chloraea crispa, rhizoctonia
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1. INTRODUCCIÓN
La familia de las Orchidaceae, es uno de los grupos de plantas más numerosos del
Reino vegetal, contando con más de 600 géneros y cerca de 17.000 especies, la
mayor parte de las cuales son tropicales. Para Chile se han descrito siete géneros
(HOFFMAN, 1998).
Todas las orquídeas chilenas son geófitas, es decir, crecen en tierra, a excepción
de una especie, en contraposición a las variedades tropicales que en su mayoría
son epifíticas, es decir, que crecen habitualmente sobre los troncos de los árboles,
pero sin extraer su alimento de ellos (HOFFMAN, 1998).
Chloraea crispa, es una orquídea endémica de Chile, que presenta notables
características para su uso como flor de corte, entre ellas destacan altura y duración
después de cosecha (RENDICH 2001 y URIBE 2000).
Por ser una orquídea presenta semillas de muy pequeño tamaño, contienen pocas
reservas de alimento, germinan asociadas a un hongo del género Rhizoctonia la
cual constituye una micorriza, formando una relación de simbiosis (MERSEY,
2003, BATTY, 2002 y MITCHELL, 1989).
En esta especie, se logra identificar todas las etapas de germinación propuestas por
MITCHELL (1989), quien distingue cinco estados durante el proceso, pasando de
semillas que no presentan indicios de germinación, hasta protocormos que toman
un color verde y comienzan a formar la primera hoja.
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MERSEY (2003) indica que se logra obtener un protocormo sobre un medio de agar
avena al 25 % inoculando el medio con Rhizoctonia, en dicho ensayo la formación
de protocormos se obtuvo a 25 ºC y en oscuridad, sin embargo el período de
aclimatización de las plantas fue de alta mortalidad.
Las plántulas crecen en condiciones ideales de temperatura de 18ºC a 22ºC, con
un régimen de luz de 16 horas luz y ocho horas oscuridad (BATTY, 2001 y
MITCHELL,1989). Es de vital importancia que en la etapa de aclimatación se
conserve una alta humedad relativa en torno a las plántulas, de este modo, se evita
la deshidratación producida por el transplante e incentiva la formación de raíces
(HARTMANN y KESTER, 1988).
Los antecedentes de aclimatación son escasos, lo que conlleva a altas pérdidas, por
esta razón, en esta investigación, se han planteado una serie de ensayos para
evaluar diferentes formas de aclimatización. En el primer ensayo, el trasplante se
realiza en las etapas dos y tres descritas por MITCHELL (1998) en un sustrato de
tierra de hoja y perlita, los protocormos son sometidos a tres vías de aclimatación,
las cuales incluyen desde una cámara de crecimiento con temperatura y luz
controlada, hasta la utilización de un sombreadero. En el segundo ensayo, el
trasplante se realiza en la etapa que obtiene mejores resultados del ensayo
anterior, con la mejor vía de aclimatación, pero realizando un cambio en el sustrato,
el cual varía de tierra y perlita a agar avena y arena. El tercer ensayo, se realiza en
la mejor etapa y vía de aclimatación, con sustrato de agar avena y arena sometido a
diferentes métodos de esterilización. El objetivo general fue determinar el efecto de
estos sistemas en la sobrevivencia y crecimiento de las plántulas.
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2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1. Antecedentes de la familia Orquidaceae:
Las características generales de las Orquídeas son las siguientes: Hierbas perennes
de forma muy variables. Las flores son trímeras, hermafroditas, zigomórficas, es
decir, que es una flor irregular que tiene simetría bilateral, provistas de un ginostemo
u órgano específico de las orquídeas, que corresponde a una prolongación del eje
floral y sobre el cual están insertos los estambres. El fruto es una cápsula llena de
numerosas semillas muy pequeñas (HOFFMAN, 1998).
Las semillas de las orquídeas son conocidas usualmente como semillas polvo, ya
que son muy pequeñas y contienen pocas reservas de alimentos (MCKENDRICK,
2000). Se encuentran entre las semillas más pequeñas de todas las plantas con
flores, pesan entre 0,3 y 14 ug, y miden de 0,25 a 1,2 mm en largo y 0,09 a 0,27
en ancho, son producidas en un gran número, los rangos van entre 1.300 a
4.000.000 semillas por cápsulas (ARDITTI, 1967). Las semillas se componen de
una testa muy dura que cubre un embrión de pocas células, las semillas de
orquídeas no poseen endosperma, por lo tanto, prácticamente no tienen material de
almacenamiento que puedan ocupar para su propia germinación y crecimiento
(MITCHELL, 1989).
Usualmente estas semillas no germinan en el medio natural a menos que sean
infectadas por un hongo micorriza, el mismo que abastece a las plantas jóvenes con
azúcares y nutrientes que necesitan hasta que sean lo suficientemente grande para
fabricar su propio alimento (MCKENDRICK, 2000).
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2.1.1. Antecedentes del género Chloraea
El género Chloraea fue determinado por John Lindley en el año 1827, basándose
principalmente en colecciones chilenas (CORREA, 1969).
Las especies integrantes de este género son plantas terrestres que crecen
exclusivamente en América del Sur. Se encuentran sobre todo en lugares húmedos
de las zonas montañosas, pero también en lugares rocosos y arenosos bien
expuestos (CORREA, 1969).
En 1840 Lindley describió un total de 27 especies chilenas y del sur de Argentina
(CORREA, 1969).
2.1.2. Especie Chloraea crispa
CORREA (1996) describe a Chloraea crispa como una planta robusta de 40- 70 cm
de alto. Hojas de 15 cm de largo por 23 cm de ancho aproximadamente,
lanceoladas, dispuestas en roseta basal y casi secas al momento de la antesis,
Inflorescencia pauciflora de flores grandes, blancas y vistosas (Figura 1).
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FIGURA 1. Flor e inflorescencia de Chloraea crispa.
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Según CORREA (1969) Chloraea crispa ha sido descrita en Chile entre Concepción
y Valdivia, en terrenos abiertos arenosos. Florece de octubre a enero y es una de
las más hermosas del género, junto con Chloraea bletioides y Chloraea gavilu.
Según URIBE (2000), Chloraea crispa presenta características en su inflorescencia,
que potenciaría su cultivo para ser desarrollada como un producto comercial en el
mercado de las flores de corte. Entre estas características se mencionan:
• Buena producción de botones por inflorescencia, 10 de ellos como mínimo.
• Buena apertura de flores, produciéndose tan sólo el aborto de un botón apical, lo
cual es una característica deseada por tratarse de una inflorescencia única por
planta.
• Buena duración de la inflorescencia, con un número alto de flores abiertas en
forma simultánea (nueve flores como mínimo).
• Altura de vara floral de 90 cm, siendo además muy firme.
RENDICH (2001) y URIBE (2000) señalan que a pesar de las sobresalientes
características de la especie para usarla como flor de corte, presenta el
inconveniente de florecer cada dos temporadas.
Según URIBE (2000) el ciclo fenológico de la planta se extiende por 10 meses y dos
semanas. De los cuales cinco meses corresponden a desarrollo vegetativo, cuatro
meses y una semana para el desarrollo reproductivo y un mes para la senescencia
de ésta.
