General Microbiology

AJ. TREE VATAKIT (M.S.,Food Technology)

Program in Agro-Industry Nakhon Phanom College of Agriculture and Technology

Nakhon Phanom Universityhttp://agri.npu.ac.th

จุ�ลชี�วว�ทยาท��วไป

บทท�� 7 การแยกเชี��อจุ�ล�นทร�ย�บร�สุ�ทธิ์��

General Microbiology

เน��อหา-การแยกเชื้อบร สุ�ทธิ์ �-การเก�บร�กษาเชื้อจุ�ลิ นทร�ย�-ลิ�กษณะการเจุร ญของแบคท�เร�ยใน

อาหารเลิ�ยงเชื้อ

การแยกเชี��อบร�สุ�ทธิ์��

เชี��อบร�สุ�ทธิ์�� (pure culture) หมายถึ&งเชื้อจุ�ลิ นทร�ย�ท�'ประกอบด้*วยเซลิลิ�ของจุ�ลิ นทร�ย�ชื้น ด้เด้�ยวก�นซ&'งม�ลิ�กษณะเหมอนก�นท�กประการ

การแยกเชี��อบร�สุ�ทธิ์��1 .การขี�ดเชี��อในจุานเพาะเชี��อ

(streak plate) เป-นว ธิ์�การท�'ให*เชื้อแบคท�เร�ยท�'ม�ความเข*มข*นมากๆ ค/อยๆกระจุายตั�วออกไป หรอม�ความเจุอจุางพอท�'จุะท3าให*เซลิลิ�แตั/ลิะเซลิลิ�แยกออกจุากก�น โด้ยแตั/ลิะเซลิลิ�จุะเจุร ญจุนเป-นโคโลิน�ท�'มองเห�นด้*วยตัาเปลิ/า

1.1 simple streak1.1 simple streak

เป#นการขี�ดเชี��อแบบง่%ายโดยการใชี' ห%วง่เป#นการขี�ดเชี��อแบบง่%ายโดยการใชี' ห%วง่เขี��ยเชี��อ เขี��ยเชี��อ (loop) (loop) ลนไฟจุนร'อนแดง่และท��ง่ให'ลนไฟจุนร'อนแดง่และท��ง่ให'เย)น จุากน��นแตะท��เชี��อจุ�ล�นทร�ย�ท��ต'อง่การแยกเย)น จุากน��นแตะท��เชี��อจุ�ล�นทร�ย�ท��ต'อง่การแยกให'บร�สุ�ทธิ์�� โดยน+ามาขี�ดบนอาหารว� 'นแขี)ง่ ลากให'บร�สุ�ทธิ์�� โดยน+ามาขี�ดบนอาหารว� 'นแขี)ง่ ลากเป#นแนวก�น เชี��อจุ�ล�นทร�ย�จุะเก�ดการแยกขีอง่เป#นแนวก�น เชี��อจุ�ล�นทร�ย�จุะเก�ดการแยกขีอง่เซลล�จุากปร�มาณหนาแน%น จุะเหล�อน'อยละจุนเซลล�จุากปร�มาณหนาแน%น จุะเหล�อน'อยละจุนแยกเป#นโคโลน�เด�ยวๆได'แยกเป#นโคโลน�เด�ยวๆได'

Simple Streak แบบต%าง่ๆ

1.2 cross streak1.2 cross streak

การขี�ดเชี��อแบบต�ดก�น น�ยมใชี'มากในห'อง่ปฏิ�บ�ต�การ การขี�ดเชี��อแบบต�ดก�น น�ยมใชี'มากในห'อง่ปฏิ�บ�ต�การ ท+าเชี%นเด�ยวก�นว�ธิ์� ท+าเชี%นเด�ยวก�นว�ธิ์� simple streak simple streak แต%จุะท+าการขี�ดแต%จุะท+าการขี�ดเสุ'นบนอาหารว� 'นแขี)ง่ตามแนวประมาณ เสุ'นบนอาหารว� 'นแขี)ง่ตามแนวประมาณ 3-4 3-4 แนว ซ2�ง่แนว ซ2�ง่ท�กคร��ง่ท��ท+าการขี�ดเชี��อในแต%ละแนวต'อง่ลนไฟท�� ท�กคร��ง่ท��ท+าการขี�ดเชี��อในแต%ละแนวต'อง่ลนไฟท�� loop loop และรอให'เย)น โดยลากเชี��อให'ต�ดก�น และรอให'เย)น โดยลากเชี��อให'ต�ดก�น (cross) (cross) ก�บแนวก�บแนวเชี��อท��ลากผ่%านมาแล'วเล)กน'อย ซ2�ง่จุะลากเสุ'นจุากห%าง่ไปเชี��อท��ลากผ่%านมาแล'วเล)กน'อย ซ2�ง่จุะลากเสุ'นจุากห%าง่ไปถี่��จุนได'โคโลน�เด�ยวๆแยกออกมา โดยการน+าอาหารถี่��จุนได'โคโลน�เด�ยวๆแยกออกมา โดยการน+าอาหารเล��ยง่เชี��อท��ผ่%านการขี�ดเชี��อแล'วไปบ%มท��อ�ณหภู6ม�เหมาะเล��ยง่เชี��อท��ผ่%านการขี�ดเชี��อแล'วไปบ%มท��อ�ณหภู6ม�เหมาะสุมนาน สุมนาน 24-48 24-48 ชีมชีม..

