Questo umore…….immediatamente si solidifica non solo al di fuori del corpo,

ma addirittura all’interno dei suoi naturali contenitori: questa

solidificazione termina con la formazione di un “thrombus”, termine con il quale i Greci chiamano il sangue solidificato.

Galeno (130-200 dC)

Galeno, La bile nera. Corpus medicorum Graecorum Quae Extant V: 106, Leipzig Cnoblock, 1823

Cosa è l’emostasi?Serie di reazioni biochimiche e cellulari, sequenziali e sinergiche, che hanno lo

scopo di impedire la perdita di sangue dai vasi.

E’ un meccanismo di difesa, finalizzato al mantenimento dell’integrità dei vasi sanguigni e della fluidità del sangue

Alterazioni Alterazioni dell’emostasidell’emostasi

Aumento RiduzioneAumento Riduzione

Trombosi EmorragiaTrombosi Emorragia

Fasi del processo emostatico

1- Vascolare contrazione Riduzione lume muscolatura vasale vascolare2- Piastrinica - adesione - risposta biochimica Formazione - shape change tappo - degranulazione piastrinico - aggregazione

3- Coagulativa attivazione di Formazione proteasi plasmatiche coagulo fibrina

4- fibrinolitica attivazione sistema Dissoluzione fibrinolitico coagulo

RIPARAZIONE LESIONE VASCOLARE

RUOLO DELL’ENDOTELIO NEL PROCESSO EMOSTATICO

L’endotelio veniva considerato, in passato, come una semplice barriera passiva, la cui unica funzione consisteva nel trasferimento

di nutrienti e nel regolare gli scambi di ossigeno e anidride carbonica tra sangue e tessuti.

L’endotelio è, invece, un tessuto metabolicamente attivo, che, a seconda del suo stato funzionale, può favorire

o inibire l’emostasi. Costituisce una superficie che modula il tono vascolare

e regola il sistema emostatico, mantenendo il sangue in stato di fluidità.

Questa proprietà si basa su numerose attività presenti sull’endotelio o secrete in circolo in condizioni di normalità,

che nel loro insieme definiscono la cosiddetta

BILANCIA EMOSTATICA ENDOTELIALE

BILANCIA BILANCIA EMOSTATICAEMOSTATICA ENDOTELIALEENDOTELIALE

Attività antitrombotiche Attività protrombotiche

Attività anti-aggreganti piastriniche:PGI2, ecto-ADPasiOssido Nitrico (NO)

Attivitàanti-coagulanti:TrombomodulinaEparan solfato

Attivitàfibrinolitiche: tPA, uPA

Attivitàpro-adesive epro-aggregantipiastriniche: PAF, vWF

Attivitàpro-coagulanti: TF, legame di Fatt V, IXa, Xa

Attività anti-fibrinolitiche: PAI

vasodilatazio

ne

vasocostrizione

FASE VASCOLARE – VASOCOSTRIZIONE

Il primo evento del processo emostatico è la vasocostrizione a livello della zona lesa utile

a ridurre momentaneamente la perdita di sangue

Risposta diretta (miogena) delle cellulemuscolari lisce della tunica media

Riflesso neurovegetativo vasomotore nerva vasorum

Rilascio endotelina (endotelio)

Rilascio serotonina piastrinica

ENDOTELINA-1 (ET-1)

Polipeptide di 21 animoacidi prodotto costitutivamente, in basse concentrazioni,dalle cellule endoteliali (ma anche da cellule muscolari lisce).

SINTESI: precursore inattivo, pre-pro-entotelina

“big endotelina” (38 aminoacidi)

endotelina matura, biologicamente attiva

taglio proteasico

ECE (ET-converting-enzyme)

2 tipi di recettori: ETA ed ETB, a sette domini transmembranaassociati a proteine G, che promuovono effetti diversi secondo il tipo

di cellule su cui si trovano (cellule muscolari lisce e cellule endoteliali).

Vasocostrizione

Proliferazione cellulareProduzione di citochine e fattori di crescitaDeposizione di ECM

In condizioni fisiologiche vi è un equilibrio dinamico tra vasocostrizione e vasodilatazione. In tale equilibrio l’ET gioca un ruolo importante

mediante la sua azione sui recettori specifici: l’interazione con i recettori presenti

sulla membrana delle cellule muscolari lisce della parete vascolare determina

la contrazione di queste cellule e conseguentemente vasocostrizione che

controbilancia l’effetto di vasodilatazione dovuto all’azione di NO e PGI2 prodotte dalle cellule endoteliali

i recettori ETB sonodown-regolati sulle cellule endoteliali

Ridotta produzione di NO e prostaciclina

i recettori ETB sono up-regolatisulle cellule muscolari lisce dei vasi

Aumentata contrazione e proliferazione vasocostrizione

ENDOTELINA IN CONDIZIONI PATOLOGICHE“ENDOTELIO ATTIVATO”

