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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA E RECURSOS NATURAIS DA AMAZÔNIA
Prospecção Química e Biológica de Fungos Endofíticos associados à
Aniba rosaeodora (Lauraceae)
CELINA DE JESUS SILVA
Manaus
2010
Programa de Pós‐Graduação em Biotecnologia e Recursos
Naturais da Amazônia
Programa de Pós‐Graduação em Biotecnologia e Recursos
Naturais da Amazônia
42
Ficha Catalográfica
S586p Silva, Celina de Jesus. Prospecção química e biológica de fungos endofíticos
associados à Aniba Rosaeodora (Lauraceae) / Celina de Jesus Silva. -- Manaus : Universidade do Estado do Amazonas, 2010.
88 f. : il.
Dissertação de Mestrado do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Recursos Naturais da Amazônia - UEA, 2010.
Orientador: Profª. Dra. Sandra Patrícia Zanotto.
1. Fungos Endofíticos. 2. Aniba rosaeodora. 3. Linalol. 4. Terpenos. I. Título.
Ficha Catalográfica elaborada pela bibliotecária Suziane Batista.
43
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA E RECURSOS NATURAIS DA AMAZÔNIA
CELINA DE JESUS SILVA
Prospecção Química e Biológica de Fungos Endofíticos associados à
Aniba rosaeodora (Lauraceae)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biotecnologia e Recursos
Naturais da Amazônia, da Universidade do
Estado do Amazonas como requisito para
obtenção do título de Mestre.
Orientação: Dra. Sandra Patricia Zanotto
Co-Orientação: Dra. Antônia Queiroz Lima de Souza
Manaus
2010
Programa de Pós‐Graduação em Biotecnologia e Recursos
Naturais da Amazônia
Programa de Pós‐Graduação em Biotecnologia e Recursos
Naturais da Amazônia
44
CELINA DE JESUS SILVA
Prospecção Química e Biológica de Fungos Endofíticos associados à
Aniba rosaeodora (Lauraceae)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biotecnologia e Recursos
Naturais da Amazônia, da Universidade do
Estado do Amazonas como requisito para
obtenção do título de Mestre.
Aprovado em: Manaus, 24 de março de 2010.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________________
Professora Dra. Sandra Patricia Zanotto
Universidade do Estado do Amazonas
________________________________________________
Professora Dra. Yamile Benaion
Centro Universitário Nilton Lins
_________________________________________________
Professor Dr. Jamal Chaar
Universidade Federal do Amazonas
45
DEDICO ESTE TRABALHO
Aos meus pais, Raimundo e Arilene, pelo amor, incentivo e paciência.
Ao meu querido irmão, Felipe, pelo amor, incentivo, paciência e os momentos
descontração.
Ao meu querido amor, amigo e companheiro, Anderson, pelo apoio.
Aos meus parentes e amigos.
46
AGRADECIMENTOS
À professora Dra. Sandra Zanotto pela orientação e por ter acreditado na minha
capacidade;
À professora Dra. Antônia Souza, que pacientemente me ajudava quando eu precisava,
além de sempre ter uma palavra de conforto nos momentos difíceis;
Ao professor Dr. Paulo de Tarso, por ter me ajudado na coleta dos tecidos vegetais de
Aniba rosaeodora para isolamento dos fungos endofíticos;
Ao professor Dr. Sérgio Duvoisin Jr., por ter me ajudado com as análises em
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) das amostras, me ensinando a técnica e
por sempre estar disposto a ajudar quando eu precisava;
À professora Dra. Aurea Echevarría, por ter colaborado com as análises em
cromatografia de fase gasosa acoplada ao espectrômetro de massas (CG/EM), na
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ);
Ao professor Dr. Afonso Souza, pela colaboração para execução dos testes
antimicrobianos, cedendo seu laboratório na Universidade Federal do Amazonas
(UFAM);
Ao amigo Rafael Lopes e Oliveira, por ter ajudado a dar os primeiros passos no trato
com fungos endofíticos;
Aos amigos do curso de mestrado Dolores, Juci, Danielle, Márcia, Renah, Sandro, pelos
momentos de descontração, companheirismo e aprendizagem;
Aos alunos de iniciação científica Soraya, Fabiana, Andréia, Fabrícia, Marta, Saloni,
Yan, Starley, Thiago, Rick, Nadia, Gabriel, Adriana e Cássia pelos momentos de
descontração e ajuda;
47
Ao querido Emerson Bacelar pelas longas conversas, pelo apoio nos momentos difíceis,
e pelos filosóficos ensinamentos;
Ao professor Dr. Lozano, por sempre ter um bom conselho nos momentos de
dificuldade;
A todos que contribuíram direta ou indiretamente para o desenvolvimento deste
trabalho,
MUITO OBRIGADA!
49
RESUMO
Fungos endofíticos são microrganismos que vivem no interior das plantas sem causar
dano aparente. O resultado dessa relação mútua pode justificar a produção de compostos
de importância para biotecnologia. Como exemplo de árvore nativa da região
amazônica, Aniba rosaeodora é produtora de óleo essencial rico em linalol, um
metabólito secundário de grande interesse comercial. Considerando dados na literatura
que reportam a capacidade dos fungos endofíticos produzirem, in vitro, metabólitos
idênticos aos da planta hospedeira, o estudo com fungos endofíticos torna-se uma
alternativa viável para busca por uma nova fonte para produção de linalol e de outros
compostos que possam ter bioatividades relevantes. Foi possível isolar 262 fungos de
quatro espécimes de A. rosaeodora. Esses fungos foram submetidos a processo de
fermentação e após quatorze dias, os sobrenadantes foram analisados em aparelho de
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), resultando em dez amostras que
apresentaram cromatogramas com perfil diferenciado entre si e dezessete amostras que
sugeriam a presença de linalol. Essas amostras foram fracionadas e encaminhadas para
análise por aparelho de cromatografia de fase gasosa acoplada ao espectrômetro de
massas (CG/EM). Sete amostras apresentaram espectro com o perfil de fragmentação
semelhante ao perfil de linalol; o que sugere a produção deste composto pelos fungos
endofíticos. Também foi possível observar na constituição dos sobrenadantes outras
substâncias, como farnesol; citronelol; undecano; álcool fenetílico, entre outras. Para
avaliação da atividade antibacteriana e antifúngica os sobrenadantes dos fungos com os
códigos PRII-Fo 68 e PRII-Ca 256 apresentaram atividade inibitória para o crescimento
de Pseudomonas aeruginosa, com média dos halos de inibição de 26 mm e 10 mm de
diâmetro, respectivamente, e os extratos dos micélios dos fungos com os códigos PRIII-
Fo 134 e PRIII-Fo 136 apresentaram atividade inibitória para o crescimento de
Penicillium avelani, com média dos halos de inibição de 23 mm e 28 mm de diâmetro,
respectivamente. Foi feito cultura em larga escala do fungo com código PRII-Fo 68 e o
50
sobrenadante passou por processo de partição líquido-líquido resultando em extratos de
diferentes polaridades. Esses resultados sugerem boa perspectiva para uma possível
nova fonte de linalol, e de outras substâncias que podem ter utilidade biotecnológica.
Uma maneira sustentável para o resguardo da espécie vegetal (A. rosaeodora) do risco
de extinção.
Palavras chave: Fungos endofíticos, Aniba rosaeodora, linalol, terpenos
ABSTRACT
Endophytic fungi are microorganisms that live inside plants without causing apparent
damage. The result of this mutual relationship can justify the production of important
compounds to the biotechnology. As an example of an Amazon native tree, Aniba
rosaeodora is producer of essential oil rich in linalool, a secondary metabolite of great
commercial interest. Considering the literature, that report the capacity of endophytic
fungi to produce, in vitro, metabolites identical to them of the host plant, the study with
endophytic fungi becomes a viable alternative to search for a new source for production
of linalool and other compounds that may have relevant activity. Were isolated 262
fungi from four specimens of A. rosaeodora. These fungi were subjected to
fermentation and after fourteen days, the supernatants were analyzed in the
chromatograph high performance liquid chromatography (HPLC), resulting in ten
samples with chromatograms with different profile to each other and seventeen samples
suggested the presence of linalool . These samples were fractionated and sent for
analysis by a gas chromatography coupled to mass spectrometer (GC/MS). Seven
samples showed a spectrum with the fragmentation profile similar to the profile of
linalool standard, which suggests the production of this compound by endophytic fungi.
They also observed the formation of supernatants other substances, such as farnesol,
citronellol, undecane, phenethyl alcohol, among others. To evaluate the antibacterial
and antifungal activity of supernatants of fungi with the codes PRII-Fo 68 and PRII-Ca
256 showed inhibitory activity for the growth of Pseudomonas aeruginosa, with
average inhibition zones of 26 mm and 10 mm in diameter, respectively, and extracts of
the mycelium of the fungi with the codes PRIII-Fo 134 and PRIII-Fo 136 showed
inhibitory activity for the growth of Penicillium avelani, with average inhibition zones
of 23 mm and 28 mm in diameter, respectively. Was done on a large scale culture of the
51
fungus with code PRII-Fo 68 and the supernatant was submitted to a liquid-liquid
partition resulting in extracts of different polarities. These results suggest good
prospects for a possible new source of linalool, and other substances that may be useful
in biotechnology. A sustainable way to guard the plant species (A. rosaeodora) the risk
of extinction.
SUMÁRIO
PÁGINA
RESUMO viii
ABSTRACT ix
LISTA DE FIGURAS xiii
LISTA DE TABELAS xv
LISTA DE GRÁFICOS xvii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS xviii
1 INTRODUÇÃO 1
1.1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 6
1.1.1 FUNGOS 6
1.1.1.1 Fungos endofíticos 11
1.1.2 FAMÍLIA LAURACEAE 19
1.1.2.1 Aniba rosaeodora Ducke 23
2 OBJETIVOS 25
2.1 GERAL 26
2.2 ESPECÍFICOS 26
3 METODOLOGIA 27
52
3.1 ISOLAMENTO DOS FUNGOS ENDOFÍTICOS DE Aniba rosaeodora 28
3.1.1 COLETA 28
3.1.2 ISOLAMENTO 30
3.1.2.1 Desinfecção superficial 30
3.1.2.2 Inoculação dos fragmentos vegetais 30
3.1.3 PURIFICAÇÃO 32
3.2 PRODUÇÃO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS 32
3.2.1 FERMENTAÇÃO 32
3.2.2 EXTRAÇÃO DOS METABÓLITOS 32
3.3 TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS PARA ANÁLISE DOS
METABÓLITOS
34
3.3.1 TRIAGEM DE PRODUÇÃO DE LINALOL 34
3.3.1.1 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) 34
3.3.1.2 Cromatografia de fase gasosa acoplada ao espectrômetro de massas
(CG/EM)
35
3.4 DETECÇÃO DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA 35
3.4.1 AVALIAÇÃO DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO BACTERIANO 35
3.4.2 AVALIAÇÃO DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO FÚNGICO 36
3.5 CULTIVO EM LARGA ESCALA 37
3.6 IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS 38
3.6.1 IDENTIFICAÇÃO TAXONÔMICA MORFOLÓGICA 38
3.6.2 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR 39
3.6.2.1 Extração de DNA 39
3.6.2.1.1 Manipulação dos reagentes 39
3.6.2.1.2 Extração de DNA fúngico 39
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES 41
4.1 ISOLAMENTOS DE FUNGOS ENDOFÍTICOS DE A. rosaeodora 42
4.1.1 COLETA, ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO 42
4.2 PRODUÇÃO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS 51
4.2.1 FERMENTAÇÃO 51
4.3 TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS PARA ANÁLISE DOS
METABÓLITOS SECUNDÁRIOS
55
53
4.3.1 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA 55
4.3.2 CROMATOGRAFIA DE FASE GASOSA ACOPLADA AO
ESPECTRÔMETRO DE MASSAS
63
4.4 DETECÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA 78
4.5 CULTIVO EM LARGA ESCALA 80
5 CONCLUSÕES 83
6 PERSPECTIVAS 86
7 REFERÊNCIAS 88
54
LISTA DE FIGURAS
PÁGINA
Figura 1 Estrutura química do 3,7-dimetil-1,6-octadien-3-ol (linalol) 2
Figura 2 Metabólitos secundários de fungos idênticos às substâncias isoladas da
planta hospedeira
4
Figura 3 Substâncias isoladas de fungos utilizadas como agroquímicos 5
Figura 4 Estruturas químicas de micotoxinas 8
Figura 5 Antibióticos de origem fúngica 9
Figura 6 Substâncias de origem fúngica com diferentes atividades farmacológicas 10
Figura 7 Substâncias de origem fúngica que conferem vantagens para planta
hospedeira
14
Figura 8 Via metileritritolfosfato 16
Figura 9 Árvores de Aniba rosaeodora selecionadas para isolamento dos fungos
endofíticos
28
Figura 10 Material vegetal coletado de cada espécime de A. rosaeodora 29
Figura 11 Armazenamento em sacos plásticos hermeticamente fechados 30
Figura 12 Desinfecção superficial 31
Figura 13 Inoculação dos fragmentos 31
Figura 14 a) Frascos de erlenmeyer no aparelho shaker, com caldo de batata dextrose
e inóculo fúngico
b) Filtração à vácuo para separação do micélio e sobrenadante
33
Figura 15 Sobrenadante filtrado e mantido à -19° C 33
Figura 16 Massa micelial após filtração e submersa em etanol 33
55
Figura 17 Aparelho de Cromatografia líquida de alta eficiência utilizado nas análises 34
Figura 18 Difusão em Agar das amostras para avaliação da atividade antimicrobiana 36
Figura 19 Frascos de erlenmeyer com 300mL de meio de cultura líquido cada para
cultivo em larga escala
38
Figura 20 a) Partição do sobrenadante do cultivo em larga escala b) Trituração do
micélio remanescente após a filtração à vácuo
38
Figura 21 Reação de equilíbrio da solução de hipoclorito de sódio 42
Figura 22 Fungo classificado no grupo 4 (PRII-Fo 56) 54
Figura 23 Sobreposição de cromatogramas: Sobrenadante sem inoculo fungico (A) e
sobrenadante do fungo com código PRI-Fo 7 (B)
56
Figura 24 Sobreposição de cromatogramas: Sobrenadante do fungo com código PRII
– Ca 100 (A) e Sobrenadante do fungo com código PRI - Ca 30 (B)
57
Figura 25 Cromatograma da amostra de PRI – Fo 8 58
Figura 26 Cromatograma da amostra de PRII – Fo 56 58
Figura 27 Cromatograma da amostra de PRII – Fo 58 58
Figura 28 Cromatograma da amostra de PRII – Fo 71 59
Figura 29 Cromatograma da amostra de PRIII – Fo 136 59
Figura 30 Cromatograma da amostra de PRIII – Fo 148 59
Figura 31 Cromatograma da amostra de PRIII – FoMF 156 60
Figura 32 Cromatograma da amostra de PRIII – Fl 188 60
Figura 33 Cromatograma da amostra de PRIII – Fl 189 60
Figura 34 Cromatograma da amostra de PRII – Se 253 61
Figura 35 Cromatograma da amostra padrão de linalol 61
Figura 36 Espectro de massas do linalol 73
Figura 37 a) Halo de inibição do sobrenadante de PRII-Fo 68; b) Halo de inibição do
sobrenadante de PRII-Ca 256
79
Figura 38 a) Halo de inibição do sobrenadante de PRIII-Fo 134; b) Halo de inibição
do sobrenadante de PRIII-Ca 136
79
Figura 39 Micélio do fungo PRII-Fo 68 em 300 mL de meio de cultura líquido 80
Figura 40 Erlenmeyer do lado esquerdo: meio de cultura sem inoculo; erlenmeyer do
lado direito sobrenadante
81
Figura 41 Micélio triturado em extração com etanol 81
Figura 42 Cromatografia em camada delgada do extrato etanólico do micélio de 82
56
PRII- Fo 68
LISTA DE TABELAS
PÁGINA
Tabela 1 Utilidade para espécies do gênero Ocotea 20
Tabela 2 Espécies do gênero Ocotea utilizadas na medicina tradicional 22
Tabela 3 Quantidade de fungos isolados em cada espécime e parte vegetal de A.
rosaeodora
43
Tabela 4 Grupos e características dos fungos endofíticos de A. rosaeodora 45
Tabela 5 Taxa de colonização de cada espécime e parte vegetal 48
Tabela 6 Taxa de colonização de cada espécime 49
Tabela 7 Quantidade de fungos isolados por meio de cultura 50
Tabela 8 Quantidades de fungos com crescimento micelial nas condições de
fermentação
52
Tabela 9 Distribuição dos fungos com crescimentos micelial por grupo 53
Tabela 10 a) descrição dos picos do cromatograma A; b) descrição dos picos do
cromatograma B
56
Tabela 11 a) descrição dos picos do cromatograma A; b) descrição dos picos do
cromatograma B
57
Tabela 12 Amostras que apresentaram aumento da área do pico no cromatograma 62
Tabela 13 Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRI – FoMF
12
63
Tabela 14 Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRI – Fo 8 63
Tabela 15 Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIII – Fo 136 64
Tabela 16 Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIII – FoMF 156
64
57
Tabela 17 Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRII- Ca 258 65
Tabela 18 Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIII – Fo 148 65
Tabela 19 Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIII – Fl 188 66
Tabela 20 Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIII – Fl 189 67
Tabela 21 Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRII – Fo 61 67
Tabela 22 Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRI – Fo 6 67
Tabela 23 Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRII – Fo 58 68
Tabela 24 Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIII – CaMF 183
68
Tabela 25 Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRII – Fo 71 69
Tabela 26 Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRII – 56 69
Tabela 27 Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIV – Fo 198
70
Tabela 28 Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIII – Ca 159
71
Tabela 29 Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIII – Fo 140 71
Tabela 30 Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIII – Ca 180
72
Tabela 31 Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIII – Ca 168
72
Tabela 32 Amostras que apresentaram presença do linalol 73
Tabela 33 Compostos em comum entre as amostras 74
58
LISTA DE GRÁFICOS
PÁGINA
Gráfico 1 Quantidade de fungos isolados por parte vegetal de cada espécime 44
Gráfico 2 a) Distribuição total dos isolados fúngicos em grupos
b) Distribuição dos grupos de isolados fúngicos cultivados em M.F.
c) Distribuição dos grupos de isolados fúngicos cultivados em B.D.A.
47
Gráfico 3 Quantidade de fungos encontrados e isolados por n° de fragmentos de cada
parte vegetal
49
Gráfico 4 Qtde de fungos encontrados e isolados por n° de fragmentos de cada espécime 50
Gráfico 5 Porcentagem de fungos com crescimento micelial por grupo 54
59
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
°C Grau Celsius
AM Amazonas
BDA Agar batata dextrose
Ca Galhos
CG-EM Cromatografia em fase Gasosa acoplada a Espectrometria de Massa
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Resolução
cm Centímetro
DMSO Dimetilsufóxido
DNA Ácido Desoxirribonucléico
Fl Flores
Fo Folhas
Fr Frutos
g Gramas
g/L Gramas por litro
h Horas
IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais
Renováveis
INPA Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia
ITS Internal Transcribed Spacers (Espaço Interno Transcrito)
Km Quilometro
L Litros
M Molar
MF Meio Folha
Min Minutos
60
MHA Agar Müller Hinton
mL Mililitro
n° Número
NaCl Cloreto de Sódio
NaOH Hidróxido de Sódio
PCR Polymerase Chain Reaction (Reação de Cadeia polimerase)
PRI Espécime I de A. rosaeodora;
PRII Espécime II de A. rosaeodora
PRIII Espécime III de A. rosaeodora
PRIV Espécime IV de A. rosaeodora
Se Sementes
T.C. Taxa de Colonização
T.R. Tempo de retenção
UEA Universidade do Estado do Amazonas
μL Microlitro
62
1 INTRODUÇÃO
A Amazônia possui a mais rica variedade de espécies vegetais e animais do
mundo e, com a tendência mundial para revalorização dos produtos de origem natural
que substituam os sintéticos, ela representa um foco de manejo equilibrado da
biodiversidade, permitindo um desenvolvimento sustentável para a região (SILVÉRIO,
2004).
