Clonaggio funzionale Clonaggio posizionale

Conoscenza proteina Malattia genetica

Determinazione sequenza aminoac. Mappatura genetica con marcatori polimorfici

Deduzione sequenza nucleotidica Identificazione cloni genomiciche coprono il sito mappato

Sintesi sonda oligonucleotidica Ricerca del gene (varie tecniche)

Isolamento clone di cDNA Deduzione della struttura aminoac.

Isolamento clone genomico Ricerca mutazioni nucleotidichenelle famiglie affette

Caratterizzazione clone genomico Ricerca funzione proteica

Ricerca di mutazioni nucleotidiche

MARCATORI GENETICI

Un marcatore genetico è paragonabile ad un cartellino colorato che serve a “marcare” gli individui in un pedigree.

Un marcatore genetico per essere tale deve essere polimorfico ed i suoi diversi alleli possono essere utilizzati per seguire la segregazione di alleli per un altro gene quando si effettuano incroci.

TIPI DI MARCATORI POLIMORFICI

- Polimorfismi immunologici (es: gruppi sanguigni, rilevabili con tecniche sierologiche)

- Polimorfismi genetici a livello proteico (rilevabili attraverso l’elettroforesi ed altre tecniche di caratterizzazione degli isozimi)

- Polimorfismi genetici a livello del DNA

VARIABILITA’ GENETICA SEMPLICE

POLIMORFISMO: presenza di 2 o più fenotipi alternativi (morfi) a trasmissione mendeliana

MORFI: generalmente determinati da alleli diversi ereditati in modo mendeliano

POLIMORFISMO GENETICO

Carattere monogenico presente in una popolazione con una frequenza 1%

ETEROZIGOSITA’ (H)f(A) = p f(B) = q H = 2pq

H aumenta in relazione al numero di alleli del locus

TIPI DI MARCATORI GENETICI NELL’UOMO

Tipo di marcatore n° loci Caratteristiche

Gruppi sanguigni 20 sangue fresco, dominanza1910-1960

Varianti proteiche 30 siero fresco, saggi specialistici,1960-1975 polimorfismo limitato

RFLP del DNA >105 2 alleli, eterozigosità massima 0,51975-

VNTR del DNA >104 Molti alleli, altamente informativi(minisatelliti)1985-

VNTR del DNA >105 Molti alleli, altamente informativi(microsatelliti)1989-

SNP del DNA >106 Meno informativi dei microsatelliti1998-

LIVELLO DI POLIMORFISMO

- Eterozigosità

- Contenuto d’informazione del polimorfismo (Polymorphism Information Content = PIC)

TASSO DI MUTAZIONE

Singola Sostituzione Nucleotidica (SNS): 10-9

Variable Number of Tandem Repeat (VNTR): minisatelliti 10-2 - 10-3

microsatelliti 10-3 - 10-4

Il genoma è un serbatoio potenziale di polimorfismi così vasto da consentire di individuare i marcatori più adatti per affrontare un ampio spettro di problematiche della genetica delle popolazioni umane.

Analisi della segregazione degli alleli per il locus A e degli alleli del locus BDalle meiosi di II-1 è possibile stabilire: 5 combinazioni parentali e2 ricombinanti

1 2

MAPPAGGIO GENETICO DEI CARATTERI MENDELIANI

Dopo quante meiosi si può stabilire se i loci A e B sono associati o indipendenti?

LA MAPPATURA GENETICA PRIMA DEI MARCATORI MOLECOLARI DEL DNA

Gruppi di associazione con loci (marcatori proteici) noti:

ABO - adenilatochinasiABO - sindrome unghia- rotulaDuffy - cataratta congenitaRh - ellissocitosiCollinesterasi - transferrinaLutheran - secretoreG6PD - emofiliaG6PD - daltonismo

A1 Y A1 /A2

cA2 Y A2 YA2 = Allele enzimopenia G6PD

D/d

D D

D

A1 Ydd = allele daltonismo

A1 A1 A2 A2

A1 A2

A) NON INFORMATIVA Gli alleli del marcatore in omozigosi nel padre non possono essere distinti

B) NON INFORMATIVA

A1 A2 A1 A2

A1 A2

La figlia può aver ereditato A1 dal padre e A2 dalla madre o viceversa

MEIOSI INFORMATIVE E NON INFORMATIVE

MEIOSI INFORMATIVE E NON INFORMATIVE

C) INFORMATIVA

A1 A2 A1 A2

A1 A1

La figlia ha ereditato A1 dal padre

(fratria A1 A1 alternativa a A1 A2 della

famiglia B)

