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Ing. Sergio Duarte

Ing. Pedro Medina

ESTEQUIOMETRÍA Y CINÉTICA MICROBIANA

Cinética del crecimiento microbiano y de la formación de producto

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Temario3.0 Cinética del crecimiento microbiano y de la formación de producto

3.1 Requisitos para el crecimiento microbiano

3.2 Cuantificación del crecimiento

3.3 Parámetros cinéticos3.3.1 Velocidades volumétricas3.3.2 Velocidades específicas3.3.3 Tiempo de duplicación3.3.4 Grado de duplicación3.3.5 Productividad volumétrica3.3.5 Edad del cultivo3.4 Fases de crecimiento en cultivo por lotes (batch)

3.5 Cinética de la utilización de substrato y de la formación de producto

3.6 Modelos cinéticos3.6.1 Modelos cinéticos para el crecimiento3.6.2 Modelos cinéticos para la formación de producto3.7 Modelado de un cultivo por lotes (batch) simple

3.8 Cinética del decaimiento microbiano

3.9 Relación entre el ambiente y el crecimiento microbiano

3

3.1 Requisitos para el crecimiento microbiano

Los requisitos para el crecimiento microbiano son:

Inóculo viable

Fuente de energía

Medio de cultivo con los nutrientes necesarios

Ausencia de inhibidores

Condiciones ambientales apropiadas.

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El estudio cuantitativo de la cinética microbiana requiere contar con métodos confiables y sencillos para medir el crecimiento de poblaciones.

Las medidas más usadas de la cantidad de microorganismos son el número de células y la masa celular en base seca

(biomasa). Esta última es la más usada desde el punto de vista“ingenieril”.

No existe necesariamente una relación proporcional entre la biomasa y el número de células. Esta relación es más

compleja para los microorganismos que crecen formando agregados o ramificaciones (cultivos miceliales).

En el caso de cultivos miceliales (hongos, actinomicetos), los microorganismos pueden desarrollarse en forma difusa en toda la masa de líquido o en forma discreta adoptando la

forma esférica (pellets).

3.2 Cuantificación del crecimiento

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La biomasa y el número de células que interesan determinar son los correspondientes a los microorganismos activos, aquellos que realmente participan en el bioproceso.

No todos los microorganismos vivos o medidos como viables están realmente activos.

La actividad microbiana se mide por la velocidad para realizar la transformación de interés por cantidad de microorganismos presentes en el sistema considerado (velocidades específicas).

La biomasa que debiera usarse en las ecuaciones que describen y cuantifican procesos microbianos es la “biomasa activa”. En la práctica, se mide la masa celular total y paralelamente se hacen de medidas de viabilidad o

actividad celular.

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Recuento directo de células en celda

Recuento de colonias crecidas en placa

NMP

Medida de peso seco por gravimetría

Nefelometría

Turbidimetría

Correlación entre microorganismos y el nivel de un componente celular (nitrógeno, proteína, ADN, ATP, etc.)

Correlación entre microorganismos y una actividad metabólica (consumo de substrato, formación de producto, emisión de luz, etc.)

Lista parcial métodos para cuantificar el crecimiento de poblaciones microbianas

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3.3 Parámetros cinéticos

Los parámetros definidos en esta sección se refieren básicamente a cultivos en medio líquido “homogéneneos”.

3.3.1 Velocidades volumétricas

Se define como el cambio de un componente por unidad de volumen y de tiempo.

volumenxtiempoicomponenteencambio

ri (17)

t

SrS d

d

trX d

dXt

rP d

dP

rS: velocidad volumétrica de consumo de substrato

rX: velocidad volumétrica de crecimiento microbiano

rP: velocidad volumétrica de formación de producto

(18) (19) (20)

En términos de concentraciones, se pueden expresar:

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3.3.2 Velocidades específicas

tiempoxbiomasa

componenteelencambioespecíficaVelocidad

En términos de concentraciones:

tX

SqS d

d

tXμ

d

Xd

tXPd

dPq

Se denominan también actividades o cocientes metabólicos

Velocidad específica de consumo de substrato:

Velocidad específica de formación de producto:

Velocidad específica de crecimiento:

(21)

(22)

(23)

A partir de la ecuación 23, se puede expresar también como:

t

lnXμ

d

d (24)

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La pendiente de la curva ln X vs t es .

