ambiente.
Aps esse perodo de crescimento, 10 mL de soluo salina estril de 0,15 M foi vertida
sobre as placas e para a liberao de esporos foi utilizada uma ala de Drigalski. Os esporos
extrados foram recuperados e quantificados em cmara de Neubauer.
Para o ensaio de atividade antifngica do extrato total da secreo amostras dos
fungos C. musae, C. lindemutianum e F. oxysporum, mantidos no Laboratrio de Fisiologia
e Bioqumica de Microrganismos, foram inoculados em meio slido gar Sabouraud em
34
placas de Petri, durante dez dias, a temperatura ambiente. Aps este perodo, 10 mL de
soluo salina estril de 0,15 M foi vertida no recipiente e para a liberao de esporos foi
utilizada uma ala de Drigalski. Os esporos extrados foram recuperados com uma pipeta e
quantificados em cmara de Neubauer. A germinao foi determinada atravs da
inoculao de esporos em meio lquido, 1x104 esporos/200 L de meio de cultura
Saboraud, contendo 250 g/mL de protenas do extrato total da secreo. O ensaio foi
realizado em placas de cultura de clulas de 96 poos, a temperatura de 28 C, por um
perodo de 60 h. O crescimento micelial foi determinado por densidade ptica com leitura
de 6 em 6 h em um leitor de ELISA a 600 nm. Todo o ensaio foi feito sob condies
estreis em capela de fluxo laminar e em triplicatas (Broekaert et al., 1990).
35
4. RESULTADOS
Os exemplares coletados de Bathysa nicholsonii na Reserva Biolgica de Tingu
mostraram poucos sinais de herbivoria nas estpulas no pice caulinar (fig. 1A). Nas
estpulas, que medem aproximadamente 5 cm (fig. 1C e 1D) a herbivoria foi menor que nas
folhas. Quando as estpulas so destacadas do pice caulinar possvel identificar,
macroscopicamente, os colteres (fig. 1E e 1F). Estas numerosas estruturas ocorrem
distribudas na forma de dois tringulos na base da face adaxial (fig. 1E), contornando o
primrdio foliar do n subseqente. Ao destacar as estpulas, observou-se que a secreo
produzida pelos colteres, freqentemente, se apresentava translcida ou raramente
amarelada e cobria as estruturas do pice caulinar. Aps exposio ao ambiente, esta
secreo torna-se vtrea e frivel. A secreo encontrada no pice caulinar dificultou a
separao das estpulas devido a sua viscosidade. Sob estereomicroscpio, colteres
caracterizavam-se por formato cilndrico, superfcie lisa e colorao uniformemente
amarela brilhante (fig. 1F). Alguns colteres apresentavam pice com colorao
amarronzada, sugerindo a sua senescncia.
A microscopia eletrnica de varredura confirmou que os colteres de B. nicholsonii
so estruturas cilndricas de base estreita, s vezes de pice afinalado, sendo este um sinal
de senescncia (fig. 2A) na base das estpulas. Freqentemente, a secreo cobria parte dos
colteres (fig. 2B), sendo este um indicativo de sua abundncia. Em vista frontal, as clulas
epidrmicas apresentavam perfil retangular e superfcie lisa (fig. 2 A e 2B). Em cortes
longitudinais (fig. 2C) e transversais (fig. 2D) foi identificado uma epiderme unisseriada
dispostas em paliada, e o eixo central parenquimtico. Na regio de ocorrncia dos
colteres na estpula, foram identificados tricomas prximos a estas estruturas (dado no
mostrado).
Em microscopia ptica, cortes transversais e longitudinais revelaram que colteres
de B. nicholsonii apresentavam eixo central vascularizado, formado por parnquima
fundamental circundado por um estrato epidrmico em paliada (fig. 3A-B, D-F). Estas
estruturas inserem-se na estpula por uma regio basal de menor dimetro, apresentando
constrico na base. Nesta foram observadas 2 ou 3 clulas epidrmicas isodiamtricas,
seguidas de clulas de aspecto cilndrico, cujo maior eixo aumenta gradativamente (fig.