MECCANISMO D’AZIONE DI ENDOTELINA-1

Liberazione di ET-1 dalle cellule endoteliali

Legame di ET-1 ai recettori presentisulla membrana delle cellule muscolari lisce

(recettori a sette domini transmenbranalegati a proteine G)

Aumento di calcio citosolico

Contrazione delle cellule muscolari

RUOLO DELLA VASOCOSTRIZIONENEL PROCESSO EMOSTATICO

permette di ridurre il deflusso di sangue attraverso il vaso danneggiato, riducendo in tal modo l’entità dell’emorragia

(fase vascolare dell’emostasi)

favorisce, in seguito al rallentamento del flusso nel vaso leso,i fenomeni di marginazione delle piastrine, con

conseguente loro attivazione (fase piastrinica dell’emostasi)

favorisce l’accumulo locale dei fattori della coagulazione attivati in seguito alla esposizione del tessuto sottoendoteliale o in seguito alla liberazione, da parte dei tessuti danneggiati,

di materiale tromboplastinico (fase della coagulazione).

ENDOTELIO E FASE PIASTRINICA DELL’EMOSTASI

DANNO ENDOTELIALE conesposizione del sottoendotelio

Esposizione delle proteineadesive della ECM

Adesione piastrinica

Attivazione piastrinica

Aggregazione

Oltre alla vasocostrizione, che favorisce il fenomeno della marginazione delle piastrine, vengono alterati i normali rapporti fra parete vascolare e piastrine e

la parete vascolare, compreso l’endotelio, assume attività adesive ed aggreganti.La normale funzionalità dell’endotelio può risultare alterata in seguito a:

ATTIVAZIONE DELLE EC (DANNO BIOCHIMICO)

“perturbazione o disfunzione endoteliale”

produzione di fattori implicati in adesione (vWF, selectina P rotolamento) e

aggregazione piastrinica (PAF)

presenza di trombina (attività aggregante) sulle EC attivate in seguito ad esposizione di

fosfatidilserina che lega la trombina.

esposizione del TF sulla membrana cellulare via estrinseca della coagulazione formazione

di uno strato di fibrina, su cui aderiscono le piastrine attivate mediante GP IIb/IIIa

BFU-Mega CD34+ pro-megacarioblasto(Burst Forming Unit) (prima cellula riconoscibile)

megacarioblasto

megacariocita basofilo

megacariocita granuloso

emissione di prolungamenti che si allungano progressivamente da cui si distaccano le piastrine megacariocita ridotto a solo nucleo che viene fagocitato dai macrofagi midollari

PIASTRINE MATURE

Piastrine Reticolate Piastrine giovani nel sangue periferico con elevato contenuto in RNA.Sintesi di diverse proteine, quali: Glicoproteine Ib, IIb (CD41) /IIIa (CD61)

PIASTRINOPOIESI

Replicazione del DNA senza divisionedel citoplasma nucleo grosso, poliploide, da 4 a 64 N.Aumento della dimensione delle cellule da 20 a 100 diametro

Citoplasma basofilo, finemente granulosoGranuli che tendono a aumentare

Nucleo lobulato, numero di lobuli correlatoal grado di poliploidia. Cromatina addensatacitoplasma acidofilo con numerosegranulazioni basofile

Ogni megacriocita durante la suaVita genera circa 4000 piastrine

trombopoietina

FASE PIASTRINICA

LE PROTEINE DELLA SUPERFICIE PIASTRINICA CON FUNZIONE ADESIVA

FUNZIONE classif. elettroforetica classif. Integrinica

_________________________________________________

Rec. Collageno GpIa/IIa 2/1

Rec. Fibronectina GpIc/Iia 5/1

Rec. Vitronectina v/3

Rec. Fibrinogeno GpIIb/IIIa IIb/3

Rec. Laminina GpIc/IIa 6/1

Rec. vWF GpIb/IX/V non integrina

Rec. Collagenoo trombospondina GpIV non integrina

CONTENUTO DEI GRANULI PIASTRINICI

LISOSOMI enzimi lisosomiali

CORPI DENSI (granuli delta) agonisti della aggregazione:

ADP, ATP, Ca, Serotonina

GRANULI ALFA:

PROTEINE “SPECIFICHE” PIASTRINICHE: Fattore piastrinico 4 (PF4), β-tromboglobulina

PROTEINE ADESIVE: Fibrinogeno, fibronectina, fattore di von Willebrand, trombospondina, vitronectina