Cross streak plate

ขี'อแตกต%าง่ขีอง่การแยกเชี��อบร�สุ�ทธิ์��

หล�กการว�เคราะห�ค�ณภูาพทาง่จุ�ล�นทร�ย�

จุ�ล�นทร�ย�สุ%วนใหญ่%พบได'ในอาหารท�กจุ�ล�นทร�ย�สุ%วนใหญ่%พบได'ในอาหารท�กชีน�ด เน��อง่จุากเป#นแหล%ง่อาหารสุ+าหร�บชีน�ด เน��อง่จุากเป#นแหล%ง่อาหารสุ+าหร�บการเจุร�ญ่เต�บโตและขียายจุ+านวนเพ��มมากการเจุร�ญ่เต�บโตและขียายจุ+านวนเพ��มมากขี2�นขี2�น

การว�เคราะห�จุ�ล�นทร�ย� ม�ว�ธิ์�การต%าง่ๆการว�เคราะห�จุ�ล�นทร�ย� ม�ว�ธิ์�การต%าง่ๆมากมายในการตรวจุสุอบ เพ��อให'ทราบถี่2ง่มากมายในการตรวจุสุอบ เพ��อให'ทราบถี่2ง่จุ+านวน รวมท��ง่ชีน�ดขีอง่จุ�ล�นทร�ย�ท��เราจุ+านวน รวมท��ง่ชีน�ดขีอง่จุ�ล�นทร�ย�ท��เราสุนใจุสุนใจุ

การท+าเจุ�อจุาง่ 10 เท%า (Ten fold serial dilution)

ในการตัรวจุสุอบจุ3านวนจุ�ลิ นทร�ย�จุากตั�วอย/าง โด้ยในการตัรวจุสุอบจุ3านวนจุ�ลิ นทร�ย�จุากตั�วอย/าง โด้ยการเพาะเลิ�ยงในอาหารเลิ�ยงเชื้อ จุะสุามารถึตัรวจุสุอบการเพาะเลิ�ยงในอาหารเลิ�ยงเชื้อ จุะสุามารถึตัรวจุสุอบจุ3านวนจุ�ลิ นทร�ย�อย5/ในชื้/วง จุ3านวนจุ�ลิ นทร�ย�อย5/ในชื้/วง 30-300 30-300 โคโลิน�เท/าน�นโคโลิน�เท/าน�น

ปร มาณจุ�ลิ นทร�ย�ท�'หนาแน/นเก นไป ท3าให*ไม/สุามารถึปร มาณจุ�ลิ นทร�ย�ท�'หนาแน/นเก นไป ท3าให*ไม/สุามารถึน�บโคโลิน�ได้* จุ3าเป-นตั*องท3าการเจุอจุางตั�วอย/างก/อนน�บโคโลิน�ได้* จุ3าเป-นตั*องท3าการเจุอจุางตั�วอย/างก/อนน3าไปเพาะเลิ�ยงบนอาหารเลิ�ยงเชื้อน3าไปเพาะเลิ�ยงบนอาหารเลิ�ยงเชื้อ

Diluient Diluient หรอสุารเจุอจุาง ท3าหน*าท�'ในการเจุอจุางหรอสุารเจุอจุาง ท3าหน*าท�'ในการเจุอจุางจุ3านวนเซลิลิ�ของจุ�ลิ นทร�ย�ให*อย5/ในชื้/วงท�'แหมาะสุม จุ3านวนเซลิลิ�ของจุ�ลิ นทร�ย�ให*อย5/ในชื้/วงท�'แหมาะสุม สุารท�'ใชื้*เป-นสุารเจุอจุางได้*แก/ สุารท�'ใชื้*เป-นสุารเจุอจุางได้*แก/ Nutrient Broth, Nutrient Broth, 0.85 % NaCl, Peptone water 0.85 % NaCl, Peptone water เป-นตั*นเป-นตั*น