Para cultivos microbianos sin limitaciones en la disponibilidad de substrato, es generalmente constante y corresponde al valor máximo (m) para las condiciones existentes.

El cultivo bajo dichas condiciones sigue una cinética de primer orden. Sigue el comportamiento cinético de una reacción autocatalítica.

El período durante en el cual el crecimiento tiene lugar con constante se denomina fase exponencial o logarítmica,

según se describa el crecimiento en base a X o al ln X. Si es constante, a partir de la ecuación 23 se tiene:

tμX

Xln

0

tμ0 eXX (25) (26)

10

11

3.3.3 Tiempo de duplicación

Se denomina tiempo de duplicación (td ) el intervalo de tiempo que insume duplicar la biomasa. A partir de la ecuación 25 o 26 con X = 2X0 y t = td, se tiene:

μ

2lntd (27)

3.3.4 Grado de duplicación

Es el número de veces n que se duplica una población microbiana en un tiempo dado. Se denomina también número de generaciones.

n

0

2X

X

(28)

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Tipo de organismo td (h)

Bacterias 0,3 – 2,0

Levaduras 1,0 – 4,0

Hongos filamentosos 2,0 – 4,0

Microalgas 18 – 35

Células animales (in vitro) 20 - 40

Tabla 4. Valores típicos de tiempo de duplicación (td)

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3.3.5 Productividad volumétrica

Es un parámetro cinético que se utiliza para evaluar un proceso desde el punto de vista industrial.

volumenxtiempo

producidamasaavolumétricdadProductivi (29)

QX: productividad volumétrica de biomasa

QP: productividad volumétrica de producto

3.3.6 Edad del cultivo

Intervalo de tiempo que transcurre entre la inoculación y un tiempo dado, generalmente cuando el cultivo se interrumpe para usarlo como inóculo u otra aplicación.

tΔ

XΔQX

tΔ

PΔQP (30) (31)

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3.4 Fases de crecimiento en cultivo por lotes (batch)

Fase

I Lag o de retardo

II Aceleración

IIIExponencial (logarítmica), de producción

IV Desaceleración

V Estacionaria

VI Decaimiento o muerte

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ln X

X

rX

Variaciones de X, ln X, y rX con el tiempo

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Crecimiento por lotes (batch) usando dos substratos como fuente de carbono (crecimiento diaúxico)

17

3.5 Cinética de la utilización de substrato y de la formación de producto

La formación de producto y el crecimiento están relacionados con la utilización (consumo) de nutrientes. En esta sección se establecerán las relaciones entre ellos, mediante ecuaciones de balance de materiales.

En base a la ecuación 4, se tiene:

t

S

t

S

t

S

t

S PMG

d

d

d

d

d

d

d

d (32)

Se define velocidad específica de consumo de substrato para mantenimiento celular “m” como:

tiempoxbiomasa

ntomantenimieparasubstratodeconsumom

tX

Sm M

d

dEn términos de concentraciones se expresa:

(33)

(34)

18

Tabla 5. Valores típicos de velocidad específica de consumo de substrato para mantenimiento (m)

Organismo m (g/gh)

Lactobacillus casei 0,135

Aerobacter cloacae 0,094

Saccharomyces cerevisiae 0,036

Penicillium chrysogenum 0,022

Candida utilis 0,170

Azobacter vinelandii 0,15

Klebsiella aerogenes 0,04

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Introduciendo los parámetros cinéticos y los coeficientes de rendimiento en la ecuación 32, se tiene:

X/SY

Xμ

t

S

d

d

P

P

G Y

XqXm

Y

Xμ

t

S

d

d

X/SS Y

μq

P

P

GS Y

qm

Y

μq

PX/S

P/S

GX/S Y

1

Y

Y

μ

m

Y

1

Y

1

(35)

(36)

(37)

(38)

(39)

Definiendo YP/X como el coeficiente de rendimiento de producto por cantidad de biomasa producida, se tiene:

X/S

P/SP/X Y

Y

X

PY

d

dP

P/X

GX/S Y

Y

μ

m

Y

1

Y

1(40) (41)

20

Cuando no hay formación de producto, qp = 0 y las ecuaciones 36, 38 y 39 se pueden expresar:

XmY

Xμ

t

S

G

d

d

mY

μq

GS

μ

m

Y

1

Y

1

GX/S

(45)

(46)

(47)

XμYXμY

YXq P/X

X/S

P/SS P/SP YXq

tP

dd

SqP/SP Yq

μYP/XPq

Para la formación de producto:

(42)

(43)

(44)

Si los consumos de substrato para mantenimiento celular y formación de producto son despreciables, m 0, qP 0, entonces YX/S YG .

