CLONAREA SI CARACTERIZAREA CADRELOR DE CITIRE ORF32 SI ORF40 DE PE MEGAPLASMIDUL PAO1 DIN ARTHROBACTER NICOTINOVORANS -

POTENTIALE MODELE DE STUDIU ALE INTERACTIUNII TAGATOZA-PROTEINE (PD-337)

Sinteza lucrării, etapa unică 2011

Dezvoltarea deosebită a metodelor de secven iere a ADN-ului a dus la acumularea unuiț număr mare de informa ii legate de secven a diferitelor gene. Doar secven a de nucleotide nu oferăț ț ț însă suficiente informa ii care să indice i func ia acesteia ț ș ț (Faulon et al., 2008; White, 2010; White, 2006) . Pentru a putea în elege rolul fiziologic al unei sunt a adar necesare investiga ii suplimentare.ț ș ț Un caz interesant în acest context este microorganismul Arthrobacter nicotinovorans care con ine înț celula sa megaplasmidului catabolic pAO1. Având dimensiunea de165 kb, pAO1 a fost complet secven iat în 2001 de către Igloi i colab.ț ș (Igloi and Brandsch, 2003) (secven a fiind accesibilă înț bazele de date cu indicativul AJ507836 GI:25169022). De i încă din 2003 aș cela i autor indicăș existen a a două poten iale căi metabolice codificate de gene de pe acest plasmid, doar una dintreț ț acestea a fost complet elucidată: cea responsabilă de degradarea nicotinei (Brandsch, 2006), aceasta reprezentând doar 12 % din numărul total de cadre de citire descrise pe pAO1.

Cea de-a doua cale metabolică posibil a fi implicată în degradarea glucidelor, fiind din acest punct de vedere deosebit de interesantă din punct de vedere tiin ific i practic. Cu toate acestea nuș ț ș a fost deloc investigată până în 2008 când, în cadrul programului de pregătire pentru doctorat am realizat primele primele observa ii i am lansat primele ipoteze legate de implicareaț ș megaplasmidului pAO1 în degradarea glucidelor (Mihasan, 2010-10-01) .

Figura 1. Megaplasmidul pAO2 şi grupul de gene presupus a codifica o cale de degradare a tagatozei (Mihasan, 2010-10-01) . Cu săge iț colorate sunt genele studiate în acest proiect (figura din manuscrisul aflat in pregatire).

După cum se poate vedea în figura 1, grupul de gene presupus a fi implicat în metabolizarea glucidelor alcătuie te unș operon a cărui expresie este reglată de cadrul de citire GntR (figura 2). Operonul con ine unț sistem multicomponent de transport activ al glucidelor alături de o gamă întreagă de oxidoreductaze ce integrează produ ii deș degradare în fluxul metabolic general al celulei.

În vederea identificării substratului acestei căi metabolice, abordarea propusă constă în clonarea genei de interes în vectori specifici, supra-expresia proteinei codificate într-o altă gazdă i purificarea acesteia subș forma recombinată, utmată apoi de caracterizarea proteinei d.p.v al masei molare, cofactorilor conţinuţi şi al activităţii enzimatice sau d.pv. al funcţiei fiziologice.

Astfel, gena codificând cadrul de citire orf32 (gntR) a fost izolată prin PCR folosind primerii degenera i din tabelul 1. Programul PCR utilizat este unul derivat de la programul standardț recomandat de producătorul Pfu polimerazei, în care temperatura de annealing fost modificată la 60oC iar durata etapei de amplificare la 60s. S-a reu it izolarea astfel a unui fragment de aprox. 800ș pb care a fost apoi digerat cu enzimele de restric ie BamHI/XhoI şi ligat în vectorul pH6EX3ț

(Berthold et al., 1992) folosind Fast-Link Ligation Kit (NEB, UK).

Figura 2. Rezultate BLAST (Altschul et al., 1997) cu secvenţa orf32 identifică aceasta gena ca fiind un factor de transcrip ie. ț

Tabelul 1. Nucleotide folosite în acest studiuNo. Orientation Sequence (5′–3′)* Amplified fragment (bp)

1 Forward GGCCGAGGA T CC ATGGACGorf32 (800)

2 Reverse CGCTACCACT C G A G GCTGACC Amestecul de reac ie a fost utilizat direct pentru transformarea celulelor competente deț

E.coli, celulele transformate fiind selectate apoi pe plăci cu ampicilină 50 microg/ml concentra ieț finală. În final s-au ob inut un număr de 8 colonii, care au fost testate pentru prezen a insertuluiț ț folosind digestii controlate cu enzimele de restricţie 1 – BamHI/XhoI şi 2 – BamHI/PstI. Rezultatele digestiei sunt prezentate în figura 3, concluzia fiind ca fragmentul de interes a fost inserat în pozi ia dorită.ț

Figura 3. Fragment din caietul de laborator prezentând schema de verificare a corectitudinii clonării genei gntR in vectorul pH6EX3.