Em anos de pesquisa voltada para busca de compostos bioativos, as plantas são
fornecedoras de novas substâncias usadas para as mais diversas finalidades. Podem ser
utilizadas tanto na produção de medicamentos ou utilização do conhecimento
tradicional para prevenir e curar doenças, quanto na indústria de alimentos e cosméticos,
na produção de aromatizantes, flavorizantes ou antioxidantes (PLETSCHI, 1998;
PINTO et al., 2002).
Um exemplo de planta nativa da região amazônica é a Aniba rosaeodora,
produtora de um óleo essencial com ingredientes úteis na indústria de cosméticos, cujo
principal constituinte é o linalol (3,7-dimetilocta-1,6-dien-3-ol), um metabólito
secundário utilizado como fixador de perfumes (MAIA et al., 2007). Devido à produção
desse constituinte, A. rosaeodora tem sido intensiva e desordenadamente explorada
desde 1950, e por isso, é uma espécie que se encontra em risco de extinção
(GONÇALVES et al., 2005; LIMA E CHAAR, 2006).
O linalol é um monoterpeno alcoólico terciário de cadeia aberta (Figura 1) e,
por possuir um átomo de carbono assimétrico, apresenta-se como mistura racêmica em
várias espécies vegetais. Tem sido utilizado principalmente, como fixador de aromas na
indústria de cosméticos e como composto de partida para várias sínteses importantes -
como a do acetato de linalila que também possui uma grande capacidade de fixação.
Esse composto também tem sido testado como acaricida, bactericida e fungicida; além
63
de ter apresentado resultados promissores como sedativo e anticonvulsivante (SILVA et
al., 2003).
Figura 1 - Estrutura química do 3,7-dimetil-1,6-octadien-3-ol (linalol)
O óleo essencial de A. rosaeodora é majoritariamente extraído da madeira e,
para produzir 200 litros de óleo através dos métodos tradicionais de destilação, é
necessário processar de 16 a 30 toneladas de madeira. O volume de óleo de pau-rosa
exportado já atingiu mais de 500 t/ano, com cerca de 50 destilarias instaladas na região
amazônica, extraindo aproximadamente 50 mil t/ano de madeira de pau-rosa de florestas
nativas (SAMPAIO, 2003). Diante da exploração descontrolada surgiu a necessidade de
alternativas para conservação e ao mesmo tempo para a utilização adequada do recurso
natural.
O sucesso do manejo dos plantios de pau-rosa visando produção de óleo a
partir de galhos e de folhas depende da capacidade de rebrota e do crescimento dos
novos brotos. A capacidade de rebrota aliadas à maior produtividade de óleo dos galhos
e folhas em relação à madeira das árvores indica que este método pode ser considerado
como uma alternativa para o manejo sustentável de pau-rosa. Um estudo silvicultural
demonstrou que a produtividade e a qualidade do óleo essencial de pau-rosa extraído de
folhas e galhos de plantios de diferentes idades no município de Maués – AM é maior e
melhor em amostras com idades entre 2 a 5 anos (LIMA E CHAAR, 2006).
Estudos com microrganismos associados às plantas - fungos e bactérias
endofíticos - se tornou outro tema recorrente na pesquisa em Química de Produtos
Naturais realizada hoje no Brasil, como uma alternativa para conservação de inúmeras
espécies vegetais. Estes microrganismos vivem em associação íntima com as plantas
hospedeiras vivas e sadias, podendo imitá-las quanto à produção de metabólitos
secundários e conferir as mesmas uma maior adaptação ao meio ambiente e suas
variações físicas, químicas, sazonais e microbiológicas.
Dados na literatura têm reportado a capacidade dos fungos endofíticos
produzirem in vitro metabólitos secundários idênticos aos da planta hospedeira (Figura
2). O primeiro exemplo e o que deu impulso aos estudos com fungos endofíticos foi o
OH
64
isolamento do metabólito secundário Taxol (estrutura 2 da figura 2) da espécie fúngica
Taxomyces andreanae - fungo endofítico de Taxus brevifolia (Taxaceae). Este
composto é um agente terapêutico antineoplásico, isolado por Strobel e colaboradores
em 1993. Outro exemplo é a substância vincristina (estrutura 3 da figura 2), também
com atividade anticancerígena, é produzida pelo fungo endofítico Mycelia sterilia
associado à Catharanthus roseus, sendo isolada por Yang e colaboradores em 2004.
Eyberger e sua equipe isolou em seu estudo com o fungo endofítico Phialocephala
fortinii, associado à Podophyllum peltatum, a Podofilotoxina (estrutura 4 da figura 2),
um precursor natural para três drogas anticancerígenas - teniposido, etoposido e
etoposido fosfatado - substância primeiramente encontrada na planta Podophyllum
emodi e por dificuldades para total síntese do composto houve necessidade por uma
nova fonte natural (STROBEL, 2003; GUIMARÃES, 2006; EYBERGER et al., 2006).
O
NH
O
O
OH
OH
O
O
OH
O
O
O
O
O
O
O
O
O
OH
O
OMe
OMeOMe
NH
N
OH
N
OMe CHO
N
O
OHH
H
O
CO2CH3
CO2CH3
2 - Taxol
4 - Podofilotoxina
3 - Vincristina Figura 2 - Metabólitos secundários de fungos idênticos às substâncias isoladas da planta hospedeira
65
Além dos investimentos da indústria farmacêutica na produção de
medicamentos a partir de substâncias de origem fúngica, a indústria agroquímica
também tem bons resultados com compostos isolados a partir dos fungos, os quais se
apresentam menos tóxicos do que os agroquímicos sintéticos (Figura 3). Pode-se citar
como exemplos destruxinas (inseticidas) (estrutura 5 da figura 3) produzidas pelo fungo
Beauveria felina; estrobirulinas (fungicidas) (estrutura 6 da figura 3) isoladas de um
cogumelo identificado como Strobilurus tenacellu, e várias toxinas como as produzidas
pelo fungo Nimbya alternantherae que agride rápida e violentamente a planta daninha
Alternanthera philoxeroides (PINTO et al., 2002; TERÃO et al., 2005; OLIVEIRA et
al., 2006; DEMUNER et al., 2006).
NH
NN
NH
OO
OO
OO
N
O
N N
O
N
OO
O
5 - Destruxina B
6 - Azoxystrobin
Figura 3 - Substâncias isoladas de fungos utilizadas como agroquímicos
Considerando esses aspectos, realizar a triagem dos metabólitos produzidos
pelos fungos endofíticos surge como uma nova alternativa que gerará conhecimento e
contribuirá para preservação da espécie fúngica e da planta a que esta associada.
66
Portanto, o estudo com fungos endofíticos associados à A. rosaeodora
favorecerá a identificação de espécies produtoras de linalol, bem como de outros
constituintes ativos com possível aplicação na biotecnologia, possibilitando o
surgimento de outra fonte natural de metabólitos e assim colaborando para a
preservação das espécies.
1.1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1.1 FUNGOS
Os fungos são seres eucariotos, podendo ser haploides, diploides ou
poliploides; com parede rígida quitinosa constituída de polímeros de amino-açúcares.
São heterotróficos, dependendo de substâncias orgânicas disponíveis. Desprovidos de
clorofila, são incapazes de produzir energia por meio da luz e do gás carbônico.
Pertencentes ao reino Fungi, são altamente eficientes na degradação de uma ampla
variedade de substratos e podem se apresentar nas formas leveduriforme e hifal.
Responsáveis pela produção de substâncias de interesse comercial, os fungos também
representam importantes agentes decompositores dos componentes primários da
madeira - lignina e celulose - o que resulta em um controle na produção de biomassa em
um ecossistema florestal (MINAMI, 2003).
Segundo Loguercio-Leite (2004), os fungos estão agrupados em quatro filos:
Chytridiomicota, Zygomycota, Ascomycota e Basidiomycota. Do primeiro, fazem parte
os fungos mais simples e com dimensões muito pequenas, que normalmente apresentam
esporos flagelados. É considerada a linhagem mais primitiva de fungos. O filo
Zygomycota apresenta duas classes: Zygomycetes e Trichomycetes. A classe
Zygomycetes é distinguida pela produção de um esporo de resistência, de origem sexual,
o zigosporo. Algumas espécies são utilizadas na fabricação de produtos industriais
como amilases (Mucor racemosus), β-caroteno (Blakeslea trispora), ácido cítrico
(Mucor piriformes), ácido fumárico (Rhizopus oryzae) e alguns alimentos. O filo
Ascomycota possui o maior número de espécies até agora encontradas, e devido à
variabilidade estrutural e numérica, ainda não existe uma delimitação mais precisa das
67
suas categorias taxonômicas superiores. Existem cerca de nove classes de ascomicetos
que continuam em discussões entres os especialistas. Por fim, o filo Basidiomycota
onde a maioria das espécies produz estruturas protetoras macroscópicas. São utilizados
como fonte de proteínas e outros são cultivados comercialmente. Outros são
comestíveis ou produtores de antibióticos (LOGUERCIO-LEITE, 2004).
Os fungos constituem um ótimo modelo para estudos em eucariontes devido à
sua simplicidade se comparado a outros seres. Eles possuem entre 30 a 35 milhões de
pares de nucleotídeos no genoma. Diversas características do DNA de fungos são
semelhantes a de outros eucariontes. Por exemplo, seus cromossomos também possuem
histonas e centrômeros; seus genes possuem introns e exons, sendo os introns em menor
quantidade; entre outras (TUDZYNSKI E TUDZYNSKI, 1997; AZEVEDO, 2004).
A utilidade dos fungos já é conhecida há séculos, desde a fermentação de
bebidas alcoólicas, como também servindo de alimentos (uma vez que são ricos em
vitaminas), na fabricação de pães, queijos, até a capacidade metabólica em produzir
uma grande diversidade de micromoléculas bioativas, como por exemplo, a produção de
antibióticos.
A relação da indústria de alimentos com os fungos filamentosos é muito antiga
e extensa. Os fungos estão associados à tecnologia de alimentos desde os primórdios
das civilizações mais antigas conhecidas, como por exemplo, nos processos de
preparação de alimentos orientais, bebidas de povos indígenas no continente americano
e, na Europa, participam no processo de alimentos a base de leite. Com o
desenvolvimento das pesquisas, já é possível conhecer o processo pelos quais os fungos
modificam os alimentos, seja pela produção de micotoxinas ou com a contaminação de
alimentos processados (PASTORES E MACEDO, 2004).
Os estudos toxicológicos da ação de micotoxinas datam dos anos 60, devido ao
surgimento de casos de contaminação e morte de centenas de animais. Entre as
micotoxinas (Figura 4) conhecidas, incluem-se as aflatoxinas (estrutura 7 da figura 4) –
grupo de compostos tóxicos produzidos por certas cepas dos fungos Aspergillus flavus e
A. parasiticus; ocratoxinas (estrutura 8 da figura 4) – composto derivado de
isocumarinas com um grupo amida ligado ao grupo amino da fenilalanina produzida
principalmente pelos fungos Penicillium cyclopium, P. viridicatum, P. palitans e
algumas cepas de Aspergillus; citreoviridinas (estrutura 9 da figura 4), tricotecenos e
fumonisinas, produzidos por fungos do gênero Fusarium, além de uma variedade de
derivados indólicos (PINTO et al., 2002; PASTORES E MACEDO, 2004).
68
7 - Aflatoxina B2
8 - Ocratoxina A
9 - Citreoviridina
7 - Aflatoxina B2
8 - Ocratoxina A
9 - Citreoviridina
Figura 4 - Estruturas químicas de micotoxinas
Entre as enzimas fúngicas importantes para a indústria alimentícia destacam-se
as amiloglicosidases, produzidas por linhagens de Aspergillus e Rhizopus; α-amilases,
que transforma amido em dextrinas e oligossacarídeos e pode ser isolada por
fermentação de linhagens de A. niger; reninas; lipases, que catalisam reversivelmente a
hidrólise de triacilgliceróis sob condições naturais, podendo catalisar a
transesterificação e a síntese estereoespecífica de ésteres em um grande número de
substratos (PASTORES E MACEDO, 2004).
Além do potencial gastronômico, os fungos estão diretamente ligados à
recuperação ambiental, tanto na reciclagem de resíduos agrícolas e agroindustriais,
como na biodegradação de materiais lignocelulósicos (constituídos por celulose, poliose
e lignina), especialmente a madeira (FERRAZ, 2004).
A maioria dos fungos produtores de enzimas necessárias para degradação de
materiais lignocelulósicos pertencem aos grupos de Ascomycetes, Deuteromycetes e
Basidiomycetes. Esses fungos podem causar três tipos de degradação: branca –
degradam todos os componentes da madeira (white-rot fungi), marrom – degradam
69
principalmente polissacarídeos (brown-rot fungi), macia – podem degradar lignina e
polissacarídeos, porém em velocidades baixas (soft-rot fungi). Essas degradações são
em geral, feitas por enzimas oxidativas, principalmente do tipo lacases e peroxidases
(DURÁN, 2004).
Para a indústria farmacêutica, importantes fármacos de uso clínico em várias
patologias são obtidos de fungos. Dentre os medicamentos de maior repercussão
terapêutica para doenças infecciosas, destacam-se como os exemplos mais conhecidos,
os antibióticos (Figura 5): penicilina (estrutura 10 da figura 6), substância produzida por
fungo do gênero Penicillium, descoberta em 1928 por Alexander Fleming; e a
cefalosporina (estrutura 11 da figura 5), isolada de culturas de Cephalosporium
acremonium em 1948 (MENEZES et al., 2000; PINTO et al., 2002).
NH
N
S
O
H
O
COOH
N
SNH
O
HOOC
OCOOH
OAc
H NH2H10 - Penicilina F
11 - Cefalosporina C
Figura 5 - Antibióticos de origem fúngica
Outros exemplos de substâncias produzidas a partir de metabólitos de fungos
com atividades farmacológicas diferentes são (Figura 6): mevinolina (estrutura 12 da
figura 6) - um agente redutor de colesterol; ciclosporinas; ergometrina (estrutura 13 da
figura 6); asperlicina (estrutura 14 da figura 6) - um antagonista de doenças
gastrointestinais e do sistema nervoso central; papulacandinas (estrutura 15 da figura 6)
- um agente antifúngico, entre outros (PINTO et al., 2002; MORO et al., 2007).
70
OH
OO
OH O
OMe
N
NH
NH
OH
H
H O
NNH
NH
NN
O
O
O
OH
H
O
OHOH
OH
O OH
OH
O OH
12 - Mevinolina13 - Ergometrina
14 - Aspercilina
15 - Papulacandina
Figura 6 - Substâncias de origem fúngica com diferentes atividades farmacológicas
Outra utilização para os produtos obtidos a partir dos fungos é o controle
biológico na agricultura. Destacam-se nesse processo, a utilização de fungos do gênero
Trichoderm e Metharizum como micoerbicidas, micoinseticidas ou micoparasitas.
Os fungos têm ocorrência em todos os ambientes, podendo infectar animais,
incluindo humanos; parasitam plantas, causando doenças e morte das árvores ou podem
se associar em simbiose, onde colaboram com a planta para a absorção de água e sais
minerais, aumentando a resistência da mesma ao estresse biótico e abiótico em que está
exposta (GUIMARÃES, 2005).
71
1.1.1.1 Fungos Endofíticos
Os fungos endofíticos fazem parte de um grupo de microrganismos pouco
estudado, mas que representa uma abundante e confiável fonte para novos compostos
bioativos com grande potencial para aplicação em uma grande variedade de áreas (LIU
et al., 2007).
O termo “endófito” refere-se a microrganismos que em algum momento do seu
ciclo de vida, vivem nos tecidos das plantas, normalmente ocupando espaços
intercelulares dos troncos, pecíolos, folhas, raízes e etc, sem causar dano aparente. Ao
contrário dos microrganismos ditos “fitopatogênicos”, que se apresentam danosos ao
hospedeiro (AZEVEDO et al., 2002; GUIMARÃES, 2005). A exata relação física que
o fungo endofítico tem com a planta, na maioria dos casos, permanece obscura, pois é
extremamente difícil encontrar um endofítico no tecido vegetal (DAISY et al., 2002).
Como um endófito, o fungo cresce com a planta em uma relação mutualística
de protocooperação. Essa relação beneficia o fungo através de provisão de energia,
nutrientes, proteção e se manifesta como uma ajuda para o crescimento e sobrevivência
individual da planta hospedeira. O resultado dessa relação pode justificar a produção de
compostos bioativos, também denominados como metabolitos primários ou
secundários, os quais podem ter uma ampla utilização na indústria farmacêutica, de
alimentos e na agricultura (LIU et al., 2007; DAISY et al., 2002).
Esses compostos químicos são resultantes de síntese, degradação ou
transformação no processo de metabolismo, sendo úteis para fornecimento de energia e
síntese de substâncias essenciais à sobrevivência do organismo (SIMÕES et al., 2004;
GALVAGNO E FORCHIASSIN, 2004).
As principais macromoléculas – carboidratos, lipídeos, proteínas e ácidos
nucléicos – estão presentes em todo ser vivo, apresentando uma similaridade nos
processos metabólicos dessas substâncias. O processo desses macro-nutrientes é
considerado essencial para manutenção da vida do organismo, e por isso, é denominado
como metabolismo primário (SIMÕES et al., 2004).
Os microrganismos (assim como os vegetais) possuem um conjunto de
substâncias químicas, entre essas as enzimas e coenzimas, capazes de produzir inúmeras
outras substâncias que não estão, necessariamente, relacionadas com a sobrevivência do
produtor. A produção dessas substâncias é definida como metabolismo secundário, nos
72
quais os metabólitos produzidos, embora não essencialmente úteis para a manutenção
do organismo, podem trazer vantagens para a sobrevivência e para a perpetuação
daquela espécie (GALVAGNO E FORCHIASSIN, 2004).
Os metabólitos secundários trazem características únicas para um determinado
microrganismo, uma vez que sua produção depende de fatores bióticos e abióticos em
que o fungo está envolvido. Sendo uma característica única, o interesse da pesquisa
sobre esses metabólitos vem crescendo ao longo dos anos.
Embora descritos pela primeira vez na segunda metade do século XIX, apenas
a partir de 1970 passaram a ser objetos de pesquisas mais profundas, depois que foi
atribuído ao fungo endofítico do gênero Balansiae (Ascomycota) a produção de
alcalóides da sua planta hospedeira (FIRÁKOVÁ et al., 2007). À medida que se
verificou que os fungos poderiam conferir vantagens ao seu hospedeiro, como por
exemplo, proteção contra insetos e moléstias, alteração de características fisiológicas
das plantas ou produção de substâncias de interesse biotecnológico, os estudos passaram
a ser mais extensivos nessa área (AZEVEDO et al., 2002; GUIMARÃES, 2005).
