capitulo ii antecedentes
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Antecedentes
Capítulo II
Antecedentes
El ácido cítrico (2-hidroxi, ácido-1,2,3-tricarboxilico) deriva de la palabra latina
citrus: “árbol del cítrico”, una fruta parecida al limón. Fue primeramente aislado
del jugo de limón en 1784 por Carl Scheele, tiene un peso molecular es de 210.14
Da, contiene tres grupos carboxilos, por lo tanto tiene tres pKa´s con valores de
pH de 3.1, 4.7 y 6.4, respectivamente. Este ácido es un intermediario universal
del metabolismo en eucariotes y se encuentran trazas en prácticamente todos los
animales y plantas (Papagianni, 2007).
El ácido cítrico fue producido comercialmente en Inglaterra en 1826 a partir de
limones importados de Italia. El jugo de limón fue la base de su producción hasta
que en 1919 se desarrollo un proceso industrial en Bélgica con Aspergillus niger
y se sintetizó a partir de glicerol por Grimoux y Adams en 1880. Se han reportado
diferentes métodos para su síntesis química, utilizando diferentes métodos, pero
están muy lejos de ser competitivas con los métodos de fermentación
(Papagianni, 2007). Actualmente solo el 1 % de la producción total mundial es
extraído del jugo del limón en países como México y Sudamérica donde aún es
viable económicamente (Yigitoglu, 1992).
Microorganismos productores de ácido cítrico
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Para la producción por fermentación además de los hongos, se han empleado
levaduras y bacterias que han alcanzado producciones en cantidades
importantes, como sustrato se ha usado a hidrocarburos (alcanos) y
carbohidratos (Mattey, 1999). Se conocen varias levaduras que producen ácido
cítrico a partir de diversas fuentes de carbono, tales como: Candida tropicalis, C.
catenula, C. guilliermondii, C. intermedia, Hansenula, Pichia, Debaromyces,
Torula, Torulopsis, Kloekera, Saccharomyces, Zygosaccharomyces y Yarrowia
lipolytica Candida sp, Hansenula sp, Debaromyces sp, Torula sp, Turolopis sp,
Kloekera sp, Saccharomyces sp, Zygosaccharomyces sp y Yarrowia sp. De
todas ellas, las especies de Candida son las que se han usado industrialmente
para su producción, estas son: C. catenula, C. guilliermondii y C. intermedia. Las
levaduras son capaces de producir ácido cítrico a partir de varias fuentes de
carbono. Por ejemplo, Yarrowia lipolytica se ha estudiado ampliamente, pero
produce una gran cantidad de ácido isocitrico, lo cual es indeseable. Este
problema ha motivado a usar cepas mutantes de Y. lipolytica, estas son capaces
de tener baja actividad de la enzima acotinasa la cual es responsable de la
síntesis de ácido isocitrico. Las mutaciones genéticas no han sido bien
exploradas, pero ofrecen posibles usos para mejorar los rendimientos y altas
velocidades de fermentación (Rymowicz et al, 2010).
En tanto entre las bacterias que se han empleado tenemos a Arthrobacter
paraffinens, Bacillus licheniformis, Corynebacterium sp y hongos como:
Aspergillus niger, A. awamori, A. clavatus, A. nidulans, A. fonsecaeus, A.
luchensis, A. phoenicus, A. wentii, A. saitoi, A. flavus, Absidia sp., Acremonium
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sp., Botrytis sp., Eupenicillium sp., Mucor piriformis, Penicillium citrinum, P.
janthinellu, P. luteum, P. restrictum Talaromyces sp, Trichoderma viride y Ustulina
vulgaris (Crolla y Kennedy, 2001; Kuforiji et al, 2011).
Aunque muchos microorganismos pueden ser usados para producir ácido cítrico,
el hongo Aspergillus niger sigue siendo el principal microorganismo productor a
nivel industrial. Cepas específicas de A. niger lo sobreproducen y se han
desarrollado a partir de diversos procesos de fermentación. Su rendimiento a
veces excede el 70 % de la fuente de carbono. Currie (1917) descubrió que
algunas cepas de A. niger crecen de forma exitosa en medios con altas
concentraciones de azucares y minerales a un pH inicial entre 2.5 y 3.5, los cuales
producían altas concentraciones de ácido cítrico. Este descubrimiento sentó las
bases para la producción industrial por medio de estas cepas. La principal ventaja
de Aspergillus niger es su fácil manejo y cultivo, crece en una gran variedad de
sustratos, tiene altos rendimientos. Con el desarrollo de la Biotecnología se han
generado varias cepas modificadas genéticamente de Aspergillus niger, donde se
han reportado mejores rendimientos. Sin embargo, su uso industrial y estabilidad
no ha sido del todo aceptado, ya que la industria se ha basado principalmente en
el uso de varios sustratos para incrementar los rendimientos de ácido cítrico
(Singh et al, 2011).
La producción industrial de ácido cítrico involucra de manera general una etapa de
filtración de medio de cultivo que contiene el producto, micelio y otras impurezas.
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Primero se precipita como citrato de calcio, posteriormente este es filtrado y
lavado con agua. Después es tratado con ácido sulfúrico y por último se remueve
el CaSO4 formado por filtración. Este es el único proceso viable de separación y
purificación en la industria, el problema es que cada tonelada de ácido cítrico
producido genera 2.5 toneladas de desecho (Bauer et al, 1988).
La extracción por solventes es otra alternativa al método clásico (Wenneresten,
1983). Sin embargo, la extracción por este método contiene impurezas que
provienen de la melaza o licores de azucares. La ventaja del método de
extracción por solventes es que evita el uso de calcio y H2SO4 y el problema de
contaminación.
El ciclo del ácido cítrico
La síntesis del ácido cítrico comienza con la glucolisis (Martin y Wilson, 1951;
Cleland y Johnson, 1954). Pero también una pequeña fracción se sintetiza por la
vía de las pentosas fosfato, la cual va decreciendo conforme avanza la
fermentación (Legisa y Mattey, 1988); pero no existe evidencia de un bloqueo total
de esta vía (Roehr et al, 1987).