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2.2. Métodos de propagación:
Mediante la germinación in vitro, se reproducen semillas en frascos de vidrio o
plástico, sobre un medio de agar nutritivo que contiene los azúcares y minerales
necesarios para que las semillas germinen y crezcan. Hay dos tipos de germinación
in vitro: simbiótica y no simbiótica (MCKENDRICK, 2000). Las diferencias entre
cultivo simbiótico y asimbiótico, están directamente relacionadas a la presencia del
hongo micorriza en el cultivo (MITCHELL, 1989).
En la germinación simbiótica, las semillas se siembran con una pequeña porción del
hongo micorriza apropiado, perteneciente en este caso al género Rhizoctonia. El
hongo crece en el medio, coloniza a las semillas en el proceso de germinación, se
origina una relación simbiótica que se espera que alimente al protocormo hasta que
este produzca hojas y se vuelva autotrófico. Esta técnica, es ampliamente usada
para la propagación de orquídeas terrestres de zonas templadas. Tiene la ventaja
de usar un medio simple (uno de los más comúnmente usados consiste en avena
polvo con una pequeña cantidad de extracto de levadura), y como resultados las
plantas micorrizadas suelen ser más fuertes y resistentes a infecciones que sus
contrapartes cultivadas asimbióticamente. Sin embargo, la desventaja es que se
necesita seleccionar el tipo de hongo micorriza adecuado para que se origine la
simbiosis y prevenir parasitismo y la consecuente muerte de las semillas
(MCKENDRICK, 2000).
Uno de los mejores medios utilizados para la germinación simbiótica de las semillas
de orquídeas es el avena básica al 25% recomendado por CLEMENTS et al.
(1986). Este medio ha dado consistentes resultados durante varios años, pero
puede ser fácilmente enriquecido o agotado según lo requerido, dependiendo del
vigor del aislado fúngico (MITCHELL, 1989).
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La germinación asimbiótica es usualmente usada en la propagación de orquídeas
tropicales, las mismas que tienden a crecer fácilmente en comparación con sus
parientes provenientes de zonas templadas.
El medio usado para la germinación asimbiótica es más complejo que para la
germinación simbiótica, ya que todos los nutrientes orgánicos e inorgánicos y los
azúcares deben estar disponibles para la orquídea en una forma apropiada, puesto
que ya no existe la intermediación del hongo (MCKENDRICK, 2000).
2.2.1. Recolección y desinfección de las semillas
Las semillas pueden ser colectadas a partir de cápsulas verdes o cápsulas
maduras. Una cápsula verde que está madurando, y está lista para ser sembrada,
se encuentra llena de semillas y no se deforma cuando se aprieta con las pinzas
(MCKENDRICK, 2000).
Se pueden sembrar semillas a partir de cápsulas verdes o a partir de semillas
secas. Si se realiza la siembra a partir de cápsulas verdes, se debe esterilizar la
parte exterior de las mismas, donde hongos y bacterias pueden desarrollarse, y se
abre la cápsula en condiciones estériles. La ventaja de este método es que no
requiere la esterilización de las semillas, lo que podría provocar su deterioro
(MCKENDRICK, 2000). Sin embargo, el método más usual es remover las semillas
del fruto maduro cuando la dehiscencia se efectúa en forma natural y se les trata
con un desinfectante, como peróxido de hidrógeno, o hipoclorito de calcio o de
sodio diluido a una concentración de 0.5% hasta 5% (BATTY, 2001, MITCHELL,
1989, HARTMANN Y KESTER, 1988).
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Para que el contacto entre la semilla y el desinfectante sea completo, se debe
agregar un detergente a la solución (MCKENDRICK, 2000, MITCHELL, 1989).
El tiempo de esterilización varía dependiendo de la especie, del tiempo de
maduración, luego que la semillas es colectada, de las condiciones climáticas al
momento de la colección, de los métodos de secado y almacenamiento
(MCKENDRICK, 2000). MITCHELL (1989) informa haber esterilizado semillas con
hipoclorito de calcio durante tres a cinco minutos.
MERSEY (2003), sin embargo, indica que la desinfección, no es necesaria si el
hongo micorriza adecuado está presente en el sustrato de siembra, sin embargo, la
cantidad de semillas germinadas mediante cultivos simbióticos es mayor cuando
estas son desinfectadas.
Para realizar la esterilización de las semillas de orquídeas existen diferentes
métodos, entre ellos: método de la jeringa, método del tubo y método del paquete.
El método del tubo planteado por BATTY (2001), consiste en desinfectar las
semillas dentro de un tubo y realizar el enjuague dentro de este mismo (Anexo 1).
Para el método de la jeringa, la desinfección y enjuague de las semillas se realiza
dentro de una jeringa (Anexo 2). Tiene como ventaja que su realización se puede
llevar a cabo en un medio abierto no estéril, sin embargo, para realizar la posterior
siembra de las semillas se requiere de un medio estéril (BATTY, 2001).
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En el método del paquete planteado por MITCHELL (1989), las semillas son
envueltas dentro de un papel filtro, el cuál es introducido a la solución desinfectante.
La mayor ventaja de este método, es la baja manipulación de las semillas, sin
embargo, se necesitan dosis altas de esterilizantes y detergente para que la
solución desinfectante penetre el papel (Anexo 3).
2.2.2. Siembra de las semillas
Antes de la siembra de las semillas en las placas petri en un medio de agar avena,
es necesario la inoculación del hongo micorriza apropiado. La inoculación del
hongo en las placas, se realiza desde un aislado del hongo, el cual se obtiene de
plantas de la misma especie. Las placas petri por lo tanto son inoculadas con el
hongo a través de un pequeño cubo de agar que contiene el hongo libre de toda
contaminación. La siembra de las semillas ya desinfectadas se realizará una vez
que el hongo infecte por completo la placa (BATTY, 2001).
MCKENDRICK (2000), indica que después de la siembra los frascos, deben
taparse con papel celofán estériles o “cling-film” para evitar la contaminación de las
placas. Una vez que el hongo invade el interior del embrión de la semilla, se
produce la germinación y formación de una masa indiferenciada de célula llamada
protocormo. Es de vital importancia que la relación orquídea- hongo se conserve
durante los estados tempranos del ciclo de vida de la planta ya que el protocormo
enterrado no puede fabricar alimento por sí mismo.
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Según MITCHELL (1989) en el proceso de germinación de las orquídeas existen
cinco etapas bien definidas (Anexo 4).
• Etapa 0: no se presentan indicios de germinación en las semillas.
• Etapa 1: crecimiento del embrión y ruptura de la testa.
• Etapa 2: comienza el crecimiento del protocormo y las raíces.
• Etapa 3: el protocormo crece rápidamente y hay desarrollo de un brote.
• Etapa 4: los protocormos toman un color verde y comienzan a formar la primera
hoja, el tiempo que demora en llegar a esta etapa es de dos meses
aproximadamente.
La etapa 3 según MITCHELL (1989) es el mejor estado para la transferencia a un
nuevo medio.
Las placas de germinación deben ser iniciadas tres meses antes del comienzo de la
estación de crecimiento, de modo que las plantas del semillero estén listas para
transferirse al invernadero, durante los meses más fríos del año, para compatibilizar
el crecimiento del semillero con la fase natural de crecimiento ( BATTY y BRUNDET,
2001).