D) INFORMATIVA

A1 A2 A3 A4

A1 A4

La figlia ha ereditato A1 dal padre

UNA MEIOSI E’ INFORMATIVA, OVVERO UTILE PER GLI STUDI DI ASSOCIAZIONE (LINKAGE), QUANDO SI PUO’

IDENTIFICARE LA FASE DEI 2 LOCI E QUINDI STABILIRE SE IL GAMETE E’ O MENO RICOMBINANTE

PERCHE’ LA MEIOSI SIA INFORMATIVA IL GENITORE DEVE ESSERE DOPPIO ETEROZIGOTE PER I DUE LOCI

Es: locus malattia: Allele normale (+)/Allele mutato (-) marcatore: A1/A2

Marcatore Alleli (Frequenze H PIC alleliche)

A 1 0 0

A 2 (0,5; 0,5) 0,50 0,375

A 2 (0,4; 0,6) 0,48 0,365

A 2 (0,3; 0,7) 0,42 0,332

A 2 (0,1; 0,9) 0,18 0,164

A 4 (0,25;0,25;0,25; 0,25) 0,75 0,703

A 10 (tutti = 0,1) 0,90 0,891

X 2 (0,5; 0,5) 0,5 0,5

X 4 (0,25;0,25;0,25; 0,25) 0,75 0,75

1) Raccolta famiglie con diagnosi certa di una specifica malattia il cui locus genico è ignoto

2) Costruzione degli alberi genealogici di tutte le famiglie

3) Determinazione del genotipo di tutti gli individui per uno o più marcatori polimorfici

4) Se la famiglia è informativa, si classificano gli individui in ricombinanti o non ricombinanti tra il locus della malattia ed il marcatore analizzato

………

MAPPATURA GENETICA A DUE PUNTI

1 2

MAPPAGGIO GENETICO DEI CARATTERI MENDELIANI

Dalle meiosi paterni: i loci A e B sono indipendenti o associati?

Non si possono classificare II-2 e tutti gli individui della III generazione rispetto a II-2 (omozigote A1A1B1B1)

Sacchetto con monete di tre possibili tipi: TT (monete con T su entrambe le facce), oppure TC, oppure CC

4 lanci: T, T, T, T

E’ possibile capire da che tipo di monete è fatto il sacchetto?

Ipotesi che siano CC = ScartataIpotesi possibili: A: che siano TT B: che siano TC

Se non si fossero fatti lanciIpotesi A: Ipotesi B 1:1

Si intende per VEROSIMIGLIANZA di un’ipotesi A, rispetto ad una serie di fatti che costituiscono il risultato R, la probabilità con cui si sarebbe verificato R se A fosse stata vera.

Si confrontano le VEROSIMIGLIANZE di tutte le ipotesi per accertare se una è risultata MOLTO PIU’ VEROSIMILE delle altre

Verosimiglianza dell’Ipotesi A = 1 (che siano TT)

Verosimiglianza dell’ipotesi B = (1/2)4 = 1/16

1 Rapporto -------- = 16 :1 1/16Quanti lanci bisogna fare prima di assumere che siano TT?Si decide una soglia per 2 motivi:

1) ridurre al minimo i casi in cui si accetta per buona un’ipotesi che invece è sbagliata;

2) ridurre al minimo i casi in cui si lascia senza risposta il problema in esame

Rapporto della verosimiglianza = (1-)5 x 1 / (1/2)6

(1-)5 x 1

Lod score Z = log10 ---------------------

(1/2)6

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Z - 0,577 0,623 0,509 0,299 0

UN ESEMPIO DI CALCOLO DI LOD SCORE

NR NR NR NR NR R

Probabilità di meiosi ricombinante = Probabilità di meiosi non ricombinante = (1- )

Probabilità 5 NR e 1R = (1- )5 x 1

Probabilità totale in assenza di associazione = (0,5)6 = (1/2)6

Caso in cuiII 1 ha fase nota

Z = lod score 1000Z = log 10 -------- = 3 (p=0,05) 1Z > 3 EVIDENZA DI LINKAGE 1Z = log 10 -------- = - 2 100Z < - 2 ESCLUSIONE DI LINKAGE

3 > Z > - 2 NON CONCLUSIVI PER IL LINKAGE

SENZA RICOMBINANTI MASSIMO DI LOD SCORE E’ PER = 0

INTERVALLO DI CONFIDENZA (95%): LOD SCORE - 1

es. curva 2 max lod score = 3.7 per = 0.23 limiti fiduciali: 0.17 - 0.32

LE CURVE DEI LOD SCORE

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Z - 0,577 0,623 0,509 0,299 0

(1-)5 x 1

Lod score Z = log10 ---------------------

(1/2)6

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Z - 0,276 0,323 0,222 0,074 0