Aspergillus niger tiene una vía adicional para el catabolismo de la glucosa y es
llevado a cabo por la glucosa oxidasa (Hayashi y Nakamura, 1981). Esta enzima
se activa por las altas concentraciones de glucosa y oxígeno en la presencia de
bajas concentraciones de otros nutrientes (Mischak et al, 1985; Rogalski et al,
1988; Dronawat et al, 1985). Desafortunadamente la glucosa oxidasa, en la fase
lag de crecimiento, transforma una cantidad importante de glucosa en ácido
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glucónico. Pero debido a la localización extracelular de la enzima, esta puede ser
influenciada por el pH y se inactiva a pH´s menores de 3.5 (Mischak et al, 1985;
Roukas y Harvey, 1988). La acumulación de ácido cítrico hace disminuir el pH del
cultivo inactivando a la glucosa oxidasa (Mischak et al, 1985).
En la glucolisis, una molécula de glucosa produce 2 moléculas de piruvato, este
último se convierte en Acetil CoA y oxalacetato, precursores del citrato. Clealand y
Johnson (1954) fueron los primeros en demostrar que Aspergillus niger libera una
molécula de CO2 durante la conversión de piruvato a Acetil CoA y que se utiliza
una molécula de piruvato más una de bióxido de carbono para formar una
molécula de oxalacetato. Esta última reacción incrementa el rendimiento del ácido,
debido a que el oxalacetato se forma en cada vuelta del ciclo de Krebs. Lo anterior
provoca la pérdida de 2 moles de CO2 y solamente dos terceras partes del
carbono proveniente de la glucosa se convierte en ácido cítrico. El piruvato se
convierte en oxalacetato y posteriormente en malato en el citoplasma. Se ha
postulado que la concentración de malato estimula el transporte del ácido cítrico
fuera de la mitocondria. Pero este fenómeno no parece ocurrir durante las fases
tempranas de la fermentación (Kubicek et al 1979b), esto se correlaciona con el
coeficiente respiratorio (CO2/O2) durante las primeras 70 horas de cultivo, este es
cercano a uno, pero comienza a decrecer cuando se inicia la acumulación del
ácido cítrico (Kristiansen et al, 2002).
Aspergillus niger también puede acumular otros ácidos orgánicos, tal como el
ácido oxálico, un coproducto tóxico de la fermentación. La síntesis de este
compuesto parece depender de la fuente de carbono (Kubicek et al, 1988), de
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acuerdo a Muller (1975) el ciclo del glioxilato ha estado implicado en biosíntesis.
Cuando se usa glucosa como fuente de carbono por la vía del glioxilato, se pierde
fuente de carbono en esta vía neutral, compitiendo con la sobreproducción de
citrato (Kubicek, 1988). Debido a la toxicidad del oxalato, este fenómeno es de
interés para la producción de ácido cítrico y su regulación biosintetica aún está en
debate (Strasser et al, 1994).
Kubicek-Pranz et al (1990) encontraron que la acumulación de ácido cítrico
sucede cuando la concentración de glucosa-fructosa es de 14 % (p/v), pero
cuando eso sucede, Xu et al (1989a) encontraron un incremento en la
concentración intracelular de fructosa 2-6 bifosfato. La concentración de este
intermediario de la glucolisis correlaciona con la alta producción de citrato. La
bioquímica de los primeros pasos de la glucolisis aún no es completamente
entendida, sin embargo, Steinbock et al (1994) encontró que la enzima hexocinasa
en la cepa ATCC 11414 fue inhibida por citrato. La inhibición de la síntesis de
ácido cítrico se debió a la quelación del magnesio.
Las trazas de iones metálicos, particularmente los iones de manganeso, estimulan
la acumulación de ácido cítrico (Trumpy y Millis, 1963), pero uno de los defectos
causados por la deficiencia de manganeso es la síntesis de macromoléculas y
provoca un incremento en la degradación de proteínas (Ma et al, 1985). Como
consecuencia, el micelio acumula grandes concentraciones de NH4 (Kubicek et al,
1979a). Pero varios autores han reportado que la adición extra de amonio (NH4)
durante la fermentación de ácido cítrico estimula la velocidad de su producción
(Choe y Yoo, 1991; Yigitoglu y McNeil, 1992). Estos autores también reportan que
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la cantidad de amonio y tiempo son importantes, pero cuando se agrega en
tiempos inapropiados disminuye la acumulación de ácido cítrico.
Bioquímica de la producción y acumulación de ácido cítrico por Aspergillus
niger
Se han propuesto varias teorías para explicar la acumulación de ácido cítrico por
A. niger, ya que los altos rendimientos de este metabolito, en procesos de
fermentación, siempre han dependido del conocimiento de su bioquímica.
Después de 50 años de optimización del proceso de su producción, todavía no
existe una explicación coherente de la síntesis bioquímica con los factores
observados que influencian su rendimiento en biorreactores (Kristiansen et al,
2002). En un proceso de fermentación, la acumulación de ácido cítrico se lleva a
cabo cuando varios nutrientes se encuentran en exceso: fuente de carbono, iones
hidrógeno y oxígeno. Pero también se ha demostrado que la limitación de iones
metálicos (Fe, Mn, Mg), nitrógeno y fosfatos estimulan su producción y
acumulación. En resumen, no existe un evento bioquímico simple responsable de
la sobreproducción ya que se trata de un evento multifactorial. A pesar de que se
han llevado a cabo numerosos estudios sobre la síntesis bioquímica de ácido
cítrico en A. niger, aún no se conocen los eventos que estimulan su acumulación.
La comprensión de los eventos anteriores es incompleta y las industrias dedicadas
a su producción y comercialización mantienen en secreto sus logros alcanzados.