เทคน�คต%าง่ๆท��ใชี'ว�เคราะห�ปร�มาณจุ�ล�นทร�ย� 21. 21. ว�ธิ์� ว�ธิ์� Plate CountPlate Count

ว�ธิ์�เพลทเคานต� ใชี'ว�เคราะห�ปร�มาณขีอง่ว�ธิ์�เพลทเคานต� ใชี'ว�เคราะห�ปร�มาณขีอง่แบคท�เร�ยในอาหาร โดยอาศั�ยหล�กการท�� แบคท�เร�ยในอาหาร โดยอาศั�ยหล�กการท�� เซลล�แบคท�เร�ยท��ม�ชี�ว�ตหร�อกล�%มเซลล�แบคท�เร�ยท��ม�ชี�ว�ตหร�อกล�%มเซลล�เซลล�(clump) (clump) จุะเจุร�ญ่และเพ��มจุ+านวนจุะเจุร�ญ่และเพ��มจุ+านวนภูายในหร�อบนผ่�วหน'าอาหารเล��ยง่เชี��อท��ภูายในหร�อบนผ่�วหน'าอาหารเล��ยง่เชี��อท��เหมาะสุมเหมาะสุม

แบ%ง่เป#น แบ%ง่เป#น 2 2 ว�ธิ์�ค�อว�ธิ์� ว�ธิ์�ค�อว�ธิ์� pour plate pour plate และ และ spread platespread plate

เทคน�คต%าง่ๆท��ใชี'ว�เคราะห�ปร�มาณจุ�ล�นทร�ย�

เทคน�คต%าง่ๆท��ใชี'ว�เคราะห�ปร�มาณจุ�ล�นทร�ย�

2.22.2ว�ธิ์� ว�ธิ์� Spread PlateSpread Plateเปนการแยกจุ�ลิ นทร�ยใหบร สุ�ทธิ์ �ท�'สุามารถึตัรวจุน�บเปนการแยกจุ�ลิ นทร�ยใหบร สุ�ทธิ์ �ท�'สุามารถึตัรวจุน�บ

ปร มาณได้โด้ยม�การเจุอจุางเปนลิ3 าด้�บสุวน ปร มาณได้โด้ยม�การเจุอจุางเปนลิ3 าด้�บสุวน ( Serial ( Serial dilution ) dilution ) จุากน�นปเปตัตั�วอยางท�'ม�ความเจุอจุางตัามจุากน�นปเปตัตั�วอยางท�'ม�ความเจุอจุางตัาม

ตัองการโด้ยว ธิ์� ตัองการโด้ยว ธิ์� aseptic technique aseptic technique ปร มาตัร ปร มาตัร 0.1 0.1 ml. ml. ใสุตั�วอยางลิงบนอาหารว�นแข�ง แลิะท3าการเกลิ�'ย ใสุตั�วอยางลิงบนอาหารว�นแข�ง แลิะท3าการเกลิ�'ยตั�วอยางใหกระจุายทตั�วอยางใหกระจุายท�'ว� 'ว ผิ วหนาอาหารด้วย ผิ วหนาอาหารด้วย Sterile Sterile spreader spreader ร5ป ร5ป L L ท�'ท3าจุากแทงแกว ท�'ท3าจุากแทงแกว colony colony ของจุ�ลิ ของจุ�ลิ

นทร�ยจุะเจุร ญบนอาหารว�นแข�งเทาน�น ว ธิ์�การ นทร�ยจุะเจุร ญบนอาหารว�นแข�งเทาน�น ว ธิ์�การSpread plate Spread plate งายแลิะสุะด้วกกวาว ธิ์� งายแลิะสุะด้วกกวาว ธิ์� Pour plate Pour plate แตัไมเหมาะก�บจุ�ลิ นทร�ยพวกท�'ไวตัอออกซ เจุนแตัไมเหมาะก�บจุ�ลิ นทร�ยพวกท�'ไวตัอออกซ เจุน