(1-)5 x 1 (1-) 1 x 5

Z = log10 --------------------- + ---------------------

(1/2)6 (1/2)6

1) Raccolta famiglie con diagnosi certa di una specifica malattia il cui locus genico è ignoto

2) Costruzione degli alberi genealogici di tutte le famiglie

3) Determinazione del genotipo di tutti gli individui per uno o più marcatori polimorfici

4) Se la famiglia è informativa, si classificano gli individui in ricombinanti o non ricombinanti tra il locus della malattia ed il marcatore analizzato

………

MAPPATURA GENETICA A DUE PUNTI

5) Nel caso di meiosi non informative non è possibile stabilire con certezza gli individui ricombinanti e non ricombinanti e quindi se i due loci sono associati

6) Estensione della tipizzazione a più famiglie

Come si stabilisce se i due loci sono associati?

7) Analisi dell’associazione tra il marcatore ed il locus attraverso il calcolo del lod score per ogni singola famiglia

8) Valutazione del lod score complessivo e utilizzazione del criterio statistico per decidere l’associazione o l’esclusione di associazione

MAPPATURA GENETICA A DUE PUNTI......

Rispetto alla combinazione parentale (II-1): 5 NR, 2 R

Frequenza di ricombinazione = 2/7 = 28,6%

1 2

STIMA DELLA DISTANZA GENETICA TRA MARCATORI

Esempio di analisi di associazione tra marker M e malattia AD

Stima della frequenza di ricombinazione = 2/6 = 0,33

IL LINKAGE A DUE O PIU’ PUNTI E’ ESSENZIALE PER LA COSTRUZIONE DELLE MAPPE MARCATORE - MARCATORE

QUESTO E’ STATO OTTENUTO CON:

- COLLEZIONE DI FAMIGLIE CON STRUTTURA IDEALE RACCOLTE A QUESTO SCOPO DAL CEPH DI PARIGI (CENTRE POUR L’ETUDE DES POLYMORPHISMES HUMAINES): 40 famiglie con 3 generazioni e almeno 6 figli)

- ANALISI DI MARCATORI POLIMORFICI (SOPRATTUTTO MICROSATELLITI) LOCALIZZATI SU TUTTI I CROMOSOMI IN FAMIGLIE CEPH ED ISTITUZIONE DI UNA BANCA DATI

- DETERMINAZIONE DELL’ORDINE DEI LOCI NELLE MAPPE MARCATORE – MARCATORE E DEFINIZIONE DELLE DISTANZE IN CENTIMORGAN

Famiglia 12

10 11 12 13

1 2

4 5 6 873 9

ESEMPIO DI FAMIGLIA CEPH

IL PROGETTO GENOMA UMANO

PER LA MAPPATURA DEL GENOMA UMANO SONO STATI UTILIZZATI NUMEROSISSIMI MARCATORI POLIMORFICI (RFLP E VNTR), NON NECESSARIAMENTE CORRELATI A GENI ESPRESSI, CON MODALITA’ DI TRASMISSIONE MENDELIANA

Utilizzi:1) Mappatura genetica di loci sconosciuti responsabili di malattie genetiche;2) Clonaggio genico;3) Diagnosi prenatale e presintomatica.

23 GRUPPI DI ASSOCIAZIONE (22 AUTOSOMI E CROMOSOMA X)

Mappatura genetica

Mappatura fisica bassarisoluzione

Mappatura fisica alta risoluzione

Mappatura del trascritto

Sequenziamento del gene

A1 A2D d

A1

D

A1

D

A2

d

d d

A2 A3

A3 A3

dd

A2

d

A3 A2D d

A3

D

A3

D

A2

d

d d

A2 A3

A3 A3

dd

A2

d

A2 A4D d

A2

D

A2

D

A4

d

d d

A2 A3

A3 A3

dd

A2

d

Associazione (linkage) tra il locus A e il locus ignoto in 3 famiglie con la stessa patologia

A4

d

A2

d

STIMA DELLA RELAZIONE TRA DISTANZA GENETICA E FISICA

Stima della distanza genetica totale nella specie umana:

somma della lunghezza totale dei cromosomi ottenuta dalla mappatura genetica attraverso meiosi di origine paterna o materna

= 2644 cM (maschio)

= 4481 cM (femmina)

Per 3000 Mb = 3 x 10 9 bp di genoma

Maschio 1 cM = 1.13 Mb = 1.13 x 106 bp

Femmina 1 cM = 0.67 Mb = 0.67 x 106 bp Media : 1 cM = 0.9 Mb = 0.9 x 106 bp

Il tasso di ricombinazione non è identico lungo il cromosoma

La distribuzione dei ricombinanti lungo il cromosoma non è casuale e dipende dal sesso