Etapas y tipos de producción de ácido cítrico por fermentación con
Aspergillus niger
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Hoy en día, el 99 % de la producción total mundial de ácido cítrico se obtiene por
fermentación (Kuforiji et al, 2010). A. niger es el microorganismo preferido por sus
altos rendimientos. La producción se puede dividir en tres etapas, las cuales son:
preparación e inoculación de medio de cultivo, fermentación y recuperación o
purificación del producto. Además existen tres posibles métodos para producir
ácido cítrico por A. niger: fermentación sumergida, fermentación de superficie y
fermentación en medio sólido. Se pueden usar varios tipos de sustrato de acuerdo
al tipo de fermentación (Singh et al, 2011).
a) Fermentación de superficie
El micelio de A. niger crece y flota en la parte alta del medio de cultivo. Se usa a
pequeña y mediana escala, se requieren pocos esfuerzos de operación, poco
equipo y bajo costo de energía. El proceso se lleva a cabo en cámaras de
fermentación donde existe un gran número de charolas o tinas. Las charolas
deben ser de aluminio puro, tipo acero o polietileno. Pero en las charolas de acero
se obtienen mejores rendimientos (Soccol y Vandenberghe, 2003). Las cámaras
de fermentación cuentan con circulación de aire y al pasar por la superficie del
cultivo controlan la humedad y temperatura. El aire se filtra por medio de filtros ya
que las cámaras se deben de mantener bajo condiciones asépticas y así deben
permanecer al menos durante los primeros dos días, período durante el cual las
esporas germinan. La fermentación termina entre 8 y 12 días (Yokoya, 1992), para
extraer el ácido cítrico, se separa el caldo y el micelio, este es lavado para separar
el ácido cítrico.
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Desventajas: A pesar de obtener altos rendimientos en la fermentación por
superficie, este proceso no se utiliza mucho en la industria debido a que se
requiere mucho espacio, se requiere de mucho tiempo, existe riesgo de
contaminación, generación de altas cantidades de calor y altos costos de
producción.
b) Fermentación en estado sólido
Éste proceso requiere poca energía y genera pocos desechos. El agua necesaria
para el crecimiento de A. niger se encuentra dentro de la matriz sólida. El sólido de
soporte puede ser de material sintético, residuos agrícolas, entre otros (Pandey,
2003). Este proceso requiere de tecnología simple, tiene altos rendimientos,
medio de cultivo a bajo costo, mejor circulación de oxígeno, menos susceptible a
la inhibición por elementos traza, requiere poca energía y bajo costo de
mantenimiento, menor riesgo de contaminación y genera menor cantidad de
desechos en su recuperación.
Desventajas: Dificultades al escalar el proceso, difícil controlar a los parámetros
de cultivo (pH, humedad, temperatura, nutrientes, etc.) alto contenido de
impurezas, así como altos costos en la purificación (Susana y Sanroman, 2006;
Holker et al, 2004).
c) Fermentación sumergida
Se estima que alrededor del 80 % de la producción mundial de ácido cítrico se
obtiene por fermentación sumergida, se hace en medios de cultivo que usan como
base a la sacarosa y glucosa con A. niger (Vanderberghe et al, 1999), utilizando
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principalmente productos que utiliza la industria del azúcar, así como desechos
agroindustriales (Rivas et al, 2008). Los procesos de fermentación sumergida usan
fermentaciones en lote y lote alimentado, Dependiendo de las condiciones de
fermentación, estas concluyen entre 5 a 12 días. Este tipo de procesos tienen
mecanismos sofisticados de control, menor riesgo de contaminación, bajo costo en
mano de obra, alta productividad y rendimientos.
Desventajas: Medio de cultivo caro, sensible a la inhibición por trazas de metales
(Fe, Mn, Mg), riesgo de contaminarse y grandes cantidades de desecho
(Vanderberghe et al, 1999).
Morfología de A. niger durante la fermentación
La morfología del micelio es crucial durante el proceso de la fermentación, no
solamente en relación a la forma de la hifa si no también a la agregación o unión
de micelio en forma de pellets. En todos los casos, el micelio de Aspergillus niger
es corto, con ramificaciones hinchadas, las cuales tienen puntas apicales. Los
pellets son pequeños con una superficie dura y lisa (Clark, 1962). Este fenómeno
está relacionado con la aireación y agitación (Svenska-Sockerfabrik, 1964), pH
(Fried y Sandza, 1959), concentración de manganeso y otros metales (Kisser et al,
1980) y cantidad de inóculo (Berry et al, 1977). Para la producción de ácido cítrico
en cultivo sumergido, el crecimiento en pellets de Aspergillus niger es altamente
recomendable (Berovic et al, 1993).
La agitación es importante para un adecuado mezclado, transferencia de masa y
calor. El mezclado determina la aireación y transferencia de masa a través del
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reactor y este es crítico para la fermentación de ácido cítrico. Pero el exceso de
agitación provoca esfuerzos de corte que afectan la morfología del
microorganismo, cambiando su crecimiento y dañando a la estructura de las
células (Papagianni et al, 1994). Aunque A. niger es resistente a los esfuerzos de
corte, se ha reportado que el incremento de la agitación daña a las hifas, liberando
el material intracelular, explicando las bajas productividades bajo condiciones de
alta agitación. Por ejemplo, Smith et al (1990) y Makagiansar et al (1993)
reportaron bajas velocidades de síntesis de penicilina a altas agitaciones con
Penicillium chrysogenum.
Papagianni, 1995 reporto cultivos con Aspergillus niger en biorreactores agitados
mecánicamente de 100 a 600 rpm, los micelios se comenzaron a agregar a las 24
horas de cultivo en todos los experimentos. Por medio de análisis de imágenes se
demostró que al incrementar la agitación, se disminuía la longitud de los
filamentos. La velocidad específica de la formación de ácido cítrico se incremento
con la agitación, pero la cantidad de producto se mantuvo constante después de
300 rpm. Asimismo la longitud del micelio se redujo por un factor de tres al
incrementar la agitación. Se ha reportado que cultivos de A. niger deficientes en
manganeso (Mn2), se forman pellets (Levente y Christian, 2003). Sin embargo, el
manganeso es esencial para el crecimiento del micelio. Un prerrequisito esencial
para tener la morfología deseada y obtener altos rendimientos es optimizar la
concentración inicial de manganeso en el medio de cultivo.
Se ha observado que los medios ricos en nutrientes incrementan la velocidad
específica de crecimiento y la morfología del hongo, reduciendo la formación de
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pellets (Hemmersdorfer et al, 1987). No solo el tipo de fuente de carbono, sino
también la concentración es crítico para la fermentación, influenciando la velocidad
de producción, rendimiento y crecimiento del hongo. Por ejemplo, Papagianni
(1995) reportaron cultivos con concentración inicial de glucosa de 60, 100 y 150
g/L en un reactor agitado mecánicamente, se encontró que la velocidad de
crecimiento se incrementa (a las 48 hrs de cultivo) conforme la concentración de
glucosa disminuye.
