CLONAREA SI CARACTERIZAREA CADRELOR DE CITIRE ORF32 SI ORF40 DE PE MEGAPLASMIDUL PAO1 DIN ARTHROBACTER NICOTINOVORANS - POTENTIALE

MODELE DE STUDIU ALE INTERACTIUNII TAGATOZA-PROTEINE (PD-337)Sinteza lucrării, etapa 2010

Dezvoltarea deosebită a metodelor de secvenţiere a ADN-ului a dus la acumularea unui număr mare de informaţii legate de secven a diferitelor gene. Doar secven a de nucleotide nu oferăț ț însă suficiente informaţii care să indice şi funcţia acesteia. Pentru a putea în elege rolul acesteia înț cadrul organismului sunt necesare a adar investiga ii suplimentare. Un caz interesant în acestș ț context este microorganismul Arthrobacter nicotinovorans care con ine în celula sa megaplasmidulț catabolic pAO1. Având dimensiunea de165 kb, pAO1 a fost complet secven iat în 2001 de cătreț Igloi i colab. (9) (secven a fiind accesibilă în bazele de date cu indicativul AJ507836ș ț GI:25169022). De i încă din 2003 acela i autor indică existen a a două poten iale căi metaboliceș ș ț ț codificate de gene de pe acest plasmid, doar una dintre acestea a fost complet elucidată: cea responsabilă de degradarea nicotinei (4), cale metabolică ce reprezintă doar 12 % din numărul total de cadre de citire descrise pe pAO1.

Cea de-a doua cale metabolică, de i este interesantă din punct de vedere tiin ific i practicș ș ț ș nu a fost deloc investigată până în 2008 când, în cadrul programului de pregătire pentru doctorat am realizat primele primele observa ii i am lansat primele ipoteze legate de rolul acestei căi ț ș (12; 13; 13).

Figura 1. Grupul de gene presupus a fi implicat în metabolizarea nicotinei (11). Îngro ate suntș genele studiate în acest proiect.

După cum se poate vedea în figura 1, grupul de gene presupus a fi implicat în metabolizarea nicotinei alcătuie te un operon a cărui expresie este reglată de cadrul de citire ș GntR. Operonul con ine un sistem multicomponent de transport activ al glucidelor alături de o gamă întreagă deț oxidoreductaze ce integrează produ ii de degradare în fluxul metabolic general al celulei. ș

Cum cea mai mare parte a genelor codifică proteine, caracterizarea acestor molecule constituie o direc ie de cercetare care a cunoscut o dezvoltare deosebită în ultima perioadă. Oț modalitate de a investiga rolul i proprietă ile unei proteine ce devine din ce în ce mai utilizatăș ț constă în clonarea genei de interes în vectori specifici, supra-expresia proteinei într-o altă gazdă iș purificarea proteinei recombinate în vederea investigării proprietă ilor acesteia. Această abordareț ne-am propus-o i noi pentru a elucida rolul a 2 cadre de citire plasate pe megaplasmidul pAO1.ș Este vorba despre ORF32, proteină similară cu factorul de GntR i ORF 40 proteină ce are 63ș % identitate cu o GFO-oxidază (14).

Deoarece în cursul doctoratului gena ORF40 a fost clonată, primul obiectiv al proiectului a constat în punerea la punct a protocolului de purificare a proteinei codificate.

Cadrul de citire 40 a fost supraexprimat în Escherichia coli folosind vectorul pH6EX3(2) pe mediul autoinductibil descris de Studier (18). Vectorul de expresie pH6EX3 utilizat oferă de asemenea nu numai avantajul unui nivel înalt de expresie, ci si o modalitate foarte simplă şi eficientă de purificare a proteinei exprimate. Astfel aceasta este fuzionata cu o coada de poli-His (alcătuită din un numar variabil, 6-8, reziduuri de histidină) care îi conferă afinitate pentru Ni2+.