ว�ธิ์�การ spread plate ปฏิ�บ�ต�ท+าด�ง่น��

1. เจุอจุางตั�วอยางลิ3าด้�บสุวนแบบ 10

เทา เม'อถึ&งความเจุอจุาง 1 104 ใชื้ปเปตัอ�นใหมด้5ด้ตั�วอยางท�'ผิสุมเขาก�นด้�ก�บน3ากลิ�'นจุ3 านวน 01. ml. ใสุลิงในอาหาร

nutrient agar แลิะใชื้ปเปตัอ�นเด้�ยวก�น ด้5ด้ของผิสุมใสุในขวด้ท�'ม�น3 ากลิ�'นไรเชื้ออย5 9

ml. ด้5ด้น3 าในขวด้ข&นลิงเพ'อลิางปเปตัจุ3 านวน 5 คร�ง ผิสุมใหเขาก�นด้� ได้ความเจุอจุาง

เปน 110: 5

2 . ใชื้ปเปตัอ�นใหมด้5ด้ตั�วอยางท�'ม�ความเจุอจุาง 1 10: 5 จุ3 านวน 01. ml.ใสุบนอาหาร nutrient agar กอนใชื้ปเปตัอ�นเด้�ยวก�นด้5ด้ของผิสุมใสุในขวด้ท�'ม�น3 ากลิ�'นไรเชื้ออย5 9ml. ด้5ด้น3 าในขวด้ข&นลิงเพ'อลิางปเปตัจุ3 านวน 5คร�งผิสุมใหเขาก�นด้� ได้ความเจุอจุางเปน 1 10: 6

ว�ธิ์�การ spread plate ปฏิ�บ�ต�ท+าด�ง่น�� 3. 3. ใชื้ปเปตัอ�นใหมด้5ด้ตั�วอยางท�'ม�ความเจุอจุาง ใชื้ปเปตัอ�นใหมด้5ด้ตั�วอยางท�'ม�ความเจุอจุาง

1 10: 1 10: 66 จุ3 านวน จุ3 านวน 01. ml. 01. ml. ท�'ผิสุมเขาก�นด้�ท�'ผิสุมเขาก�นด้�แลิวใสุบนอาหารแลิวใสุบนอาหาร nutrient agar nutrient agar

4. 4. ใชื้ ใชื้ Sterile spreader Sterile spreader ร5ปตั�ว ร5ปตั�ว L L เกลิ�'ยตั�วอยาเกลิ�'ยตั�วอยางบนผิ วหนาอาหาร งบนผิ วหนาอาหาร nutrient agar nutrient agar ใหกระจุายท�'วใหกระจุายท�'วท�งจุานกอนน3 าไปบมท�'อ�ณหภู5ม ท� งจุานกอนน3 าไปบมท�'อ�ณหภู5ม 37 37 นาน นาน 22

- 448- 448 ชื้�'วโมงชื้�'วโมง 5. 5. ด้5ผิลิปฏิ บ�ตั การ โด้ยสุ�งเกตัการเจุร ญเตั บโตั ด้5ผิลิปฏิ บ�ตั การ โด้ยสุ�งเกตัการเจุร ญเตั บโตั , ,

ลิ�กษณะของ ลิ�กษณะของ colony colony แลิะน�บจุ3 านวน แลิะน�บจุ3 านวน colony colony บนบนอาหารอาหาร nutrient agar nutrient agar ด้ วยเคร'องมอน�บ ด้ วยเคร'องมอน�บ colony ( colony (

colony counter ) colony counter )

เทคน�คต%าง่ๆท��ใชี'ว�เคราะห�ปร�มาณจุ�ล�นทร�ย�2.3 2.3 ว�ธิ์� ว�ธิ์� Pour PlatePour Plate