Diante de estudos químicos que demonstram a produção de inúmeras
substâncias bioativas, permanece a dúvida quanto à justificativa para origem de tais
compostos. Estes compostos podem ser produzidos pela planta e devido à co-evolucão
da mesma com microrganismo, pode ocorrer a transferência da informação genética
para a sua produção ou pode ser uma consequência da relação mútua entre os
organismos, ou seja, a substância não poderia ser produzida sem a presença de um dos
participantes.
Do ponto de vista biológico, a produção de um metabólito pode estar
fundamentada em vários mecanismos envolvidos na interação entre o microrganismo e
seu habitat. A colonização, adaptação e propagação dos fungos endofíticos no
hospedeiro, podem ser beneficiadas com a produção de compostos que atuem na
competição com outros microrganismos, animais herbívoros e promoção de crescimento
vegetal (AZEVEDO et al., 2002; ZHI-LIN et al., 2007).
A relação do endófito com o hospedeiro pode ter iniciado quando as primeiras
plantas superiores apareceram na terra, há milhões de anos. Evidências de associações
microbianas com plantas estão sendo descobertas em tecidos de troncos e folhas
fossilizados. Como resultado dessa longa associação é possível imaginar que alguns
desses microrganismos endofíticos podem ter desenvolvido sistemas genéticos que
73
permitam a transferência de informações entre eles e as plantas superiores (STROBEL,
2003; FIRÁKOVÁ et al., 2007).
Os fungos endofíticos estão presentes em todos os órgãos da planta hospedeira
e podendo ser transferidos pela semente. O micélio do fungo cresce dentro dos tecidos
de revestimento, tronco, folha e finalmente penetra no tronco da flor passando para
semente (TAN E ZOU, 2001).
Em geral, pode-se esperar que as condições ambientais em que a planta
hospedeira cresce, podem influenciar no número e na variedade de fungos endofíticos.
Por exemplo, no estudo com os extratos dos metabólitos de 15 isolados do fungo
endofítico Pestalotiopsis microspora obtidos em 4 continentes, observou-se que apenas
dois dos extratos apresentavam cromatogramas idênticos, ou seja, as condições
ambientais dos continentes influenciaram diretamente na produção dos metabólitos de
cada espécime (STROBEL, 2003).
Como, em certos momentos, é uma relação onde ambos participantes se
beneficiam; a planta hospedeira também tem vantagens com a infecção por fungos
endofíticos. A produção de metabólitos secundários pelos endofíticos, proporciona uma
variedade de aptidões tanto no aumento da resistência a herbívoros, parasitismo,
estiagem, como favorecendo o crescimento da planta (FIRÁKOVÁ et al., 2007).
Groppe, em 1999, estudou a relação do fungo endofítico Epichloë bromicola
com a planta hospedeira Bromus erectus. Ele verificou que a concentração de fungo
endofítico estava diretamente correlacionada com o vigor vegetativo da planta,
sugerindo que durante o crescimento vegetativo, o fungo endofítico fosse mais benéfico
para a planta quando estava em alta taxa de colonização. Lu e colaboradores, em 1999,
isolaram um hormônio de crescimento vegetal, o ácido isoprenilindol-3-carboxilico
(item 16 da Figura 7), do fungo endofítico Colletotrichum sp. (fungo endofítico de
Artemisia annua), além de dois outros compostos com atividade antimicrobiana. Li e
Strobel, em 2001, isolaram dois compostos com atividade antimicótica contra fungos do
grupo oomycete (um dos mais comuns como patógenos de planta), jesterona (estrutura
17 da figura 7) e hidroxijesterona, a partir do fungo endofítico Pestalotiopsis jesteri. Em
2002, Silva e colaboradores, obtiveram extratos de origem fúngica com atividade
nematicida contra Meloidogyne incognita. Nesse estudo, os fungos submetidos ao
processo de fermentação foram Cunninghamella elegans, Fusarium sp., Paecilomyces
lilacinus e P. variotii, sendo o extrato acetoetanólico de Fusarium sp. o mais ativo. Em
2005, Silva e sua equipe isolaram duas substâncias com atividades contra fungos
74
fitopatogênicos, 2,4-diidroxi-5,6-dimetil benzoato de etila (estrutura 18 da Figura 7) e
phomopsilactona (GROPPE et al., 1999; LU et al., 2000; LI et al., 2001; SILVA et al.,
2002; SILVA et al., 2005).
NH
COOH
OHH
H
O
OH H
O
H H
OH OH
O
O
16 - Ácido isoprenilindol-3-carboxílico
17 - Jesterona 18 - 2,4-diidroxi-5,6-dimetilbenzoato de benzila
Figura 7 – Substâncias de origem fúngica que conferem vantagens para planta hospedeira
Na área de saúde, metabólitos secundários de origem fúngica tem sido de
extrema utilidade para indústria farmacêutica. São utilizados como princípio ativo e
ajudam a prevenir e curar inúmeras doenças.
O principal exemplo de metabólito secundário produzido por fungo endofítico
é o taxol, utilizado no tratamento de câncer de mama e de útero. Sua principal fonte é a
árvore Taxus brevefolia, encontrada em pântanos e alagadiços da costa oeste norte-
americana. O fungo endofítico isolado da planta, Taxomyces adreanae, também é capaz
de sintetizar taxol. Na planta, esse composto confere proteção contra fungos
patogênicos à raiz que são característicos de ambientes alagados como Phytium e
Phytophthora. Hoje sabe-se que vários fungos que colonizam Taxus spp. e outras
plantas que não produzem taxol mas que crescem em solos alagados, também produzem
a mesma substância (AZEVEDO et al., 2002).
75
A aquisição pelos fungos endofíticos da via metabólica para a produção desse
composto pode ter ocorrido durante o processo de co-evolução com a planta produtora
ou mesmo por meio de transferência gênica. E uma explicação para a produção do
mesmo composto em outras plantas que não o produzem, mas que possuem ecologia
semelhante é a disseminação dos esporos fúngicos (AZEVEDO et al., 2002; ZHI-LIN et
al., 2007).
A rota dos metabólitos secundários, provavelmente é apenas ativa em algum
estágio particular de crescimento do fungo. De uma maneira geral, todos os metabólitos
secundários são originados a partir do metabolismo da glicose (GALVAGNO E
FORCHIASSIN, 2004).
A partir dos produtos de degradação da glicose, classificados como metabólitos
primários, dependendo do estado fisiológico do microrganismo e da planta a que está
associado, pode ocorrer a formação dos precursores dos metabólitos secundários.
Nas plantas, existem três grandes grupos de metabólitos secundários: os
compostos fenólicos; alcalóides e terpenos. Os terpenos são formados a partir do ácido
mevalônico ou de reações com piruvato mais gliceraldeído-3-fosfato. Os compostos
fenólicos são formados a partir do ácido chiquímico ou ácido mevalônico (com
rendimento menor). Os alcalóides são derivados de aminoácidos aromáticos – triptofano
e tirosina – os quais são formados a partir do ácido chiquímico e também de
aminoácidos alifáticos – ornitina e lisina (SIMÕES et al., 2004).
Nos fungos, a indução para acúmulo (ou biossíntese) de terpenos e
carotenóides pode ocorrer por uma via alternativa à via do ácido mevalônico, a via
metileritritol fosfato (Figura 8), que é derivado dos compostos piruvato e gliceradeído-
3-fosfato originados a partir da degradação da glicose (ZHI-LIN et al., 2007).
76
OH
OOPO
O
O
O
O
O
O
OH
OH
OH OOH
OH
P
O
O
O
OH OOH
OH
P
O
O
O P
O
ON
N
OO
O
NH2
OH OH
P
O
OO
O
P
O
O
O
OH OOH
O
P
O
O
O P
O
ON
N
OO
O
NH2
OH OH
1-deoxi-5-xilulose fosfato sintetase
+
Gliceraldeído-3-fosfato
Piruvato
1-deoxi-5-xilulose fosfato
NADPH NADP+
Metileritritol-4-fosfato
CTP
PPi
Difosfocitidil metileritritol sintetase
1-deoxi-5-xilulose fosfato redutaisomerase
ATP
ADP
Difosfocitidil metileritritol
Difosfocitidil metileritrol quinase
Difosfocitidil metileritritol 2 fosfato
CMP
Metileritritol 2,4-ciclofosfato sintetase
Figura 8 – Via metieritritol fosfato
77
O
OH
O
OH
P
P
O
O
O
OO
O
OH
P O P OH
O
O
O
O
O P O P OH
O
O
O
O
O P O P OH
O
O
O
O
Metileritritol 2,4-ciclofosfato Hidroximetilbutenil difosfato
Hidroximetilbutenil difosfato sintetase
Hidroximetilbutenil difosfato redutase
Isopentil difosfato isomerase
Isopentil difosfato Dimetilalil difosfato
Isoprenosintetase
Isopreno Figura 8 – Via metieritritol fosfato (continuação)
O isopreno resultante é a unidade comum nos terpenos. Os terpenos possuem
essa unidade comum em suas formulas após a união de duas, quatro, seis, oito, ou mais
unidade de isopreno. Os óleos essenciais classificados na sua maioria como
monoterpenos e sesquiterpenos, por exemplo, são formados por duas e três unidades de
isopreno, respectivamente. Os diterpenos são formados por quatro unidades; os
triterpenos formados por seis unidades e assim sucessivamente até a formação dos
politerpenos com cerca de duas mil unidades de isopreno formando, por exemplo, a
borracha (COSTA, 1994).
No metabolismo do nitrogênio, tem sido observado que a fonte de nitrogênio
adicionada ao meio gera íon amônio (NH4+) ou amônia (NH3) para ser absorvido. Essa
assimilação pode ser feita tanto por aminação redutiva, liberando L-aminoácidos,
principalmente glutamato via glutamato desidrogenase, quanto pela via da glutamina.
Os aminoácidos gerados são catabolizados em peptídeos, tornando a única fonte de
carbono e nitrogênio para geração de energia (GALVAGNO E FORCHIASSIN, 2004).
Outros exemplos de metabólitos secundários com efeitos anticancerígenos são
podofilotoxina, responsável pela produção dos medicamentos etoposido e teniposido; e
78
camptotecina, isolado do fungo da família Phycomycetes, associado à planta
Nothapodytes foetida (PURI et al., 2005).
Outras publicações demonstram que determinadas propriedades medicinais de
certas plantas podem estar relacionadas com os metabólitos que são produzidos por
microrganismos endofíticos. Por exemplo, o fungo endofítico Pestalotiopsis leucothes
isolado de Trypterygium wilfordii produz metabólitos com efeitos variáveis sobre as
células T, células B e monócitos, representando uma nova alternativa para pesquisa de
compostos imunomoduladores ou para o tratamento de doenças auto-imune
(AZEVEDO et al., 2002; KUMAR et al., 2005; FIRÁKOVÁ et al., 2007).
A variedade de metabólitos secundários produzidos por um único
microrganismo endofítico está sendo estimada, mas a expectativa é que seja alta. Por
exemplo, Colletotrichum é um gênero considerado fitopatogênico, mas que já fora
isolado como endofítico na planta Artemisia annua, já demonstrou síntese de vários
compostos de interesse para indústria, entre esses a ergometrina e seus derivados, ácido
indolacético e outros (LU et al., 2002).
A maioria dos estudos realizados com fungos endofíticos é proveniente de
material biológico oriundo de regiões de clima temperado. Entretanto, pesquisas
sugerem existir grande potencial de microrganismos endofíticos associados às plantas
de clima tropical. As pesquisas realizadas no Brasil têm revelado a existência de novas
espécies de microrganismos.
O estudo dos microrganismos endofíticos de plantas da Amazônia é uma
dinâmica linha de pesquisa na área de Biotecnologia na Universidade Federal do
Amazonas iniciada pelo prof. Dr. José Odair Pereira em 1993. Trabalhos com
prospecção de microrganismos endofíticos de Paullinia cupana (guaranazeiro), teve
mais de 4000 isolados fúngicos obtidos a partir de cerca de 160 plantas. Quatro gêneros
foram mais freqüentes das populações estudas: Guignardia, Phomopsis, Xylaria,
Glomerella e Colletotrichum. Outros menos freqüentes como: Dreschlera,
Nodulisporium, Pestalotia, Curvularia e Humicolata também foram encontrados
(AZEVEDO et al., 2002).
Outra planta nativa da região amazônica que foi estudada, é Theobroma
grandiflorum, o cupuaçuzeiro, no qual o gênero fúngico mais frequente encontrado foi
Guignardia. A presença de gêneros de fungos associados a somente uma das plantas
corrobora com a hipótese de especificidade do endofítico com seus hospedeiros
(AZEVEDO et al., 2002).
79
Outra abordagem com estudos de fungos endofíticos no Amazonas é a
investigação de microrganismos endofíticos de plantas medicinais, como Copaifera
multifuga (copaíba). Seu óleo vem sendo utilizado pela população como
antiinflamatório, anti-reumático, cicatrizante, tratamento de ulcerações e desinfetatante
das vias urinárias. Os principais gêneros fúngicos isolados foram Guignardia,
Phomopsis, Fusarium, Colletotrichum, Xylaria, alguns fungos leveduriformes e muitas
bactérias do gênero Bacillus (AZEVEDO et al., 2002).
Diante de vários estudos que comprovam a produção, por fungos endofíticos,
de metabólitos secundários que podem ter as mesmas atividades dos compostos isolados
a partir das plantas hospedeiras, este trabalho se propõe a realizar o isolamento dos
fungos endofíticos associados à Aniba rosaeodora (Lauraceae) e a análise química dos
metabólitos por eles produzidos, com o intuito de colaborar com o acervo mundial de
substâncias químicas de origem natural.
1.1.2 FAMÍLIA LAURACEAE
A família Lauraceae é considerada uma das famílias mais primitivas
pertencentes à divisão Magnoliophyta. Descrita por Antoine Laurent de Jussieu, as
árvores da família Lauraceae apresentam-se amplamente distribuídas através das regiões
tropicais e subtropicais do planeta, sendo formadas por 49 gêneros e 2.500 - 3.000
espécies. No Brasil ocorrem 22 gêneros que habitam em sua maior parte as Florestas
Pluviais e também as restingas e os cerrados (WERFF E RICHTER, 1996; STASI E
HIRUMA-LIMA, 2002; QUINET, 2005).
Esta família destaca-se entre as demais pela sua importância econômica. São
principalmente utilizadas na culinária, marcenaria e construção civil, fábrica de papel,
indústria de cosméticos e medicina popular. Porém, a maioria das espécies tem seu uso
restrito às comunidades tradicionais que detêm o conhecimento empírico da utilização
dessas plantas (MARQUES, 2001). Os principais gêneros são: Laurus, Sassafras,
Licaria, Ocotea, Nectandra, Aniba, Persea e Cinnamomum (RIBEIRO et al., 1999;
STASI E HIRUMA-LIMA, 2002).
Na Tabela 1 pode ser observado alguns exemplos de espécies da família
Lauraceae que são úteis na construção civil e na fabricação de objetos em geral.
80
Tabela 1 – Utilidade para espécies do gênero Ocotea
Espécie Utilidade Observação O. puberula Fabricação de papel --
O. organensis Carpintaria Apresenta madeira de cor parda
e de pouca duração.
O. diospyrifolia Fabricação de postes e tábuas de assoalho. A casca contém tanino (útil em processo de fábrico de curtumes).
Espécie encontrada nas regiões sul e sudeste do Brasil, sendo comum ainda na Argentina e no Paraguai.
O. guianensis Produção pasta para fabricação
de papel. Fornece madeira branca, leve, com densidade 0,44 m/L.
O. acutifolia Marcenaria e construções civil. --
O. aciphylla Construção civil e fabricação
de tábuas para assoalhos. Fornece madeira amarela, aromática, resistente aos insetos, principalmente aos cupins.
O. catharinensis Construção civil, na produção
de vigas, ripas, assoalhos, móveis e moirões.
--
O. canaliculata Marcenaria. Fornece madeira de cor pardo-
escura.
O. spectabilis, O. divaricata, O. porosa e O. elegans
Marcenaria e construções em geral.
--
Fonte: RIBEIRO et al., 1999; MARQUES, 2001
O gênero Nectandra, possui características favoráveis à produção de papel,
móveis, devido a rigidez elevada e coeficiente de flexibilidade mediano, sendo
utilizadas principalmente as espécies N. amazonum, N. leucothyrsus, N. angustifolia e
N. rígida (GUIMARÃES et al., 1996).
As espécies do gênero Aniba merecem destaque pelo alto valor econômico,
devido à constituição química do óleo essencial, encontrado em grande quantidade
principalmente no tronco. Em 1881, Morim separou o óleo essencial de um álcool e o
81
chamou de linalol. Sua primeira exportação para a Europa aparece registrada na Guiana
Francesa em 1883. Anos mais tarde, Koeller sugeriu que a espécie fosse denominada O.
caudata. Posteriormente, Mez sugeriu o nome A. parviflora, contudo, Ducke, em 1926
passou a chamá-la A. rosaeodora Ducke, popularmente conhecida como pau-rosa. O
próprio autor, neste mesmo ano, verificou que havia diferenças entre as espécies da
Amazônia e das Guianas, daí passou a chamá-la A. rosaeodora var. amazonica Ducke.
A última mudança foi feita em 1938, quando Kostermans propôs a alteração para A.
duckei Kosterm e, a espécie que mais produz óleo essencial, para A. fragans Ducke.
(BASTOS, 1943).
Segundo Ducke, o manejo comercial do gênero Aniba torna-se impossibilitado
pela escassez de matéria-prima. Outras espécies, como A. canellita e A. parviflora
também são usadas em perfumaria. Porém, esta última, é de ocorrência muito rara, o
que restringe sua utilização (MARQUES, 2001).
Os caboclos geralmente distinguem três tipos de pau-rosa, conforme a
coloração do lenho: “pau-rosa mulatinho” - que é mais escuro, de densidade elevada, e
que submerge quando as toras são cortadas e atiradas na água; “pau-rosa itaúba” - de
cor amarelada, menos densa, e “pau-rosa imbaúba” - muito leve e quase branca. O
primeiro é mais rico em essência e o último, mais pobre. A exploração dos paus-rosa,
fez com que essas espécies fossem levadas à beira da extinção. Cabe salientar que o
óleo de pau-rosa já chegou a ocupar o terceiro lugar na pauta de exportação da região
Amazônica, cabendo à borracha e à castanha, o primeiro e segundo lugar,
respectivamente (BASTOS, 1943).
As aproximadamente 40 espécies do gênero Aniba são ocorrentes no Brasil.
Algumas destas podem ser divididas em 3 grupos, de acordo com a natureza química do
constituinte predominante no óleo essencial: o grupo do linalol (A. roseodora); o grupo
do benzoato (A. fragans, A. firmula, A. gardneri, A. burchelli, A. parviflora, A.
permolis, A. guianensis) e o grupo do alibenzeno (A. canellita, A. hostmanniana, A.
pseudocoto) (MORAES et al., 1972; GOTTLIEB et al., 1981).
Na medicina popular, as espécies da família Lauraceae apresentam utilização
variada, desempenhando diferentes funções contra diversas doenças (MARTINS E
SANTOS, 1995). A Tabela 2 relaciona as espécies do gênero Ocotea que são
popularmente conhecidas na medicina tradicional.