După îndeplinirea primului obiectiv al proiectului, s-au facut demersuri pentru purificarea proteinei codificate de gena gntR. Astfel, gntR a fost supraexprimată în Escherichia coli folosind vectorul pH6EX3 pe mediul autoinductibil (Busso et al., 2008). Vectorul de expresie pH6EX3 utilizat oferă de asemenea nu numai avantajul unui nivel înalt de expresie, ci şi o modalitate foarte simplă şi eficientă de purificare a proteinei exprimate. Astfel aceasta este fuzionată cu o coada de poli-His (alcătuită din un număr de 6-8 reziduuri de histidină) care îi conferă afinitate pentru Ni2+. Această coadă este intens folosită într-un număr mare de laboratoare deoarece oferă o serie de avantaje nete. În primul rând dimensiunile deosebit de mici fac ca

modificările induse asupra structurii secundare i ter iare a proteinei de interes să fie minime, ceeaș ț ce se traduce într-un impact minim asupra activită ii enzimatice. Al doilea avantaj este faptul căț întregul proces de purificare se reduce la o singură etapă, aceasta constând în legarea proteinei recombinate de coloana cu Ni2+ imobilizat. Tehnica de purificare a fost descrisă pentru prima dată de Porath i colab. ș (Jerker, 1988) Suportul cromatografic folosit este High-Performance Nickel-chelating Sepharose comercializat de GE Healthcare. Protocolul utilizat pentru purificarea propriu-zisă este unul adaptat după instruc iunile producătorului şi cel stabilit în etapa anterioară a proiectului. Acest protocol con ineț ț un număr de 4 etape distincte:1. Pregătirea coloanei

Ni-Sepharose 6 Fast Flow este men inută ca o solu ie 40% în alcool etilic 20% la frigider.ț ț Înaintea utilizării solu ia se agită pentru omogenizare i 5 ml se plasează în coloana de plastic.ț ș Aceasta va duce la ob inerea unei coloane cu volumul (CV) de 2 ml . Materialul se spală apoi cuț apă distilată 10 volume de coloană (CV). Pentru siguran ă coloana a fost cură ată i apoi reîncărcatăț ț ș cu Ni2+. Aceasta s-a realizat prin spălări succesive cu: 10x CV EDTA 0,05 M, NaCl 0,5 M; 2-3x CV NaCl 0,5 M; 1x CV NaCl 1M (se men ine în contact cu coloana pentru 15-20 minute laț temperatura camerei); 10x CV NaOH 1M; 10x CV etanol 70%; 10x CV apă distilată. La final coloana se încarcă cu nichel prin spălare cu 4x CV NiCl2 150 mM şi 10x CV apă distilată.2. Echilibrare coloanei i ob inerea extractului acelular:ș ț

După etapa preliminară mai sus men ionată coloana a fost echilibrată prin spălare cu 10xCVț de tampon de lucru: HEPES 40mM, NaCl 500 mM, pH 7,4.

20 ml de mediul LB (Lysogeny broth) inoculată cu o colonie de E.coli pH6EX3orf32 a fost incubată la 37oC pentru aproximativ 16 ore. Câte 2 ml din această pre-cultură au fost utiliza i pentruț a inocula 2 culturi principale de câte 200 ml mediu LB (dilutie 1/10). Acestea au fost men inute laț 370C până densitatea optică la 600 nm a atins aproximativ 0,4 apoi expresia proteinelor a fost indusă cu prin adăugarea în mediu a IPTG, 1 mM concentra ia finală. Temperatura de incubare aț fost redusă la 300C. După 16 ore, cei 400 de ml de cultură con inând suspensia celulara au fostț centrifuga i pentru 30 minute la 4500 rpm în vederea recuperării celulelor. Acestea au fost re-țsuspendate în aproximativ 20 ml de tampon de lucru i sonicate în 3 reprize de câte 2 minute peș ghea ă utilizând un sonicator Branson. Solu ia ob inută, numită de aici extract total a fost supusăț ț ț unei noi centrifugări la 13000 rpm pentru 30 minute în vederea clarificării i separării celulelorș intacte i elementelor insolubile. Supernatantul este extractul acelular (cell free extract, CFE), iarș depozitul (pellet, P) con ine proteinele insolubile.ț