2.3. Transplante de las plántulas:
La etapa de trasplante abarca la transferencia de la plántula del medio aséptico de
cultivo al medio de vida natural en el invernadero y luego en su sitio final. Para que
pueda sobrevivir debe pasar por un período de aclimatación.
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Por tanto, se deben volver autótrofas, tienen que desarrollar raíces, brotes
funcionales y aumentar la resistencia a la desecación y al ataque de organismos
patógenos ( HARTMANN Y KESTER, 1988).
Según BATTY y BRUNDET (2001) los protocormos deben ser transferidos en etapa
3 y 4, desde las placas de crecimiento a recipientes de policarbonato de 60 mm de
alto por 100 mm de ancho con una capa de arena/agar. El recipiente de crecimiento
de los protocormos, deberá ser incubado a 22ºC con un régimen de 16 horas luz y
ocho horas oscuridad. Según MCKENDRICK (2000) las plantas crecen 4 cm bajo
tubos fluorescentes de 20 watts en un cuarto de crecimiento regulado a 18ºC con
igual régimen de luz.
Seguido por la incubación en recipientes por tres meses, éstos pueden ser pasados
a invernaderos por una semana previo a la remoción de la tapa. Las plántulas son
endurecidas por cinco días antes de la transferencia al suelo.
Según HARTMANN y KESTER (1988) durante el período inicial que sigue al
transplante, son esenciales varias condiciones ambientales, entre ellas:
• El mantenimiento elevado de la humedad relativa durante dos a tres semanas,
para proteger la planta de la desecación y permitir que inicie nuevas raíces y
brotes.
• El segundo requerimiento, es un medio que permita un rápido enraizamiento, por
lo tanto debe ser aireado y poseer buen drenaje.
• Un tercero, es la protección contra diversos organismos patógenos hasta que haya
adquirido resistencia.
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• El cuarto factor, es el control del crecimiento durante el trasplante para superar el
letargo o falta de crecimiento resultante.
• La fluctuación de temperatura entre el día y la noche y entre día y día es crucial.
Las plantas que se desarrollan bajo temperaturas uniformes, no crecen ni florecen
bien como las que crecen bajo un régimen de temperaturas fluctuantes entre el día
y la noche (WHITE, 1996 citado por RENDICH, 2001).
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3. MATERIALES Y MÉTODO
3.1. Ubicación del ensayo:
Esta investigación, se realizó en la estación experimental “La Palma”, perteneciente
a la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, ubicada en la Provincia de
Quillota, V Región , Chile, entre el período de agosto 2003 y agosto 2004.
Para alcanzar los objetivos propuestos, se realizaron tres ensayos. En el primer
ensayo, se trasplantaron los protocormos en las etapa 2 y 3 descritas por
MITCHELL (1989) en bandejas de cepellones con tierra de hoja y perlita y tres vías
de aclimatación, que incluyen desde el uso de cámara de crecimiento hasta un
sombreadero. En el segundo ensayo, el trasplante se realizó en la etapa 3 descrita
por MITCHELL (1989) en recipientes de plástico transparente con agar avena y
arena sin autoclavar, en este ensayo, se utilizó una vía de aclimatación. Finalmente
en el ensayo tres, los protocormos fueron trasplantados en forma individual, en
etapa 3 descrita por MITCHELL (1989) en tubos de vidrio con agar avena y arena
autoclavada y se realizó un tipo de aclimatación.
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3.2. Material utilizado:
3.2.1. Material vegetal
El material utilizado correspondió a semillas de Chloraea crispa. Dichas semillas
fueron recolectadas el 2002 en la localidad de Yumbel, VIII Región, siendo
almacenadas por siete meses a 4ºC.
3.2.2. Hongo utilizado
Para la micorrización de estas semillas, se empleó la selección denominado MN3,
una especie del género Rhizoctonia que fue probado por MERSEY (2002).
El hongo utilizado, proviene de orquídeas nativas de Chloraea crispa, de la
localidad de Yumbel, VIII Región, el cuál fue aislado en un comienzo en la
Universidad de Concepción ( MERSEY, 2002).
3.3. Preparación de las placas:
El medio nutritivo utilizado en las placas, se preparó en base a agar avena al 25%,
para ello en un vaso precipitado se añadieron 1000 ml de agua destilada y 25 g de
avena (producto comercial Avena Quaquer), se calentaron y agitaron durante 20
minutos a 40ºC más menos 5 ºC en un agitador magnético (modelo ANC500).
Luego la solución, se filtró con una gasa sobre otro vaso precipitado.
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A la solución resultante, se le agregaron 8 g de agar común (agar agar
bacteriológico, fabricado por Algamar), una vez que la solución se entibió, se le
agregó el agar. La solución final se calentó y agitó hasta inicio de ebullición. Se
esperó que la solución se entibiara y luego se midió el pH ajustándolo a 5,5 con
HCL al 0,1%.
Posteriormente para esterilizar el medio de cultivo, los 1000 ml se distribuyeron en
cuatro matraces de 250 ml, los cuales fueron autoclavados por 20 minutos tapados
con algodón y papel aluminio (Anexo 5).
Terminado el período de esterilización, los matraces fueron llevados a la campana
de flujo laminar, y el medio fue traspasado a placas de petri plásticas estériles (de 5
cm de diámetro), las cuales fueron envueltas en papel estéril y llevadas a
refrigerador por seis días.
Al séptimo día, las placas fueron inoculadas con el hongo NM3, esto se realizó en
un medio estéril bajo la campana de flujo laminar, de modo de reducir la
contaminación de las placas. En seguida fueron selladas con parafilm y llevadas a
incubadora a 25ºC. El hongo al cabo de siete días cubrió por completo la placa .
3.4. Desinfección y siembras de las semillas:
La desinfección de las semillas, se llevó a cabo utilizando el producto comercial
Clorinda, el cuál posee una concentración de hipoclorito de sodio de un 5%.
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Para preparar la solución desinfectante, se diluyeron 20 ml de Clorinda en 80 ml de
agua destilada esterilizada, resultando una concentración final de 1% de hipoclorito
de sodio.
Las semillas fueron sacadas de la cámara a 4ºC, pesando conjuntos de 0,5 mg más
menos 0,1 mg en una balanza de precisión, y luego fueron desinfectadas con la
solución al 1% de Hipoclorito de sodio más dos gotas de Tween 80 (humectante),
durante tres minutos a través del método del tubo planteado por BATTY (2001) y
según las observaciones hechas por MERSEY (2002).
Dos semanas después de la inoculación, las placas que no mostraban
contaminación fueron sembradas con 0.5 mg de semillas de Chloraea crispa. Una
vez sembradas las semillas en las placas estas fueron selladas con parafilm y
puestas nuevamente en la incubadora a 25ºC (Figura 2).
Un mes después de la siembra, se realizó el traspaso (repique) de las semillas que
se encontraban al menos en la etapa 1 de germinación descrita por MITCHELL
(1989). Las semillas fueron repicadas en forma individual, mediante una pinza de
laboratorio a nuevas placas con agar avena no inoculadas, fueron selladas y
puestas en cámara de crecimiento a 25ºC, de esta forma, se logra el repique
solamente de semillas germinadas y no de un conjunto de semillas.