82
Tabela 2 – Espécies do gênero Ocotea utilizadas na medicina tradicional
Espécie Indicação Observação O. aciphylla Infusão das folhas: Tônico e
estomáquico. Casca: anti-reumática e depurativa
Folha é utilizada para enrolar o cigarro e quando queimada, pode ter um efeito narcótico.
O. spectabilis Infusão da casca e da raiz:
tônico. Tanto a casca quanto da raiz possui característica adstringente.
O. pulchella Casca e as folhas: tônicas do
útero. --
O. teleiandra Casca: Analgésico
Folhas: Sudoríficas Casca possui um gosto amargo
O. indecora Sudorífica, anti-reumática e até
antisifilítica --
O. guianensis Casca e folha: Abcessos Possui casca e folha aromáticas
Fonte: EMMERICH E SENNA, 1985
Outra espécie da Amazônia, denominada O. barcellensis, possui um óleo que é
extraído através de furos na madeira, sendo usado contra a ptiríase. Por vezes, é
utilizado para substituir o querosene, assim como os das espécies O. pretiosa, O.
cymbarum e ainda Licaria puchury-major Kosterm. Possuem atividade comprovada
contra o desenvolvimento do ancilostomídeo humano (MARQUES, 2001).
Dentre as espécies medicinais, também merecem destaque as pertencentes ao
gênero Aniba. A espécie A. riparia, por exemplo, é típica da região Amazônica e dela
pode-se obter um extrato dos frutos e dos cálices persistentes que possuem atividade
antibiótica comprovada contra Cândida albicans, Bacillus cereus, Klebsiela
pneumoniae e Staphylococcus aureus. As espécies A. canellita, A. duckei Kosterm. e A.
hastmanniana, também possuem atividade bloqueadora no desenvolvimento do
ancilostomídeo humano, devido a ação do óleo essencial que é extraído do lenho e da
casca. É usado ainda para banhos aromáticos com as folhas. O óleo essencial contém
laurostearina, geraniol, linalol, cineol, terpineno, engenol e pineno, além de ácidos
orgânicos, ácidos graxos e tanino (MARQUES, 2001).
83
1.1.2.1 Aniba rosaeodora Ducke
A A. rosaeodora é uma árvore da família Lauraceae, popularmente conhecida
como pau-rosa, pau-rosa-mulatinho, pau-rosa-itaúba, pau-rosa-imbaúba, casca preciosa,
rosenhozbaum (em alemão), bois de rose (em francês), bois de rose femelle (em
francês), rosewood (em inglês), palo de rosa (em espanhol), legno di rose (em italiano),
e as seguintes sinonímias: Licaria guianensis Aublet, 1775, A. rosaeodora var.
amazonica Ducke, 1926 e A. roseodora Kostermans, 1938 (NEGRAES, 2003; LUPE,
2007; ALCÂNTARA, 2009). É encontrada nas florestas de terras firmes e altas,
principalmente de mata pluvial não inundável (ALCÂNTARA, 2009).
O óleo essencial produzido por A. rosaeodora é constituído na maior parte por
linalol (70-90%).
O linalol e seus ésteres, como acetato de linalila, são matérias odoríferas de
cheiro intenso e agradável. Esse álcool é um importante intermediário na produção de
vitamina E (OHASHI, 1997). O óleo extraído é também utilizado na medicina caseira
para amenizar dor após a extração de dentes, embebendo-o em algodão e aplicando-o
sobre o ferimento. O óleo também é empregado em tratamento de acnes, resfriados,
tosse, dermatites, febre, dor de cabeça, tensão nervosa e náusea, diversas infecções e
ferimentos (LORENZI E MATOS, 2008; NEGRAES, 2003).
É largamente utilizada em produtos cosméticos para cuidados com peles
sensíveis; tratamento de acnes, rugas e dermatite na forma de lavagens faciais,
vaporizações, sabonetes, loções, cremes e géis de limpeza; em banhos de imersão
tonificantes; cremes massageadores para tratamento de estrias e cicatrizes; perfumes
caseiros; spray para aromatizar ambientes e em loções com óleo de Andiroba (Carapa
guianensis) para reumatismo. No interior do Estado do Amazonas, as lavadeiras
utilizam-na durante o último enxágue das roupas, para conferir aroma de limpeza
(NEGRAES, 2003; LUPE, 2007).
Na aromoterapia, o óleo essencial é aconselhado como estimulante celular,
regenerador de tecidos, antidepressivo, tônico dos nervos, calmante, contra dores de
cabeça e náuseas (NEGRAES, 2003).
84
Com vasta utilidade para a indústria cosmética, o óleo é vendido hoje por US$
80/kg, e, devido à escassez do produto, esse preço tem aumentado, considerando que as
últimas fontes naturais estão se esgotando. Atualmente, os principais importadores do
pau-rosa são os Estados Unidos, Alemanha, França, Espanha, Países Baixos e Reino
Unido e alguns projetos de pesquisa interinstitucionais investigam as possibilidades de
manejo sustentável do pau-rosa (LUPE, 2007; SAMPAIO, 1987).
De acordo com o IBAMA, para cada tambor de 180 litros de óleo produzido,
80 mudas de A. rosaeodora, deveriam ser plantadas, pois o principal problema para
extração do óleo é a destruição da árvore. E para seguir a recomendação de
reflorestamento adequado, seriam necessários 25 anos para a maturação da árvore.
Análises do óleo essencial das folhas de A. rosaeodora apresentaram alta
concentração de linalol extraído da madeira, cerca de 85%, e na folhas, cerca de 81%
(LUPE, 2007).
Nos últimos tempos, houve um declínio no consumo de óleo de pau-rosa, tanto
pelo preço quanto pelo risco ambiental em causar a extinção da espécie, pois não é bom
para nenhuma empresa estar veiculada a um processo de devastação ambiental. Fatores
como a substituição do óleo natural de pau-rosa por correspondentes sintéticos e a
inexistência de uma política florestal para o setor, também contribuíram para o declínio
da exportação do óleo nas últimas décadas (SAMPAIO, 2000). E devido a esse risco,
pesquisadores procuram fontes renováveis e sustentáveis como alternativas para
obtenção do linalol.
86
2 OBJETIVOS
2.1 GERAL
Realizar a triagem biológica dos fungos endofíticos associados à Aniba
rosaeodora e a triagem química dos seus metabólitos secundários.
2.2 ESPECÍFICOS
Isolar fungos endofíticos associados à A. rosaeodora.
Obter extratos de metabólitos secundários dos fungos endofíticos isolados.
Realizar a triagem química dos extratos utilizando técnicas cromatográficas.
Realizar testes antimicrobianos com o sobrenadante do meio de cultura e com
extratos miceliais dos fungos endofíticos.
Realizar identificação dos isolados fúngicos que obtiverem resultados de
bioatividade relevante.
87
___________________________________________________________________Metodologia
Metodologia 3 METODOLOGIA
3.1 ISOLAMENTO DOS FUNGOS ENDOFÍTICOS DE A. rosaeodora
3.1.1 COLETA
Para o isolamento dos seus fungos endofíticos, coletaram-se diferentes partes
vegetais de quatro espécimes de A. rosaeodora, situadas na Reserva Florestal Adolfo
88
Ducke, pertencente ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), localizada
no Km 26 da estrada AM 010, Manaus-Itacoatiara.
As árvores utilizadas estavam previamente marcadas pelo grupo de pesquisa do
Dr. Paulo de Tarso Sampaio (INPA/UEA) (Figura 9). As coletas foram realizadas no dia
24 de abril de 2008, no horário da manhã.
a b c d
Figura 9 – Árvores de Aniba rosaeodora selecionadas para isolamento dos fungos endofíticos
Dos dois primeiros espécimes coletaram-se folhas, galhos, semente (Figura 9a,
9b e Figura 10a, 10b); do terceiro espécime coletaram-se folhas, galhos e flor (Figura 9c
e Figura 10c); e, do quarto espécime coletaram-se folha, galhos e fruto (Figura 9d e
Figura 10d).
a b
89
c
d
Figura 10 - Material vegetal coletado de cada espécime de A. rosaeodora
Utilizou-se entre vinte e cinco à trinta fragmentos de folhas, galhos, frutos e
flores da planta (ARAÚJO et al., 2002). Após a coleta, as amostras foram transportadas
para o laboratório de Biorgânica do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e
Recursos Naturais da Amazônia da Escola Superior de Ciências da Saúde da
Universidade do Estado do Amazonas (MBT/ESA/UEA), separadas, identificadas
conforme Figura 10, acondicionadas em sacos plásticos hermeticamente fechados,
identificadas e armazenadas sob temperatura de 4°C por 24 horas (Figura 11). Os
tecidos utilizados foram selecionados quanto à ausência de sinais de doença.
Figura 11 – Armazenamento do material vegetal em sacos plásticos hermeticamente fechados
3.1.2 ISOLAMENTO
3.1.2.1 Desinfecção superficial
90
O isolamento dos fungos endofíticos foi executado de acordo com
procedimento de Petrini (1992). As amostras vegetais coletadas foram lavadas em água
corrente e com detergente neutro. Foram cortadas em fragmentos de 10 a 12 cm. Foram
submetidas a uma seqüência de submersões em soluções na seguinte ordem e tempo:
álcool a 70% por um minuto; hipoclorito de sódio 3% por quatro minutos; álcool a 70%
por trinta segundos; e água destilada estéril por dois minutos (Figura 12). Este
procedimento foi realizado em ambiente estéril, utilizando-se a câmara de fluxo laminar
Como contra-prova de esterilização, foram semeadas em meio ágar-batata-dextrose
(BDA), alíquotas de água da última lavagem dos fragmentos vegetais e submetido a
uma temperatura de 28°C por sete dias (PETRINI, 1992; FROHLICH et al., 2000;
GUIMARÃES et al., 2009).
3.1.2.2 Inoculação de fragmentos vegetais
Após a desinfecção superficial, o material vegetal foi cortado em pequenos
fragmentos e estes, foram inoculados em placas de petri contendo meio BDA e meio
folha (MF), conforme Figura 13, previamente esterilizados em autoclave, acrescido de
amoxicilina (0,5g/L), para evitar o crescimento de bactérias endofíticas. Foram
utilizados cinco fragmentos em cada placa. Em seguida, foram incubadas sob
temperatura de 28 °C por sete a quatorze dias, e retiradas da incubadora conforme
observação macroscópica do crescimento dos fungos (ARAÚJO et al., 2002;
GUIMARÃES, 2005).
a b
91
c d
Figura 12 – Desinfecção superficial
a b
Figura 13 – Inoculação dos fragmentos. a) Inoculação em BDA. b) Inoculação em MF
A taxa de colonização (T.C.) fúngica foi calculada por avaliação macroscópica
dos microrganismos isolados, considerando a expressão abaixo (ARAÚJO et al., 2002):
3.1.3 PURIFICAÇÃO
Foi utilizada a técnica de purificação por esgotamento para obtenção de
colônias isoladas. Essa técnica consiste em fazer estrias, com auxílio de uma alça de
platina, em meio sólido onde por esgotamentos se obtém colônias isoladas no final das
estrias. Os meios utilizados para purificação foram os mesmos utilizados na inoculação
inicial, para permitir a manutenção das características de cada fungo. Foram incubados
por um a dois dias à 28 °C (ARAÚJO et al., 2002; LEMOS E ARAÚJO, 2002).
Em seguida, foi retirado um disco do meio contendo a colônia isolada e
inoculado em outra placa com o mesmo meio de cultura, colocando o fragmento no
centro da placa. Assim, foi possível identificar as características de crescimento de cada
fungo (ARAÚJO et al., 2002; LEMOS E ARAÚJO, 2002).
3.2 PRODUÇÃO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS
92
3.2.1 FERMENTAÇÃO
Três discos dos meios sólidos dos fungos purificados, medindo 6 mm de
diâmetro, foram transferidos para frascos de erlenmeyer de 150 mL com 50 mL de meio
líquido de batata-dextrose (acrescido de 0,2% de extrato de levedura) sob condições
estéreis (SOUZA et al., 2004). Os fungos isolados em meio de cultura MF foram
primeiramente repicados para outra placa com meio de cultura BDA, e após
crescimento neste meio de cultura, foi retirado discos deste meio sólido e foram
transferidos para frascos de erlenmeyer sob condições estéreis.
Foram incubadas sob agitação por quatorze dias a uma temperatura de 28°C com
a velocidade de 150 rotações por minuto. Em seguida, o caldo de fermentação dos
fungos foi filtrado para separação do sobrenadante e o micélio (Figura 14a e b).
3.2.2 EXTRAÇÃO DOS METABÓLITOS
Os sobrenadantes foram armazenados sob a temperatura -19° C para posterior
análise (Figura 15). As massas miceliais remanescentes foram mantidas submersas por
sete dias em etanol para extração dos metabólitos (Figura 16). Os extratos foram
concentrados com auxílio de um evaporador rotatório para utilização em testes
antimicrobianos.
b
a
Figura 14 – a) Frascos de erlenmeyer no aparelho shaker, com caldo de batata dextrose e inoculo fúngico.
b) Filtração à vácuo para separação do micélio e sobrenadante.
93
Figura 15 – Sobrenadantes filtrados e mantidos à -19° C
Figura 16 – Massas miceliais após filtração e submersas em etanol
3.3 TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS PARA ANÁLISE DOS METABÓLITOS
SECUNDÁRIOS
3.3.1 TRIAGEM DE PRODUÇÃO DE LINALOL
3.3.1.1 Cromatografa líquida de alta eficiência (CLAE)
Os sobrenadantes filtrados foram submetidos à análise por CLAE em um
aparelho modelo Star 800 da empresa Varian, com injetor automático Module interface
e bomba para eluição modelo 240, série 00690 Varian ProStar, acoplado ao detector de
luz ultra violeta modelo 310, série 01316 Varian ProStar (Figura 17).
94
Figura 17 – Aparelho de Cromatografia líquida de alta eficiência utilizado nas analises
As amostras foram filtradas novamente em filtro Chromafil – CA-45/25
Cellulose acetato 0,45 µm e em seguida injetadas no aparelho com auxílio do injetor
automático, sendo analisadas a um comprimento de onda de 271 nm.
A coluna utilizada para as análises foi YMC Pack NH2 de 250 x 4,6mm; com
gradiente de 10% de água e 90% de acetonitrila por cinco minutos, seguido pelo
aumento para 40% de água e 60% de acetonitrila após dez minutos, permanecendo sob
essa concentração por mais quinze minutos. A solução padrão de linalol (Sigma®)
também foi submetida à análise nas mesmas condições para comparação e possível
detecção da produção deste pelos fungos.
Para os extratos que apresentaram picos com tempo de retenção na região da
amostra padrão foram adicionados 10 µL da solução padrão de linalol na concentração
de 1 µL/mL e injetados novamente.
As amostras que apresentaram acréscimo na área do pico com mesmo tempo de
retenção da amostra padrão foram submetidas a processo extração por partição com
acetato de etila, utilizando-se 20 mL do solvente para cada 50mL de sobrenadante em
três repetições. Em seguida, foram encaminhadas para o departamento de química da
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), sob os cuidados da Professora
Dra. Aurea Echevarría, para análise por Cromatografia da fase gasosa acoplada ao
espectrometro de massas.
3.3.1.2 Cromatografia de fase gasosa acoplada ao espectrômetro de massas (CG/EM)
As amostras encaminhadas para CG/EM, foram analisadas nas seguintes
condições: O aparelho de cromatografia da empresa VARIAN; coluna cromatográfica:
vf-5MS (30Mx0,25x0,25mm); a curva de aquecimento com temperatura inicial de
95
130°C mantida por um minuto, taxa de aquecimento de 10°C/min até a temperatura de
290°C, permanecendo sob essa temperatura por mais vinte e cinco minutos; detector de
ionização por impacto de elétrons com energia de 70eV e base de dados Mainlib.
3.4 DETECÇÃO DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
As linhagens selecionadas para realização dos testes foram: Staphylococcus
aureus (ATCC 25927), Enterococcus fecalis (n° 309), Pseudomonas aeruginosa (n°
024), Bacillus cereus (ATCC), Streptococcus mutans (n° 289), Candida albicans (n°
1132), Penicillium avelani.
Cerca de 15 mL das amostras dos sobrenadantes foram liofilizados e
ressuspendido para 2 mL de água destilada autoclavada. As amostras de maceração
micelial em etanol foram concentradas e 2 mg do material seco foi utilização em 2 mL
de solução Dimetilsufóxido (DMSO) / água 1:9.
3.4.1 AVALIAÇÃO DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO BACTERIANO
As bactérias foram reativadas por repique em meio de cultura Agar-brain-
heart-infusion (BHI), pela técnica de esgotamento, incubada por vinte e quatro horas à
37 oC. Em seguida, a colônia isolada foi inoculada em caldo Müeller-Hinton por mais
vinte e quatro horas na mesma temperatura. O parâmetro utilizado para avaliação do
crescimento bacteriano foi a escala de MacFarland n° 3 (6 x 109 unidade formadora de
colônia). Adicionou-se a uma placa com meio de cultura agar BHI 50 µL da suspensão
bacteriana e com auxílio da alça de Drigalski, a suspensão bacteriana foi inoculada por
toda extensão da placa (SOUZA et al., 2004).
Conforma a Figura 18, foram feitos seis pequenos poços com 5 mm de
diâmetro cada no meio de cultura de cada placa para adicionar 100 µL dos extratos
selecionados, previamente ressuspendidos (SOUZA et al., 2004).
96
Figura 18 – Difusão em Agar das amostras para avaliação da atividade antimicrobiana
As placas foram incubadas em aerobiose por 18 a 24 horas em sob a
temperatura de 37°C.
3.4.1 AVALIAÇÃO DE INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO FÚNGICO
Para avaliação de inibição do crescimento celular da levedura C. albicans, a
cepa padrão foi reativada por repique em meio de cultura Agar Saboraoud (AS), pela
técnica de esgotamento, incubada por 24 horas à 37 oC. Em seguida, a colônia isolada
foi inoculada em caldo saboraud por mais 24 horas na mesma temperatura. Adicionou-
se a uma placa com meio de cultura agar saboraud 50 µL da suspensão fúngica e com
auxílio da alça de Drigalski a mesma foi inoculada por toda extensão da placa (SOUZA
et al., 2004).
Foram feitos seis pequenos poços com 5 mm de diâmetro cada no meio de
cultura de cada placa para adicionar 100 µL dos extratos selecionados, previamente
ressuspendidos.
Para avaliação de inibição do crescimento do fungo P. avelani, a cepa foi
reativada por repique em meio de cultura AS pela técnica de diluição, incubada por sete
dias à 26 oC. Em seguida, esporos da colônia foram suspendidos em uma solução de
Tween 80 a 20 %. Três tubos com 9 mL de água auto-clavada foram utilizados para
diluição em serie. Foi retirado 1 mL da suspensão de esporos em tween, adicionado ao
primeiro tubo com água e em seguida foi ressuspendido. Deste primeiro tubo foi
retirado 1 mL da solução, adicionado ao segundo tubo e mais uma vez foi
ressuspendido. Da mesma maneira, foi retirado 1 mL da solução do segundo tubo para
adição ao terceiro tubo e em seguida foi ressuspendido.
97
Foi vertido em placas de petri meio de cultura AS e antes que este esfriasse à
placa foi adicionado 100 µl da suspensão de esporos do terceiro tubo e cada placa foi
levemente agitada para homogeneização do meio com a suspensão de esporos (SOUZA
et al., 2004).