MODULATORI DI CRESCITA: PDGF, TGF-beta, trombospondina

FATTORI DELLA COAGULAZIONE: Fattore V, HMWK, C1-inibitore, Fibrinogeno, fattore XI, proteina S, PAI-1

ADESIONE PIASTRINICA

• L’endotelio integro e la superficie piastrinica si respingono in virtù delle loro cariche negative• La perdita dell’endotelio espone il collageno sottoendoteliale, che lega la GpIa. La GpIb si lega al vWF, a sua volta adeso al collageno

PiastrinaGpIa GpIb

= collageno

Piastrina

= fattore di Von Willebrand (multimero)

endotelio

Membrana basalelesione

ATTIVAZIONE PIASTRINICA

cambiamento di forma

degranulazione

In seguito all’adesione le piastrine attivano meccanismi di trasduzione che determinano il cambiamento di forma e la reazione didegranulazione

Esposizione di FP3

Centralizzazionedei granuli

GpIIb-IIIa GpIIb-IIIa

FibrinogenoL’aggregazione piastrinica siverifica perché il fibrinogenosi pone a ponte tra il GpIIb-IIIa di una piastrina e quello di altre piastrine. Il fibrinogeno è quindi il“collante” dell’aggregazione.Il cross-linking della trombospondina stabilizza illegame

AGGREGAZIONE PIASTRINICA

L’aggregazione piastrinica è un fenomeno bifasico e si può distinguere in primaria e secondaria.

L’aggregazione primaria (prima onda di aggregazione),

è un’aggregazione reversibile, indotta da piccole quantità di agonisti che interagiscono con i loro recettori sulla

membrana piastrinica (ADP, collageno, trombina, PAF, ecc.)TAPPO EMOSTATICO PRIMARIO O TEMPORANEO

L’aggregazione secondaria (seconda onda di aggregazione) è dovuta invece sia all’interazione di grosse quantità di agonisti

con i loro recettori, sia al rilascio di grosse quantità di ADP e quindi di TXA2 da parte delle piastrine attivate da piccole

quantità di agonisti. TAPPO EMOSTATICO SECONDARIO O TAPPO PIASTRINICO

AGGREGAZIONE PIASTRINICA

AGGREGAZIONE DA ADP E COLLAGENO STUDIATE CON L’AGGREGOMETRO

Periodo di latenza seguito da aggregazioneirreversibile le piastrine aderisconoal collagene, vengono attivate e rilascianoADP, che è il vero responsabile dell’aggregazione

AGONISTI E ANTAGONISTIDELLA AGGREGAZIONE PIASTRINICA

AGONISTI ANTAGONISTI

Collageno ++++ ProstaciclinaTrombossano A2 ++++ Ossido NitricoPAF * +++ Prostaglandina D2ADP ++ AdenosinaTrombina ++ Adrenalina (rec.beta)Adrenalina(rec. Alfa) ++Complessi immuni ++Vasopressina ++Serotonina ++Prostaglandina H2 +++__________________________________________________* PAF = Platelet Activating Factor

MECCANISMI DI TRASDUZIONE NELLA ATTIVAZIONE PIASTRINICA

Gli agonisti della aggregazione piastrinica possono essere classificati inbase alla capacità di indurre aggregazione da soli oppure in combinazione

fra loro agonisti deboli e agonisti forti

Esistono differenti meccanismi di trasduzione dello stimolo chedipendono dal tipo di agonista e dal recettore con cui questo interagisce

Gli agonisti possono interagire con 2 categorie di recettori:

-Recettori a sette domini transmembranaassociati a proteine G

-Recettori associati a proteinchinasi

1-RECETTORI ASSOCIATI A PROTEINE G

G-protein

Membrana piastrinaPLC

PIP2

IP3

DAG PKC

Ca++

Granulo deltaADP

Plekstrina Plekstrina-P

ADP

ADP

ADP

AttivazioneMLCK

Miosina-P

degranulazione

Schema 2

GpIIb/IIIa

AGONISTA

2- RECETTORI ASSOCIATI A PROTEINE G

L’ ADP interagisce per autocrinia e paracrinia su recettori specifici

ADP

PLA2

PL-AA

AA

TXA2

>[Ca++]

IP3(vedi schema 1)

PLC

Replica “potenziata” delle trasduzioni delloschema 1

GpIIbGpIIIa

GpIIb-IIIa

PKCGP

ADP

PLC

Schema 1

Esiste un’altra classe di recettori agonisti dell’aggregazione,associati a proteine di trasduzione Gi in grado di inibire

la attivazione della adenilato-ciclasi. Il blocco della formazione di cAMP favorisce la aggregazione piastrinica.