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A B
C D
FIGURA 2. Pasos de la siembras de semillas de orquídeas. A: desinfección realizada a las semillas en tubos eppendorf, B: placa de petri con el hongo inoculado, C: siembra de las semillas y finalmente en D se observan los protocormos obtenidos de las semillas germinadas.
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3.5. Trasplante y aclimatación de las plántulas:
En esta etapa, se realizaron tres ensayo para evaluar estados de trasplante y vías
de aclimatación de las plantas. Es necesario señalar que los ensayos se realizaron
en períodos consecutivos y se adecuaron al resultado anterior.
3.5.1.Ensayo 1: Evaluación de dos etapas de trasplantes y tres aclimataciones
El trasplante, se realizó en noviembre con los protocormos en los estados 2 y 3
descritos por MITCHELL (1989) para germinación de orquídeas, los cuales se
sometieron a tres aclimataciones (ANEXO 6).
• La primera vía de aclimatación fue desde cámara de crecimiento, en que los
protocormos se encontraban en oscuridad a 25ºC, a una cámara bioclimática
programada con 16 horas luz y ocho horas oscuridad y a una temperatura de
16ºC la mínima y 22ºC la máxima, por dos semanas. Posteriormente, se
trasladaron por dos semanas a una habitación ambiente, en este caso se trata del
Laboratorio de Plantas Medicinales de la Facultad y finalmente pasaron al
sombreadero del Área de Flores del la misma Facultad.
• Una segunda vía de aclimatación, fue desde la cámara de crecimiento a la cámara
bioclimática por dos semanas y finalmente a una habitación ambiente.
• La tercera vía de aclimatación, fue desde la cámara de crecimiento, luego a una
habitación ambiente por dos semanas y finalmente a sombreadero.
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Para el trasplante, se utilizaron los protocormos que se encontraban en la etapa 2
comienza el crecimiento del protocormo y las raíces. En la etapa 3 el protocormo
crece rápidamente y hay desarrollo de un brote, determinada en forma visual, para
ello se tomó el protocormo con pinzas de laboratorios y fueron trasplantadas a
bandejas de cepellones con cavidades de 16 cc, en un sustrato de tierra de hoja
esterilizada y perlita con una proporción de 1:1. La bandeja de siembra se dispuso
dentro de una caja de plástico transparente, cuyo fin, es mantener la humedad en el
interior y evitar de esta forma la deshidratación de los protocormos en los primeros
días después del trasplante, también tiene como finalidad el aislamiento de los
protocormos disminuyendo la contaminación en el interior.
La bandeja de siembra y la caja de plástico fueron desinfectadas con el producto
comercial Clorinda. El transplante, se realizó en un ambiente no estéril, sin
embargo, se tomó la precaución de desinfectar los implementos utilizados, mesa y
manos con alcohol al 95% (Figura 3).
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FIGURA 3. Bandeja de siembra en caja de plástico y altura en la base entre estas para permitir el drenaje.
1 cm
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En la base de la caja, se realizaron seis orificios, distribuidos equitativamente y que
tuvieron por finalidad permitir la hidratación de los protocormos por infiltración
desde la base, de esta forma, se realizó el riego sin la necesidad de abrir la caja,
manteniendo el aislamiento (Figura 4). Entre la bandeja de siembra y el fondo de la
caja de plástico, quedaron entre 1 y 2 cm de altura de manera de permitir el
drenaje una vez que se realizó la hidratación. Se utilizó una bandeja de aluminio
para el riego, en la cual se agregó el agua y poniendo luego la caja de plástico en
su interior, el nivel de agua de la bandeja de aluminio, debió ser el suficiente para
permitir el contacto del sustrato con el agua, de esta forma, se realizó el riego por
capilaridad. Para determinar la frecuencia del riego, se tuvo como referencia el
color del sustrato, el sustrato húmedo posee un color negro y cuando disminuye el
contenido de agua se torna café claro, en ese momento se le proporcionó agua. El
tiempo de riego, se determinó una vez que la superficie se encontró nuevamente de
color negro, luego se eliminó el exceso de agua de las bandejas por los orificios de
drenaje.
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FIGURA 4. Bandeja de aluminio para implementar el método de riego por infiltración.
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En este ensayo, se utilizaron 360 protocormos, de los cuales 180 se encontraban en
etapa 2 y 180 en etapa 3.
Los protocormos en estado 2 y 3 se distribuyeron respectivamente en nueve cajas
de plástico con la bandeja de siembra, se trasplantaron 20 protocormos en cada
unidad de siembra.
En la etapa de aclimatación en condiciones ambientales, se realizaron en las cajas
pequeños orificios en la parte superior. Cada mes, se realizó un orificio por caja.
Las cajas permanecieron cerradas hasta el término del verano, para evitar la
deshidratación de las plantas, en el mes de abril, se abrieron parcialmente las cajas
y finalmente en el mes de mayo, se abrieron completamente.
Las evaluaciones que se realizaron en este ensayo, correspondió al porcentaje de
sobrevivencia de los protocormos al trasplante y al porcentaje de protocormos que
llegaron a formar clorofila, lo cual, se determinó en forma visual por la aparición del
color verde.
El ensayo se condujo como un modelo factorial, con un diseño completamente al
azar con dos factores.
Factor 1: con tres niveles: * aclimatación 1 (cámara de crecimiento- cámara bio-
climática- habitación ambiente-sombreadero)
* aclimatación 2 (cámara de crecimiento- cámara bio-
climática- habitación ambiente)
*aclimatación 3 (cámara de crecimiento- habitación
ambiente- sombreadero)
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Factor 2: con dos niveles: * trasplante en estado 2 de crecimiento para semillas de
orquídeas descrito por MITCHELL (1989).
* trasplante en estado 3 de crecimiento para semillas de
orquídeas descrito por MITCHELL (1989).
El ensayo tuvo seis tratamientos con tres repeticiones cada uno, la unidad
experimental estuvo constituida por un grupo de 20 plantas.
Para determinar el efecto de los tratamientos, se realizó un análisis de varianza.
Posteriormente, si hubo efecto de algún tratamiento, se aplicó un test de separación
de medias de Tukey con 95 % de confiabilidad, para identificar diferencia (s) en los
tratamientos.
3.5.2. Ensayo 2: Trasplante realizado en etapa 3 , aclimatación 2 y sustrato de agar
avena y arena
En este ensayo, se usó el estado tres de trasplante que corresponde a un
crecimiento rápido del protocormo con el desarrollo de un brote (MITCHELL, 1989) y
se realizó aclimatación en conjunto de 20 protocormos empleando arena entre el
medio de agar avena y el protocormo. El material utilizado, correspondió al mismo
del ensayo anterior, la forma de preparación de placas y la desinfección de las
semillas se repite en este ensayo.
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Para el trasplante, realizado en febrero del 2004, se utilizaron las semillas que se
encontraban en la etapa adecuada, determinada en forma visual, para ello, se tomó
el protocormo con pinzas de laboratorios y fueron transplantadas a recipientes de
plástico transparente de 7 cm de diámetro y 10 cm de alto. El sustrato utilizado
correspondió a 1 cm de agar avena y 0,5 cm de arena.