3A). Em cortes longitudinais, evidenciou-se o formato cilndrico das clulas
36
parenquimticas, dispostas, tendo como referencial seu maior eixo, perpendicularmente
epiderme (fig. 3A e 3C). Neste eixo central, os feixes vasculares apresentavam-se discretos,
em forma de traos vasculares. Em cortes transversais, eram observados o eixo central
parenquimtico e a epiderme. Estruturas grandes e osmioflicas eram evidentes no
citoplasma das clulas epidrmicas (fig. 3B e 3D). Em maiores aumentos, era clara a
distino entre estas estruturas e o ncleo celular, sendo tambm evidente a densidade
citoplasmtica (fig. 3C). Cortes a mo livre de material fresco no revelaram diferenas na
organizao tecidual dos colteres (fig. 3E e 3F) quando comparados com material
processado para microscopia (fig. 3A-3D). O mtodo histoqumico de Schiff revelou a
presena de acares, predominantemente no pice das clulas epidrmicas e na secreo
(fig. 3G e 3H); enquanto que a colorao com Azul Brilhante de Coomassie revelou
protenas com localizao similar a dos polissacardeos revelados pelo mtodo de Schiff
(fig. 3I).
Em microscopia eletrnica de transmisso foi possvel flagrar diferentes momentos
da epiderme secretora dos colteres. No momento secretor, as clulas epidrmicas
encontravam-se trgidas e com aparato ultraestrutural tpico de clulas altamente
envolvidas em processos de sntese (fig. 2 a 5); e, um segundo momento senescente, em
que eram evidentes o desmantelamento do aparato celular e progressiva plasmlise (fig. 6 e
7).
No primeiro momento, o citoplasma apresentou abundncia de organelas,
caracterstica tpica de clulas altamente funcionais, sendo evidente a distino entre ncleo
celular e incluses osmioflicas (fig. 4A). Tais incluses so freqentes no citoplasma e as
imagens fortemente sugerem que se formam a partir de acrscimo de incluses menores
(fig. 4B). Elementos do retculo endoplasmtico liso foram comumente observados
lateralmente s incluses (fig. 4B e 4C). O teste citoqumico de tetrxido de
smio/imidazol confirmou a natureza lipdica desta estrutura (fig. 4C). O ncleo apresentou
distino clara entre eucromatina e heterocromatina, seu envelope nuclear aparece
preservado (fig. 4D). Dispersos no citoplasma foram observados elementos do retculo
endoplasmtico rugoso dispostos concentricamente (fig. 4E) e paralelamente (fig. 4F).
Retculo endoplasmtico liso e rugoso e complexos de Golgi eram abundantes no
citoplasma (fig 4F 4H); enquanto que, as mitocndrias, apresentando um grande nmero
37
de cristas na membrana interna, e pequenos vacolos, com contedo eletronluscente, foram
menos freqentes (fig. 4F). Complexos de Golgi apresentando profcuo trans-Golgi-
network (fig. 4G) e ribossomos livres (fig. 4H) tambm foram abundantes. No foram
observados espaos entre a parede celular e a membrana plasmtica.
Vesculas osmioflicas foram identificadas emergindo de complexos de Golgi desde
a regio cis at a regio de trans-Golgi-network, em amostras processadas por mtodos de
rotina para microscopia eletrnica de transmisso (Fig. 5A). A proximidade de elementos
do retculo endoplasmtico rugoso (fig. 5B 5D) e de extremidades dilatadas destas
estruturas com a membrana celular foi identificada (fig. 5B). No entanto, figuras de fuso
de membrana do retculo endoplasmtico rugoso com a membrana celular no foram
observadas. Fuses de membrana de grandes vesculas com a membrana plasmtica, e
conseqente extravasamento de seu contedo para o apoplasto, foram identificados (fig.
5F). Plastdios (fig. 5E) e retculo endoplasmtico liso (fig. 5F) foram abundantes. Um
marco da transio do momento de sntese para o de senescncia o surgimento de um
espao entre a membrana celular e a parede celular (fig. 5E e 5F).
No momento senescente era evidente a gradativa desestruturao citoplasmtica
paralelamente plasmlise. A principal evidncia da desestruturao citoplasmtica era a
degradao do sistema de membranas das organelas. No incio deste processo,
determinadas organelas, como complexo de Golgi e retculo endoplasmtico (fig. 6A),
podiam ser identificadas apresentando membranas fragmentadas. Incluses lipdicas de
diferentes dimetros eram freqentes (fig. 6A). O ncleo celular era identificvel, porm
apresentando-se parcialmente degradado, com discreta diferenciao entre eucromatina e
heterocromatina; o envelope nuclear apresentava-se estruturalmente alterado (fig. 6B). Em
outros casos, era perceptvel a diferenciao entre eucromatina e heterocromatina (fig. 6C).