Factores que afectan la producción de ácido cítrico por Aspergillus niger en
cultivo sumergido
a) Condiciones del cultivo
Afectan el crecimiento de A. niger y la producción de ácido cítrico de forma
diferente. Por ejemplo, Grewal y Kalra (1995), Couto y Sanroman (2006)
reportaron que se produce alta concentración de ácido cítrico en condiciones
donde se genera poca biomasa. Vanderberghe et al (2000) obtuvieron un buen
crecimiento de micelio junto a altas productividades de acido cítrico. Sin embargo,
Elzbieta (2008) obtuvo altos rendimientos con 150 g/L de azucares en el medio de
cultivo. Las trazas de metales influencian notablemente la síntesis de ácido cítrico,
porque requiere de ciertas trazas para su crecimiento (Mattey, 1999). Los iones
metálicos que deben limitarse son el Zinc, Manganeso, Hierro, Cobre, metales
pesados y metales alcalinos. Algunos metales iónicos (Fe2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+ y
otros) inhiben la producción de ácido cítrico aún a muy bajas concentraciones
(Kapoor et al, 1987). Pero también es sensible a las trazas de metales que vienen
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en las melazas (Majolli y Aguirre, 1999). Por lo tanto, la concentración de esos
metales debe disminuirse para tener un óptimo crecimiento y síntesis del ácido
cítrico (María y Wladyslaw, 1989). La concentración óptima de Fe2+ requerida para
su producción varía entre diferentes especies de hongos, pero para A. niger en
cultivo sumergido y usando melazas como sustrato, la síntesis de ácido cítrico es
severamente afectado por la presencia de hierro a concentraciones de 0.2 ppm.
Sin embargo, la adición de cobre entre 0.1 a 500 ppm durante la inoculación o
durante las primeras 50 horas de cultivo contrarresta el efecto nocivo del hierro.
Otros autores también han reportado el efecto benéfico del cobre sobre el hierro
(Haq et al, 2002).
Suministros de Mn2+ a concentraciones de 3 g/L reducen drásticamente el
rendimiento de ácido cítrico (Rohr et al, 1996). Estos autores también confirmaron
el papel del manganeso en la regulación de las enzimas del ácido cítrico, pero
también es importante en otras funciones celulares, por ejemplo en la síntesis de
la pared celular, formación de esporas y producción de metabolitos secundarios.
La concentración de las trazas de metales en el medio de cultivo se puede
controlar por dos formas:
1) Purificar el medio de cultivo para remover ciertos iones metálicos y después
adicionar la cantidad requerida.
2) Agregar agentes quelantes al medio para disminuir la concentración de los
iones metálicos. La ventaja del último método es que el complejo actúa
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como un buffer metálico, el cual se disocia para iones conforme el
microorganismo los utilice para su crecimiento (Jianlong, 1988).
La presencia de trazas de metales en concentraciones toxicas es un problema
significativo durante una fermentación sumergida. Pero en fermentaciones en
sólido se obtienen altos rendimientos sin que haya inhibición. Las sales de hierro
son esenciales para activar la síntesis de Acetil CoA, por lo tanto importante para
producir el metabolito (Milson y Meers, 1985). Pero el exceso en su concentración
activa la síntesis de la enzima aconitasa, la cual es responsable de la producción
de ácido isocitrico, Este es un producto no deseable y reduce el rendimiento del
ácido cítrico. El fosfato de dihidrógeno de Potasio es la fuente más apropiada de
fosforo, y a bajas concentraciones favorece la síntesis del metabolito de nuestro
interés. La adición de acetato de metilo, cobre y zinc favorecen el crecimiento del
mecelio y producción de ácido cítrico (Sato y Sudo, 1999). El tipo y la
concentración de la fuente de carbono es uno de los factores más importantes
que determinan la concentración final del producto deseado. De acuerdo a Anwar
et al (2009), el alto contenido de azucares favorece una producción alta.
b) Fuente de nitrógeno
Estimula la formación de conidios y la producción del metabolito de interés, es
directamente influenciado por la fuente de nitrógeno, la urea, cloruro de amonio y
sulfato de amonio son los preferidos (Chundakkadu, 2005). La ventaja de usar
sales de amonio es que el pH cae conforme son consumidas, y el pH bajo es
esencial para la fermentación de ácido cítrico (Mattey, 1999). Los componentes
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del medio de cultivo juegan un papel importante en el rendimiento final. Es
importante considerar la concentración de las trazas de metales y otros
constituyentes presentes en la biomasa, de acuerdo al tipo de fermentación y
requerimientos fisiológicos del microorganismo. Por ejemplo, la toxicidad causada
por los metales pesados debe considerarse, removiendo con una sustancia
quelante para optimizar el crecimiento óptimo del microorganismo. La morfología
del hongo es un parámetro importante que afecta la producción de ácido cítrico y a
su vez, esta depende de los constituyentes del medio de cultivo (Singh et al,
2011).
c) Factores ambientales
Varios factores ambientales influencian el bioproceso, entre ellos se encuentran, la
temperatura, humedad, pH, minerales, tipo de inoculo, adición de nutrientes, entre
otros. Pero también se encuentran parámetros de ingeniería, como lo es la
agitación (Shojaosadati y Babaeipor, 2002) y tamaño de sustrato (Roukas, 1999).
1) Humedad
Los hongos prefieren ambientes húmedos para su crecimiento. En una
fermentación solida, se requiere la baja humedad para la generación de biomasa,
reducir la difusión de nutrientes, optimo crecimiento, estabilidad de sus enzimas,
consumo de sustrato (Chundakkadu, 2005). Por el contrario, una humedad alta
causa la aglomeración del sustrato, limitación en la transferencia de masa, y
competencia con bacterias (Gowthaman et al, 2001).
2) Temperatura
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La temperatura es una de las variables que más afectan el rendimiento de A. niger
para la producción de ácido cítrico. El no controlar de forma adecuada a la
temperatura se puede afectar a la fisiología en varios aspectos, tal como
desnaturalización de proteínas, inhibición enzimática, aceleración o supresión en
la producción del metabolito, y lo más importante, afectar la fisiología celular
(Pandey et al, 2001).