CFE a fost apoi aplicat pe coloana echilibrată. Solu ia evacuată la ie irea din coloană a fostț ș colectată i analizată din punct de vedere al con inutului de proteine.ș ț3. Spălarea coloanei

După aplicare CFE cu proteina de interes coloana este spălată pentru eliminarea componentelor legate nespecific de aceasta. Spălarea se face prin realizarea unui cradient crescăror în etape de imidazol, după cum urmează: Imidazol 10 mM în HEPES 40mM, Nacl 500 mM, pH 7,4, 30xCV; Imidazol 40 mM în HEPES 40mM, Nacl 500 mM, pH 7,4, 30xCV; Imidazol 80 mM în HEPES 40mM, Nacl 500 mM, pH 7,4, 10xCV4. Eluţia

Eluarea proteinei legate de coloană s-a realizat prin spălarea cu 10xCV solu ie con inândț ț 200 i apoi 500 mM imidazol. Lichidul evacuat a fost colectat în frac iuni de 1 ml i analizat înș ț ș

vederea con inutului de proteine.ț Cromatograma întregii proceduri de purificare prin IMAC poate fi observată în figura 4. Figura 4. Cromatograma tipică pentru purificarea prin IMAC a proteinei ORF32 (GntR)

Analiza cantită ii de proteine s-a realizat după metoda BCA, folosind kit-ul achizi ionat de laț ț Sigma-Aldrich. Analiza spectrului proteic a fost realizată prin elecroforeza în geluri de poliacrilamidă în sistem denaturant (SDS-PAGE). Elecroforeza s-a realizat într-o cuvă verticală miniProtean2 produsă de Biorad (USA). Gelurile au fost preparate urmând indicaţiile producătorului sistemului electroforetic, iar colorarea s-a realizat cu Comassie Blue. M 1 2 3 3

Figura 5. Gradul de puritate al preparatului obţinut în urma purificării prin IMAC a ORF40 M. Sigma Wide Range Molecular Wheight Marker

1. elutie cu 80 mM imidazol2. elutie cu 200 mM imidazol3. elutie cu 500 mM imidazol

Gelul utilizat a fost de 12% acrilamidă, în format mini.

În urma densitometrării gelului cu ajutorul programului BioCapt 12.2., gradul de puritate măsurat a fost de aproximativ 90%, iar masa moleculară relativă de 27 kDa, în bună concordan ă cu masa moleculară de 24,124 kDaț

calculată de servele Expasy pe baza secven ei. Deoarece represorii sunt în general multimeri, amț determinat masa moleculare native a acestei proteine prin filtrare pe gel. Cromatograma ob inutăț este prezentată în figura 6.

Figura 6. Cromatograma obţinută în urma filtrării prin gel a preparatului enzimatic con inândț ORF32. Aproximativ 10 mg proteină într-un volum de 600 microl au fost injectate pe o coloana HiLoadSuperdex 200 PrepGrade (Amersham, Elveţia). Separarea cromatografică s-a realizat pe un sistem Pharmacia LKB FPLC la un debit de 1 ml/min.

După cum se poate observa din figură, proteina eluează de pe coloana de filtrare prin gel sub forma unui singur peak, corespunzând unei mase molare de 32 kDa, indica ie că proteina de interesț este monomeră în solu ie. Deşi este extrem de rar, cazuri de represori monomeri au fost raportate înț literatura de specialitate (Kosugi and Ohashi, 2002; Needham and Trumbly, 2006).

Concentrarea preparatului proteic ob inut folosind un filtru centrifugal Vivaspin MWCOț 3000 nu a dus la modificări majore are culorii proteine purificate. Mai mult decât atât, analiza in silico a secventei acestei proteine indica faptul că este prezent domeniul înalt conservat wHTH (winged helix turn helix), domeniu responsabil de legarea ADN-ului într-un număr mare de represori. Toate aceste elemente indică faptul că proteina ORF32 nu con ine co-factori de naturăț metalică.

Figura 7. Identificarea domeniilor înalt conservate (Marchler-Bauer et al., 2011) şi a situsurilor de interac iune cu ADN-ul din GntRț

În vederea ob inerii de anticorpi policlonali s-a urmat protocolul stabilit şi descris în etapaț anterioară a proiectului pentru ORF40. Suplimentar, pe lângă anticorpii anti-orf32 au fost ob inu iț ț anticorpi şi pentru o a treia proteină codificată de pAO1 – orf39.