Foram feitos seis pequenos poços com 5 mm de diâmetro cada no meio de
cultura de cada placa para adicionar 100 µL dos extratos selecionados, previamente
ressuspendidos (SOUZA et al., 2004).
3.5 CULTIVO EM LARGA ESCALA
O fungo que apresentou extrato com a maior halo de inibição do crescimento
bacteriano foi submetido à fermentação em larga escala (Figura 19). Foram preparados
18 L de caldo de batata dextrose, acrescido 0,2% de extrato de levedura (SOUZA et al.,
2004).
Após vinte e cinco dias de crescimento micelial, a cultura foi submetida a
filtração a vácuo e o sobrenante foi extraído por partição com acetato de etila e em
seguida com acetato de etila/isopropanol 7:3 (Figura 20a). A massa micelial
remanescente foi triturada e mantida em maceração em etanol por vinte e quatro horas
(Figura 20b).
Os extratos foram concentrados com auxílio de um evaporador rotatório e seus
rendimentos mensurados.
Figura 19 – Frascos de erlenmeyer com 300mL de meio de cultura líquido cada para cultivo em larga
escala
98
a b
Figura 20 – a) Partição do sobrenadante do cultivo em larga escala b) Trituração do micélio
remanescente após a filtração à vácuo
3.6 IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS
3.6.1 IDENTIFICAÇÃO TAXONÔMICA MORFOLÓGICA
A identificação dos fungos que obtiveram resultados mais relevantes na
triagem química e na avaliação da atividade antimicrobiana foi feita através da analise
macroscópica de suas características e análise microscópicas das estruturas
reprodutivas, estruturas de resistência ou morfologia das hifas, através de micro-cultivo.
Foram consideradas características das culturas quanto: cor, textura, topografia,
pigmento difuso, cor do verso da colônia e topografia do verso da colônia. Será retirado
um fragmento da colônia isolada e colocado em uma lâmina previamente esterilizada
em auto-clave para realização do microcultivo. As estruturas foram coradas com azul de
lactofenol e observadas ao microscópio óptico em um aumento de 400 X. Foram
observadas as septações das hifas, cor, esporos, presença de estrutura de resistência e
ramificações.
3.6.2 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR
3.6.2.1 Extração do DNA
3.6.2.1.1 Manipulação dos reagentes
Para início do processo de extração, foram manipuladas as seguintes soluções:
1) Tampão de extração; 2) Clorofil.; 3) Clorofane e 4) Tampão TE (MARTINS, 2005).
99
Para manipulação de 10 mL da solução 1, são necessários 2 mL de Tris-HCl
1M (Trizma-Base 121,0 g para 1 L de água); 0,5mL EDTA 0,5M (ácido etilenodiamino
tetra-acético 37,22g para 100 mL de água); 1 mL SDS (Dodecilsulfato de sódio 10g
para 100 mL de água); 0,5 mL NaCl 5M e 6 mL de água destilada (MARTINS, 2005).
Para manipulação da solução 2, utilizou-se uma proporção 24:1 de clorofórmio
e álcool isoamílico (MARTINS, 2005).
Para o preparo da solução 3, utilizou-se uma proporção 1:1 da solução de
clorofil e fenol (MARTINS, 2005).
Para a manipulação da solução 4, utilizou-se 1 mL Tris-HCl 1M e 0,2 mL
EDTA 0,5M completando o volume final para 100 mL com água destilada (MARTINS,
2005).
3.6.2.1.2 Extração de DNA fúngico
Aproximadamente 1g do micélio do fungo selecionado foi triturado com 5 mL
nitrogênio líquido. Cerca 8mg do micélio triturado foi transferido para um tubo de
microcentrífuga com capacidade de 1,5 mL. Foi adicionado 1,5 mL de tampão de
extração (Solução 1) e após a homogeneização, os tubos de microcentrífuga foram
incubados em banho por 1 hora a 60°C, sob leve agitação. Após o período de incubação
foi adicionado 1 ml de fenol, misturando-se suavemente as fases e centrifugado a
10.000 rpm por 15 min. A fase aquosa foi recuperada e transferida para um novo tubo
de microcentrífuga e a esta foi adicionado 1mL da solução de clorofane (Solução 3).
Novamente a solução foi homogeneizada e centrifugada na mesma condição anterior,
onde o sobrenadante foi recuperando e transferido para outro tubo de microcentrífuga e
a este foi adicionado 1mL de clorofil (Solução 2). Mais uma vez os tubos foram
homogeneizados e centrifugados a 10.000 rpm por 15 minutos e o sobrenadante, foi
transferido para outro tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e este foi acrescentado 0,75
mL NaCl 0,5M. A seguir, foram adicionados 0,75 mL de etanol 96%. As amostras
foram submetidas à centrifugação a 14.000 rpm por 15 minutos. Após a centrifugação o
sobrenadante foi descartado e o pellet obtido foi lavado com etanol 70%. Os tubos
foram invertidos até secagem completa do DNA. O pellet foi ressuspendido em 200μL
do tampão TE (Solução 4) e foi mantido congelado sob -19°C (MARTINS, 2005).
100
_________________________________________________________Resultados e Discussões
Resultados e Discussões
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
101
A planta selecionada para realização deste trabalho faz parte de uma série de
plantas escolhidas pelo grupo de pesquisa Biotecnologia de Fungos da Amazônia,
objetivando o isolamento de fungos endofíticos para estudo de seus metabólitos
secundários e potencial enzimático. Até o momento ainda não existe relato na literatura
sobre estudos com fungos endofíticos de Aniba rosaeodora.
4.1 ISOLAMENTO DOS FUNGOS ENDOFÍTICOS DE A. rosaeodora
4.1.1 COLETA, ISOLAMENTO e PURIFICAÇÃO
Na técnica para esterilização externa (desinfecção superficial) dos tecidos
vegetais de A. rosaeodora, os fungos que são recuperados dos fragmentos do material
vegetal após o processo são considerados fungos endofíticos (ZITO et al, 1995).
Na metodologia que consiste em submeter o material vegetal a uma seqüência
de imersões em soluções para desinfecção, o álcool etílico a 70% está em concentração
adequada para penetração na membrana do microrganismo e age desnaturando
proteínas, além de ser solvente para lipídeos (KALL e COSTA, 1994). A solução de
hipoclorito de sódio encontra-se em equilíbrio conforme reação abaixo:
NaOCl + H2O NaOH + HOCl Na+ + OH- + OCl - + H+
Figura 21 – Reação de equilíbrio da solução de hipoclorito de sódio
O hipoclorito em equilíbrio na solução fornece hidróxido de sódio (NaOH) que
pode reagir com ácidos graxos e formar sabão e glicerol, caracterizando a reação de
saponificação; podendo também reagir com aminoácidos em uma reação de
neutralização e formar um sal amino e água. O ácido hipocloroso (HOCl) também pode
reagir com aminoácido em uma reação de cloraminação e formar cloroamina e água.
Essas reações levam a dissolução da membrana do microrganismo elucidando a
atividade antimicrobiana da solução de hipoclorito de sódio (ESTRELA et al, 2002).
As duas soluções associadas na metodologia demonstraram eficiência na
desinfecção superficial, pois durante o processo de isolamento dos fungos, como contra-
prova de esterilização superficial dos tecidos vegetais, foram semeadas em meio BDA,
alíquotas de água da última lavagem dos fragmentos vegetais e submetido a uma
102
temperatura de 28°C por sete dias, não sendo observado crescimento microbiano neste
período.
Dos quatro espécimes coletados isolou-se 262 fungos endofíticos de diferentes
partes da planta, conforme a Tabela 3.
Tabela 3 - Quantidade de fungos isolados em cada espécime e parte vegetal de A. rosaeodora
Espécime Parte coletada
Qtde de fungos Isolados
Total
I
Folha 14 56 Galho 31
Semente 11
II Folha 26
86 Galho 44 Semente 16
III Folha 24
63 Galho 27 Flor 12
IV Folha 20
57 Galho 32 Fruto 5
262
Observou-se que houve isolamento de maior número de fungos a partir dos
galhos de cada espécime de A. rosaeodora coletada. O Grafico 1 mostra a distriuição
dos isolados em cada parte da planta.
103
Grafico 1 – Quantidade fungos isolados por parte vegetal de cada espécime
Segundo Guimarães (2006), existem duas maneiras para disseminação dos
fungos na planta, sendo uma delas a transferência vertical de esporos fúngicos através
da semente e a outra transferência horizontal dos esporos fúngicos de planta para planta
(GUIMARÃES, 2006). Considerando um conjunto de fatores tais como: disseminação
horizontal dos fungos, assepsia branda para este tecido e a presença de tecidos mortos
(casca do galho), pode-se justificar o favorecimento para obtenção de maior número de
isolados fúngicos a partir dos galhos. Além disso, o tecido dos galhos e caule apresenta
maior resistência frente às alterações no habitat natural, oferecendo então, um ambiente
favorável para a manutenção de fungos nesse tecido.
Os 262 fungos isolados foram agrupados em 22 grupos de acordo com as
características macro-morfológicas das colônias apresentadas depois de sete a quatorze
dias de crescimento a uma temperatura de 28ºC, conforme exposto na Tabela 4.
No Gráfico 2, pode-se observar que cerca de 23% dos fungos estão
classificados no grupo 8, cujas as características são micélio branco a cinza com
numerosos ascos pequenos. Para o grupo 9 são 25% do total de isolados que
apresentaram as mesmas características. Confirmando assim o que Strobel e
colaboradores observaram em seus experimentos, que a maior parte dos fungos
endofíticos isolados estão classificados como Ascomicetos (Strobel et al., 2001).
104
Tabela 4 – Grupos e características dos fungos endofíticos de A. rosaeodora
Grupo
Nº de isolados
Qtde de isolados por meios
Característica
BDA MF Grupo 1 20 12 8 Micélio preto, com poucos ascos. Grupo 2 21 14 7 Micélio cinza a preto, rasteiro, sem estrutura de reprodução Grupo 3 8 1 7 Micélio castanho claro, sem estrutura de reprodução Grupo 4 4 3 1 Colônias de cor verde com numerosos esporos pequenos e micélio branco Grupo 5 3 - 3 Micélio feltroso, amarelo-claro, sem estrutura de reprodução. Grupo 6 2 1 1 Micélio castanho escuro, rasteiro Grupo 7 4 3 1 Micélio cotonoso, rasteiro de cor branca Grupo 8 60 55 5 Micélio branco à cinza; com numerosos ascos pequenos Grupo 9 66 59 7 Micélio amarelo com numerosos ascos grandes. Grupo 10 22 20 2 Micélio branco cotonoso, com pontos escurecidos no micélio. Sem estrutura de reprodução Grupo 11 11 11 - Micélio branco rasteiro levemente preguiado, ausência de esporos. Grupo 12 4 4 - Micélio negro cotonoso Grupo 13 3 3 - Micélio beje pregueado
105
Tabela 4 - Grupos e características dos fungos endofíticos de A. rosaeodora (continuação)
Grupo 14 3 3 - Micélio cinza, rasteiro pregueado com pigmento difuso Grupo 15 3 3 - Micélio cinza feltroso Grupo 16 3 1 2 Micélio creme levemente pregueado Grupo 17 6 - 6 Micélio creme em camadas, levemente pregueado e feltroso Grupo 18 3 1 2 Micélio creme, pregueado, feltroso Grupo 19 5 5 - Micélio preto, feltroso e pregueado Grupo 20 3 2 1 Micélio preto, cerebriforme, com numerosos ascos. Grupo 21 4 3 1 Micélio branco, preguiado, ausência de esporos e estrutura de reprodução Grupo 22 4 3 1 Micélio laranjado, com aspecto gelatinoso.
106
Gráfico 2 – a) Distribuição total dos isolados fúngicos em grupos; b) Distribuição dos grupos de isolados
fúngicos cultivados em meio-folha (M.F).; c) Distribuição dos grupos de isolados fúngicos cultivados em
B.D.A.
A taxa de colonização é uma informação que relaciona o número de fragmento
vegetal inoculado que apresentou crescimento fúngico com o número total de
b c
a
107
fragmentos vegetais inoculados. De acordo com os dados da Tabela 5, o isolamento de
fungos endofíticos de A. rosaeodora, apresentou maior número de isolados a partir dos
galhos dos quatro espécimes analisados. Pode-se observar também, que a taxa de
colonização permaneceu maior que 1 nessa região, ou seja, ocorreu o crescimento de
mais de um fungo em um único fragmento de galho inoculado. Para as folhas, flores e
semente, o número de taxa de colonização permaneceu próximo de 1. Ao contrário do
que foi observado em outros tecidos vegetais, o fruto não apresentou um numero
significativo para a taxa de colonização, tornando esse material inviável para isolamento
de fungos endofíticos. Provavelmente, devido fruto apresentar uma massa densa existe a
dificuldade de permanência dos microrganismos em seu interior.
Tabela 5 – Taxa de colonização de cada espécime e parte vegetal
Placa Qtde de fragmentos
Fungos encontrados
Fungos Isolados
Taxa de colonização
PRI-Fo 30 16 14 0,53 PRI-Ca 30 34 31 1,13 PRI-Se 15 15 11 1,00 PRII-Fo 30 30 26 1,00 PRII-Ca 30 44 44 1,47 PRII-Se 15 16 16 1,07 PRIII-Fo 30 31 24 1,03 PRIII-Ca 30 31 27 1,03
PRIII-Fl 15 12 12 0,80 PRIV-Fo 30 20 20 0,67 PRIV-Ca 30 32 32 1,07
PRIV-Fr 15 6 5 0,40 PRI - Espécime I de A. rosaeodora;PRII - Espécime II de A. rosaeodora; PRIII - Espécime III de A. rosaeodora; PRIV - Espécime IV de A. rosaeodora; Fo – Folhas; Ca – Galhos; Se – Sementes; Fl – Flores; Fr – Frutos.
O fato dos valores da taxa de colonização ser constantemente maior que 0,5;
demonstra que a utilização dessa técnica para isolamento dos fungos endofíticos é
eficaz, além de confirmar que é possível obter um número significativo de isolados
fúngicos em qualquer um dos espécimes de A. rosaeodora.
O Gráfico 3 facilita a visualização da comparação entre o número de fungos
isolado e número de fungos encontrados por fragmento em cada espécime.
108
PRI - Espécime I de A. rosaeodora;PRII - Espécime II de A. rosaeodora; PRIII - Espécime III de A. rosaeodora; PRIV - Espécime IV de A. rosaeodora; Fo – Folhas; Ca – Galhos; Se – Sementes; Fl – Flores; Fr – Frutos.
Grafico 3 – Quantidade de fungos encontrados e isolados por n° de fragmentos de cada parte vegetal
A Tabela 6 e o Gráfico 4 mostra a comparação da taxa de colonização entre os
quatro espécimes de A. rosaeodora analisados. O espécime II apresentou uma taxa de
colonização maior que 1, ou seja, no total de fragmentos inoculados, alguns
apresentaram crescimento de mais de um fungo. Este fato pode ser relacionado pelo
diâmetro do caule, pois dos quatro espécimes coletados para isolamento, este possui
(visualmente) o maior diâmetro, ou seja, esta árvore é maior. Sendo assim, pode possuir
uma distribuição maior de fungos entre os espaços intercelulares do seu caule, galhos e
folhas. Os outros espécimes apresentaram valores entre 0,75 e 0,99; demonstrando
proximidade nos valores.
Tabela 6 – Taxa de colonização de cada espécime
Espécime Qtde de fragmentos
Fungos encontrados
Fungos Isolados
Taxa de colonização
I 75 65 56 0,87 II 75 90 86 1,20 III 75 74 63 0,99 IV 75 58 57 0,77
109
I - Espécime I de A. rosaeodora; II - Espécime II de A. rosaeodora; III - Espécime III de A. rosaeodora; IV - Espécime IV de A. rosaeodora.
Gráfico 4 – Qtde de fungos encontrados e isolados por n° de fragmentos de cada espécime
A Tabela 7 relaciona a quantidade de fungos endofíticos isolados de A.
rosaedora com dois diferentes meios de cultura.
Tabela 7 – Quantidade de fungos isolados por meio de cultura
RI - Espécime I de A. rosaeodora;PRII - Espécime II de A. rosaeodora; PRIII - Espécime III de A. rosaeodora; PRIV - Espécime IV de A. rosaeodora; Fo – Folhas; Ca – Galhos; Se – Sementes; Fl – Flores; Fr – Frutos; B.D.A – Agar batata-dextrose.
Parte do vegetal
Qtde de fragmentos
Qtde de fungos
isolados
Meio de Cultura % de fungos em
B.D.A.
% de fungos em Meio folha
B.D.A Meio Folha
PRI-Fo 30 14 11 3 44 60
PRI-Ca 30 31 25 6 100 120
PRI-Se 15 11 8 3 80 60
PRII-Fo 30 26 21 5 84 100
PRII-Ca 30 44 39 5 156 100
PRII-Se 15 16 11 5 110 100
PRIII-Fo 30 24 17 7 68 140
PRIII-Ca 30 27 25 2 100 40
PRIII-Fl 15 12 7 5 70 100
PRIV-Fo 30 20 17 3 68 60
PRIV-Ca 30 32 25 7 100 140
PRIV-Fr 15 5 1 4 10 80
110
No meio de cultura BDA, foram utilizados vinte e cinco fragmentos vegetais em
cinco placas para inoculação de folhas e galhos (ou seja, cinco fragmentos em cada
placa) e dez fragmentos de flores, fruto e sementes foram em duas placas cada (ou seja,
cinco fragmentos em cada placa). Para meio de cultura de MF, foram utilizados cinco
fragmentos de cada parte vegetal em todas as placas, em um total de doze placas com
MF.
Tendo a relação entre o número de isolados e o número de fragmentos
inoculados em cada tipo de meio de cultura, pode-se observar que a porcentagem de
isolados é maior no meio de cultura MF do que no meio de cultura B.D.A. Como MF é
um meio diferenciado, composto por 200g de decocto das folhas de A. rosaeodora, este
meio de cultura acabou se tornando específico para alguns fungos, como por exemplo,
os fungos classificados nos grupos 2, 5 e 17. Pode-se considerar que este meio
diferenciado é viável para isolamento dos fungos, pois a composição do meio de cultura
é, parcialmente, semelhante à composição química em que fungo está adaptado em seu
habitat e dessa maneira, o resultado de isolamento poderia ser mais fiel à diversidade
fúngica existente no vegetal. Porém torna-se inviável, pois existe a necessidade de
preparo do meio de cultura com os mesmo componentes, sempre que for preciso fazer o
repique do fungo para a sua manutenção. Como a árvore é, normalmente, encontrada em
ambiente inacessível, torna-se difícil o acesso às suas folhas.
4.2 PRODUÇÃO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS
4.2.1 FERMENTAÇÃO
Conforme Tabela 8, dos 262 fungos isolados, apenas 86 fungos tiveram
crescimento micelial nas condições pré-estabelecidas.
Pode-se observar que a maior parte dos fungos que obtiveram crescimento
micelial foram os fungos isolados em BDA. Assim, pode-se concluir que o MF
realmente tornou-se um meio de cultura específico para algumas espécies fúngicas. Este
fato justifica a inviabilidade de utilização deste meio de cultura para um trabalho de
prospecção.