Această coadă are un succes foarte mare, fiind intens folosită într-un număr mare de laboratoare deoarece oferă o serie de avantaje nete. În primul rând dimensiunile deosebit de mici fac ca modificările induse asupra structurilor secundare i ter iare a proteinei de interes să fie minime, ceeaș ț ce determină coada să manifeste influen e minime asupra activită ii enzimatice. Al doilea avantajț ț este faptul că întregul proces de purificare se reduce la o singură etapă, ce constă în legarea proteinei recombinate de coloana cu Ni2+ imobilizat. Această tehnică de purificare a fost descrisă pentru prima dată de Porath şi colab. (15) Suportul cromatografic folosit este High-Performance Nickel-chelating Sepharose comercializat de GE Healthcare. Protocolul utilizat pentru purificarea propriu-zisă este unul adaptat după instrucţiunile producătorului şi după etapele propuse de Ausuble si colab(1), fiind folosit cu succes pentru purificarea unor alte proteine recombinante (6; 17). Acest protocol conţine un număr de 4 etape distincte:1. Pregătirea coloanei

Ni-Sepharose 6 Fast Flow este menţinută ca o soluţie 40% în alcool etilic 20% la frigider. Înaintea utilizării soluţia se agită pentru omogenizare şi 5 ml din aceasta se plasează în coloana de plastic. Aceasta va duce la obţinerea unei coloane cu volumul (CV) de 2 ml . Materialul se spală apoi cu apă distilată 10 volume de coloană (CV). Pentru siguran ă coloana a fost cură ată i apoiț ț ș reîncărcată cu Ni2+. Aceasta s-a realizat prin spălări succesive cu:

EDTA 0,05 M, NaCl 0,5 M 10x CV

NaCl 0,5 M 2-3x CV

NaCl 1M* 1x CV

NaOH 1M 10x CV

Etanol 70% 10x CV

Apă distilată 10x CV

NiCl2 150 mM 4x CV

Apă 10x CV *această solu ie este men inută în contact cu coloana pentru 15-20 minute la temperatura camereiț ț2. Echilibrarea coloanei:

După etapa preliminară mai sus men ionată coloana a fost echilibrată prin spălare cu 10xCVț tampon de lucru: HEPES 40mM, NaCl 500 mM, pH 7,4.

20 ml de mediul LB (Lysogeny broth) (16) inoculat cu o colonie de E.coli pH6EX3orf40 a fost incubat la 37oC pentru aproximativ 16 ore. Câte 1,5 ml din această pre-cultură au fost utiliza iț pentru a inocula 2 culturi principale de câte 150 ml mediu LB. Acestea au fost menţinute la 370C până când densitatea optică la 600 nm a atins valoarea de aproximativ 0,4 apoi expresia proteinelor a fost indusă prin adăugarea în mediu a IPTG, 1 mM concentra ia finală. Temperatura de incubare aț fost redusă la 300C. După 3 ore, cei 300 de ml de cultură con inând suspensia celulara au fostț centrifuga i timp de 10 minute la 4500 rpm în vederea recuperării celulelor. Acestea au fostț resuspendate în aproximativ 20 ml tampon de lucru i sonicate în 3 reprize de câte 2 minute, peș ghea ă, utilizând un sonicator Branson. Solu ia ob inută, numită de aici încolo extract total a fostț ț ț supusă unei noi centrifugări la 13000 rpm timp de 30 minute în vederea clarificării i separăriiș celulelor intacte i elementelor insolubile. Supernatantul este extractul acelular (cell free extract,ș CFE), iar depozitul (pellet, P) con ine proteinele insolubile.ț

CFE a fost apoi aplicat pe coloana echilibrată. Solu ia evacuată la ie irea din coloană a fostț ș colectată şi analizată din punct de vedere al con inutului de proteine.ț3. Spălarea coloanei

După aplicare CFE cu proteina de interes, coloana este spălată pentru eliminarea componentelor legate nespecific de aceasta. Spălarea se face prin aplicare succesivă pe coloana a următoarelor solu ii, cu volumul indicat:ț

Imidazol 10 mM în HEPES 40mM, Nacl 500 mM, pH 7,4 30xCV

Imidazol 40 mM în HEPES 40mM, Nacl 500 mM, pH 7,4 30xCV

Imidazol 80 mM în HEPES 40mM, Nacl 500 mM, pH 7,4 10xCV 4. Eluţia

Eluarea proteinei legate de coloană s-a realizat prin spălarea cu 10xCV solu ie con inândț ț 200 i apoi 500 mM imidazol. Lichidul evacuat a fost colectat în frac iuni de 1 ml i analizat înș ț ș vederea determinării con inutului de proteine. ț

Analiza cantită ii de proteine s-a realizat după metoda Bradford cu reactivul gata preparatț (RotiQuant) produs de Roth (Germania) urmând indica iile producătorului. ț