3) Aireación
En cultivos sumergidos, el principal objetivo de la aireación es suministrar oxígeno
suficiente para el crecimiento del microorganismo y para remover el bióxido de
carbono. La aireación también es crítica para remover el calor y mantener la
transferencia de humedad (Raimbault, 1998; Pandey et al, 2000; Shojaosadati y
Babaeipour, 2002) regulando de esta forma la temperatura del medio de cultivo,
distribución del vapor de agua y cantidad de compuestos volátiles producidos
durante el metabolismo. La acumulación de ácido cítrico se incrementa
considerablemente conforme se incrementa la tensión de oxígeno disuelto, pero
también se incremento su concentración en un factor de 1.4 por la adición de n-
dodecano al 5 % (v/v), el cual fue usado como vector para transportar oxígeno al
medio de cultivo con A. niger (Jialong, 2000). Sin embargo, la excesiva aireación
produce esfuerzos de corte, el cual tiene un efecto dañino para la morfología del
hongo filamentoso (Lu et al, 1997; Shojaosadati y Babaeipour, 2002).
4) Agitación
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La agitación es uno de los parámetros más importantes en las fermentaciones
aerobias, esta permite la homogeneidad del medio de cultivo, con respecto a la
temperatura y ambiente gaseoso una mayor interacción entre el área interfacial
gas-líquido, permitiendo la transferencia de oxígeno en el líquido (Trilli, 1986). La
agitación permite la remoción de la remoción de metabolitos volátiles, evita la
formación de pellets o agregados celulares, incrementa la transferencia de calor,
protege al medio de cultivo contra la desecación o humedad excesiva y mejora las
condiciones para el crecimiento microbiano (Mitchell y Berovic, 1998). Durante la
producción de ácido cítrico, la agitación permite la distribución de esporas,
necesidades de agua para el control de la humedad y/o cualquier otro nutriente
dentro del medio de cultivo (Suryanarayan, 2003).
5) pH
El pH es otro de los aspectos importantes a considerar en cualquier fermentación,
este varía de acuerdo a los requerimientos metabólicos del microorganismo. En el
caso de la producción de ácidos orgánicos, estos provocan que el pH disminuya.
Cada microorganismo tiene un rango de pH para su crecimiento, los hongos
filamentosos crecen en un rango amplio de pH (desde 2 hasta 9) con un rango
óptimo de 3.8 a 6.0. Esta versatilidad para adaptarse es beneficio para los hongos
ya que esto minimiza la contaminación por bacterias, especialmente a pH bajos.
Durante la producción de ácido cítrico, se pueden marcar dos tiempos; el primero
donde las esporas requieren un pH mayor a 5 para germinar y segundo, el pH
para la producción de ácido cítrico necesita pH´s menores a 2. El pH bajo reduce
el riesgo de contaminación e inhibe la síntesis de ácidos orgánicos no deseados,
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como el ácido gluconico y ácido oxálico pero también permite que la extracción y
purificación del ácido cítrico se más simple (Levente y Christian, 2003). El pH
cambia también de acuerdo de la fuente de nitrógeno seleccionada, así como de
las características de crecimiento del microorganismo (Gowthaman et al, 2001).
Para sobreproducir el producto deseado, el microorganismo puede ser crecido
bajo condiciones suboptimas para la producción de biomasa. Se han reportado
varias ventajas para usar esporas en el inoculo en lugar de micelio. De acuerdo a
Larroche (1996), las esporas funcionan como biocatalizadores, los tiempos son
flexibles para preparar el inoculo, se pueden almacenar durante largos periodos de
tiempo y tienen alta resistencia al daño causado por esfuerzos de corte o
insuficiente transferencia de masa cuando no se tiene un control perfecto en las
fermentaciones sumergidas (Gowthaman et al, 2001; Krishna y Nokes, 2001). Sin
embargo, también trae algunas desventajas, como la mayor duración de la fase
lag, diferentes condiciones optimas para la germinación de esporas y crecimiento
vegetativo y excesivo tamaño del inoculo. Es necesario que la actividad
metabólica de las esporas sea inducida antes de que el hongo comience a usar el
sustrato para crecer (Krishna y Nokes, 2001). El tamaño y la forma de los pellets
del micelio juegan un papel directo en la biosíntesis del ácido cítrico durante una
fermentación sumergida (Saha et al, 1999). Los pellets menores a 1 mm de
diámetro están asociados con altas velocidades de producción y altos
rendimientos (Magnuson y Lasure, 2004).
6) Otros factores
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Se ha observado que la adición de metanol incrementa la producción de ácido
cítrico a partir de glucosa y otras fuentes de carbono. Sikander y Haq (2005),
utilizaron concentraciones de metanol, etanol, isopropanol, metil acetato, n-
propanol, el cual incrementa el rendimiento de etanol. Esos estudios demostraron
que la adición de 4 % (v/v). Lo anterior se atribuye a la lenta degradación del ácido
cítrico y a la reducción de la actividad de la enzima acotinasa, pero también puede
ser debido al incremento de la actividad de otras enzimas del ciclo de Krebs. Pero
también existe la posibilidad de que el etanol pueda ser convertido a Acetil CoA
metabolito intermediario necesario en la síntesis de nuestro metabolito de interés.
La adición de metanol puede incrementar también la permeabilidad de la pared
celular para transportar citrato, Taketomi (1961) analizó la adición de metanol a la
fermentación y la síntesis de proteínas afecto la síntesis de proteínas pero sin
afectar el consumo de nitrógeno. Lo anterior provoco el incremento de la síntesis
de aminoácidos, péptidos y proteínas de bajo peso molecular durante las etapas
tempranas de la fermentación. El metanol afecta directamente la morfología del
micelio y promueve la formación de pellets, pero también provoca una alta
permeabilidad de la membrana estimulando la excreción de ácido cítrico del
micelio. Pandey et al, (2000) reportan que es necesario mantener la forma de
pellets en el cultivo en diámetros menores de 3 mm para una máxima producción;
lo anterior se ha demostrado con la adición de metanol, etanol, isopropanol y
acetato de metilo.
La adición de aceites vegetales también incrementa la producción del metabolito
(Sikander y Haq, 2005). Las grasas vegetales actúan como fuente de carbono y se
Antecedentes
degradan como glicerol y ácidos grasos; el glicerol entra directamente al ciclo de
Krebs y los ácidos grasos ingresan a través de la glucolisis. Hoy en día la
producción de biodisel tiene como subproducto al glicerol y es un sustrato
disponible y actúa directamente en la síntesis de ácido cítrico (Figenova et al,
2005).