Tabela 8 – Quantidade de fungos com crescimento micelial nas condições de fermentação
111
Placa Fungos encontrados
Fungos Isolados
Fungos q/ obtiveram massa micelial
Qtde por espécime
BDA MF PRI-Fo 16 14 9 2
24 PRI-Ca 34 31 8 1 PRI-Se 15 11 4 - PRII-Fo 30 26 8 -
25 PRII-Ca 44 44 14 - PRII-Se 16 16 3 - PRIII-Fo 31 24 8 2
23 PRIII-Ca 31 27 7 2 PRIII-Fl 12 12 3 1 PRIV-Fo 20 20 5 -
14 PRIV-Ca 32 32 6 2 PRIV-Fr 6 5 1 - TOTAL 287 262 86 86
PRI - Espécime I de A. rosaeodora;PRII - Espécime II de A. rosaeodora; PRIII - Espécime III de A. rosaeodora; PRIV - Espécime IV de A. rosaeodora; Fo – Folhas; Ca – Galhos; Se – Sementes; Fl – Flores; Fr – Frutos; B.D.A – Agar batata-dextrose; MF – Meio folha.
O tecido vegetal galho do espécime II apresentou o maior número de fungos que
cresceram nas condições de fermentação estabelecidas, sendo justificável por ser a
região e o espécime que apresentou maior número de isolados. Porém, em porcentagem,
os valores de 14 fungos representam 31,82%, enquanto que os fungos isolados das
folhas do espécime I representam 78,57% dos isolados.
Observou-se que os fungos isolados necessitam de estudos mais detalhados
quanto às condições de crescimento, pois menos da metade dos isolados obtiveram
crescimento micelial nas condições estabelecidas. Será necessário determinar
alternativas de meios de cultura para analisar a produção de metabólitos dos demais
fungos.
A Tabela 9 relaciona a quantidade de fungos que obtiveram crescimento micelial
nas condições estabelecidas com os 22 grupos previamente classificados conforme a
Tabela 4.
Tabela 9 – Distribuição dos fungos com crescimentos micelial por grupo
112
Grupo % de fungos c/
crescimento
Qtde de fungos com crescimento
n° de isolados
Grupo 1 20 4 20 Grupo 2 38 8 21 Grupo 3 25 2 8 Grupo 4 75 3 4 Grupo 5 0 0 3 Grupo 6 0 0 2 Grupo 7 25 1 4 Grupo 8 45 27 60 Grupo 9 38 25 66 Grupo 10 18 4 22 Grupo 11 0 0 11 Grupo 12 25 1 4 Grupo 13 0 0 3 Grupo 14 33 1 3 Grupo 15 67 2 3 Grupo 16 33 1 3 Grupo 17 17 1 6 Grupo 18 33 1 3 Grupo 19 20 1 5 Grupo 20 33 1 3 Grupo 21 25 1 4 Grupo 22 50 2 4 TOTAL 86 262
Conforme Gráfico 5, cerca de 75% dos fungos classificados no grupo 4, cujas
características são: colônias verdes com numerosos esporos pequenos e micélio branco,
apresentou crescimento micelial nas condições estabelecidas, sendo assim, essas
condições são as mais adequadas para fungos com essas características (Figura 22).
113
Gráfico 5 – Porcentagem de fungos com crescimento micelial por grupo
Os grupos 8 e 9, que apesar de possuírem maior número de isolados, não
apresentaram bom crescimento no meio de cultura estabelecido, cerca de 45 e 38%,
respectivamente. Provavelmente, como são fungos com características morfológicas
descritas para ascomicetos, necessitariam de mais tempo ou nutrientes diferenciados
para produção de seus ascosporos para assim, consumir os nutrientes fornecidos no
meio de cultura resultando na produção dos metabólitos.
O segundo grupo que apresentou maior quantidade de fungos que obtiveram
crescimento micelial, cerca de 67%, foi o grupo 15. Porém, este valor, representa 2 de 3
fungos isolados e classificados neste grupo.
Figura 22 – Fungo classificado no grupo 4 (PRII-Fo 56)
%
114
4.3 TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS PARA ANÁLISE DOS METABÓLITOS
SECUNDÁRIOS
4.3.1 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
Foram analisados os 86 sobrenadantes dos fungos endofíticos de A. rosaeodora
que obtiveram crescimento micelial nas condições fermentativas pré-estabelecidas.
Os perfis cromatográficos dos sobrenadantes de 76 amostras analisadas
demonstraram similaridade diante das condições de análises estabelecidas. Na Figura 23
observa-se a sobreposição dos cromatogramas das amostras do meio de cultura utilizado
com o sobrenadante do fungo PRI-Fo 7, demonstrando a semelhança entre eles. A
sobreposição observada na Figura 24 confirma a semelhança entre as amostras dos
sobrenadantes PRII – Ca 100 e PRI - Ca 30.
Porém, os cromatogramas dos sobrenadantes dos fungos com códigos PRI-Fo 8,
PRII-Fo 56, PRII-Fo 58, PRII-Fo 71, PRIII-Fo 136, PRIII-Fo 148, PRIII-FoMF 156,
PRIII-Fl 188, PRIII-Fl 189, PRII-Se 253 apresentaram perfil cromatográfico bastante
diferenciados entre eles conforme as Figuras 25 a 34.
115
Figura 23 – Sobreposição de
cromatogramas: Sobrenadante sem inoculo fúngico(A) e sobrenadante do
fungo com código PRI-Fo 7 (B)
Tabela 10 – a) descrição dos picos do
cromatograma A; b) descrição dos
picos do cromatograma B
A
B
b
a
116
Figura 24 - Sobreposição de
cromatogramas: Sobrenadante do
fungo com código PRII – Ca 100
(A) e Sobrenadante do fungo com
código PRI - Ca 30 (B)
Tabela 11 – a) descrição dos picos do
cromatograma A; b) descrição dos picos do
cromatograma B
A
B
a b
Figura 25 - Cromatograma da amostra de PRI – Fo 8
Figura 26 - Cromatograma da amostra de PRII – Fo 56
Figura 27 – Cromatograma da amostra de PRII – Fo 58
ii
F
igura 28
–
Cromat
ograma
da
amostra
de PRII
– Fo 71
Figura 29 -
Cromatograma da
amostra de PRIII – Fo
136
Figura 30 - Cromatograma da amostra de PRIII - Fo148
Figura
31 –
Cromato
grama
da
iii
amostra de PRIII – FoMF 156
Figura 32 - Cromatograma da amostra de PRIII – Fl 188
Figura 33 - Cromatograma da amostra de PRIII – Fl 189
Figura 34 - Cromatograma da amostra de PRII – Se 253
iv
Para análise da presença de linalol nas amostras foram comparados os 86
cromatogramas com o cromatograma do padrão linalol (Figura 35). Destas amostras foram
selecionadas 29 que apresentaram um pico próximo ou no mesmo tempo de retenção do
padrão. Nestas amostras foram adicionados 10 µL da solução padrão para observar a
ocorrência do aumento na área do provável pico.
Figura 35 – Cromatograma da amostra padrão de linalol
Na Tabela 12, observam-se os códigos das amostras, tempo de retenção, área do pico
antes da adição do padrão, área do pico depois da adição do padrão e a diferença entre as
áreas dos picos. Foram destacadas somente as amostras que apresentaram aumento na área do
pico após adição do padrão.
Tabela 12 – Amostras que apresentaram aumento na área do pico no cromatograma
Item Amostra TR (min)
Área do pico antes da adição
Área do pico
depois da adição
Diferença das áreas
v
1 PRI – Fo 6 3,430 24015 26908 28932 PRI – Fo 8 3,493 9507 10105 5983 PRI – Fo 10 3,541 82114 82771 6574 PRI – FoMF 12 3,533 37149 41340 41915 PRII – Fo 61 3,434 40319 56530 162116 PRII – Ca 108 3,435 7301 8215 9147 PRIII – Fo 140 3,594 2871 3102 2318 PRIII – Ca 159 3,598 22405 23936 15319 PRIII – Ca 168 3,529 1126 1646 52010 PRIII – Ca 170 3,632 5622 5925 30311 PRIII – Ca 180 3,642 31224 31917 69312 PRIII – CaMF 183 3,544 33071 33152 8113 PRIII – Fl 187 3,668 18642 18715 7314 PRIII – Fl 188 3,434 548063 561457 1339415 PRIII – Fl 189 3,596 34878 36536 165816 PRIV – Fo 198 3,682 2424 3141 71717 PRII – Ca 258 3,511 2933 3239 306
PRI - Espécime I de A. rosaeodora; PRII - Espécime II de A. rosaeodora; PRIII - Espécime III de A. rosaeodora; PRIV - Espécime IV de A. rosaeodora; Fo – Folhas; Ca – Galhos; Se – Sementes; Fl – Flores; Fr – Frutos
As amostras que apresentaram aumento na área do pico no cromatograma após adição
do padrão, mais as amostras que apresentaram perfil cromatográfico diferenciado no CLAE,
foram submetidas a um processo de extração líquido – líquido em acetato de etila. As frações
resultantes foram submetidas à análise em cromatografia de fase gasosa acoplada ao
espectrômetro de massas (CG/EM).
Foram encaminhadas dezenove amostras para análise, exceto os sobrenadantes dos
fungos com os códigos PRI - Fo 10, PRII – Se 253; PRII – Ca 108; PRIII – Ca 170; PRIII – Fl
187; pois estes apresentaram quantidades insuficientes de sobrenadante para análise.
4.3.2 CROMATOGRAFIA DE FASE GASOSA ACOPLADA AO ESPECTRÔMETRO DE
MASSAS
As tabelas abaixo relacionam as amostras analisadas, com o tempo de retenção (TR)
do pico, fragmentação no espectrômetro de massas e sugestão da identificação do composto
fornecida pelo banco de dados do aparelho.
Tabela 13 – Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRI – FoMF 12
N° do Pico
TR (min) Composto identificado
Fragmentação
1 2,742 ? 50; 65; 91; 92; 121 2 4,027 ? 41; 42; 43; 56; 57; 70; 71; 83; 85; 97
vi
3 5,043 ? 41; 42; 43; 57; 70; 71; 83; 85; 97; 120 4 6,158 ? 42; 43; 56; 57; 70; 71; 83; 85; 97 5 7,294 n-docosano (18,4%) 42; 43; 55; 57; 70; 71; 84; 85; 97; 111 6 8,448 n-docosano (15,3%) 42; 43; 55; 57; 70; 71; 84; 85; 97; 121; 178. 7 9,559 n-docosano (21,6%) 43; 55; 57; 70; 71; 85; 97; 115; 195 8 11,011 ? 41; 69, 70; 86; 125; 154; 155 9 11,186 ? 41; 68; 70; 86; 125; 154; 155 10 11,345 ? 41; 149; 150; 223 11 15,702 ? 41; 53; 55; 57; 69; 77; 95; 97; 105; 123;
147; 165; 207; 235; 264; 265; 266 12 15,987 ? 42; 43; 55; 65; 69; 70; 93; 95; 97; 123; 151;
180; 207; 235; 265; 283 13 16,665 Bis-(2etilhexil)-ftalato
(47,1%) 56; 57; 83; 104; 149; 150; 167; 207; 279
14 19,198 ? 41; 53; 67; 69; 81; 94; 95; 121; 149; 207; 281
Tabela 14 – Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRI – Fo 8
N° do Pico
TR (min) Composto identificado
Fragmentação
1 2,572 3,7-dimetil-1,6-octadien-3-ol (37,7%)
40; 41; 43; 53; 55; 65; 69; 71; 77; 91; 92; 93; 109; 121; 136
2 2,728 Fenetil álcool (43,8%) 50; 65; 91; 92; 122 3 4,034 n-docosano (14,5%) 42; 43; 56; 57; 70; 71; 84; 85; 97; 174 4 5,041 n-tetracosano (16,5 42; 43; 56; 57; 70; 71; 83; 85; 96 5 6,158 n-docosano (18,9%) 42; 43; 55; 57; 70; 71; 83; 85; 96; 111 6 6,629 5-hidroxi-1,4-
naftalenodiona (97,9%) 50; 63; 64; 92; 118; 120; 146; 173; 174
7 8,326 2,5,8-trimetil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno (34,0%)
51; 63; 77; 102; 103; 115; 131; 132; 159; 160; 174; 175
8 8,580 3-metóxi-4,5-metilendióxi-alilbenzeno (47,7%)
50; 65; 77; 91; 105; 117; 120; 131; 146; 148; 163; 174; 192; 193
9 9,572 8-acetil-7-hidroxi-4-metil- 43; 57; 77; 91; 103; 115; 119; 133; 144; 158; Tabela 14 – Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRI – Fo 8 (continuação)
cumarina (28,6%) 161; 175; 176 10 10,358 N,N’-dietil-1,4-
benzenodiamina (18,4%) 40; 43; 51; 57; 67; 77; 78; 91; 105; 117; 118; 131; 135; 145; 149; 160; 174; 175; 192; 193; 223
11 11,017 Acenafteno (77,4%) 41; 69; 70; 86; 125; 153; 154 12 11,190 Acenafteno (54,2%) 41; 55; 68; 70; 86; 125; 154; 155; 167 13 11,350 Di-N-butilftalato (38,8%) 41; 149; 150; 223 14 15,706 Ácido 9-metilester
octadecenóico (83,3%); 41; 42; 55; 67; 68; 69; 93; 95; 97; 122; 125; 153; 179; 207; 235; 264; 265; 266
15 15,992 Ácido 9-metilester octadecenóico (74,5)
41; 42; 55; 67; 68; 69; 94; 95; 97; 123; 151; 180; 207; 235; 263; 265; 283
16 19,198 Trans-farnesol (11,6%) 41; 67; 69; 79; 81; 95; 135; 207; 209; 281; 341
Tabela 15 – Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIII – Fo 136
N° do Pico
TR (min) Composto identificado
Fragmentação
1 2,738 ? 50; 65; 91; 92; 122 2 4,303 ? 42; 43; 56; 57; 58; 70; 71; 83; 85; 97 3 5,034 ? 42; 43; 55; 57; 70; 71; 83; 85; 97
vii
4 5,933 5-hexildiidro-2-furanone (37,5%)
41; 57; 69; 85; 95; 110; 128
5 7,595 Ibuprofeno (71,4%) 41; 77; 91; 118; 119; 161; 162; 206 6 11,366 ? 65; 149; 150; 223 7 13,373 Acido metilester-9-
octadecenoico (74,0%) 41; 53; 55;67; 69; 71; 94; 91; 135; 137; 180; 222; 223; 264; 265; 266; 355
8 15,432 Di-(2-etilhexil)-adipato (78,5%)
43; 55; 69; 71; 101; 129; 147; 207
9 16,012 Acido metilester-9-octadecenoico (80,9%)
42; 43; 55; 69; 81; 82; 97; 107; 111; 137; 166; 207; 235; 265; 283
Tabela 16 - Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIII – FoMF 156
N° do Pico
TR (min) Composto identificado
Fragmentação
1 2,072 Diidrocitronelol (12,2%) 43; 45; 56; 57; 69; 97
2 2,303 n-undecano (19,9%) 41; 42; 43; 45; 55; 57; 67; 70; 71; 84; 85; 108
3 2,522 n-undecano (17,2%) 41; 42; 43; 53; 56; 57; 68; 69; 70; 71; 84; 85
4 2,746 Ciclohexanamina (43,8%) 43; 55; 56; 70; 99
5 4,031 n-docosano (18,6%) 42; 43; 55; 57; 67; 70; 71; 84; 85; 97
6 4,278 N-acetilpirrolidina (40,1%) 42; 43; 55; 70; 84; 113; 114
7 5,041 n-tricosano (12,9%) 40; 41; 43; 56; 57; 71; 84; 111
8 5,391 Ácido 2-hexenilester hexanóico
(39,2%)
42; 43; 54; 60; 81; 82; 83; 99; 100
Tabela 16 - Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIII – FoMF 156 (continuação) 9 5,569 5-hidroxi-2-hidroximetil-4H-
piran-4-one (98,3%)
41; 57; 69; 85; 113; 142; 143
10 11,340 ? 149; 150; 223
11 16,367 2-aminobenzimidazol (18,6%) 41; 55; 72; 91; 114; 134; 135; 207; 302
12 17,116 9-cis-retinal (47,7%) 51; 57; 85; 128; 185; 212; 227; 255; 256; 284; 285
13 19,201 Trans-farnesol (20,1%) 41; 67; 68; 69; 81; 95; 107; 149; 207; 209; 265; 341
Tabela 17 – Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRII – Ca 258
N° do Pico
TR (min) Composto identificado
Fragmentação
1 2,086 Sec-butilnitrito (19,8%) 41; 43; 45; 55; 81
2 2,541 3,7-dimetil-1,6-octadien-3-ol
(9,64%)
41; 43; 44; 69; 71; 81; 93; 121
3 4,026 ? 41; 42; 43; 56; 57; 70; 71; 83; 85; 97
4 5,041 ? 41; 42; 43; 55; 57; 70; 71; 83; 85; 97
5 6,045 3,4-dimetoxibenzaldeído
(79,3%)
41; 65; 77; 95; 105; 151; 166; 167
viii
6 6,540 n-tetradecanol (12,3%) 42; 55; 56; 67; 83; 84; 97; 111
7 11,354 ? 41; 149; 150; 223
8 13,378 ? 41; 42; 55; 69; 70; 97; 111; 135; 155; 180; 221; 264
9 16,004 Ácido metilester-9-
octadienoico (37,4%)
55; 56; 67; 69; 98; 123; 165; 207; 265; 316; 367; 423; 479; 535; 591; 647; 648; 649; 670
Tabela 18- Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIII – Fo 148
N° do Pico
TR (min) Composto identificado
Fragmentação
1 5,897 1-tetradeceno (14,2%) 40; 41; 44; 55; 65; 67; 70; 84; 97; 111
2 6,532 1-octadeceno (13,5%) 41; 42; 55; 57; 82; 83; 85; 97; 111
3 9,115 2,3-diidro-2,2-
dimetilbenzofuran-7-
metilcarbamato (19,7%)
55; 81; 109; 137; 138; 165; 166
4 10,844 3,5-tris(aziridin-1-il)benzo-
1,4-quinona (21,7%)
43; 79; 119; 147; 175; 199; 200; 217; 232
5 11,428 6-tercbutil-2,4-dimetilfenol
(30,4%)
41; 69; 69; 91; 122; 123; 135; 147; 163; 164; 233
Tabela 18- Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIII – Fo 148 (continuação)
6 11,539 2,6-bis-(1,1dimetiletil)-2,5-
ciclohexadieno-1,4-diona
(28,9%)
42; 55; 65; 67; 78; 91; 93; 107; 110; 125; 133; 149; 150; 175; 178; 191; 207; 219; 234; 235
7 11,760 Octahidro-4,4,8,8-tetrametil-4a-
7-metano-4aH-naft[1,8a]oxireno
(42,4%)
41, 67; 69; 91; 97; 121; 149; 165; 192; 219; 234; 235; 236
8 11,855 17-α-metiltestoterone (12,1%) 43; 53; 63; 67; 69; 78; 91; 95; 97; 107; 119; 133; 135; 136; 148; 163; 189; 215; 217; 232; 233; 234
9 12,031 Digitoxina (32,0%) 41; 43; 50; 53; 67; 69; 83; 105; 107; 109; 111; 133; 134; 147; 161; 175; 203; 236; 237.