Un alt obiectiv important al proiectului este identificarea diferen elor metabolice dintre 2ț tulpini de Arthrobacter nicotinovorans: tulpina sălbatică con inând megaplasmidul pAO1 şi oț tulpina ob inută în laborator care a pierdut megaplasmidul pAO1 ț (Igloi and Brandsch, 2003). Eventualele diferen e sunt direct legate de megaplasmidul pAO1 i permit identificarea substratuluiț ș fiziologic al eventualelor căi metabolice codificate de acest mega-plasmid. Metodologia consacrată pentru caracterizarea metabolismului microorganismelor este folosirea sistemului API 50 CH ce permite testarea simultană a 50 de glucide. Rezultatele acestui test sunt prezentate în figura 8 ele demonstrând existen a unei căii de metabolizare a pentozelor la nivelul megaplasmidului pAO1. ț

A. nicotinovorans pAO1+

A. nicotinovorans pAO1-

Figura 8. Diferen e privind capacitatea de metabolizare a glucidelor dintre cele tulpina purtătoareț de plasmid (pAO1+) şi cea fără plasmid (pAO-) identificate prin intermediul kit-ului API50CH. Poziţia 15 – D-Xiloză, 19 – D -Riboză. Diferente au fost observate de asemenea şi pentru tagatoză şi arabinoză (figura din manuscrisul aflat in pregătire)

Figura 9. Tulpina Arthrobacter nicotinovorans pAO1+ atinge densită i optice mai mari pe medii cu xiloza comparativ cuț tulpina pAO1- (figura din manuscrisul aflat in pregătire)

Aparent, această cale metabolică de pe pAO1 oferă microorganismului o modalitate alternativă de asimilare a pentozelor, diferită de mecanismul obi nuit (fosforilareaș oxidativă) şi care are un randament mai bun (Johnsen and Schönheit, 2004; Johnsen et al., 2009). Astfel, experimentele realizate până în prezent doar cu xiloza demonstrează că tulpina pAO1+ poate să se dezvolte mai bine pe medii suplimentate cu acest glucid comparativ cu tulpina fără plasmid (figura 9). Experimentele in curs doresc evaluarea comportamentul tulpinii pAO1 pe medii minerale suplimentate cu celelalte

glucide identificate. Bineîn eles, aceste date indică existen a unei căi metabolice pe pAO1, dar nu precizează careț ț

din cele 165 de cadre de citire pe care le con ine sunt implicate. Având la dispozi ie cei treiț ț anticorpi produ i în cadrul acestui proiect, a fost posibilă abordarea ultimului obiectiv tiin ific dinș ș ț această etapă, şi anume identificarea condi iilor de expresieț in vivo a genelor luate în studiu. Pentru

aceasta, A. nicotinovorans pAO1+ si A. nicotinovorans pAO1- au fost cultivate pe mediu mineral suplimentat sau nu cu xiloza. Celulele provenind din cei 200 mL de cultură au fost resuspendate în 40 mM Hepes, pH 7.4, 0.5 M NaCl, 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 10% glicerol, 0.1 mM EDTA and 10 mg/ml lizozim. După 30 min de incubare la temperatura camerei, suspensia bacteriană a fost lizată prin sonicare la 4 °C folosind un sonicator Sonics Vibra-Cell VC 505 sonifier (2 X 2 min, 70% amplitudine, 10 sec puls, 2 sec pauză). Aprox. 30 µg de proteine totale au fost separate prin SDS-PAGE pe geluri in gradient 8-12% gradient gel şi electro-transferate pentru 2 h la 500 mA pe o membrană de nitroceluloză Optitran BA-S 85 (Schleicher & Schuell, Dassel, Germany). Membrana a fost apoi developată folosind anticorpi specifici, vizualizarea realizându-se prin intermediul anti-rat immunoglobulin G conjugat cu fosfataza alcalină şi nitroblue tetrazolium chloride. Rezultatele pot fi observate în figura 10.