Ncleos celulares condensados no foram identificados. As membranas dos plastdios
tambm se encontravam desorganizadas (fig. 6B). A degradao citoplasmtica avanou
paralelamente plasmlise (fig. 6C e 6D). Em reas destas clulas, no foram observadas
membranas estruturadas, exceto as do envelope nuclear (fig. 6C). Endomembranas com
morfologia atpica foram identificadas (fig. 6E), as quais se assemelhavam a elementos do
retculo endoplasmtico. Mitocndrias puderam ser identificadas, porm apresentando
diferentes nveis de desorganizao de suas membranas (fig. 6F e 6G) e matriz condensada
38
(fig. 6G). Finalmente, o citoplasma se apresentava praticamente degradado, com grandes
vacolos, e no justaposto membrana (fig. 7A e 7B). Ausncia de limites celulares,
ruptura dos grandes vacolos (fig. 7A e 7B), debris eletrondensos (fig. 7C) e estruturas que
morfologicamente podiam ser inferidas como mitocndrias (fig. 7C), e retculo
endoplasmtico rugoso (fig. 7D) evidenciam o trmino da degradao celular.
De forma assincrnica em relao aos fenmenos citoplasmticos, foi possvel
identificar diferentes fases de diferenciao da parede periclinal externa das clulas das
epidermes secretoras. Assim, a parede periclinal externa de B. nicholsonii apresentou trs
camadas morfologicamente distintas. Uma camada basal rica em polissacardeos, uma
membrana cuticular, rica em lipdios, subdividida em arborescente e reticulada, e uma fina
camada de cutcula propriamente dita (fig. 8A), sendo inicialmente, estruturalmente similar
parede celular da estpula (fig. 8B).
Stios de acmulo de secreo, presentes exclusivamente na camada basal e
caracterizados por serem regies da parede celular pobres em material fibrilar, foram
identificados durante o processo de diferenciao da parede periclinal externa (fig. 8C).
Estes stios apresentaram-se fortemente marcados pelo mtodo do iodeto de potssio (fig.
8D) e pelo mtodo do tetrxido de smio/imidazol; enquanto que, a marcao pelo mtodo
de Thiry foi fraca ou inexistente (fig. 8F). Em relao parede periclinal externa,
polissacardeos, revelados pelo mtodo de Thiry, apresentaram forte marcao na camada
basal, nas regies arborescentes da membrana cutcula e fraca ou ausncia de marcao nas
outras regies (fig. 8F). A cutcula propriamente dita no apresentou marcao por este
mtodo. O mtodo do tetrxido de smio/imidazol revelou intensa marcao na membrana
cuticular e nos stios de acmulo de secreo (fig. 8E); a camada basal e a cutcula
propriamente dita foram fracamente marcadas. A marcao pelo mtodo de iodeto de
potssio revelou-se heterognea na membrana cuticular, sendo intensa nas regies prximas
camada basal (fig. 8D), em contraste com a fraca marcao observada na camada basal e
na cutcula propriamente dita.
Os stios de acmulo de secreo aumentam gradativa e relativamente de tamanho
em relao camada basal, sendo que, em determinadas regies atingem a membrana
cuticular (fig. 9A e 9B). Os mtodos citoqumicos apresentaram resultados similares aos
descritos anteriormente; ressaltando-se a intensa marcao da membrana cuticular prxima
39
camada basal pelo mtodo do iodeto de potssio (fig. 9C), a continuidade de marcao
pelo do tetrxido de smio/imidazol na membrana cuticular (fig. 9D), e a marcao dos
stios de acmulo de secreo por estes dois mtodos.
A partir de determinado momento, os stios de acmulo de secreo no eram mais
individualmente identificveis; e, as imagens fortemente sugerem a disperso do material
acumulado pela parede periclinal externa (fig. 9E). Cortes transversais aparentemente
revelaram um aumento relativo da membrana cuticular em comparao com a camada
basal, a qual se projetam regies pontuais da membrana cuticular (fig. 9E 9G). Os
mtodos citoqumicos revelaram o mesmo padro de marcao, anteriormente descrito,
diferindo no aumento de intensidade de marcao.
Subseqentemente, evidenciou-se desestruturao da parede periclinal externa (fig.
10A - 10D). A camada basal apresentou-se menos condensada que anteriormente (fig. 10A)
e os stios de acmulo de secreo no foram identificveis (fig. 10A e 10B). As projees
da camada polissacardica, nos estratos cuticulares, tornam-se menos evidentes (fig. 10A).
A marcao com iodeto de potssio revelou-se heterognea na membrana cuticular (fig.