10 13,006 Metil paraoxona (46,6%); 9-cis-
retinal (13,0%)
43; 55; 78; 79; 119; 147; 148; 171; 186; 189; 197; 215; 216; 230; 248; 249
11 13,541 11-α-hidroxi-17-α-
metiltestosterona (20,5%)
43; 51; 67; 77; 95; 119; 121; 135; 141; 150; 159; 189; 192; 193; 215; 233; 249
12 13,902 Citrinina (50,5%) 41; 43; 67; 69; 77; 95; 96; 97; 121; 123; 147; 161; 171; 189; 192; 215; 217; 232; 233; 234; 250; 251; 252
Tabela 19 - Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIII – Fl 188
N° do Pico
TR (min) Composto identificado
Fragmentação
ix
1 2,530 ? 41; 42; 43; 53; 56; 57; 67; 70; 71; 84; 85
2 5,892 ? 41; 43; 53; 55; 56; 57; 69; 70; 81; 83; 95; 97; 111
3 6,522 ? 41; 43; 53; 55; 68; 69; 82; 83; 96; 97; 110; 111
4 9,113 2,3-diidro-2,2-
dimetilbenzofuran-7-
metilcarbamato (26,2%)
41; 67; 81; 95; 109; 137; 138; 165; 166
5 10,836 3,5-tris(aziridin-1-il)benzo-
1,4-quinona (26,7%)
43; 79; 119; 147; 159; 175; 199; 200; 217; 232; 233
6 11,422 6-terc-butil-2,4-dimetilfenol
(43,2%)
41; 65; 67; 91; 122; 123; 135; 147; 163; 164; 199; 233
7 11,759 Octadiidro-4,4,8,8-tetrametil-4-
α-7-metano-4H-nafto[1,8]xireno
(50,0%)
41; 67; 69; 91; 97; 121; 149; 165; 201; 219; 234; 235
8 11,854 Viridilfloreno (12,2%) 43; 53; 66; 67; 69; 83; 91; 97; 107; 110; 135; 136; 161; 189; 217; 232; 233; 234
9 13,545 2,6-bis-(1,1-dimetil)-2,5- 43; 50; 67; 79; 82; 95; 105; 121; 134;
Tabela 19 - Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIII – Fl 188 (continuação)
ciclohexadieno-1,4-diona
(23,1%)
135; 149; 162; 164; 192; 193; 199; 217; 233; 250
10 13,892 Citrinina (50,5%) 43; 51; 67; 69; 91; 97; 119; 121; 147; 149; 177; 199; 215; 217; 233; 234; 250; 251; 252
Tabela 20 – Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIII – Fl 189
N° do Pico
TR (min) Composto identificado
Fragmentação
1 2,086 ? 41; 43; 44; 56; 57; 69; 71; 89
2 2,308 ? 40; 41; 43; 55; 57; 70; 71; 84; 85; 107
3 2,564 3,7-dimetil-1,6-octadien-3-ol
(39,1%)
41; 43; 44; 55; 57; 68; 70; 71; 84; 85; 121
4 5,595 1-metilnaftaleno (62,9%) 41; 57; 69; 85; 113; 142; 143
5 11,358 ? 50; 76; 149; 150; 223
6 15,985 ? 42; 43; 44; 55; 67; 69; 79; 95; 97; 107; 111; 138; 165; 193; 207; 235; 265; 266; 283
7 17,126 9-cis-retinal (51,2%) 57; 85; 128; 185; 228; 229; 255; 256; 284; 285
8 19,231 Cis-Farnesol (13,3%) 41; 44; 67; 68;69; 81; 95; 121; 149; 207; 281
Tabela 21 – Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRII – Fo 61
N° do Pico
TR (min) Composto identificado
Fragmentação
x
1 2,740 ? 50; 65; 91; 92; 122
2 5,474 N-benziloxicarbonil-L-tyrosina
(34,4%)
51; 77; 79; 107; 108; 138
3 11,026 ? 41; 69; 70; 86; 125; 154; 155
4 11,197 ? 41; 55; 68; 70; 86; 125; 154; 155
Tabela 22 – Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRI – Fo 6
N° do Pico
TR (min) Composto identificado
Fragmentação
1 2,743 Fenil etil álcool (45,3%) 50; 63; 65; 91; 92; 121
Tabela 23 – Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRII – Fo 58
N° do Pico
TR (min) Composto identificado
Fragmentação
1 11,202 Acenafteno (69,7%) 41; 68; 70; 86; 125; 154; 155
2 12,195 Benzantraceno (75,5%) 41; 55; 69; 70; 97; 129; 157; 185; 211; 228
3 12,449 Ácido 9-metilester
octadecenóico (64,1%)
41; 42; 55; 69; 70; 93; 97; 123; 151; 189; 209; 227
4 12,531 Criseno (65,4%) 42; 43 70; 71; 97; 129; 157; 185; 228; 229
5 13,951 Ácido 9-metilester
octadecenóico (57,7%)
40; 41; 55; 57; 69; 79; 96; 97; 99; 123; 151; 175; 193; 217; 236; 237; 238; 255
6 14,124 Isopropil palmitato (70,8%) 41; 43; 69; 70; 71; 97; 129; 157; 185; 213; 239; 256
7 14,270 Ácido 9-metilester
octadecenóico (67,2%)
42; 43; 55; 67; 68; 69; 97; 101; 111; 137; 165; 194; 219; 237; 255; 325
8 14,446 Ácido butilester hexadecanóico
(55,4%)
41; 43; 67; 69; 70; 95; 115; 157; 185; 255; 256; 257; 326
9 15,096 Ácido octadecanoico (30,3%) 40; 42; 43; 55; 57; 83; 95; 129; 153; 185; 213; 214; 241; 270; 271; 311; 340
10 15,158 Ácido 9-metilester
octadecenóico (79,3%)
43; 55; 57; 69; 82; 97; 111; 137; 166; 207; 231; 251; 269
11 15,406 Di-(2-etilhexil)-adipato
(89,4%)
43; 55; 83; 112; 129; 147
12 15,707 Ácido 9-metilester
octadecenóico (57,0%)
41; 42; 43; 68; 70; 71; 97; 98; 123; 151; 179; 221; 247; 264; 265; 283
13 16,008 Ácido 9-metilester
octadecenóico (55,8%)
41; 43; 54; 55; 57; 69; 81; 82; 95; 96; 113; 123; 124; 151; 153; 178; 179; 220; 221; 245; 247; 264; 265; 283; 353; 354
Tabela 24 – Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIII – CaMF 183
xi
N° do Pico
TR (min) Composto identificado
Fragmentação
1 2,554 3,7-dimetil-1,6-octadien-3-ol
(33,3%)
41; 43; 44; 69; 70; 71; 91; 93; 121
2 4,023 n-docosane (19,9%) 41; 43; 55; 57; 70; 71; 84; 85
3 5,041 ? 42; 43; 55; 57; 70; 71; 83; 85; 97
4 6,531 ? 41; 42; 54; 55; 57; 68; 69; 70; 71; 83; 84; 96; 97; 110; 111
5 11,354 ? 50; 76; 149; 150; 223
6 11,481 1,3,4,6,7,8–hexahidro-4,6,6,7,8,8-
hexametil-ciclopenta-2-
benzopirano (41,6%)
50; 77; 115; 159; 187; 213; 215; 230; 243; 257; 258
Tabela 24 – Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIII – CaMF 183 (continuação)
7 11,624 Ácido 2-(2-hidroxietoxi)-etilester
octadecanoico (49,1%); Ácido
octadecanoico (35,6%)
42; 44; 55; 67; 69; 73; 88; 89; 111; 115; 143; 157; 158; 185; 200; 213; 227; 241; 255; 284
8 11,752 Octahidro-4,4,8,8-tetrametil-4,7-
metano-4H-naft[1,8]-oxireno
(34,0%)
41; 67; 69; 91; 97; 121; 147; 149; 173; 201; 234; 235
9 15,398 ? 41; 55; 69; 83; 112; 129; 147
10 15,696 ? 41; 53; 55; 5771; 73; 96; 97; 123; 148; 179; 207; 235; 265; 266
11 15,991 ? 42; 43; 55; 67; 69; 70; 94; 97; 98; 123; 151; 180; 221; 245; 265; 283
12 16,364 2,6-Dichloro-4-nitroaniline-2,6-
Dichloro-4-nitrobenzenamine
(15,1%)
55; 56; 72; 91; 113; 114; 134; 135; 207; 302
13 16,673 ? 50; 57; 76; 104; 149; 150; 167; 207; 279
14 17,107 Estrone metilester (31,5%) 63; 128; 199; 227; 229; 255; 256284; 285
Tabela 25- Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRII – Fo 71 N° do Pico
TR (min) Composto identificado
Fragmentação
1 5,957 n-tetradecene (13,3%) 41; 43; 53; 55; 56; 67; 69; 70; 82; 83; 96; 97; 111
2 6,533 n-dodeceno (8,99%) 41; 42; 43; 55; 56; 66; 67; 69; 70; 82; 83; 96; 97; 110; 111
3 11,032 ? 41; 69; 70; 86; 125; 154; 155
4 11,201 ? 41; 68; 70; 86; 125; 154; 155
5 15,705 ? 41; 42; 55; 67; 68; 69; 92; 95; 97;123; 125; 151; 153; 193; 207; 222; 244; 245; 264; 265; 266
6 15,988 ? 43; 55; 57; 69; 79; 81; 97; 107; 111; 127; 151; 180; 221; 245; 265; 283;
xii
7 31,864 a-11-hidroxipregn-4-eno-3,20-
dione (23,0%)
55; 56; 72; 91; 120; 121; 160; 202; 230; 231; 246; 279; 280; 329; 330; 374; 378; 379; 422; 475; 476
Tabela 26 – Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRII – Fo 56 N° do Pico
TR (min) Composto identificado
Fragmentação
1 6,680 Octadecene (9,62%) 41; 43; 54; 55; 5682; 83; 111 2 15,676 Di-(2-etilhexil)-adipato (74,4%) 40; 43; 55; 69; 71; 84; 101; 111; 128;
Tabela 26 – Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRII – Fo 56 (continuação) 129; 147; 207 3 15,963 Ácido 9-metilester
octadecenóico (81,9%)41; 53; 55; 57; 69; 85; 96; 97; 125; 151; 179; 221; 264; 265; 355; 429
4 16,245 Ácido 9-metilester octadecenóico(75,3%)
43; 55; 57; 67; 69; 94; 96; 97; 123; 151; 180; 222; 247; 265; 283
5 19,625 Acetato de nerolidila (10,3%) 40; 41; 69; 79; 95; 133; 207; 281; 341; 429;
6 24,804 Digitoxina (35,4%) 43; 55; 56; 95; 97; 98; 135; 173; 207; 208; 222; 265; 281; 327; 446
Tabela 27 – Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIV – Fo 198 N° do Pico
TR (min) Composto identificado
Fragmentação
1 2,141 1,2,4-trimetilbenzeno (29,4%) 43; 44; 45; 56; 77; 104; 105; 119; 120
32 2,552 3,7-dimetil-1,6-octadien-3-ol
(51,0%)
41; 43; 44; 45; 68; 67; 71; 83; 91; 93; 107; 119; 134
4 3,851 n-undecano (11,3%) 40; 42; 43; 58; 69; 71
5 4,037 n-heneicosano (10,3%) 40; 54; 55; 57; 70; 71; 84; 85; 97; 135
6 5,042 n-tridecano (14,2%) 40; 42; 43; 44; 56; 57; 70; 71; 83; 85; 97
7 6,021 Diidrocitronelol (13,3%) 40; 41; 42; 44; 53; 55; 56; 67; 67; 69; 71; 83; 84; 85; 97; 111
8 6,540 1-eicoseno (8,90%) 41; 44; 54; 55; 57; 67; 83; 84; 97; 111; 221
9 7,304 n-docosano (15,6%) 43; 55; 57; 71; 83; 85; 111
10 8,442 ? 40; 42; 43; 55; 57; 70; 71; 84; 85; 97; 111
11 8,946 ? 40; 42; 43; 55; 57; 69; 71; 84; 85; 97; 111
12 11,644 Ácido octadecanoico (31,8%) 40; 43; 55; 60; 61; 73; 85; 87; 88; 109; 115; 143; 157; 158; 185; 186; 213; 214; 241; 255; 284
13 13,340 3-iso-thujopsanono (10,1%) 43; 55; 67; 69; 91; 95; 109; 111; 135; 178; 262
14 15,417 ? 43; 55; 83; 101; 111; 129; 130; 147
15 15,716 ? 41; 42; 55; 65; 67; 71; 82; 91; 97; 111; 112; 137; 165; 193; 221; 245; 264; 265; 266; 283
16 ? 41; 42; 43; 55; 57; 67; 69; 71;73; 81; 95; 97; 112; 123; 136; 151; 180; 221; 245; 264; 283
xiii
Tabela 28 – Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIII – Ca 159 N° do Pico
TR (min) Composto identificado
Fragmentação
1 2,560 3,7-dimetil-1,6-octadien-3-ol (30,9%) 43; 44; 55; 71; 91; 93; 121
2 4,032 ? 42; 43; 56; 57; 70; 71; 84; 85
3 11,368 ? 41; 76; 149; 150; 223
4 11,639 Ácido octadecanoico (52,2%) 43; 44; 55; 61; 67; 73; 86; 87; 88; 111; 115; 143; 152; 157; 172; 185; 200; 213; 227; 241; 255; 284
5 13,324 Octahidro-4,4,8,8-tetrametil-4,7-metano-
4H-naft[1,8]-oxireno (44,4%)
41; 55; 67; 69; 71; 91; 95; 109; 111; 135; 163; 191; 263
6 15,416 Di-(2-etilexil)-adipato (86,6%) 43; 55; 83; 101; 111; 128; 147
7 15,709 ? 41; 55; 56; 67; 71; 82; 97; 108; 111; 133; 151; 179; 207; 235; 264; 265; 266
8 16,006 Perileno (66,0%) 42; 43; 55; 69; 70; 73; 93; 96; 97; 123; 148; 166; 197; 222; 245; 265; 283
9 19,240 Dendrolasina (15,7%) 41; 67; 68; 69; 81; 94; 93; 95; 121; 123; 149; 175; 207; 209
Tabela 29 – Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIII – Fo 140 N° do Pico
TR (min) Composto identificado
Fragmentação
1 2,562 3,7-dimetil-1,6-octadien-3-ol (51,0%) 43; 44; 55; 71; 91; 93; 121
2 6,529 Octadecene (9,73%) 41; 42; 43; 54; 55; 56; 67; 69; 70; 81; 83; 96; 97; 111
3 7,593 Ibuprofeno (71,4%) 45; 77; 91; 105; 119; 161; 162; 206; 207
4 9,941 Ciclopentadecanol (11,2%) 50; 53; 69; 81; 82; 83; 97; 99; 110; 112; 128
5 15,406 Di-(2-etilhexil)-adipate (87,9%) 43; 55; 83; 101; 111; 128; 129; 147
6 15,701 Perileno (92,0%) 41; 53; 55; 57; 71; 93; 96; 97; 112; 135; 166; 193; 221; 245; 264; 265; 266
7 15,982 Perileno (79,3%) 42; 43; 55; 69; 70; 93; 96; 97; 123; 151; 179; 221; 263; 264; 283
8 19,218 Cis-fernesol (24,6%) 41; 43; 67; 68; 69; 81; 95; 97; 121; 149; 177; 207; 281
Tabela 30 – Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIII – Ca 180 N° do Pico
TR (min) Composto identificado
Fragmentação
1 2,777 Fenil etil alcool (63,9%) 50; 63; 65; 91; 92; 122
2 6,033 n-tetradeceno (14,7%) 40; 41; 43; 54; 55; 56; 67; 69; 70; 81; 83; 96; 97; 111
3 6,667 ? 41; 42; 55; 57; 81; 83; 85; 110; 111
xiv
4 15,938 ? 41; 42; 43; 67; 68; 71; 93; 97; 98; 123; 151; 179; 221; 245; 264; 265; 266; 355.
5 16,221 ? 41; 43; 53; 55; 56; 57; 67; 69; 84; 85; 96; 97; 110; 112; 134; 136; 166; 197; 221; 246; 265; 283
Tabela 31 – Perfil químico da fração acetato de etila do sobrenadante de PRIII – Ca 168 N° do Pico
TR (min) Composto identificado
Fragmentação
1 2,544 ? 41; 42; 43; 56; 57; 67; 70; 71; 84; 85
2 4,024 ? 42; 43; 56; 57; 70; 71; 84; 85; 97
3 5,898 n-tridecanol (11,6%) 40; 41; 43; 54; 55; 56; 57; 67; 69; 70; 71; 82; 83; 85; 96; 97; 111
4 6,528 Octadecene (11,7%) 41; 42; 54; 55; 56; 67; 68; 69; 70; 81; 82; 83; 96; 97; 110; 111
5 11,357 ? 76; 149; 150; 223
6 15,696 Ácido 9-metilester octadecenóico
(74,9%)
40; 41; 44; 55; 70; 71; 79; 96; 97; 112; 135; 165; 193; 207; 222; 245; 265; 266
7 15,995 ? 40; 43; 55; 56; 57; 67; 69; 79; 84; 97; 98; 110; 112; 135; 165; 197; 207; 246; 265; 283
Das amostras analisadas, sete apresentaram picos no mesmo tempo de retenção do
padrão de linalol e o perfil de fragmentação desses picos são semelhantes à fragmentação do
padrão (figura 36). A tabela abaixo relaciona as amostras que apresentaram a presença do
linalol, com os tempos de retenção e probabilidade.
Tabela 32 – Amostras que apresentaram presença do linalol
Amostra TR (min) Probabilidade
PRI – Fo 8 2,572 30,7
PRIII – Fo 140 2,562 51,0
PRIII – Ca 159 2,560 30,9
PRIII – CaMF 183 2,554 33,3
PRIII – Fl 189 2,564 39,1
PRIV – Fo 198 2,552 51,0
PRII – Ca 258 2,541 9,64
PRI - Espécime I de A. rosaeodora;PRII - Espécime II de A. rosaeodora; PRIII - Espécime III de A. rosaeodora; PRIV - Espécime IV de A. rosaeodora; Fo – Folhas; Ca – Galhos; Se – Sementes; Fl – Flores; Fr – Frutos
xv
Figura 36 – Espectro de massas do linalol
Até o momento, não há relato na literatura sobre fungos filamentosos que possam
produzir substâncias da classe de terpenos. Porém, estudos relacionados a interações
fungos/plantas mencionam uma possível rota metabólica que favorece a produção dessa classe
de substâncias. Essa rota é denominada via non mevalonato – metileritritol fosfato para
produção de terpenos.
Os genes que codificam a expressão das enzimas 1-deoxi-D-xilulose-5-fosfato
sintetase e 1-deoxi-D-xilulose-5-fosfato-isomerase, que regulam essa via, são transferidos
pela planta para o fungo, provavelmente devido à co-evolução de ambos os indivíduos
(CARRAU et al., 2005; ZHI-LIN et al., 2007). A partir de produtos de degradação da glicose,
após reação catalizada pela enzima 1-deoxi-D-xilulose-5-fosfato sintetase a via de produção é
iniciada (Figura 8).