Questo meccanismo pro-aggregante è comunque meno ricorrente rispetto a quello correlato all’attivazione delle fosfolipasi C e A2

Le sostanze che si oppongono o inibiscono l’aggregazione piastrinica sidefiniscono ANTAGONISTI della aggregazione piastrinica. Tutti gli

antagonisti possiedono recettori piastrinici associati a proteine G confunzione stimolatrice (Gs) sulla attività della adenilato/guanilato ciclasidi membrana: l’ aumento di nucleotide ciclico inibisce l’aggregazione

Gs

Adenilato/guanilato-ciclasi

ATPGPT

cAMPcGMP

Recettore antagonista

Inibizione

cAMP: blocca il legame

degli agonisti ai loro recettori, inibisce

la fosfolipasi C,inibisce

la proteino-chinasi C ed

antagonizza le risposte

mediate dal calcio

IIb

y

y

PLC

Gq

Ca 2+Ca 2+

ADP

P2X1

ADP

P2Y1

ADP

P2Y12

Gi2AC

ATPcAMPMLC-kinase

MLC-P

SHAPE CHANGE

TRANSIENTAGGREGATION

SUSTAINEDAGGREGATION

-

ADPCOOPERAZIONE TRA RECETTORI P

TROMBINA

La trombina è un potente AGONISTA della aggregazione piastrinicae la sua attività proteasica è richiesta per svolgere tale azione

La trombina attiva un particolare recettore, PAR-1 (Protease-Activated Receptor-1) presente sulla superficie

piastrinica. Tale recettore appartiene alla famiglia di recettori associati a proteine G. L’attivazione di questo recettore da

parte della trombina avviene in seguito ad un taglio proteoliticodi 41 aminoacidi a livello della porzione N-terminale del recettorestesso. La rimozione di questo peptide determina la formazione di un nuovo terminale N, che si lega ad un’altra regione di PAR-1

ed agisce come agonista (“tethered ligand”).

PAR-1 è associato a diverse famiglie di proteine G e quindi puòattivare varie vie di trasduzione ruolo pleiotropico della trombina

TROMBINA

PARs: Protease-Activated Receptors

RECETTORI ASSOCIATI A PROTEINCHINASI

PLC-γ

PIP2

IP3

DAG PKC

Ca++

AGONISTA

TIROSIN-CHINASI

Vedi schema 1Alcuni agonisti, interagendo con

il proprio recettore, attivanotirosinchinasi, che, a loro voltaattivano PLC (vedi schema 1)

ATTIVAZIONE PIASTRINICA INDOTTA DA COLLAGENO

Complesso GPVI/FcRγ

fosforilazione di FcRγ (ad opera della tirosinchinasi Fyn)

legame di Syk al complesso fosforilato

fosforilazione e attivazione di Syk

fosforilazione e attivazione di BTK (Bruton’s tyrosine kinase)

Fosforilazione e attivazone di PLC

ATTIVITA’ PROCOAGULANTE DELLE PIASTRINE

Nelle membrana plasmatica delle piastrine non attivate i fosfolipidi hanno una disposizione asimmetrica: i fosfolipidi carichi negativamente (PS e PE) sono presenti quasi esclusivamente sul

lato interno del doppio strato lipidico meccanismo di controllo in grado di prevenire una inappropriata attivazione della coagulazione

L’asimmetria dei fosfolipidi di membrana è regolata da 3 enzimi:- TRASLOCASE, enzima ATP-dipendente trasporto rapido di amino-fosfolipidi dal lato esterno a quello interno. Attività inibita dal calcio- FLOPPASE, enzima ATP-dipendente, con attività non lipido-specifica trasporto lento di amino-fosfolipidi verso il lato esterno della membrana- SCRAMBLASE, enzima Ca++-dipendente, con attività non lipido-specifica permette il movimento casuale dei lipidi nella membrana

Nella piastrina non attivata, a concentrazioni fisiologiche di calcio, la asimmetria dei lipididi membrana è mantenuta in quanto l’enzima scramblase è inattivo, mentre sono attivi glienzimi traslocase e floppase.

Nelle piastrine attivate, l’aumento delle concentrazione di calcio inibisce l’attività dell’enzimatraslocase e contemporaneamente attiva l’enzima scramblase ridistribuzione dei lipidi dimembrana con perdita della asimmetria ed esposizione del fattore piastrinico 3

L’aumento del calcio citosolico, inoltre, attiva l’enzima calpaina con conseguente formazione dimicrovescicole con elevata concentrazione di PS una membrana piastrinica particolarmente

arricchita di fosfatidil-serina costituisce una superficie ottimale per l’assemblaggio dei complessi multimolecolari critici per l’avvio ed il mantenimento del processo di coagulazione

(complesso tenasico e complesso pro-trombinasico).

ATTIVITA’ PROCOAGULANTE DELLE PIASTRINE