10B); enquanto que, o emprego de tetrxido de smio/imidazol foi homognea nesta
regio. Finalmente, evidenciou-se a desestruturao da camada arborescente da membrana
cuticular (fig. 10C), que praticamente desapareceu ao termino da diferenciao (fig. 10D).
A diferenciao da parede periclinal externa das clulas da epiderme secretora dos colteres
foi observada.
A anlise qualitativa dos elementos qumicos, realizados por energia dispersiva de
eltrons em microscopia eletrnica de varredura (MEV/EDX), revelou predominncia de
potssio na parede periclinal externa dos colteres (fig. 11A) e das estpulas (fig. 11B);
enquanto que, na secreo, a predominncia foi de clcio (fig. 11C).
A presena de protenas na secreo dos colteres, com massas moleculares
variando entre 66 e 24 kDa, foi revelada por eletroforese (SDS-PAGE), havendo duas
protenas majoritrias, com massas moleculares de aproximadamente 26 e 36 kDa (fig. 12
raia A). No foram notadas diferenas nas amostras quando submetidas ao tratamento com
-mercaptoetanol; exceto, uma nica banda protica de aproximadamente 29 kDa (fig. 12
raia B). O tratamento do gel para deteco de glicoprotenas tambm revelou um padro
40
similar ao anteriormente descrito (fig. 12 raia C); inclusive, quando tratado com -
mercaptoetanol (fig. 12 raia D).
As curvas de crescimento de Fusarium oxysporum, Colletotrichum musae em meio
slido Sabouraud revelaram uma discreta inibio de crescimento destes patgenos quando
tratados com 200 mg.mL-1 do estrato total da secreo. Esta inibio pode ser detectada no
intervalo entre 50 e 60 horas de cultivo (Figura 13 A e 13 B). Em relao a C.
lindemuthianum, o mesmo procedimento revelou uma significativa inibio de crescimento
aps 26 horas de incubao, culminando com cerca de 60 % de inibio do crescimento
aps 62 horas de tratamento (Figura 13 C).
41
Figura 1: Folhas, pices caulinares e base da estpula de Bathysa nicholsonii. A Folhas e pice caulinar; B Detalhe do pice caulinar mostrando a estpula (seta); C e D pices caulinares com sinais de herbivoria. E Base da face adaxial da estpula vista ao microscpio estereoscpico. Note a distribuio dos colteres em dois tringulos, na base das estpulas; F Detalhe dos colteres vistos em microscpio estereoscpico. Barras: E - 0,6 cm; F - 0,5 mm.
42
Figura 2: Microscopia eletrnica de varredura dos colteres de Bathysa nicholsonii. A Viso da base da estpula mostrando colteres cilindriforme embebido, em parte, na secreo; B Detalhe dos colteres embebidos na secreo; C Corte longitudinal de um colter evidenciando a superfcie, a epiderme em paliada e o eixo central parenquimtico. D Corte transversal do colter. Note epiderme e eixo central parenquimtico. Colteres (asterisco); Secreo (tringulo); Superfcie (S); Epiderme em paliada (EP); Trao vascular (TV); Eixo central vascularizado (quadrado). Barras: A - 250 m; B - 200 m; C e D - 20 m.
43
Figura 3: Microscopia ptica dos colteres de Bathysa nicholsonii. A-D Colorao com azul de toluidina. A Corte longitudinal do colter evidenciando a constrico na base (seta), eixo central e epiderme em paliada; B e D Cortes transversais dos colteres mostrando estruturas lipdicas fortemente marcadas (circuladas) nas clulas da epiderme; C Detalhe da epiderme mostrando estruturas fortemente marcadas (circuladas) em contraposio ao ncleo (cabea de seta); E-I Cortes mo livre dos colteres submetidos a testes citoqumicos; E e F Controle; G e H Amostras submetidas ao reagente de Shiff; I Amostra submetida ao teste com Azul Brilhantes de Comassie. Note, em ambos os casos, marcao na secreo, predominantemente. Epiderme em paliada (EP); eixo central parenquimtico (quadrado). Barras: A e E - 100 m; C - 20 m; B, D, F , G e H - 50 m;
44
Figura 4: Microscopia eletrnica de transmisso das clulas secretoras dos colteres de Bathysa nicholsonii. A Viso geral do citoplasma evidenciando o ncleo e as estruturas lipdicas; B Detalhe da formao das estruturas lipdicas com contrastao de rotina; C Detalhe das estruturas lipidicas marcadas com a tcnica smio-Imidazol; D Ncleo mostrando individualizao entre eucromatina e heterocromatina; E Citoplasma mostrando retculo endoplasmtico digitiforme; F e H Detalhe do citoplasma mostrando cisternas do reticulo endoplasmtico rugoso e complexo de Golgi; G Viso geral do citoplasma. Note a grande quantidade de retculo endoplasmtico e complexo de Golgi. Nu - ncleo; Lip - corpos lipidicos; Seta - corpos lipidicos; RER - retculo endoplasmtico rugoso; RED - retculo endoplasmtico digitiforme; CG - complexo de Golgi; V - vescula. Barras: A - 2,5 m; B, C e D - 0,6 m; E e F - 0,4 m; G - 0,12 m; e H - 0,25 m.