Analiza spectrului proteic a fost realizată prin elecroforeză în geluri de poliacrilamidă în sistem denaturant. Elecroforeza s-a realizat într-o cuvă verticală miniVertigel2 produsă de Apelex (Fran a). Gelurile au fost preparate după indica iile lui Sambrook i colab. ț ț ș (16) precum şi ale producătorilor sistemului electroforetic. Colorarea i decolorarea gelurilor s-a realizat conformș procedurii pentru Comassie staining descrisă de Sambrook (16)

Fig.2 Gradul de puritate al preparatului obţinut în urma purificării prin IMAC a ORF40 M. Sigma Wide Range Molecular Wheight Marker

1. 5 microg proteină2. 10 microg proteină3. 20 microg. Proteină

Gelul utilizat a fost de concentraţie 12% acrilamidă, în format midi. În urma densitometrării gelului cu ajutorul programului BioCapt 12.2., gradul de

puritate evaluat a fost de aproximativ 95%, iar masa moleculară relativă de 47 kDa, în bună concordan ă cu masa moleculară de ț 46047.92 calculată de servele Expasy pe baza secven ei. ț

Deoarece proteinele cu care produsul de transla ie alț orf40 se înrude te au variateș stadii de oligomerizare, de la tetrameri la monomeri, am încercat determinarea masei moleculare native a acestei proteine prin filtrare pe gel. Cromatograma ob inută esteț prezentată în figura 7.

Fig. 3. Cromatograma obţinută în urma filtrării prin gel a preparatului enzimatic con inând ORF40. ț

Aproximativ 10 mg proteină într-un volum de 600 microl au fost injectate pe o coloana HiLoadSuperdex 200 PrepGrade (Amersham, Elveţia). Separarea cromatografică s-a realizat pe un sistem Pharmacia LKB FPLC la un debit de 1 ml/min.

După cum se poate observa din figură, 2 peak-uri pot fi decelate clar, unul de amplitudine mică, corespunzând unui volum de elu ie de 43,95 ml i celălalt predominant, corespunzând unuiț ș volum de eluţie de 56,52 ml. Primul peak, datorită volumului foarte apropiat de volumul liber (45 ml) con ine probabil conglomerate proteice care au un diametru mai mare decât cel al porilorț gelului. Al doilea peak însă, corespunzător proteinei ORF40 indică o masă moleculară de 163 kDa, ceea ce ar corespunde unui structuri tetramere. Acela i comportament a fost descris i la GFOș ș (10). O întrebare interesantă este de asemenea plasarea situsului activ al acestei enzime, adică este vorba despre câte un situs distinct în interiorul fiecărui monomer, sau situs-ul se formează la interfa aț dintre 2 monomeri?

După concentrarea preparatului proteic ob inut prin utilizarea unui filtru centrifugal Vivaspinț MWCO 3000, s-a putut observa că, solu ia ob inută, având o concentra ie de 34 μg /μL ORF40,ț ț ț avea o tentă u or maronie. Un spectru al solu iei proteice denotă existen a unui peak de dimensiuniș ț ț mari la 275 nm, normal pentru orice solu ie proteică, dar i un umăr la 405 nm (fig 4). Aceste douăț ș elemente ar indica prezen a unui co-factor enzimatic, din aceste motive am analizat con inutul deț ț Mn, Zn si Fe al preparatului ob inut. Rezultatele au arătat un con inut neglijabil de Fe i Mn, însăț ț ș con inutul de Zn ar indica faptul că molecula proteică con ine acest element. Un aspect interesantț ț este faptul că, de asemenea, i filtratul are un con inut apreciabil de Zn, însă solu ia tampon utilizatăș ț ț pe parcursul purificării nu.

Fig. 4. Spectrul de absorbţie al proteinei purificate.

Tabel. 1. Con inutul de Zn al probelor analizateț

Proba analizată Zn

[mg/L]

Solu ie tampon Hepes 40 mM, NaCl 500 mM,ț

folosită pentru purificare

1,7

Filtrat 27,2

Solu ie concentrată de proteină (34μg/μLț

ORF40)

43,2

Solu ia concentrată de proteină men inută la frigider pentru o perioadă mai mare de timpț ț formează un u or precipitat. Acest precipitat are, de asemenea, o nuan ă maronie, după cum seș ț poate observa în figura 5. Dacă însă precipitarea proteinei se realizează prin fierbere la 95 0C timp de 5 minut sau prin tratarea cu acid triclor acetic 5% (ATC), precipitatul ob inut este de culoareț albă. Această observa ie este în bună concordan ă cu prezen a Zn în filtrat i se explică prin aceea căț ț ț ș acest element este legat necovalent de apo-enzimă. Precipitarea în frigider se realizează cu men inerea unui grad de organizare secundară i păstrarea deci a co-factorului enzimatic legat.ț ș Căldura sau acidul tricloracetic duc la destabilizarea totală a structurilor secundare i eliberarea co-șfactorului.