21

La relación cinética entre crecimiento y formación de producto depende del papel del producto en el metabolismo microbiano. Según lo expresado en el numeral 2.5 se tiene:

a) Formación de producto asociada al crecimiento (clase 1)

b) Formación de producto parcialmente asociada al crecimiento, cinética mixta (clase 2, situación intermedia entre 1 y 3)

c) Formación de producto no asociada al crecimiento (clase 3).

22

Vel

oci

dad

es e

spec

ífic

as

µ

qS

qP

23

Wang et al. p. 79

24Bailey & Ollis, 2nd. Ed. pp. 422 – 423.

25

26

3.6 Modelos cinéticos

Permiten predecir comportamientos y simular el efecto de variar las condiciones de operación dentro de su rango de validez.

La formulación de un modelo puede ser experimental, teórica o mixta.

Modelos más simples idealizan a la población celular como:

No estructurada

No segregada

Estado de crecimiento balanceado: la composición celular media no se afecta por la proliferación

Representan comportamiento promedio de las poblaciones de células a través de la cuantificación de propiedades del cultivo (tales como X, S, P, , qS, qP).

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3.6.1 Modelos cinéticos para el crecimiento

El modelo cinético más difundido es el propuesto por Monod (1942).

Establece una relación funcional entre y la concentración de un único nutriente esencial “limitante”.

Es un modelo sencillo de dos parámetros.

Se aplica básicamente para el cultivo de un microorganismo que crece formando células aisladas (separadas) sobre un substrato simple y cuando no hay inhibidores del crecimiento.

Modelo flexible, ha mostrado predecir adecuadamente el crecimiento de cultivos que no cumplen totalmente los requisitos anteriores.

Si bien se basa en la forma de las isotermas de adsorción de Langmuir y en la cinética enzimática de Michaelis & Menten, es un modelo de base esencialmente empírica.

28

S

m

KS

Sμμ

(48)

m: es la velocidad específica de crecimiento máxima.

KS: constante de saturación, también llamada constante del modelo de Monod.

= m/2 para S = KS

Generalmente S >> KS y m, ( es constante).

El modelo de Monod se aplica básicamente para la fase de crecimiento exponencial.

Existen modificaciones del modelo de Monod para extender su aplicación a otros casos: inhibición, crecimiento

diáuxico (varios substratos), substrato complejos no definidos, cultivos mixtos, etc.

29

30

31

Tabla 5. Valores típicos de la constante de saturación (KS) del modelo cinético de Monod

Substrato Organismo (género) KS (mg/L)

Glucosa Escherichia 0,07 – 2,0

Glucosa Aspergillus 5,0

Glucosa Saccharomyces 25

Lactosa Escherichia 20

Glicerol Candida 4,5

Oxígeno Candida 0,04 – 0,5

Metanol Pseudomonas 0.7

Fosfato Escherichia 1,6

Mg2+ Klebsiella 0,6

Triptofano Escherichia 0,0005 – 0,001

Arginina Aspergillus 0,5

32

Modelos cinéticos para inhibición por substrato o producto

Modelo para inhibición del crecimiento por alta concentración de substrato (Modelo de Andrews o Haldane).

I

2

S

m

KS

SK

Sμμ

(49)

Modelo para inhibición del crecimiento por alta concentración de producto.

Pf

S

m

KS

Sμμ

a

mP

P1

Pf

PKPePfPK

K

P

P

Pf

(50)

fP puede tener diferentes expresiones y puede usarse también para corregir la ecuación 49 cuando existen ambos tipos de inhibiciones.

(51) (52) (53)

33

34

3.6.2 Modelos cinéticos para la formación de producto

Formación de producto asociado al crecimiento (fermentaciones de clase 1, metabolitos primarios).