เปนว ธิ์�ท�'นอกจุากจุะแยกจุ�ลิ นทร�ยใหบร สุ�ทธิ์ �แลิวย�งสุามารถึเปนว ธิ์�ท�'นอกจุากจุะแยกจุ�ลิ นทร�ยใหบร สุ�ทธิ์ �แลิวย�งสุามารถึตัรวจุน�บจุ3 านวนจุ�ลิ นทร�ยในตั�วอยางท�'น3 ามาแยกเชื้อได้ด้วย ตัรวจุน�บจุ3 านวนจุ�ลิ นทร�ยในตั�วอยางท�'น3 ามาแยกเชื้อได้ด้วย ว ธิ์�การน�'ตัองท3า ว ธิ์�การน�'ตัองท3า Serial dilution Serial dilution กอน จุ&งจุะสุามารถึน�บจุ3 ากอน จุ&งจุะสุามารถึน�บจุ3 านวนจุ�ลิ นทร�ยตัอหนวยปร มาตัรได้นวนจุ�ลิ นทร�ยตัอหนวยปร มาตัรได้หลิ�กการท3 า หลิ�กการท3 า Pour plate Pour plateคอการน3 าเอาตั�วอยางท�'ตัองการแยกหรอเพาะเลิ�ยงมาผิสุมก�บคอการน3 าเอาตั�วอยางท�'ตัองการแยกหรอเพาะเลิ�ยงมาผิสุมก�บว�นหลิอมเหลิวในอาหารเลิ�ยงเชื้อปลิอยใหว�นแข�งตั�วกอน ว�นหลิอมเหลิวในอาหารเลิ�ยงเชื้อปลิอยใหว�นแข�งตั�วกอน แลิวน3 าไปบมอ�ณหภู5ม ท�'ก3 าหนด้แลิวน3 าไปบมอ�ณหภู5ม ท�'ก3 าหนด้ colony colony ของจุ�ลิ นทร�ยจุะของจุ�ลิ นทร�ยจุะเจุร ญบนหรอในอาหารว�น ขอด้� ของว ธิ์�น�คอ เหมาะสุ3 าหร�บตั�วเจุร ญบนหรอในอาหารว�น ขอด้� ของว ธิ์�น�คอ เหมาะสุ3 าหร�บตั�วอยางท�'ม�ปร มาณมากหรอม�ความหนด้ตั�วอยางคออาหาร อยางท�'ม�ปร มาณมากหรอม�ความหนด้ตั�วอยางคออาหาร ,,นม นม เปนตัน ขอเสุ�ยคอ ใชื้เวลิามาก เปนตัน ขอเสุ�ยคอ ใชื้เวลิามาก colony colony บางสุวนอย5ในอาบางสุวนอย5ในอาหารว�นท3 าใหไมสุามารถึว เคราะหลิ�กษณะของหารว�นท3 าใหไมสุามารถึว เคราะหลิ�กษณะของ colony colonyได้แลิะท�'สุ3 าค�ญจุ�ลิ นทร�ยในกลิ�ม ได้แลิะท�'สุ3 าค�ญจุ�ลิ นทร�ยในกลิ�ม psychrophiles psychrophiles แลิะ แลิะ mesmes

ophiles ophiles อาจุถึ5 กท3 าลิายด้วยความรอนจุากอาหารว�นหลิอมอาจุถึ5 กท3 าลิายด้วยความรอนจุากอาหารว�นหลิอมเหลิวท3 าใหเก ด้การผิ ด้พลิาด้ได้ รายลิะเอ�ยด้ของเทคน คแลิะว ธิ์�เหลิวท3 าใหเก ด้การผิ ด้พลิาด้ได้ รายลิะเอ�ยด้ของเทคน คแลิะว ธิ์�การม�ด้�งน�การม�ด้�งน�

ว�ธิ์� Pour Plate

ว�ธิ์� Pour Plate 31. . 31. . ด้5ด้ของเหลิวจุากขวด้ท�'เจุอจุางเปน ด้5ด้ของเหลิวจุากขวด้ท�'เจุอจุางเปน 1 110:10: 33แลิะ แลิะ 110:110: 44 แลิะ แลิะ 1 10: 1 10: 55 ใสุในจุานใสุในจุานอาหารเลิ�ยงเชื้อเปลิาท�'ฆาเชื้อแลิว จุานลิะ อาหารเลิ�ยงเชื้อเปลิาท�'ฆาเชื้อแลิว จุานลิะ 1ml. 1ml. 2 2จุานตัอ จุานตัอ 1 1 โด้ยใชื้ปเปตัอ�นเด้�ยวก�บโด้ยใชื้ปเปตัอ�นเด้�ยวก�บ

อ�นท�'ด้5ด้เชื้ อจุากขวด้ท�'เจุอจุาง อ�นท�'ด้5ด้เชื้ อจุากขวด้ท�'เจุอจุาง 1 10: 1 10: 33 ไปท3 า ไปท3 า 1:1:1010

44 จุาก จุาก 110:110: 44 ไปท3าไปท3า 1 10: 1 10: 55 แลิะแลิะใชื้ปเปตัอ�นใหมสุ3 าหร�บ ใชื้ปเปตัอ�นใหมสุ3 าหร�บ 1 10: 1 10: 55

32. . 32. . น3 าอาหารว�นท�'อย5ในสุภูาพท�'หลิอมเหลิวในน3 าอาหารว�นท�'อย5ในสุภูาพท�'หลิอมเหลิวในขวด้อาหารจุาก ขวด้อาหารจุาก มาเทลิงในจุานท� กจุาน มาเทลิงในจุานท� กจุาน โด้ยขณะท�'เทใชื้ฝาจุานปองก�นสุวนผิสุมขางในโด้ยขณะท�'เทใชื้ฝาจุานปองก�นสุวนผิสุมขางในม ใหเชื้อจุากอากาศตักลิงไปม ใหเชื้อจุากอากาศตักลิงไป