Figura 10. Purificarea, masa molară şi profilul expresiei ORF32(GntR), ORF39(AlDH), ORF40 (OxRe) (figura din manuscrisul aflat in pregătire)

Profilul expresiei GntR sus ine foarte bine rolul dedusț in-silico, acela de represor al căii metabolice. Proteinele represoare sunt exprimate intrinsec, indiferent de prezenţa sau absenţa substratului căii metabolice pe care o controlează. GntR este prezent în citosolul celulei de A. nicotinovorans atât în prezenta cât i în absenta inductorului. Înș

cazul proteinelor cu poten ială funcţie enzimatică, expresia lor este indusă doar în prezenta xilozei,ț fiind a adar implicate în metabolizarea acestei pentoze.ș

Testele privind expresia acestor proteine in prezenta celorlalte substrate sunt în curs de desfă urare. De asemenea, pe termen scurt se are în vedere identificarea i măsurarea activită iiș ș ț pentoz-oxidoreducatzica urmând indica iile lui ț (Johnsen and Schönheit, 2004; Stephens et al., 2007)

Bibliografie

Altschul, S.F., Madden, T.L., Schoffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., Lipman, D.J., 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research 25, 3389-3402.Berthold, H., Scanarini, M., Abney, C.C., Frorath, B., Northemann, W., 1992. Purification of recombinant antigenic epitopes of the human 68-kDa (U1) ribonucleoprotein antigen using the expression system pH6EX3 followed by metal chelating affinity chromatography.. Protein Expr Purif 3, 50-56.Brandsch, R., 2006. Microbiology and biochemistry of nicotine degradation.. Appl Microbiol Biotechnol 69, 493-498.Busso, D., Stierlé, M., Thierry, J.-C., Moras, D., 2008. A comparison of inoculation methods to simplify recombinant protein expression screening in Escherichia coli.. Biotechniques 44, 101-106.Faulon, J.-L., Misra, M., Martin, S., Sale, K., Sapra, R., 2008. Genome scale enzyme-metabolite and drug-target interaction predictions using the signature molecular descriptor. Bioinformatics 24, 225-233.

Igloi, G.L., Brandsch, R., 2003. Sequence of the 165-kilobase catabolic plasmid pAO1 from Arthrobacter nicotinovorans and identification of a pAO1-dependent nicotine uptake system.. J Bacteriol 185, 1976-1986.Jerker, P., 1988. IMAC - Immobilized metal ion affinity based chromatography. Trends in Analytical Chemistry 7, 254-259.Johnsen, U., Dambeck, M., Zaiss, H., Fuhrer, T., Soppa, J., Sauer, U., Schönheit, P., 2009. D-xylose degradation pathway in the halophilic archaeon Haloferax volcanii.. J Biol Chem 284, 27290-27303.Johnsen, U., Schönheit, P., 2004. Novel xylose dehydrogenase in the halophilic archaeon Haloarcula marismortui.. J Bacteriol 186, 6198-6207.Kosugi, S., Ohashi, Y., 2002. E2Ls, E2F-like Repressors of Arabidopsis That Bind to E2F Sites in a Monomeric Form. Journal of Biological Chemistry 277, 16553-16558.Marchler-Bauer, A., Lu, S., Anderson, J.B., Chitsaz, F., Derbyshire, M.K., DeWeese-Scott, C., Fong, J.H., Geer, L.Y., Geer, R.C., Gonzales, N.R., Gwadz, M., Hurwitz, D.I., Jackson, J.D., Ke, Z., Lanczycki, C.J., Lu, F., Marchler, G.H., Mullokandov, M., Omelchenko, M.V., Robertson, C.L., Song, J.S., Thanki, N., Yamashita, R.A., Zhang, D., Zhang, N., Zheng, C., Bryant, S.H., 2011. CDD: a Conserved Domain Database for the functional annotation of proteins. Nucleic Acids Research 39, D225-D229.Mihasan, M., 2010-10-01. In-silico evidence of a pAO1 encoded pathway for the catabolism of tagatose derivatives in Arthrobacter nicotinovorans. Biologia 65, 760-768.Needham, P.G., Trumbly, R.J., 2006. In vitro characterization of the Mig1 repressor from Saccharomyces cerevisiae reveals evidence for monomeric and higher molecular weight forms. Yeast 23, 1151-1166.Stephens, C., Christen, B., Fuchs, T., Sundaram, V., Watanabe, K., Jenal, U., 2007. Genetic analysis of a novel pathway for D-xylose metabolism in Caulobacter crescentus.. J Bacteriol 189, 2181-2185.White, R.H., April 15, 2010. The Twists and Turns of Enzyme Function. Journal of Bacteriology 192, 2023-2025.White, R.H., May 15, 2006. The Difficult Road from Sequence to Function. Journal of Bacteriology 188, 3431-3432.

Director proiect,Asistent dr. Marius MIHASAN