La adición de inhibidores sobre varias enzimas del ciclo de Krebs, tales como el
fluoruro de calcio, fluoruro de sodio, arsenato de sodio, malonato de sodio, azida
de sodio, fluoruro de potasio, ácido yodoacetico y agentes axidantes, tales como
peróxido de hidrógeno, naftaquinona y azul de metileno adicionados a la
fermentación, también incrementan la acumulación de ácido cítrico (Adham et al,
2008). Sin embargo, una alta concentración de esos inhibidores puede inhibir el
crecimiento del micelio y disminuir la producción del metabolito de interés.
Se ha estudiado el efecto de otros inductores del crecimiento del micelio, por
ejemplo, Michaelis y Papoutsakis (1990) usaron a el polietilenglicol, suero
sustancias que protegen al micelio de los esfuerzos de corte causados por la
hidrodinámica e impulsores del reactor, estimulando su crecimiento. La naturaleza
de la fuente de carbono afecta a la producción de ácido cítrico, sobre todo en la
actividad de las enzimas del ciclo del ácido cítrico (Xu et al, 1989). En términos
generales, solo los azucares que son metabolizados rápidamente por el hongo
permiten altos rendimientos, así que los polisacáridos no son recomendables.
Recuperación y purificación del ácido cítrico
Antecedentes
La obtención del ácido cítrico producido en fermentaciones sumergidas se obtiene
por métodos clásicos como precipitación, extracción y absorción (Figura 1)
Figura 1. Esquema de la recuperación de ácido cítrico por los métodos convencionales
Métodos de extracción
a) Precipitación
Es uno de los métodos convencionales para extraer el ácido cítrico de una
fermentación sumergida. En este caso, el caldo de fermentación se calienta a 50
°C por 20 minutos y es precipitado como citrato de calcio, usando carbonato de
Antecedentes
calcio y ácido sulfúrico (Pazouki y Panda, 2008). El precipitado (citrato de calcio)
es entonces filtrado y lavado con agua varias veces, después es llevado a un
acidulador y tratado con ácido sulfúrico. La solución es nuevamente filtrada para
remover el CaSO4 (Kiousdetidis et al, 1979). Kunzl y Cechurova (1977) lograron
separar el 88 % de citrato de calcio de caldo de cultivo que contenía ácido cítrico,
málico, oxálico y gluconico y otros contaminantes orgánicos adicionando cal a pH
de 6 agitando constantemente y calentando de forma gradual a más de 80 °C. El
filtrado de la suspensión se calentó a 60 °C y lavada con agua a la misma
temperatura.
Karklin et al (1984) separo el ácido cítrico de caldos de fermentación usando pH´s
entre 6.1 y 7.5. La clarificación fue hecha con carbón activado y kieselgur y
después mezclado con CaCl2, acetato de sodio o Ca(OH)2 para precipitar el ácido
cítrico. Luego el citrato de calcio fue separado por filtración al vacio, lavado con
agua caliente y secado entre 90-105 °C. El pH optimo y temperatura fue entre 7.0-
7.2 y 80 °C, respectivamente.
El ácido cítrico producido por fermentación, usando como fuente de carbono a
alcanos, fue separado del caldo de cultivo como citrato de calcio. Este último fue
convertido a ácido cítrico por medio de la adición de H2SO4 a 80-90 °C, seguido
de una evaporación y cristalización. El rendimiento de ácido cítrico fue entre 64.8 a
92.9 %. El citrato de calcio también fue convertido a ácido cítrico por cromatografía
de intercambio iónico, en este caso el rendimiento fue entre 83.9 a 100 %. El ácido
cítrico también aislado del caldo de fermentación a través de citrato trisódico y
Antecedentes
citrato de tripotasio por medio de cromatografía de intercambio iónico (Ramina y
Brigmane, 1984).
El caldo de cultivo que contiene ácido cítrico es decolorado por medio de carbón
activado y pasado a través de cromatografía de columnas de resina de
intercambio iónico. El líquido fue concentrado al vacio y finalmente se cristalizó a
baja temperatura, donde el ácido cítrico cristaliza como ácido cítrico
monohidratado. El ácido cítrico cristaliza con dificultad y produce bajos
rendimientos (Kertes y King, 1986).
Pendl et al (1986) trato el caldo de fermentación con cal hasta alcanzar un pH de
4.3, seguido de un calentamiento a vapor a 60 °C. Posteriormente se le agregó
más cal hasta alcanzar un pH de 6.2. La suspensión resultante fue filtrada y
lavada con agua a 60 °C. Su descomposición fue tratada con H2SO4 a pH de 1.86
para obtener ácido cítrico y ácido oxálico. Posteriormente, la solución fue des
ionizada y cristalizada.
El método de precipitación, a pesar de ser simple y extenso, genera problemas
alternos, como la formación de productos indeseables. Pero también existe
prioridad por acortar el método e incrementar su eficiencia de recuperación
utilizando técnicas avanzadas. Para eliminar la generación de yeso y CO como co-
productos se han utilizado otras técnicas de separación, por ejemplo, extracción
por solventes (Pazouki y Panda, 1998), extracción supercritica de CO2 (Shishikura
et al, 1992), electrodiálisis (Pinto et al, 1992) y separación por membranas
(Friesen et al, 1991).
Antecedentes
b) Extracción por solventes
Aunque el método clásico por precipitación es la técnica más utilizada en procesos
industriales, la separación por solventes también ha sido usada para separar ácido
cítrico. La extracción por medio de aminas parece ser un método prometedor par
ácidos carboxílicos disueltos en soluciones acuosas. El ácido cítrico es fácilmente
extraído por un gran número de solventes orgánicos, tales como las aminas
alifáticas de alto peso molecular (Pazouki y Panda, 1998).