ว�ธิ์� Pour Plate

33. . 33. . หม�นจุานไปมาใหสุวนผิสุมเขาก�นด้�ก�บหม�นจุานไปมาใหสุวนผิสุมเขาก�นด้�ก�บอาหาร ระว�งอยาใหกระฉอกไปตั ด้ฝาจุานอาหาร ระว�งอยาใหกระฉอกไปตั ด้ฝาจุาน

34. . 34. . ตั�งท งไวจุนว�นแข�งตั�ว แลิวจุ&งกลิ�บจุานตั�งท งไวจุนว�นแข�งตั�ว แลิวจุ&งกลิ�บจุานเพ'อปองก�นไมใหน3าท�'ตั ด้บนฝาจุานหยด้ลิงมาเพ'อปองก�นไมใหน3าท�'ตั ด้บนฝาจุานหยด้ลิงมาบนว�นบนว�น

35. . 35. . น3 าไปเพาะเลิ�ยงท�'อ�ณหภู5ม น3 าไปเพาะเลิ�ยงท�'อ�ณหภู5ม 37 37 เปนเปนเวลิา เวลิา - 12- 12 ว�น เม'อเพาะเชื้อจุนเจุร ญข&นเปน ว�น เม'อเพาะเชื้อจุนเจุร ญข&นเปน colonycolonyน3 าไปน�บจุ3 านวน น3 าไปน�บจุ3 านวน colony colony จุะร5จุ3 านวน จุะร5จุ3 านวน colocolo

ny ny ได้แลิะถึาตัองการเก�บเชื้อไวศ&กษาก�ได้แลิะถึาตัองการเก�บเชื้อไวศ&กษาก�เลิอกเลิอก colony colony ท�'สุนใจุ น3 าไปท3 าใหเปนเชื้อบร สุ�ทธิ์ � ท�'สุนใจุ น3 าไปท3 าใหเปนเชื้อบร สุ�ทธิ์ � โด้ยว ธิ์� โด้ยว ธิ์� Streak plate Streak plate

เทคน�คต%าง่ๆท��ใชี'ว�เคราะห�ปร�มาณจุ�ล�นทร�ย�

เทคน�คต%าง่ๆท��ใชี'ว�เคราะห�ปร�มาณจุ�ล�นทร�ย�

2.2. 4 4 ว�ธิ์� ว�ธิ์� Membrane FiltrationMembrane Filtration

เป#นการกรอง่ผ่%านเมมเบรนซ2�ง่ท+าจุากเซลล6โลสุเป#นการกรอง่ผ่%านเมมเบรนซ2�ง่ท+าจุากเซลล6โลสุอะซ�เตสุ ท��ม�ร6ขีนาด อะซ�เตสุ ท��ม�ร6ขีนาด 0.45 0.45 ไมโครเมตร ท+าให'ไมโครเมตร ท+าให'สุามารถี่แยกแบคท�เร�ย ย�สุต� และเชี��อราได' เม��อสุามารถี่แยกแบคท�เร�ย ย�สุต� และเชี��อราได' เม��อน+าแผ่%นเมมเบรนท��ผ่%านการกรอง่แล'วมาวาง่บนน+าแผ่%นเมมเบรนท��ผ่%านการกรอง่แล'วมาวาง่บนอาหารเล��ยง่เชี��อแล'วท+าการบ%ม สุารอาหารจุะถี่6ดอาหารเล��ยง่เชี��อแล'วท+าการบ%ม สุารอาหารจุะถี่6ดด6ดซ2มจุากด'านล%าง่ขีอง่เมมเบรนท+าให'จุ�ล�นทร�ย�ด6ดซ2มจุากด'านล%าง่ขีอง่เมมเบรนท+าให'จุ�ล�นทร�ย�สุามารถี่เจุร�ญ่เต�บโตได'บนผ่�วหน'าผ่�วขีอง่เมสุามารถี่เจุร�ญ่เต�บโตได'บนผ่�วหน'าผ่�วขีอง่เมมเบรนได'มเบรนได'