La preparación del agar, correspondió al mismo descrito en el primer ensayo. Para
desinfectar la arena se hirvió durante cinco minutos en abundante agua. Los
recipientes fueron preparados en una cámara de flujo laminar, con mechero, para
proporcionar un ambiente aséptico y disminuir de esta forma la contaminación.
Los recipientes con los protocormos trasplantados, fueron llevados a una cámara
bioclimática con una temperatura constante de 16ºC la mínima y 22ºC la máxima, y
con un fotoperíodo de 16 horas luz y ocho horas oscuridad.
La hidratación de las plántulas, se realizó mediante un pequeño agujero realizado
con una jeringa y con esta misma se proporcionó el agua, de esta forma se evitó la
apertura de los recipientes.
3.5.3. Ensayo 3: Trasplante realizado en etapa 3 de desarrollo, aclimatación 2 y
sustrato de agar avena y arena con dos diferentes métodos de esterilización
El material vegetal fue el mismo mencionado anteriormente al igual que la
preparación de las placas.
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Se trasplantaron 50 protocormos en la etapa 3 descrita por MITCHELL (1998), en
frascos de vidrio de 1 cm de diámetro y 5 cm de alto, estos poseían de sustrato
agar avena y arena.
El ensayo se dividió en tratamientos originados en la forma de esterilización del
sustrato.
TRATAMIENTO 1 (25 tubos) TRATAMIENTO 2 (25 tubos)
cuatro días
cuatro días
Preparación de agar avena y vaciado en tubos (1 cm c/u)
Sellados de los tubos con papel aluminio
Envueltos en papel de diario y autoclavados por 20 minutos a 121 ºC
Preparación de agar avena y autoclavada en matraces de 250 ml por 20 minutos a 121ºC.
Esterilización de los tubos y papel aluminio
El agar es vaciado a los tubos en una cámara de flujo laminar (1cm). Sellado de los tubos con papel aluminio
Se abren los tubos bajo una cámara de flujo laminar, se agregan 0,5 cm de arena autoclavada con anterioridad 2 veces por 20 minutos a 121ºC.
Hidratación de la arena y trasplante de los protocormos en estado 3
Sellado de los tubos
28
Los 50 tubos, se llevaron a una cámara bioclamática, con una temperatura
constante de 16ºC la mínima y 22ºC la máxima y un fotoperíodo de 16 horas luz y
ocho horas oscuridad.
El trasplante, se realizó las primeras semanas de marzo del 2004 y se llevó a cabo
bajo condiciones asépticas en una cámara de flujo laminar.
Los protocormos, se mantuvieron dentro de la cámara bioclimática hasta la
formación de la primera hoja, 45 días después fueron nuevamente trasplantados,
esta vez a macetas de tamaño Nº5 (aproximadamente 100 cc) , con un sustrato de
tierra de hoja y perlita, autoclavada por 40 minutos a 121ºC, este segundo
trasplante, se realizó bajo condiciones ambientales, sin descuidar la desinfección de
pinzas, mesa, manos con alcohol 95% y el lavado de los maceteros con el producto
comercial Clorinda.
Una vez realizado el trasplante a los maceteros, estos fueron llevados a una
habitación con temperatura ambiente, en este caso nuevamente se utilizó el
Laboratorio de Plantas Medicinales de la Facultad. Cuando las plantas formaron la
3ª hoja, aproximadamente 60 días después, fueron llevadas al invernadero del Área
de Flores de la Facultad.
Las evaluaciones que se realizaron en este ensayo, correspondieron al porcentaje
de sobrevivencia de los protocormos al trasplante, porcentajes de protocormos que
formaron al menos una hoja, altura de las plántulas, y número de hojas de las
plántulas.
29
El ensayo se condujo como un diseño completamente al azar con dos tratamientos
(diferentes métodos de esterilización) y cinco repeticiones por tratamiento, la unidad
experimental estuvo constituida por una planta.
Para determinar el efecto de los tratamientos se realizó un análisis de varianza,
posteriormente cuando hubo efecto de algún tratamiento se aplicó un test de
separación de medias de Tukey con 95 % de confiabilidad, para identificar diferencia
(s).
30
4. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1. Resultados ensayo 1: Evaluación de dos etapas de trasplantes y tres vías de
aclimatación:
En la Figura cinco se visualiza el porcentaje de sobrevivencia de los protocormos al
trasplante, realizados en los estados 2 y 3 descritos por MITCHELL (1989) para la
germinación de orquídeas, utilizando la aclimatación 1, cámara de crecimiento-
cámara bioclimática- habitación ambiente- sombreadero, aclimatación 2, cámara de
crecimiento – cámara bioclimática- habitación ambiente, y aclimatación 3, cámara
de crecimiento- habitación ambiente- sombreadero. El trasplante se realizó la última
semana de noviembre del 2003.
Sólo la aclimatación 2, cámara de crecimiento- cámara bioclimática- habitación
ambiente, permitió la sobrevivencia de los protocormos por 90 días
aproximadamente. El Cuadro 1 detalla la sobrevivencia de los protocormos en
estado 2 y 3 para la aclimatación 2. Las vías de aclimatación 1 y 3 no se utilizaron
en el modelo estadístico por no presentar sobrevivencia al trasplante.
31
0
20
40
60
80
100
120
0 30 60 90 120 150días post trasplante
% d
e so
brev
iven
cia
estado 2, vía 1estado 2, vía 2estado 2, vía3estado 3, vía 1estado 3, vía 2estado 3, vía 3
FIGURA 5. Porcentaje de sobrevivencia de los protocormos trasplantados en dos estados de desarrollo. Sólo se observan tres líneas debido a que los protocormos aclimatados por la vía uno y tres ( en ambos estados de trasplante dos y tres ) presenta la misma curva de sobrevivencia, a los 30 días de trasplante la sobrevivencia es nula.
32
CUADRO 1. Porcentaje de sobrevivencia de protocormos en dos estados de desarrollo al momento del trasplante, evaluado en cuatro fechas. Aclimatados en la secuencia: cámara de crecimiento, cámara bioclimática, habitación.
Protocormos 30 días 60 días 90 días 120 días
Estado 2 75,0 a 48,3 b 26,6 a 1,7 a
Estado 3 83,3 a 75,0 a 46,6 a 5,0 a
Promedios con letras distintas en cada columna presentan diferencias significativas al nivel de probabilidad p=0.05 según Test de Tukey.
Los estados 2 y 3 de desarrollo, presentaron similares porcentajes de sobrevivencia
al trasplante en la aclimatación 2, cámara de crecimiento – cámara bioclimática-
habitación ambiente. Sin embargo, existió diferencia significativa a los 60 días post-
transplante. Ambos estados no fueron exitosos en la sobrevivencia de protocormos
evaluados durante 120 días.
En la Figura 6, se observa el porcentaje de formación de clorofila de los
protocormos transplantados en estado 2 y 3 de desarrollo, en esta ocasión se
eliminó la aclimatación 1, cámara de crecimiento- cámara bioclimática- habitación
ambiente- sombreadero y la aclimatación 3, cámara de crecimiento- habitación
ambiente- sombreadero, por no resultar exitosas para la sobrevivencia.