45
Figuras 5: Microscopia eletrnica de transmisso das clulas secretoras dos colteres de Bathysa nicholsonii. A Citoplasma das clulas epidrmicas mostrando vesculas elentrondensas do complexo de Golgi; B rea do citoplasma onde o RE se encontra muito prximo a membrana plasmtica; C e D Detalhe da eletromicrografia anterior. No foi observada conexo entre as duas membranas; E Viso do citoplasma no inicio do processo de contrao do citoplasma para a formao do espao intermembranar; F Detalhe fuso de uma vescula com a membrana plasmtica, descarregando seu contedo no espao intramembranar. CG Complexo de Golgi; RER Retculo endoplasmtico rugoso; PC Parede periclinal externa; V Vescula; P Plastdeo; EIM Espao intremembranar; REL Retculo endoplasmtico liso. Barras: A e B - 0,25 m; C - 0,9 m; D - 0,05 m; E - 0,4 m e F - 0,15 m.
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Figura 6: Microscopia eletrnica de transmisso das clulas secretoras dos colteres de Bathysa nicholsonii. A Viso geral do citoplasma no incio da formao do espao intramembranar. Note a desorganizao das membranas e a presena das estruturas lipidicas, um pequeno vacolo e retculo endoplasmtico; B Citoplasma mostrando o ncleo, sem individualizao de eucromatina e heterocromatina, e plastdeos; C e D Corte transversal das clulas secretoras evidenciando o espao intramembranar e raros vacolos; E Citoplasma desorganizado; F e G Mitocndrias em estgios de degradao. EIM Espao intremembranar; Lip Incluses lipidicas; Vac Vacolo; PC Parede celular; RE Retculo endoplasmtico; Nu Ncleo; P Plastdeo. Barras: A - 0,6 m; B e E - 0,4 m; C e D - 2,5 m; F - 0,25 m e G - 0,15 m.
47
Figura 7: Microscopia eletrnica de transmisso das clulas secretoras dos colteres de Bathysa nicholsonii. A e B Viso geral do citoplasma das clulas secretoras com o citoplasma degradado. Note o grande vacolo central, algumas vezes rompido; C Detalhe do citoplasma degradado, em uma regio onde impossvel diferenciar organelas; D Detalhe de uma regio onde possvel notar o retculo endoplasmtico rugoso com grandes espaos entre as cisternas. EXT Espao extracelular; PPE Parede Periclinal Externa; EIM Espao intremembranar; Seta Provvel stio de ruptura do vacolo; PC parede celular; Cit Citoplasma; VAC Vacolo; RER Retculo endoplasmtico rugoso; M Mitocndria. Barras: m.
48
Figura 8: Microscopia eletrnica de transmisso da parede periclinal externa das clulas secretoras dos colteres e da estpula de Bathysa nicholsonii. A Parede periclinal externa no primeiro estgio de desenvolvimento contrastada com acetato de uranila/citrato de chumbo (rotina); B Parede anticlinal das clulas secretoras; C a F Segundo estgio de desenvolvimento da parede periclinal externa. C Marcao de rotina. Note o inicio da formao dos stios de acmulo de secreo na camada polissacardica. D Marcao com KI. Note marcao heterognea das camadas lipidicas e fraca marcao na camada polissacardica. E Marcao com smio/imidazol. Note marcao homognea nos stios de acmulo de secreo e camadas lipidicas. F Marcao pelo mtodo de Thiry. Camada polissacaridica fortemente marcada, contudo os stios de acmulo de secreo no so marcados. Pol camada polissacardica da parede periclinal externa; Ext cut Extratos cuticulares, subdivididos em camada reticulada (Ret) e arborescente (Arb); Cut Cutcula propriamente dita; SAS Stio de acumulo de secreo. Barras: A e C 0,15 m; B e F 0,09 m; D e E 0,4 m.