Baniel y Gonen (1990) reportaron un 90 % de recuperación de ácido cítrico con el
método de extracción antes mencionado. Wenneresten (1983) demostraron que
las aminas terciarias son muy efectivas para la extracción de ácido cítrico. El
método de extracción por aminas es muy favorecido a pH´s muy bajos (abajo del
pKa más pequeño) y se favorece su reactividad con aminas terciarias básicas. Las
ventajas de este método son: consumo mínimo de ácidos y bases minerales, y
menor generación de co-productos, no se evaporan grandes cantidades de agua.
c) Adsorción
Es difícil lograr altos radios de recuperación usando técnicas de separación
convencionales. Se ha reportado el uso de resinas de intercambio iónico para
ácidos orgánicos, por ejemplo, Juang y Chou (1996), analizaron la adsorción de
ácido cítrico de soluciones acuosas en resinas de macroporos (Amberlita XAD-4 y
Antecedentes
XAD-16) impregnados con tri-n-octilaminas. Gluszcz et al (2004) midieron las
propiedades de absorción de 18 tipos de resinas de intercambio iónico para
recuperar ácido cítrico y láctico, encontraron que las resinas con pH básico
poseen altas capacidades de adsorción. Takatsuji y Yoshida (1998) también
reportaron los mecanismos de adsorción para el ácido cítrico, málico y acético en
resinas comerciales (Diaion WA30) con pH básico. Las isotermas de absorción de
los ácidos orgánicos fueron altamente favorables y la capacidad de adsorción
depende del valor del pH en la solución. La extracción en línea de ácido cítrico del
fermentador con resinas débilmente básicas ayudaría a evitar la inhibición por
producto e incrementar la velocidad de producción y viabilidad celular.
Estructura y propiedades del ácido cítrico
El ácido cítrico (2-hidroxy-ácido-1,2,3-tricarboxilico( Figura 2)), es un metabolito
común en las plantas y animales. Este es uno de los ácidos orgánicos más
utilizados en la industria de alimentos, bebidas e industria farmacéutica (Kirk-
Othmer, 2002).
Figura 2. Estructura química del ácido cítrico
Debido a su funcionalidad y aceptabilidad ambiental, el ácido cítrico y las sales
que produce (con potasio y sodio) se utilizan en diversas aplicaciones industriales,
entre ellas como material quelante, buffer y como sustancia amortiguadora. Esos
Antecedentes
usos incluyen la elaboración de detergentes, champús, cosméticos, limpieza de
químicos y extracción de petróleo (Kirk-Othmer, 2002).
a) Propiedades físicas
El ácido cítrico anhidro cristaliza en agua a temperaturas de 130 °C, es incoloro y
forma cristales traslucidos o polvo blanco cristalino. Su cristal es de forma
monoclínica holohedrica. El ácido cítrico es deliquiscente en aire húmedo y es
ópticamente inactivo. Algunas otras propiedades son: fórmula molecular (C6H8O7),
peso molecular 192.13 g/mol; punto de fusión 153 °C; descomposición térmica 175
°C; densidad 1.665 g/mL (Kirk-Othmer, 2002).
El ácido cítrico experimenta algunas reacciones que son comunes en cualquier
ácido orgánico. Entre ellas se incluyen las reacciones de esterificación, formación
de sales y reacciones anhídridas. Sin embargo, los grupos hidroxilo (OH) terciarios
no sufren todas esas reacciones:
1) Reacciones de descomposición
Esto ocurre cuando el ácido cítrico se calienta a 175 °C, el ácido cítrico se
descompone y forma ácido aconítico, ácido itaconico, ácido acetonedicarboxilico,
dióxido de carbono y agua (Patentes: 499-12-7; 498-23-7; 97-65-4; 542-05-2).
2) Reacciones de esterificación
El ácido cítrico es esterificado fácilmente con alcoholes en condiciones azotroficas
en la presencia de un catalizador, tal como el ácido sulfúrico. Los alcoholes unidos
Antecedentes
al ácido cítrico alcanzan su punto de ebullición a temperaturas superiores de 150
°C (Seidell, 1941).
3) Reacciones de oxidación
El ácido cítrico es fácilmente oxidado por una variedad de agentes oxidantes, tales
como los peróxidos, hipoclorito, persulfato, permanganato, periodato, hipobromito,
cromato, dióxido de manganeso y ácido nítrico. El producto de la oxidación son
ácidos acetodicarboxilicos, ácidos oxálicos, bióxido de carbono y agua (Blair y
Zienty, 1979).
4) Reducción
La hidrogenación del ácido cítrico produce ácido 1,2,3 propanocarboxilico (Seidell,
1941).La hidrogenación produce dióxido de carbono, agua, metano, ácido fórmico
y pequeñas cantidades de ácido metil succínico.
5) Formación de sales
El ácido cítrico forma sales mono, di y tribásicas con muchos cationes, tales como
los álcalis, amonio y aminas. Las sales pueden ser preparadas por neutralización
directa de una solución de ácido cítrico en agua usando una base apropiada. El
citrato trisódico es el más ampliamente utilizado en comparación con otro tipo de
sal de ácido cítrico.
6) Formación de quelantes
Antecedentes
El ácido cítrico forma complejos multivalentes con iones metálicos y forma
quelatos (Staal, 1989). Esta propiedad es importante en el proceso del ácido
cítrico, la contaminación por metales afecta el color, estabilidad, apariencia del
producto o eficiencia del proceso.
7) Corrosión
En soluciones acuosas, el ácido cítrico corroe el acero a temperaturas elevadas,
exceptuando el acero 316 es resistente a la corrosión. Otros metales como el
aluminio, cobre y niquel son medianamente corroídos por el ácido cítrico. Por otra
parte, el vidrio y plásticos (poliéster, polietileno, polipropileno, polivinil) no son
corroídos por el ácido cítrico (Kirk-Othmer, 2002).
Aplicaciones del ácido cítrico
El ácido cítrico es utilizado en la industria de alimentos, medicina, agricultura e
industria química, debido a sus propiedades únicas. El ácido cítrico se utiliza para
ajustar el pH, como sustancia quelante o para formar complejos estables con
iones metálicos multivalentes, también es usado para estabilizar emulsiones y
otros sistemas multifásicos. En resumen, el ácido cítrico es dulce, limpio, tiene
sabor agradable y es utilizado como acidulante en alimentos diversos (Kirk-
Othmer, 2002).