Los protocormos trasplantados en estado 3 de crecimiento, fueron capaces de
formar clorofila a diferencia de los protocormos en estado 2 de desarrollo. En el
estado 3 los protocormos son capaces de evolucionar a otro estado de desarrollo,
sin embargo, los protocormos que lograron la formación de clorofila no sobrevivieron
en el tiempo (Figura 7 ).
33
La formación de clorofila en los protocormos trasplantados en etapa 3, a diferencia
de los protocormos trasplantados en etapa 2, se debió a que los primeros se
encontraban con el crecimiento de un brote al momento en que fueron
trasplantados. En un comienzo los protocormos se encontraban en la cámara de
crecimiento, la cual permaneció en oscuridad y con una temperatura constante de
25ºC. Luego del trasplante, los protocormos fueron sometidos a un régimen 16
horas luz y ocho horas oscuridad, con temperatura entre 16 y 22ºC. El estímulo de
luz provocó la formación de clorofila en los brotes de los protocormos trasplantados
en la etapa 3. Los protocormos en trasplantados en etapa 2 no lograron la
formación de brote ni de clorofila.
34
0
5
10
15
20
25
30
35
30 60 90 120
días
% fo
rmac
ión
de c
loro
fila
Estado 2Estado 3
FIGURA 6. Porcentaje de protocormos que llegaron a formar clorofila (color verde) trasplantados en estado 2 y 3 de crecimiento descritos por MITCHELL (1989) sometidos a aclimatización (cámara de crecimiento- cámara bioclimática -habitación a temperatura ambiente)
35
A
B
FIGURA 7. A: Protocormos trasplantados en estado 3 de desarrollo descrito por MITCHELL (1989) aclimatados mediante la vía dos ( cámara de crecimiento- cámara bioclimática- habitación ambiente). B: Formación de la primera hoja, obtenido de protocormos trasplantados en etapa 3 y con la vía dos de aclimatización.
36
Es interesante destacar, que aunque no se observó sobrevivencia de los
protocormos luego de 120 días transcurrido el trasplante, los protocormos utilizados
en la etapa 3 presentaron formación de clorofila, con lo cual, se podría decir que el
estado 3 es el que presentó mejores resultados al trasplante. Esto concuerda con
lo propuesto por MITCHELL (1989) quien indica que la etapa 3 es el estado
óptimo de trasplante a una nuevo sustrato.
La nula sobrevivencia de los protocormos a los 120 días, se pudo deber a la época
de trasplante, por consiguiente a la temperatura y luminosidad. El trasplante de los
protocormos desde las placas, se realizó a finales del mes de noviembre, aún
cuando BATTY (2001) y MCKENDRICK (2002) aconsejan el trasplante en la época
de crecimiento normal de la especie, en este caso corresponde a los meses de
invierno.
El trasplante de los protocormos no se realizó en la época óptima debido a la fecha
en que se llevó a cabo la investigación. Por lo tanto eso pudo haber sido lo que
gatilló la muerte de los protocormos, ya que el trasplante, se realizó en noviembre
época en la cual las condiciones ambientales no son las apropiadas. Temperaturas
registradas en la Estación Climatológica de Quillota, muestran máximas de hasta
33ºC en el mes de noviembre del año 2003 (Anexo 7), la habitación a la cual fueron
llevados los protocormos presentó temperaturas entre 5-7ºC menos que las
máximas registradas por la Estación climatológica, y el sombreadero a su vez
presentó temperaturas 2-4 ºC menos en relación a las temperaturas máximas de la
Estación. Los protocormos pasaron por lo tanto en pocos días de temperaturas de
16-22ºC ( temperatura de la cámara bioclimática) a temperaturas de hasta 31ºC
(sombreadero).
37
Otra posible causa de la pérdida de protocormos, pudo ser el sustrato utilizado, los
protocormos en las placas de petri se encontraban con agar avena y fueron
trasplantados a tierra y perlita en relación 1:1, los protocormos trasplantados en las
etapas 2 y 3 de desarrollo no presentaban crecimiento de raíces, por lo tanto el
protocormo no logró fabricar alimento por sí mismo y dependió de la relación
simbiótica con el hongo micorriza, sin embargo, el hongo no encontró en el sustrato
una fuente rica en carbono, impidiendo de esta forma que la relación orquídea -
hongo se mantuviera en el tiempo (SMITH, 1966 y RASMUSSEN, 1995).
4.2. Resultados ensayo 2: Trasplante realizado en etapa 3 de desarrollo,
aclimatación 2 y sustrato de agar avena y arena.
El trasplante de los protocormos desde las placas de petri a los recipientes de
plástico con agar avena y arena se realizó en febrero del 2004, sin embargo a los
14 días del trasplante no se observó sobrevivencia de protocormos, esto se debió a
una alta contaminación, a pesar que al séptimo día a partir del trasplante la
totalidad de los protocormos presentaban clorofila.
La contaminación, se debió probablemente a que la arena que se utilizó, se sometió
a un proceso sencillo de esterilización, no autoclavada, en conjunto con la cantidad
de protocormos trasplantados a un mismo recipiente, lo que provocó una
contaminación en cadena, perdiendo en pocos días todos los protocormos.
38
4.3. Resultados ensayo 3: Trasplante realizado en etapa 3 de desarrollo,
aclimatación 2 y sustrato de agar avena y arena con dos métodos de
esterilización:
El trasplante desde las placas de petri a los tubos de vidrio, se realizó en marzo del
2004, 45 días después, se realizó el trasplante desde los tubos de vidrio a los
maceteros (Figura 8 y 9).
En el Cuadro 2, se observa la sobrevivencia de protocormos al trasplante. El
trasplante se realizó en el estado 3 de desarrollo descrito por MITCHELL (1989). Se
evaluó dos tratamientos de esterilización, en el tratamiento 1, el agar se autoclavó
en los tubos de vidrio que posteriormente fueron utilizados para el trasplante, y el
tratamiento 2 de esterilización, en que el agar se autoclavó independiente de los
tubos de vidrio y éstos se esterilizaron en forma separada.
CUADRO 2. Sobrevivencia de los protocormos en estado 3 al trasplante, con dos tratamientos de esterilización del medio.
30 días 60 días 90 días 120 días
Tratamiento 1 80 a 44 b 32 a 24 a
Tratamiento 2 76 a 76 a 60 a 28 a
Promedios con letras distintas en cada columna presentan diferencias significativas al nivel de probabilidad p=0.05 según Test de Tukey.
39
FIGURA 8. Plántulas obtenidas en el ensayo 3, y con el tratamiento 1 de esterilización ( agar autoclavado en los tubos de vidrio).
40
FIGURA 9. Plantas correspondientes al ensayo 3, y con el agar autoclavado en forma independiente del los tubos de vidrio.
41
No se observan diferencias significativas en la mayoría de las fechas evaluadas, sin
embargo, en la evaluación realizada a los 60 días, se manifiesta un incremento en
la sobrevivencia de los protocormos trasplantados en un medio esterilizado según
el tratamiento 2. Finalizadas las mediciones a los 120 días, no hay diferencia entre
la esterilización mediante el tratamiento 1 o 2.
En el Cuadro 3, se observan las plántulas que lograron la formación de al menos
una hoja (%).