Um estudo desenvolvido por Hock em 1984 revelou a produção dos terpenos linalol,
geraniol e citronelol pelas leveduras Kluyveromyees lactis e Saccharomyces fermentati
durante a fermentação alcoólica (HOCK et al., 1984). Um estudo mais recente de Carrau e
colaboradores puderam identificar a produção majoritária de linalol e α-terpeniol por
Saccharomyces cereviseae, além da produção de outros terpenos como citronelol, geraniol e
farnesol, após alteração de concentrações da fonte de nitrogênio no meio de cultura
(CARRAU et al., 2005).
Outras substâncias além do linalol apresentaram-se comuns entre as amostras,
conforme relacionado na tabela 33 e encontram-se descritos na literatura com a obtenção
xvi
destas através de diferentes microrganismos e plantas como pode ser observado nas
descrições abaixo.
Tabela 33 – Compostos em comum entre as amostras
Ítem Composto Amostras Fragmentação Estrutura química 1 n-docosano PRI – FoMF 12;
PRI – Fo 8; PRIII – FoMF 156; PRIII – CaMF 183; PRIV – 198
41; 43; 55; 57; 70; 71; 84; 85
2 Feniletil álcool PRI – Fo 6; PRIII – Ca 180; PRI – Fo 8
50; 63; 65; 91; 92; 122
3 Acenafteno PRI – Fo 8; PRII – Fo 58
41; 69; 70; 86; 125; 153; 154
4 Ácido 9-metilester octadecenóico
PRI – Fo 8; PRIII – Fo 136; PRII – Fo 58; PRII – Fo 56; PRIII - Ca 168; PRII – Ca 258
40; 41; 44; 55; 70; 71; 79; 96; 97; 112; 135; 165; 193; 207; 222; 245; 265; 266
5 (Cis/Trans)-
Farnesol PRIII – FoMF 156; PRI – Fo 8; PRIII – Fl 189; PRIII - Fo 140
41; 43; 67; 68; 69; 81; 95; 97; 121; 149; 177; 207; 281
Tabela 33 – Compostos em comum entre as amostras (continuação)
6 Di-(2-etilhexil)-adipato
PRIII – Fo 136; PRII – Fo 58; PRII – Fo 56; PRII – Ca 159; PRIII – Fo 140
43; 55; 69; 71; 101; 129; 147; 207
7 Diidrocitronelol PRIII – FoMF 156;
PRIV – Fo 198 43; 45; 56; 57; 69; 97
O
8 n-undecano PRIII – FoMF 156; PRIV – Fo 198
41; 42; 43; 45; 55; 57; 67; 70; 71; 84; 85; 108
xvii
9 Cis - Retinal PRIII – FoMF 156; PRIII – Fl 189
51; 57; 85; 128; 185; 212; 227; 255; 256; 284; 285
10 Perileno PRIII – Ca 159; PRIII – Fo 140
42; 43; 55; 69; 70; 93; 96; 97; 123; 151; 179; 221; 263; 264; 283
11 2,3-diidro-2,2-dimetilbenzofuran-7-ilmetilcarbamato
PRIII – Fo 148; PRIII – Fl 188
55; 81; 109; 137; 138; 165; 166
12 3,5-tris(aziridin-1-il)benzo-1,4-quinona
PRIII – Fo 148; PRIII – Fl 188
43; 79; 119; 147; 175; 199; 200; 217; 232
13 6-terc-butil-2,4-dimetilfenol
PRIII – Fo 148; PRIII – Fl 188
41; 69; 69; 91; 122; 123; 135; 147; 163; 164; 233
14 2,6-bis(1,1dimetiletil)-2,5-ciclohexadieno-1,4-diona
PRIII – Fo 148; PRIII – Fl 188
42; 55; 65; 67; 78; 91; 93; 107; 110; 125; 133; 149; 150; 175; 178; 191; 207; 219; 234; 235
15 Citrinina PRIII – Fo 148; PRIII – Fl 188
41; 43; 67; 69; 77; 95; 96; 97; 121; 123; 147; 161; 171; 189; 192; 215; 217; 232; 233; 234; 250; 251; 252
O item 1 da tabela 33 sugere um composto com fragmentação semelhante a n-
docosano, presente nos sobrenadantes dos fungos com os códigos PRI – FoMF 12; PRI – Fo
8; PRIII – FoMF 156; PRIII – CaMF 183, PRIV – 198. É um hidrocarboneto derivado do
petróleo que contém vinte e dois carbonos na sua estrutura e é encontrado em pequenas
concentrações em óleos essenciais de algumas plantas, como por exemplo, erva-santa-maria
(Chenopodium ambrosioides) e café (Coffea arabica). É industrialmente utilizado como parte
da composição de óleos lubrificantes automotivos (SANTOS, 2005; FERNANDES et al.,
2009).
O Feniletil álcool, composto relacionado no item 2 da tabela 33, que apresenta peso
molecular 122,07 é uma substância utilizada como componente ativo em alguns meios de
xviii
cultura seletivo para bactérias gram-positivas. Exerce ação bacteriostática inibitória sobre
bactérias gram-negativas por inibir a síntese de DNA. Sendo um derivado terpênico, está
presente na composição de óleos essenciais de várias plantas e em compostos voláteis de
fungos endofíticos Gliocladium roseum e Muscodor albu (STROBEL et al., 2008; STROBEL
et al., 2001).
A substância identificada como acenafteno (item 3 da tabela 33), é hidrocarboneto
policíclico aromático (HPA). Faz parte de um grupo de substâncias encontradas em material
particulado atmosférico de grande interesse ambiental devido suas propriedades tóxicas,
carcinogênicas e mutagênicas. São introduzidos no ambiente por fontes naturais e
antrotrópicas. Entre as fontes naturais, incluem queima natural de florestas, emissões
vulcânicas e processos petrogênico. Existe relato na literatura que confirmam a produção
destes compostos por bactérias, algas e fungos; porém em quantidades reduzidas frente a
outras fontes (CAVALCANTE et al., 2007). Por ser um dos HPAs mais leve, é facilmente
formado na atmosfera, podendo ser absorvidos pelas plantas. Dessa maneira, pode-se sugerir
que a partir do acúmulo desta substância no vegetal, o fungo endofítico associado a mesma
pode adquirir a capacidade para produzi-la (CAMINITTI, 2008).
O composto identificado como Ácido 9-metilester octadecenóico (item 4 da tabela
33), também conhecido como ácido oléico, é um ácido graxo que está presente em várias
sementes oleaginosas, como por exemplo, a semente de Copaifera officinalis, constituinte de
óleos fixos e já foi descrito como produto de origem fúngica, identificado no extrato
metanólico do fungo do gênero Xylaria por Liu e colaboradores (LIU et al., 2005; VEIGA
JUNIOR et al., 2007). Presente na maior parte dos óleos de origem vegetal é um composto de
amplo interesse por possuir uma estrutura de cadeia carbônica insaturada, revelando-se
favorável para prevenção de doenças cardiovasculares (FERNANDEZ E ROSOLEM, 1998).
O sesquiterpeno (cis/trans) farnesol (item 5 da tabela 33), está presente em inúmeros
extratos vegetais e tem sido testado como indutor de apoptose. É um inseticida natural e
também age como feromônio para outros insetos (JOO, 2009). Encontra-se associado ao
linalol como constituinte de óleos essenciais e também já foi identificado como metabólito
secundário de algumas leveduras do gênero Saccharomyces (CARRAU et al., 2005).
Estudos toxicológicos com composto identificado como Di-(2-etilhexil)-adipato
(item 6 da tabela 33) demonstrou que em ratos e camundongos pode causar embriotoxicidade,
atrofia testicular e anomalias no sistema nervoso central. Em humanos pode causar problemas
hepáticos e renais (SOUZA et al., 2009). É um plastificante petroquímico e devido seu efeito
xix
tóxico, pesquisas visam a substituição deste composto por outros polímeros menos tóxicos.
Até o momento, não existe relato na literatura da produção deste composto a partir de
metabolismos microbiológico.
O composto n-undecano (item 8 da tabela 33), é um hidrocarboneto derivado do
petróleo que também se encontra presente na composição de feromônios para formigas. Foi
identificado na composição de voláteis do fungo endofítico Gliocladium roseum, no estudo
desenvolvido por Strobel e colaboradores em 2008. Também já foi identificado na
composição química de óleos essências de algumas plantas como, por exemplo, Salvia
stenophylla (Limiaceae) (KAMATOU et al., 2005; STROBEL et al., 2008).
O composto identificado como Cis-retinal (item 9 da tabela 33), é um derivado
carotenóide também conhecido como vitamina A. Em animais é sintetizado através da reação
de clivagem de β-caroteno mediada pela enzima β-caroteno oxigenase I. Estudos com fungo
Fusarium fugikuroi identificou o gene que codifica a expressão da enzima que cataliza as
reações com carotenóides resultando na produção do composto acima citado pelo fungo
(PRADO-CRABRERO et al., 2007).
Perileno (item 10 da tabela 33), assim como o composto acenafteno, também é
classificado como um hidrocarboneto policíclico aromático (HPA). Além das fontes naturais
já citadas, também foi identificado na composição de extratos de fungo endofítico Alternaria
alternata (GAO et al., 2009).
O composto do item 11 da tabela 33, 2,3-diidro-2,2-dimetilbenzofuran-7-
ilmetilcarbamato, também conhecido como carbofurano, é um inseticida e nematicida do
grupo dos carbamatos, que é parcialmente solúvel em água e facilmente degradado no meio
ambiente devido a hidroxilação do anel benzofuranil. Seus principais metabólitos, o 3-
hidroxicarbofurano e 3-cetocarbofurano, tem curta permanência no solo, são formados
lentamente e apresentam baixa toxicidade aguda para insetos. Aplicações repetidas de
carbofurano aumentam sua atividade degradativa devido ao maior crescimento de
microrganismos capazes de utilizá-lo como fonte de carbono e nitrogênio (PEIXOTO, 2007).
O composto 3,5-tris(aziridin-1-il)benzo-1,4-quinona, também conhecido como
Traziquone (item 12 da tabela 33), é um agente alquilante citotóxico que realiza ligações
cruzadas no DNA resultando em morte celular por apoptose ou necrose. Agente
antineoplásico utilizado principalmente no tratamento de tumores ovarianos. Foi
primeiramente sintetizada por Gauss em 1958, nos laboratórios Bayer, Alemanha (SILVA et
al, 1992; HUANG et al., 2009).
xx
Citrinina (item 15 da tabela 33) é uma toxina, que pode causar hepato e
nefrotoxicidade e já foi identificado em extratos dos fungos dos gêneros Penicillium,
Aspergilus e Monascus. Descrito principalmente como contaminante de alimentos, sua análise
é incluída no controle de qualidade de alimentos, no intuito de prevenir intoxicações através
da ingestão do composto (BLANC et al., 1995; YU et al., 2006; PATTANAGGU et al.,
2008)
Os compostos dos itens 13 e 14 da tabela 33 são pouco descritos na literatura e não
apresentam fonte natural para produção.
4.4 DETECÇÃO DE ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
A atividade antimicrobiana foi testada com sobrenadante e com os extratos
etanólicos dos micélios de vinte e sete fungos escolhidos aleatoriamente.
Dentre as amostras que foram testadas para detecção de atividade antibacteriana, os
sobrenadantes dos fungos com os códigos PRII-Fo 68 e PRII-Ca 256 apresentaram atividade
inibitória para o crescimento de P. aeruginosa, demonstrando uma média dos halos de
inibição de 26 mm e 10 mm de diâmetro, respectivamente, conforme figura 37.
P. aeruginosa é um bacilo gram-negativo que apresenta alta taxa de mutação que
resulta em resistência progressiva aos antibióticos o que dificulta a terapia antinfecciosa. No
Brasil, está frequentemente relacionada a infecções hospitalares e, devido sua capacidade de
adquirir resistência, torna-se cada vez mais importante a pesquisa por novos produtos que
possam ter atividade inibitória do seu crescimento (MATA E ABEGG, 2007).
Figura 37 – a) Halo de inibição do sobrenadante de PRII-Fo 68; b) Halo de inibição do sobrenadante de PRII-Ca
256
a b
a b
xxi
Dentre as amostras que foram testadas para detecção de atividade antifúngica, os
extratos dos micélios dos fungos com os códigos PRIII-Fo 134 e PRIII-Fo 136 apresentaram
atividade inibitória para o crescimento de P. avelani, demonstrando uma média dos halos de
inibição de 23 mm e 28 mm de diâmetro, respectivamente, conforme figura 38.
Figura 38 – a) Halo de inibição do sobrenadante de PRIII-Fo 134; b) Halo de inibição do sobrenadante de PRIII-
Ca 136
4.5 CULTIVO EM LARGA ESCALA
O fungo com o código PRII-Fo 68, cujo sobrenadante apresentou melhor atividade
de inibição do crescimento bacteriano, foi submetido a fermentação em larga escala.
Após 25 dias de crescimento micelial, a cultura foi submetida a filtração a vácuo e o
sobrenante foi extraído por partição com acetato de etila e em seguida com acetato de
etila/isopropanol 7:3. A massa micelial remanescente foi triturada e mantida em maceração
em etanol por 24 horas (Figura 41).
O fungo apresentou bom crescimento (figura 39), porém, dos 18 L de meio de
cultura apenas 14,4 L foram utilizados. Os 3,6 L restantes estavam contaminados.
a b
xxii
Figura 39 – Micélio do fungo PRII-Fo 68 em 300 mL de meio de cultura líquido
Após a filtração a vácuo, o sobrenadante estava com coloração diferente ao meio de
cultura sem inoculo, conforme a figura 40, o que demonstra visualmente que houve utilização
pelo fungo dos nutrientes do meio de cultura para a produção de metabólitos.
Figura 40 – Erlenmeyer do lado esquerdo: meio de cultura sem inoculo; erlenmeyer do lado direito sobrenadante.
xxiii
Figura 41- Micélio triturado em extração com etanol
Desta cultura em larga escala, foram obtidos três extratos. O primeiro foi resultado
do processo de extração por partição do sobrenadante com o solvente acetato de etila. O
rendimento foi de 2,46 g. O segundo extrato foi resultado da segunda etapa do processo
extração do sobrenadante com acetato de etila/isopropanol na proporção 7:3. O rendimento foi
de 1,87g. O terceiro extrato é resultado da maceração do micélio em etanol. O rendimento foi
de 1,0g.
Durante o processo de concentração dos extratos no evaporador rotatório, o extrato
etanólico do micélio apresentou partículas impregnadas no balão volumétrico que foram
solubilizadas em hexano/diclorometano 1:1. Desta solução foi feito cromatografia em camada
delgada e reveladas em luz ultravioleta no comprimento de onda de 365 nm e iodo, conforme
figura 42.
Figura 42 – Cromatografia em camada delgada do extrato etanólico do micélio de PRII – Fo 68
xxiv
Conforme a figura acima, a placa do lado direito revelada em iodo, apresentou
presença de mais outras três substâncias além da que apresentou fluorescência na revelação
em ultra-violeta. Para separação dessa fração, foi feita uma coluna cromatográfica, com
sistema de eluição crescente de hexano e diclorometano.
Os compostos isolados na fração hexano/diclorometano (5:5) e na fração
diclorometano, foram conduzidos para análise em Ressonância magnética nuclear de próton
(RMN-H1) e CG/EM, porém as análises não ficaram prontas em tempo hábil para discussão
neste trabalho.
Hexano Diclorometano
7:3
Hexano
Hexano Diclorometano
5:5 Hexano
Diclorometano 3:7
Diclorometano
xxv
____________________________________________________________Conclusões
Conclusões
________________________________
xxvi
5 CONCLUSÕES
Dos quatro espécimes coletados, foi possível isolar 262 fungos endofíticos, os quais
foram classificados em 22 grupos diferentes, de acordo com suas características
macro-morfológicas.
Entre os tecidos coletados para isolamento, o galho apresentou maior quantidade de
fungos isolados, com uma média de 33,5 fungos por espécime.
As condições para fermentação dos fungos isolados não permitiram o crescimento
adequado de todos os isolados.
Os 86 fungos que obtiveram crescimento micelial nas condições de fermentação
estabelecidas foram analisados por CLAE e apenas 10 deles apresentaram
cromatogramas diferentes entre si.
Para análise da presença do linalol via CLAE, 17 sobrenadantes apresentaram aumento
no pico com mesmo tempo de retenção da amostra padrão e sete dessas amostras
apresentaram fragmentação característica de linalol após análise em CG/EM.
A literatura sugere que o fungo utiliza a via do metil-eritritol-fosfato para formação
dos monoterpenos, e que com a relação de proto-cooperação com a planta hospedeira,
a enzima que regula a via pode ser transferida possibilitando assim a produção do
linalol pelos fungos.
Mais de uma das amostras selecionadas apresentaram espectro com o perfil de
fragmentação semelhante às seguintes substâncias: n-docosano; Fenil etil álcool;
Acenafteno; Ácido-9-metilester octadecenóico; (Cis/Trans)-Farnesol; Di-(2-etilhexil)-
adipato; Diidrocitronelol n-undecano; Cis- Retinal; Perileno; 2,3-diidro-2,2-
dimetilbenzofuran-7-metilcarbamato; 2,3,5-tris(aziridin-1-il)benzo-1,4-quinona; 6-
terc-butil-2,4-dimetilfenol; 2,6-bis(1,1dimetiletil)-2,5-ciclohexadieno-1,4-diona;
Citrinina.
xxvii
O sobrenadante dos fungos PRII-Fo 68 e PRII-Ca 256 apresentaram atividade
inibitória para o crescimento de Pseudomonas aeruginosa, sendo PRII-Fo 68 o que
apresentou maior média do halo de inibição.
Os extratos dos micélios dos fungos PRIII-Fo 134 e PRIII-Fo 136 apresentaram
atividade inibitória para o crescimento de Penicillium avelani, provavelmente pode ser
o mesmo fungo, uma vez que foi isolado do mesmo tecido vegetal e espécime.
O Cultivo em larga escala do fungo que apresentou maior halo de inibição contra P.
aeruginosa, resultou na extração de um composto que, a partir de técnicas
cromatográficas de análise foi isolado.
O isolamento dos microrganismos, as extrações e as análises químicas foram
realizados de acordo com a disponibilidade de equipamentos e reagentes, não sendo
possível realizar a triagem com todos os isolados fúngicos até a presente data.
xxix
6 PERSPECTIVAS
Fazer novo isolamento dos fungos endofíticos de Aniba rosaeodora em diferentes
estações para comparação da influência do clima na produção dos metabólitos.
Triagem seletiva de fungos com meios de culturas diferenciados que favoreçam
produção de substratos de interesse biotecnológico, incluindo o linalol e os outros
compostos identificados.
Estudo da fisiologia fúngica para determinação das condições adequadas de
crescimentos para aperfeiçoar produção de metabolitos.
Utilização de marcadores moleculares para seleção de fungos com genes que
codificam enzimas que regulam a via metil eritritol fosfato.
Estudo químico dos metabolitos produzidos pelo fungo PRII – FO 68, para possível
identificação do composto ativo contra Pseudomonas aeruginosa.
Estudo químico dos metabolitos produzidos pelos fungos PRIII-Fo 134 e PRIII-Fo
136, para possível identificação do composto ativo contra Penicillium avelani.
Identificação dos seguintes fungos selecionados: PRII-Fo 68; PRIII-Fo 134; PRIII-Fo
136; PRIII – Ca 159 e PRII – Ca 258. Sendo os dois primeiro selecionados devido a
atividade antimicrobiana e os dois últimos devido a produção do linalol.
xxxi
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