49
Figura 9: Microscopia eletrnica de transmisso da parede periclinal externa das clulas secretoras dos colteres de Bathysa nicholsonii. A-D Terceiro estgio de diferenciao da parede periclinal externa; A e B Marcao de rotina. Note os stios de acumulo de secreo ocupando a maior parte da camada polissacardica, invadindo as camadas lipidicas; C Marcao com iodeto de potssio. Note marcao heterognea das camadas lipidicas e fraca marcao na camada polissacardica. Os stios de acmulo de secreo tambm so marcados; D Marcao com smio/imidazol; E-G Quarto estgio de diferenciao da parede periclinal externa; E - Marcao de rotina. Observe as projees das camadas polissacaridicas nas camadas lipidicas; F Marcao com KI; G Marcao com smio/imidazol. Os padres de marcao so os mesmos descritos anteriormente. Ext Espao extracelular; Cit Citoplasma; Pol camada polissacardica da parede periclinal externa; SAS Stio de acumulo de secreo; Seta Projees das camadas polissacaridicas nas camadas lipidicas. Barras: A 0,12 m; B 0,3 m; C-G 0,4 m.
50
Figura 10: Microscopia eletrnica de transmisso da parede periclinal externa das clulas secretoras dos colteres de Bathysa nicholsonii. A e B Quinto estgio de maturao da parede periclinal externa; A Marcao de rotina. Observe desorganizao dos estratos cuticulares, especialmente na suas camadas arborescentes; B Marcao com iodeto de potssio, revelando marcao heterognea nos extratos cuticulares; C e D Sexto estgio de maturao da parede periclinal externa, marcao de rotina. Desorganizao, seguida de provvel degradao, da camada arborescente dos estratos cuticulares Barras: A 0,25 m. B, C, D 0,4 m.
51
Figura 11: Microanlise de Raios-X (janela UTW) da parede periclinal externa dos colteres, das estpulas e da secreo. A Grfico do perfil de elementos qumicos da parede periclinal externa dos colteres. Note predominncia de potssio; B Grfico do perfil de elementos qumicos da parede periclinal externa das estpulas. Note predominncia de potssio; C Grfico do perfil de elementos qumicos da secreo dos colteres. Note predominncia de clcio. A Janela de berlio; B e C janela UTW.
52
Figura 12: Eletroforese das protenas da secreo de Bathysa nicholsonii. A Amostra da secreo sem o tratamento com -mercaptoetanol; B Amostra da secreo tratada com -mercaptoetanol; C e D Marcao de Glicoprotenas nas mesmas amostras. Setas indicam bandas de protenas majoritrias. MA- marcador de massa molecular de alto peso; albumina bovina (66KDa), ovalbumina (45KDa), anidrase carbnica (29KDa), tripsinognio (24KDa) e -lactoalbumina (14KDa)
53
Figura 13: Grfico do ensaio de inibio do crescimento de esporos de fungos fitopatognicos. A - Fusarium oxysporum; B - Colletotrichum musae; C - Colletotrichum lindemuthianum. A frao causou uma significativa inibio no fungo C. lindemuthianum, desde as primeiras horas de crescimento e nenhuma inibio significativa foi visualizada quando testamos essa frao sobre os fungos F. oxysporum e C. musae durante o decorrer da curva de crescimento na mesma concentrao de 200 mg.mL-1. () Controle; () Tratamento.
54
5. DISCUSSO
Colteres, presentes na base das estpulas, encontradas nos pices caulinares
vegetativos de Bathysa nicholsonii foram caracterizados estruturalmente. Este estudo
contribuiu para elucidar a anatomia, a ultraestrutura e os fenmenos temporais nas clulas
da epiderme secretora dos colteres de B. nicholsonii. Os mtodos microscpicos utilizados
permitiram investigar o mecanismo de secreo, focando na extruso desta atravs da
parede periclinal externa das clulas da epiderme secretora. Foram determinadas,
preliminarmente, as protenas presentes na secreo e avaliadas as atividades antifngicas
do extrato protico total.
As estpulas apresentam capacidade fotossinttica, mas sua principal funo a de
proteo das folhas jovens em desenvolvimento (Fahn, 1990). Os resultados obtidos neste
trabalho, para B. nicholsonii corroboram esta afirmativa generalista. O tamanho das
estpulas de B. nicholsonii variou pouco, sendo as suas medidas semelhantes s citadas por
Germano-Filho (1999). A morfologia e tamanho das estpulas ap