CUADRO 3. Efecto de dos tratamientos de esterilización del medio en el porcentaje de plantas que forman al menos una hoja. 30 días 60 días 90 días 120 días
Tratamiento 1 28 a 36 a 32 a 24 a
Tratamiento 2 52 a 52 a 60 a 28 a
Promedios con letras distintas en la columna presentan diferencias significativas al nivel de probabilidad p=0.05 según Test de Tukey.
No existe diferencia entre los tratamientos de esterilización del medio en relación
con la formación de al menos una hoja de los protocormos.
Es interesante mencionar, que en las mediciones que se realizaron en el
tratamiento 2, a los 90 días el porcentaje de plantas que formaron al menos una
hoja, es de un 60% el cuál a los 120 días bajó a 28%, se debe recordar que el
transplante desde los tubos con agar avena a maceteros ocurre a los 45 días, y en
ese momento el 52 % de las plantas presentaban al menos una hoja al momento
del trasplante.
42
Las condiciones en que se encontraban las plantas en ese período varían
notablemente, pasando desde la cámara bioclimática, con una temperatura entre
16º a 22ºC y con un régimen lumínico de ocho oscuridad y 16 horas luz, a una
habitación ambiente en la cuál la temperatura y luz varían constantemente, pero lo
más importante es la modificación de la humedad relativa de las plantas ya que los
tubos se encontraban cerrados, por lo que mantenían una elevada humedad, al
realizar el trasplante a maceteros, esta condición cambia drásticamente. El
porcentaje de formación de al menos una hoja disminuye debido a la mortalidad de
las plantas, ya que durante ese período debieron aclimatarse a las nuevas
condiciones a las que fueron sometidas, logrando sólo un 28 % establecerse a los
120 días.
El Cuadro 4 compara la altura final de las plántulas y el número de hojas formadas
dependiendo del tratamiento utilizado para la esterilización del medio.
CUADRO 4. Efecto de dos tratamientos de esterilización del medio en la altura de las plantas (cm) y número de hojas por plantas. Altura (cm) Nº de hojas
Tratamiento 1 2,03 a 20,6 a
Tratamiento 2 1,55 a 1,6 b
Promedios con letras distintas en igual columna presentan diferencias significativas al nivel de probabilidad p=0.05 según Test de Tukey.
No existe deferencia de los tratamientos en cuanto a la altura de las plantas pero si
existe diferencia significativa en relación al número de hojas formadas. El
tratamiento 1 (agar autoclavado en los mismos frascos) alcanzó mejores resultados
al obtener plántulas con mayor número de hojas.
43
Es de gran dificultad la interpretación final de este ensayo, ya que los tratamientos
no difieren en lo relacionado a la sobrevivencia de los protocormos, a la formación
de clorofila ni a la altura de las plantas, sin embargo, existe diferencia significativa
en relación al número de hojas obtenidos. Esta diferente tasa de crecimiento, pudo
deberse a las diferentes características del medio provocada por los distintos tipos
de esterilización, lo que a su vez pudo influir en la concentración de las micorrizas,
mayor concentración, obteniéndose un mejor resultado. Sin embargo esta variable
debe ser corroborada en futuros estudios.
44
5. CONCLUSIONES
La sobrevivencia de las plántulas al trasplante disminuye a través del tiempo, a los
60 días el estado 3 de germinación, es superior al estado 2, algunos protocormos
lograron formar clorofila.
El trasplante en verano a una mezcla de perlita y turba no es efectivo para la
sobrevivencia de las plántulas.
Usar tubos individuales con medio agar avena al 25 % más aplicación de arena,
todo autoclavado, colocando los protocormos en estado 3 en cámara bioclimática
hasta la formación de la primera hoja, posteriormente, trasplante a maceteros con
suelo perlita (1:1) dejarlos a temperatura ambiente hasta desarrollo de un nuevo
follaje permite un 24- 28 % de plantas sobrevivientes.
45
6. RESUMEN
El programa de mejoramiento genético que lleva a cabo la Facultad de Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso y la Universidad de Talca, financiado por la Fundación para la Innovación Agraria, comenzó hace cinco años, con el estudio agronómico y económico de la especie Chloraea crispa, durante el cuarto año de estudio, se estableció un protocolo de siembra y germinación simbiótica de semillas, mediante la utilización de un hongo perteneciente al género Rhizoctonia denominado como NM3. El quinto año del proyecto, tuvo como objetivo general el establecimiento de dichas plántulas en terreno. Para lograr con éxito el objetivo propuesto, se realizaron tres ensayos consecutivos. En el primero se evaluó el estado de trasplante de los protocormos, realizados en los estados 2 y 3 descritos por MITCHELL (1989), y tres vías de aclimatación que incluyen desde el uso de una cámara de crecimiento al empleo de un sombreadero. El segundo ensayo, evaluó en el mejor estado y vía de acimatación, una modificación del sustrato. Finalmente en el tercer ensayo, se evaluaron dos formas de esterilización del sustrato, ya que en el ensayo anterior, se produjo una contaminación generalizada que provocó la muerte de los protocormos.
Mediante estos ensayos, se logró el establecimiento de las plántulas de Chloraea crispa a partir de semillas inoculadas.
46
7. ABSTRACT
The genetic improvement program that carries out the Pontificia Universidad Católica de Valparaíso and the Universidad de Talca, financed by the Fundación para la Innovación Agraria, began five years ago with the agronomic and economic studies of the Chloraea crispa species. During the fourth year of study one settled down a protocol of sowing and symbiotic germination of seeds by means of the use of a Rhizoctonia fungus sort denominated like NM3. The fifth year had like general mission, in this species to improve the establishment of this plants in land. In order to obtain the proposed objective successfully, three consecutive tests were made. In first the state of trasplant of the protocormos, made in the states 2 and 3 described by MITCHELL (1989) was evaluated and three routes of acclimatization that include from the use of camera of growth the use of a shadow structure . The second test evaluated, in the best state and via, a modification of the substrate. Finally, in the third test two forms of sterilization of the substrate were evaluated, since in the previous test a generalized contamination took place that caused the failure plant. From the tests the establishment of Chloraea crispa plants was obtained from inoculated seeds with reasonable percentage of acclimatization.
47
8. LITERATURA CITADA
ARDITTI, J. 1967. Factors affecting the germination of orchid seeds. The botanical Review. 33 (1) : 1-97. BATTY, M. and BRUNDETT, M. 2001. Orchid conservation techniques manual. Canberra. Plant Science, Kings Park and Botanic Garden. First International Orchid Conservation Congress - Training Course. Perth, Western Australia, 20 September 2001. sp. CORREA, M. 1969. Chloraea, género sudamericano de Orchidaceae. Buenos Aires, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. 499p. HARTMANN, H y KESTER, D. 1998. Propagación de plantas. Principios y Prácticas. Segunda edición. México D.F., C.E.C.S.A. 760p. HOFFMAN, A. 1998. Flora silvestre de Chile zona central. Cuarta edición. Santiago, Fundación Claudio Gay. 254p. MCKENDRICK, S. 2000. Manual para la germinación in vitro de orquídeas, (Online). www.ceiba.org/documents/CFTCpropman(SP).pdf MERSEY, L. 2003. Diseño y validación de un protocolo para germinación de semillas de Chloraea crispa inoculadas con hongos micorrícicos. Taller de Licenciatura. Ing. Agr. Quillota, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso. Facultad de Agronomía. 50p. MITCHELL, R. 1989. Growing hardy orchids from seeds at Kew. Plantsman . 11(3): 152 - 169. RASMUSSEN, H. 1995. Terrestrial orchids from seed to mycotrophic plant. Press. Cambridge, Cambridge University. 444p.