El ácido cítrico, citrato de sodio y el citrato de potasio se utilizan para la
elaboración de bebidas carbonatadas y no carbonatadas (National Soft Drink
Association, 1982). Las bebidas bajas en calorías, isotónicas, utilizan solo ácido
cítrico en combinación con sales de citrato para otorgar sabor y propiedades de
Antecedentes
buffer y para incrementar la actividad antimicrobiana. La alta solubilidad del ácido
cítrico es importante para la elaboración de jarabes. Se puede combinar con ácido
málico para obtener perfiles únicos de sabor. También se utiliza para estabilizar el
pH en bebidas dietéticas. La concentración presente en muchas bebidas
carbonatadas y de sabores están alrededor del 0.10-0.25 % (p/p). Existe toda una
gama de aplicaciones en la industria de alimentos (Tabla 1).
USO PROPIEDADES
Fabricación de mermeladas y jaleas. Proveen de sabor y se ajustan al pH del producto para su óptima gelatinización.
Elaboración de dulces. Se adiciona al dulce para dar sabor. Evita la inversión del azúcar.
Ensaladas. Se combinan con el ácido ascórbico para evitar el ataque enzimático a vegetales preparados.
Alimentos congelados. Quela y acidifica para conservar a los alimentos congelados e incrementa la actividad antioxidante. Inhibe el deterioro del sabor y olor
Frutas y vegetales congelados. Atrapa metales y evita la oxidación enzimática. Mantiene el color e incrementa el sabor de las frutas enlatadas
Grasas y aceites. Evita la oxidación de grasas y aceites, además, atrapa trazas de metales
Elaboración de postres y confitería. Junto al citrato de sodio, se utilizan en la industria de la confitería para optimizar las características de gelatinas e incrementan su sabor
Elaboración de quesos Se utiliza citrato de sodio en el proceso de elaboración de queso, se utiliza para estabilizar las emulsiones de aceite y agua. También le da cuerpo y textura al queso
Lácteos. Estabilizador de cremas batidas y estabiliza lácteos que contienen vegetales. Se le adiciona a malteadas, y postres congelados antes de su pasteurización. Reduce su viscosidad
Alimentos del mar. Se adiciona junto a otros antioxidantes para bajar el pH y retardar el crecimiento bacteriano, evitando el deterioro, evita sabores desagradables y color de pescados y otros alimentos de origen marino
Productos cárnicos. Se utiliza para curar a la carne e incrementa la efectividad antioxidante y ayuda a modificar la textura. Contiene propiedades antimicrobianas
Tabla 1. Usos del ácido cítrico en los alimentos
En la medicina, el ácido cítrico y las sales de citrato son usados como buffer para
mantener la efectividad y estabilidad de una gran cantidad de fármacos. También
se utilizan para formular medicamentos efervescentes junto al bicarbonato; en este
caso les confiere una rápida disolución de los ingredientes activos y mejora la
palatabilidad. Se usan para quelar trazas de metales iónicos y evita la degradación
de los ingredientes de una formulación farmacéutica. Evita la coagulación de
sangre y es usado para separar los componentes celulares (fraccionamiento) y
Antecedentes
plasma. Los citratos de calcio y amonio se utilizan como suplementos minerales o
en gomas de mascar para el cuidado dental.
En el sector agrícola, el ácido cítrico y sus sales de amonio se usan para atrapar
iones solubles como el hierro, cobre, magnesio, manganeso y zinc, los cuales son
micronutrientes utilizados para formular fertilizantes líquidos. También se utiliza en
los forrajes para el ganado, en la formación de quelatos fácilmente digeribles de
nutrientes metálicos esenciales. También se usa para mantener un sabor
agradable logrando incrementar el consumo de alimentos por parte de los
animales, controla el pH gástrico y mejora la eficiencia de absorción de nutrientes
en el intestino delgado.
El uso industrial del ácido cítrico es muy amplio, este va desde elaboración
de detergentes hasta la fabricación de cemento para la construcción (Tabla
2).
USO PROPIEDADES
Fabricación de detergentesSe usa para fabricar detergentes en polvo y líquidos. El ácido cítrico reemplaza a los fosfatos y es menos contaminante. Atrapa iones de aguas duras y dispersa aceites. El ácido cítrico funciona adecuadamente a altos y bajos pH´s, y su efectividad no es afectada por la temperatura del agua; lo anterior hace al ácido cítrico idóneo
LimpiadorEs un limpiador de superficies duras. Acidifica y quela disolventes y depósitos de agua dura. Se utiliza en la construcción para incrementar la eficacia de surfactantes. Remueve colorantes que son díficiles de eliminar en la ropa
Limpieza de metales
El ácido cítrico ajustado a un pH de 3.5 junto al amonio y trietanolamina, se usan para limpiar metales oxidados. Es útil en la limpieza de reactores nucleares y boilers de vapor, con el fin de restaurar la eficiencia en la transferencia de calor. Limpia equipo de acero de la industria y para áreas de difícil acceso, tales como los cascos de barcos.
PetróleoLas soluciones de citrato de aluminio ajustadas a un pH de 7.0 en usada para gelificar polímeros, estimulando la recuperación de petróleo. Se usa para remover sulfuro de hidrógeno del gas natural y formando azufre elemental.
Desulfación de gas Absorbe dióxido de azufre del gas producido por las plantas eléctricas. El dióxido de azufre es el principal causante de la lluvia ácida.
Formulación de concretos y morteros Es usado como aditivo y formulaciones plásticas para retardar el tiempo de secado y reduce la cantidad de agua requerida para hacer una mezcla. Mejora su resistencia y fuerza de construcciones.
Fabricación de textiles Actúa como Buffer de resinas de glioxilato, las cuales son usadas para dar alta durabilidad y ajusta el pH durante el teñido de telas
Antecedentes
PlásticosJunto con el bicarbonato, el ácido cítrico es usado como agente efervescente de espuma de poliestireno. Ha reemplazado a los fluoroclorocarbonos de los recipientes de plástico. Es un agente quelante en la fabricación de resinas y los esteres de citrato se usan como plastificante de películas de PVC, usadas para empacar alimentos.
Fabricación de papel Se adiciona a la pulpa líquida para blanquear y atrapar iones metálicos y evita la decoloración.
Cosméticos Se adiciona a cosméticos para ajustar el pH, quelar metales y evitar la decoloración y descomposición
Cerámica Le confiere volumen, estabilidad y fuerza a materiales cerámicos usados como condensadores eléctricos y fundición.
Tabla 2. Aplicaciones del ácido cítrico en la industria