μαqP

α es un coeficiente cinético y en particular se demuestra que α = YP/X (ver ecuaciones 40 y 44).

Formación de producto parcialmente asociada al crecimiento (fermentaciones de clase 2, cinética mixta).

Modelo de Leudeking & Piret (1959) de dos parámetros, α y β.

βμαqP

Formación de producto no asociada al crecimiento (fermentaciones de clase 3, metabolitos secundarios)

βqP

(54)

(55)

(56)

35

3.7 Modelado de un cultivo por lotes (batch) simple

XμtX

dd

S/X

00 Y

XXSS

XX)XYSY(K

X)XY(Sμ

tX

0X/S0X/SS

0X/S0m

dd

t

0m

X

X 0X/S0

0X/S0X/SStμX

XX)XY(S

X)XYSY(K

0

dd

Suponemos el cultivo por lotes simple limitado solamente por un substrato y que sigue el modelo cinético de Monod.

De la ecuación 3 se tiene:

(57)

(58)

Introduciendo en la ecuación 57, las ecuaciones 48 y 58:

(59)

(60)

36

tμYS

XXYSln

XYS

YK

X

Xln

XYS

)XYSY(Km

X/S0

0X/S0

0X/S0

X/SS

00X/S0

0X/S0X/SS

(61)

La ecuación 61 da una curva X vs t tipo s para el cultivo microbiano por lotes donde para t , X YX/S S0 + X0 .

Para condiciones en las que KS << S, la ecuación 61 se puede simplificar y aproximar por la ecuación 25,

ln(X/X0) = t, donde = m.

Las ecuaciones 25 y 61 permiten estimar el tiempo de fermentación.

37

3.8 Cinética del decaimiento microbiano

El decaimiento microbiano generalmente es significativo al fin de la fase exponencial, cuando existe agotamiento de

nutrientes.

Sin embargo puede darse también cuando existen condiciones adversas (cambios en las condiciones operativas, acumulación de sustancias inhibidoras, etc.)

El decaimiento microbiano expresado en términos de biomasa puede presentar dos aspectos:

Muerte y lisis celular

Las células consumen su propio material celular de reserva (autoconsumo) y se denomina metabolismo

endógeno.

Ambos se describen usualmente como ecuaciones cinéticas de primer orden.

38

XkXμt

Xd

d

d

kd se denomina velocidad específica de decaimiento microbiano.

Si el proceso es la muerte celular, kd se denomina velocidad específica de muerte.

Si el proceso es el consumo endógeno de biomasa kd se denomina coeficiente endógeno y se denota usualmente ke .

Generalmente, bajo condiciones activas de crecimiento celular, kd es despreciable, kd << .

(62)

39

El resultado exitoso de un bioproceso implica optimizar el “binomio” microorganismo - ambiente.

Los factores ambientales inciden en la cinética y por lo tanto en los parámetros cinéticos.

Los principales factores ambientales son:

Formulación del medio de cultivo Tipo de nutrientes (simples, complejos, naturaleza

química) Solubilidad de los nutrientes, Concentración de nutrientes y otros componentes Tipo de medio (complejo, definido, mínimo)

pH

Temperatura

Concentración de oxígeno disuelto

Actividad de agua

3.8 Relación entre el ambiente y el crecimiento microbiano

40

Medio de cultivo (h-1)

Glucosa y caldo nutriente 1,2

Glucosa y sales minerales 0,82

Acetato y sales minerales 0,52

Succinato y sales minerales 0,14

Velocidad específica de crecimiento de Escherichia coli sobre diferentes tipos de medios de cultivo

Wang et al. p. 85.

41

Para pensar y hacer cuentas

Si en lugar de construir la curva X vs t para un cultivo por lotes se mide concentración celular vs tiempo, ¿qué forma

tendría?

¿Cuál es el significado físico de Pm en la ecuación 51?

¿Cuáles son los valores típicos de para diferentes microorganismos: bacterias, hongos, levaduras, microalgas?

Grafica X vs t para el cultivo por lotes de una bacteria en condiciones ideales. Grafica luego para las siguientes situaciones: a) hay inhibición por alta concentración de substrato, b) hay inhibición por alta concentración de producto, c) existe en el medio de cultivo un inhibidor químico. Idem para P vs t, suponiendo que la formación de producto está asociada al crecimiento.