48
RENDICH, A. 2001. Evaluación de crecimiento y floración de orquídeas nativas de la especie Chloraea crispa. Taller de Licenciatura. Ing. Agr. Quillota, Universidad Católica de Valparaíso. Facultad de Agronomía. 81p. SMITH, S. 1966. Physiology and ecology of orchid mycorrhizal fungi with reference to seedling nutrition. New Phytologist. 65: 488-499. URIBE, E. 2000. Descripción del ciclo fenológico de orquídeas nativas Perteneciente al género Chloraea y registro de características de interés Agronómico de la especie. Taller de Licenciatura. Quillota, Universidad Católica de Valparaíso. Facultad de Agronomía. 65p.
49
ANEXO 1. Método del tubo para la esterilización de semillas de orquídeas
planteado por BATTY (2001).
50
ANEXO 2. Método de la jeringa para la esterilización de semillas de orquídeas
según BATTY (2001).
51
ANEXO 3. Método de desinfección para semillas de orquídeas planteado por
MITCHELL (1989).
52
ANEXO 4. Etapas de desarrollo para la germinación de semillas de orquídeas
propuesta por MITCHELL (1989).
• Etapa 0: Semillas no germinadas (tamaño actual 1mm).
• Etapa 1: crecimiento del embrión y ruptura de la testa.
• Etapa 2: comienza el crecimiento del protocormo y las raíces (tamaño actual 2-
3mm).
• Etapa 3: el protocormo crece rápidamente y hay desarrollo de un brote. Óptima
etapa de transferencia (tamaño actual 3-5 mm).
• Etapa 4a: Protocormos verde-invierno (formación de un protocormo redondo el
que produce hojas verdes sin un estímulo de frío) comienzan a producir la primera
hoja, moviéndose a la luz. Posible etapa de transferencia.
• Etapa 4b: Brotes desarrollándose en protocormos que requieren un estímulo de
frío (4ºC) producen un crecimiento horizontal. Posible etapa de transferencia.
• Etapa 5a: Especies verde invierno, etapa de destete.
• Etapa 5b: especies que requieren frío, etapa de destete.
53
ANEXO 5. Preparación de agar avena.
54
ANEXO 6. Procedimiento del ensayo 1.
55
Tamaño de trasplante: aclimatación:
A : estado 2 1 : cámara de crecimiento- cámara
bioclimática- habitación ambiente-
sombreadero.
B: estado 3
2 : cámara de crecimiento- cámara
bioclimática-ambiente.
3 : cámara de crecimiento- habitación
ambiente- sombreadero.
9 unidades experimentales (cajas plásticas) con trasplante en etapa A
Aclimatación 1 Aclimatación 2 Aclimatación 3
(3 cajas) (3 cajas) (3 cajas)
9 unidades experimentales (cajas plásticas) con trasplante en etapa B
Aclimatación 1 Aclimatación 2 Aclimatación 3
(3 cajas) (3 cajas) (3 cajas)
56
ANEXO 7: Temperaturas máximas y mínimas registradas en la Estación
Climatológica de Quillota durante los meses de noviembre del 2003 y
julio del 2004.
AÑO 2003 AÑO 2004 noviembre
diciembre
enero febrero marzo abril mayo junio julio
TEMPERATURA
TEMPERATURA
TEMPERATURA
TEMPERATURA
TEMPERATURA
TEMPERATURA
TEMPERATURA
TEMPERATURA
TEMPERATURA
Máxima Mínima Máxima Mínima Máxima Mínima Máxima Mínima Máxima Mínima Máxima Mínima Máxima Mínima Máxima Mínima Máxima Mínima
días ºC ºC ºC ºC ºC ºC ºC ºC ºC ºC ºC ºC ºC ºC ºC ºC ºC ºC
1 22.0 6.2 23 8 23.4 11.2 24.4 9.4 25.6 11.6 23.4 7.6 23.0 4.6 20.4 1.2 20.4 -0.4
2 22.4 12.0 26.6 8.8 25.0 7.0 23.4 12.4 32.0 8.4 28.2 9.8 22.8 3.4 24.4 2.2 19.0 1.0
3 23.8 10.0 23 6.4 25.0 12.0 25.4 7.6 31.6 8.0 27.8 7.6 23.8 3.8 20.8 2.8 22.4 3.8
4 22.6 6.6 27.6 8.2 23.0 12.2 27.4 6.8 26.3 9.8 23.0 7.6 22.8 7.8 18.0 1.4 25.2 2.8
5 23.2 8.0 32.4 7.6 27.4 7.6 26.0 8.6 27.2 12.0 22.4 14.0 14.0 5.2 19.2 6.2 25.4 3.0
6 22.2 11.8 30.8 9 26.6 8.8 24.4 12.8 30.6 7.8 27.8 7.8 16.8 8.2 18.2 -1.8 13.0 2.8
7 27.4 5.8 22.2 9 23.6 9.0 25.2 12.0 31.6 7.0 31.0 7.4 23.8 7.2 16.2 -1.4 19.2 3.0
8 27.0 7.6 26.4 9.6 23.8 10.2 27.2 8.8 24.6 6.8 31.8 7.0 13.8 6.0 15.8 3.8 19.6 1.0
9 31.2 6.6 32 8 26.8 8.8 29.6 8.8 24.4 14.6 24.0 9.0 14.8 6.2 13.8 6.4 18.6 1.6
10 24.8 9.4 25.2 11.2 30.2 9.2 25.4 9.6 23.2 7.8 28.0 7.8 17.4 6.2 15.8 -1.2 17.8 -0.8
11 24.2 8.2 29.8 6.6 25.6 8.2 22.0 14.0 24.0 14.4 26.6 8.0 14.2 5.6 24.2 -1.6 12.8 1.6
12 31.0 8.6 27.6 7.2 24.0 12.2 25.2 8.4 23.8 6.8 26.6 11.2 19.0 0.0 23.0 -1.0 16.2 6.8
13 27.4 8.6 25.6 6.2 23.4 8.4 24.4 8.8 20.0 14.4 26.4 12.0 20.6 -1.0 12.0 1.4 12.8 8.6
14 18.4 12.0 25.2 7 23.2 12.8 24.8 10.0 26.2 14.6 24.8 12.0 23.4 0.0 23.4 3.4 16.0 0.6
15 24.8 11.8 34 7.2 24.0 14.4 22.2 8.0 27.4 7.6 19.0 11.2 14.6 3.2 20.4 3.8 16.8 -1.8
16 19.2 12.2 33.4 7.4 25.8 12.0 29.2 11.4 29.4 10.0 25.6 9.2 15.2 6.2 18.0 9.0 17.6 -1.4
17 25.0 18.0 25.2 8.2 27.4 10.6 28.6 7.4 32.4 7.8 26.0 6.0 16.4 5.6 19.6 7.8 16.6 1.0
18 30.4 8.6 23.2 12.4 27.0 10.8 35.2 6.2 30.6 7.6 28.2 6.2 15.8 5.2 20.0 5.2 17.8 1.0
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