เทคน�คต%าง่ๆท��ใชี'ว�เคราะห�ปร�มาณจุ�ล�นทร�ย�

ว�ธิ์�การกรอง่ม�ขี'อจุ+าก�ดค�ออาหารท��น+าว�ธิ์�การกรอง่ม�ขี'อจุ+าก�ดค�ออาหารท��น+ามากรอง่ต'อง่ใสุแบะไม%ควรม�ชี��นเศัษอาหารมากรอง่ต'อง่ใสุแบะไม%ควรม�ชี��นเศัษอาหารหร�อเซลล�จุ�ล�นทร�ย� ซ2ง่จุะท+าให'เมมเบรนหร�อเซลล�จุ�ล�นทร�ย� ซ2ง่จุะท+าให'เมมเบรนเก�ดการอ�ดต�นได'เก�ดการอ�ดต�นได'

เป#นว�ธิ์�ท��น�ยมใชี'ในการว�เคราะห�จุ�ล�นทร�ย�เป#นว�ธิ์�ท��น�ยมใชี'ในการว�เคราะห�จุ�ล�นทร�ย�พวก โคล�ฟอร�มในน+�าด��มหร�อน+�าบร�โภูคพวก โคล�ฟอร�มในน+�าด��มหร�อน+�าบร�โภูคต%าง่ๆต%าง่ๆ

เทคน�คต%าง่ๆท��ใชี'ว�เคราะห�ปร�มาณจุ�ล�นทร�ย�

ว�ธิ์� Membrane Filtration

เทคน�คต%าง่ๆท��ใชี'ว�เคราะห�ปร�มาณจุ�ล�นทร�ย�2.5 2.5 ว�ธิ์� ว�ธิ์� Most Probable Number Most Probable Number

(MPN)(MPN) เป-นเทคน คการตัรวจุสุอบปร มาณจุ�ลิ นทร�ย�ในตั�วอย/างท�'เป-นเป-นเทคน คการตัรวจุสุอบปร มาณจุ�ลิ นทร�ย�ในตั�วอย/างท�'เป-น

ของเหลิว แลิะม�ปร มาณน*อยมากจุนไม/สุามารถึตัรวจุสุอบได้*ด้*วยของเหลิว แลิะม�ปร มาณน*อยมากจุนไม/สุามารถึตัรวจุสุอบได้*ด้*วยว�ธิ์�อ'น ม�กใชื้*ในการตัรวจุสุอบเชื้อ ว�ธิ์�อ'น ม�กใชื้*ในการตัรวจุสุอบเชื้อ Escherichia coli Escherichia coli ท�'ปนท�'ปนเป> อนในอาหารเป> อนในอาหาร

ว ธิ์�การม�กเตัร�ยมตั�วอย/างท�'ม�ความเข*มข*นแตักตั/างก�น ว ธิ์�การม�กเตัร�ยมตั�วอย/างท�'ม�ความเข*มข*นแตักตั/างก�น 3 3 ชื้�ด้ ความชื้�ด้ ความเข*มข*นม�กแตักตั/างก�น เข*มข*นม�กแตักตั/างก�น 10 10 เท/า เชื้/น เท/า เชื้/น 1010-1 -1 1010-2 -2 แลิะ แลิะ 1010-3-3 เป-นตั*น โด้ยแตั/ลิะชื้�ด้จุะใชื้*หลิอด้ทด้ลิอง เป-นตั*น โด้ยแตั/ลิะชื้�ด้จุะใชื้*หลิอด้ทด้ลิอง 3 3 หลิอด้ อาจุม�การใสุ/หลิอด้ อาจุม�การใสุ/หลิอด้ตัร&งก?าซหลิอด้ตัร&งก?าซ(duhrum tube) (duhrum tube) โด้ยการคว3'าหลิอด้ลิงไม/ให*ม�โด้ยการคว3'าหลิอด้ลิงไม/ให*ม�อากาศเข*าก/อนเตัร�ยมอาหารเลิ�ยงเชื้ออากาศเข*าก/อนเตัร�ยมอาหารเลิ�ยงเชื้อ

หากหลิอด้ใด้เก ด้ปฏิ ก ร ยาการเปลิ�'ยนแปลิงของสุ�หรอเก ด้ฟองก?าซหากหลิอด้ใด้เก ด้ปฏิ ก ร ยาการเปลิ�'ยนแปลิงของสุ�หรอเก ด้ฟองก?าซ