Fig. 5. Comportamentul diferit al precipitatului proteic func iede agentul de precipitarețA. precipitare la frigider, culoare maroB. precipitare prin tratare cu ATC 5% sau fierbere 95 0C, culoare albă.

Cantitatea de Zn determinată corespunde unui raport de 2 atomi de Zn pentru fiecare moleculă de monomer. Un asemenea raport a fost descris i pentru L-arabinitol 4-dehidrogenaza dinș Neurospora crassa (19) sau pentru manitol dehidrogenaza din Leuconostoc , un atom fiind implicat în reacţia enzimatică iar celălalt având rol structural (8). Ambele enzime sunt de asemenea tetramere. Cele două enzime fac parte însă dintr-o altă clasă de enzime, cea a sorbitol-dehidrogenazelor. În clasa din care face parte ORF40 i anume GFO/IDH/MocA au fost descrise oș serie de proteine care prezintă un al doilea domeniu de legare al acestui metal. O regiune cu un grad mare de omologie cu acest domeniu nu a fost însă identificat pe ORF40 de nici unul din serverele de explorare a domeniilor înalt conservate utilizate.

Testele func ionale realizate cu preparatul enzimatic purificat nu au permis identificareaț substratului sau a unei activită i. Se are în vedere i explorarea posibilită ii ca pe întreg parcursulț ș ț procesului de purificare solu iile tampon să con ină Zn, în a a fel încât enzima să î i păstreze pe câtț ț ș ș posibil integritatea structurală.

În vederea ob inerii de anticorpi policlonali s-a urmat protocolul descris de Coligan et al.,ț 2005 (7). Astfel, înainte de imunizarea propriu-zisă a animalului de laborator, acesta a fost testat în vederea identificării posibilelor reac ii secundare a anticorpilor preexisten i în ser la extractele deț ț E.coli. Asemenea reac ii pot apărea ca urmare a unei infec ii nedepistate cu acest microorganism laț ț animalul de laborator i împiedică utilizarea animalului pentru ob inerea de anticorpi. Pentruș ț aceasta, 500 μl sânge au fost preleva i de la un obolan Wistar în vederea ob inerii serului pre-imun.ț ș ț Sângele recoltat a fost incubat 4 ore la temperatura camerei i apoi la 4ș oC peste noapte pentru coagulare completă. Serul pre-imun a fost separat prin centrifugare timp de 10 min. la 3000 rpm. Testarea reactivită ii s-a realizat folosind tehnica Western-Blot ț (5; 20) urmând metodologia descrisă de Sambrook (16). Astfel, extracte totale de E.coli au fost separate prin SDS-PAGE pe un gel în gradient 5-15% în format mini iar apoi proteinele au fost transferate pe o membrana de nitroceluloză (Protran, Watman, UK) prin aplicarea unei tensiuni de 120 V timp de o ora utilizând un modul de electro-transfer semi-uscat produs de PeqLab (Germania). Imuno-detec ia s-a realizatț folosind anticorpul Anti-sobolan IgM cuplat cu fosfataza alcalină (Sigma, Germania), iar sistemul de detec ie a fost cel descris de Blake (3). ț Nici o reac ie secundară nu a fost observată, ceea ceț permite folosirea animalului în cauză pentru ob inerea de anticorpi anti-orf40. ț

obolanul de laborator din rasa Wistar testat a fost injectat intracutanat în 4 zone diferite cuȘ câte 50 μl/ zonă de injectare de emulsie preparată, urmând indica iile lui Coligan et al., 2005 ț (7). Emulsia a con inut ț 50 μg ORF40 purificată în 100 μl solu ie tampon Hepes 40 mM, NaCl 500 mMț i 100 μl adjuvant Freud complet (CFA, câte 50 μl/ zonă de injectare). După 6 săptămâni de laș

imunizare ( 15 decembrie ) se va realiza re-imunizarea animalului (a a numitul boost) folosind unș amestec de antigen i adjuvantul lui Freud incomplet (IFC) urmând ca pe data de 22 decembrie săș se preleveze serul imun.