เทคน�คต%าง่ๆท��ใชี'ว�เคราะห�ปร�มาณจุ�ล�นทร�ย�

น3าผิลิท�'ได้*จุากการทด้สุอบ เพ'อเปร�ยบเท�ยบน3าผิลิท�'ได้*จุากการทด้สุอบ เพ'อเปร�ยบเท�ยบจุ3านวนจุ�ลิ นทร�ย� ด้*วยตัาราง จุ3านวนจุ�ลิ นทร�ย� ด้*วยตัาราง MPN MPN จุะท3าให*จุะท3าให*ทราบจุ3านวนจุ�ลิ นทร�ย�ท�'อย5/ในอาหารน�นๆทราบจุ3านวนจุ�ลิ นทร�ย�ท�'อย5/ในอาหารน�นๆ

ม�ท�งแบบว ธิ์�ใชื้* ม�ท�งแบบว ธิ์�ใชื้* 5 5 หลิอด้ แลิะ หลิอด้ แลิะ 3 3 หลิอด้ในการหลิอด้ในการทด้สุอบทด้สุอบ

ค/า ค/า MPN MPN ท�'ได้*จุะตั*อง ค5ณด้*วยความเข*มข*นท�'ได้*จุะตั*อง ค5ณด้*วยความเข*มข*นเร 'มตั*นของชื้�ด้ทด้ลิองแรกเสุมอเร 'มตั*นของชื้�ด้ทด้ลิองแรกเสุมอ

เทคน�คต%าง่ๆท��ใชี'ว�เคราะห�ปร�มาณจุ�ล�นทร�ย�

จุากต�วอย%าง่ ตรวจุจุ+านวน จุากต�วอย%าง่ ตรวจุจุ+านวน E.coil E.coil ด'วยด'วยว�ธิ์� ว�ธิ์� MPN MPN แบบ แบบ 5 5 หลอดเก�ดปฏิ�ก�ร�ยาในหลอดเก�ดปฏิ�ก�ร�ยาในหลอดทดลอง่ค�อ หลอดทดลอง่ค�อ 5-2-0 5-2-0 เม��อไปเป:ดเม��อไปเป:ดตาราง่ ตาราง่ MPN MPN แบบ แบบ 5 5 หลอดจุะพบว%าได'หลอดจุะพบว%าได'จุ+านวน จุ+านวน MPN MPN เท%าก�บ เท%าก�บ 4.9 MPN/ml 4.9 MPN/ml

ซ2�ง่การทดลอง่ความเขี'มขี'นแรกค�อ ซ2�ง่การทดลอง่ความเขี'มขี'นแรกค�อ 10 10 -1-1 10 10-2-2 10 10-3-3 ด�ง่น��นจุ+านวน ด�ง่น��นจุ+านวน MPN MPN จุร�ง่ๆค�อ จุร�ง่ๆค�อ 0.49 MPN/ml of 0.49 MPN/ml of E.coliE.coli

MPN table

แบบฝึ<กห�ดท'ายบท

CFU CFU หมายถี่2ง่อะไรหมายถี่2ง่อะไรAseptic technique Aseptic technique ค�ออะไรค�ออะไร Pour Plate Pour Plate ม�ขี'อแตกต%าง่อย%าง่ไรก�บ ม�ขี'อแตกต%าง่อย%าง่ไรก�บ Spread Spread

plate plate ต%อการเจุร�ญ่ขีอง่จุ�ล�นทร�ย�ในอาหารเล��ยง่เชี��อต%อการเจุร�ญ่ขีอง่จุ�ล�นทร�ย�ในอาหารเล��ยง่เชี��อ MPN MPN หมายถี่2ง่อะไรหมายถี่2ง่อะไร

เอกสุารอ'าง่อ�ง่นงลิ�กษณ� สุ�วรรณพ น จุ แลิะ ปร�ชื้า สุ�วรรณพ น จุ.2544. จุ�ลชี�วว�ทยา

ท��วไป.พ มพ�คร�งท�' 3 เท�กซ� แอนด้� เจุอร�น�ลิ พ�บลิ เคชื้�'น จุ3าก�ด้. น.42-73

อ�ชื้ชื้า บ�ญม�. 317 211 ว�ชีาจุ�ลชี�วว�ทยาท��วไป [ออนไลิน�] ค*นจุาก 202.28.94.202/.../317_211_-_Bacteria_(1)_2550_2-small.pdf [ ม ถึ�นายน 2553]

Adams, M. R. Food microbiology. / M. R. Adams and M. O. Moss. Cambridge : Royal Society of Chemistry,

1995. Atlas, Ronald M. Principles of microbiology. / Ronald

- M. Atlas. Boston, Mass. : WCB/McGraw Hill, 1997.Bacteria. [On-line] Retrieved from

www.jochemnet.de/fiu/lab7.pdf [June 2010]