Bibliografie:

1 Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. & Struhl, K. (2002). Short Protocols in Molecular Biology, II, 1512.2 Berthold, H., Scanarini, M., Abney, C.C., Frorath, B. & Northemann, W. (1992). Purification of recombinant antigenic epitopes of the human 68-kDa (U1) ribonucleoprotein antigen using the expression system pH6EX3 followed by metal chelating affinity chromatography,Protein Expression and Purification 3, 50-56.3 Blake, M.S., Johnston, K.H., Russell-Jones, G.J. & Gotschlich, E.C. (1984). A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots,Analytical Biochemistry 136, 175-179.4 Brandsch, R. (2006). Microbiology and biochemistry of nicotine degradation,Appl Microbiol Biotechnol 69, 493-498.5 Burnette, W.N. (1981). "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A,Anal Biochem 112, 195-203.6 Chiribau, C.B., Sandu, C., Fraaije, M., Schiltz, E. & Brandsch, R. (2004). A novel gamma-N-methylaminobutyrate demethylating oxidase involved in catabolism of the tobacco alkaloid nicotine by Arthrobacter nicotinovorans pAO1,Eur J Biochem 271, 4677-4684.7 Coligan, J.E., Bierer, B.E., Margulies, D.H., Shevach, E.M. & Strober, W. (2005). Short Protocols in Immunology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Immunology, 1, .8 Hahn, G., Kaup, B., Bringer-Meyer, S. & Sahm, H. (2003). A zinc-containing mannitol-2-dehydrogenase from Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291: purification of the enzyme and cloning of the gene,Arch Microbiol 179, 101-107.

9 Igloi, G.L. & Brandsch, R. (2003). Sequence of the 165-kilobase catabolic plasmid pAO1 from Arthrobacter nicotinovorans and identification of a pAO1-dependent nicotine uptake system,J Bacteriol 185, 1976-1986.10 Kingston, R.L., Scopes, R.K. & Baker, E.N. (1996). The structure of glucose-fructose oxidoreductase from Zymomonas mobilis: an osmoprotective periplasmic enzyme containing non-dissociable NADP,Structure 4, 1413-1428.11 Mihasan, M. (2010). In-silico evidence of a pAO1 encoded pathway for the catabolism of tagatose derivatives in Arthrobacter nicotinovorans,BIOLOGIA 65, 760-767.12 MIHASAN, M. & ARTENIE, V. (2008). Computer-based modeling for sugar preferences of an oxidoreducatse from Arthrobacter nicotinovorans Pao1 plasmid,Analele Stiintifice ale Universitatii Alexandru Ioan Cuza, Sectiunea Genetica si Biologie Moleculara IX, 129-133.13 Mihasan, M., Artenie, V. & Brandsch, R. (2008). A monomeric aldehyde dehydrogenase as part of a pAO1 encoded pathway for sugar utilization,FEBS JOURNAL 275, 285-285.14 Nurizzo, D., Halbig, D., Sprenger, G.A. & Baker, E.N. (2001). Crystal structures of the precursor form of glucose-fructose oxidoreductase from Zymomonas mobilis and its complexes with bound ligands,Biochemistry 40, 13857-13867.15 Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I. & Belfrage, G. (1975). Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation,Nature 258, 598-599.16 Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 1, .17 Sandu, C., Chiribau, C.B. & Brandsch, R. (2003). Characterization of HdnoR, the transcriptional repressor of the 6-hydroxy-D-nicotine oxidase gene of Arthrobacter nicotinovorans pAO1, and its DNA-binding activity in response to L- and D-nicotine Derivatives,J Biol Chem 278, 51307-51315.18 Studier, F.W. (2005). Protein production by auto-induction in high density shaking cultures,Protein Expr Purif 41, 207-234.19 Sullivan, R. & Zhao, H. (2007). Cloning, characterization, and mutational analysis of a highly active and stable L-arabinitol 4-dehydrogenase from Neurospora crassa,Appl Microbiol Biotechnol 77, 845-852.20 Towbin, H., Staehelin, T. & Gordon, J. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications,Proc Natl Acad Sci U S A 76, 4350-4354.

Director proiect,Asistent dr. Marius MIHASAN