145

Capitolul V. Formarea methemoglobinei sub aciunea ionilor nitrii la oxidarea oxihemoglobinei cu nitrii

Procesele de oxidoreducere n organismele vii sunt unele dintre cele mai impor-

tante etape n metabolismul att al substanelor endogene, ct i al xenobioticelor n

organismele vii. Un interes deosebit n acest domeniu prezint hemoproteinele. Funcia

principal a hemoglobinei este fixarea i transportarea oxigenului n organismele vii,

care se realizeaz datorit prezenei Fe2+

din molecula hemului. Legtura moleculei de

O2 cu hemoglobina nu este stabil. Structura teriar i cuaternar a hemoglobinei ra-

pid i ncontinuu oscileaz ntre conformaia oxi- i dezoxi-formei. n rezultatul acestor

oscilaii conformaionale este posibil ndeprtarea moleculei de O2 i trecerea HbO2

n Hb [356]. Forma oxigenat a hemoglobonei se afl ntr-un echilibru dinamic cu

dezoxiforma, care n anumite condiii poate fi antrenat n reacia de methemolgobini-

zare. Fixarea reversibil a oxigenului poate fi realizat numai de atomul de fier biva-

lent. n acest proces fierul rmne n starea de oxidare Fe2+

, astfel hemoglobina este

oxigenat i nu oxidat; n rezultat, se formeaz oxihemoglobina (HbO2). Hemoglobina

sau dezoxihemoglobina (Hb) i (HbO2) au proprieti diferite. Sub aciunea diferiilor oxidani n rezultatul proceselor de oxidoreducere se for-

meaz methemoglobina (MetHb), forma oxidat a hemoglobinei n care Fe2+

s-a oxidat n Fe

3+; astfel, MetHb i pierde funcia de transport a O2. De regul, n snge se men-

ine o concentraie constant de MetHb n limitele de la 1-5% [331]. Dar, sub influena xenobioticelor ce ptrund n snge, concentraia MetHb crete considerabil, ajungnd n unele cazuri pn la 70% [332,333]. n rezultatul acestor procese n organism se pro-voac o hipoxie, ceea ce duce la diferite procese patologice.

n literatura de specialitate sunt descrise grupe de compui care duc la formarea MetHb, dintre care fac parte diferite xenobiotice. Un rol deosebit n formarea MetHb revine nitrailor i nitriilor, oxizilor de azot, care ptrund pe diferite ci n organismul uman: cu produsele alimentare, apa, aerul. Ionii nitrai i nitrii sunt indispensabil legai ntre ei n circuitul natural al azotului, dar, datorit activitii chimice nalte a nitrit-ionului, ei se gsesc n concentraii mici n mediul nconjurtor. Astfel, prima etap la intoxicarea cu nitrai este reducerea lor la ioni nitrii.

Cunoaterea mecanismelor reaciilor dintre hemoglobin i diferii methemoglobi-

nizani st la baza elaborrii metodelor de inhibiie mpotriva oxidrii hemoglobinei.

V.1. Mecanismele de oxidare a hemoglobinei cu ioni nitrii i alte xenobiotice

Oxidarea HbO2 cu ioni nitrii este un proces alctuit din dou etape [334]: etapa

lent (perioada-lag) i etapa rapid, autocatalitic. Curbele cinetice sunt reprezentate

prin forma S. Trebuie de menionat c procesul de oxidare a formei oxigenate a HbO2

i a Hb cu nitrii este diferit. n rezultatul studierii oxidrii Hb cu ioni nitrii n condiii

anaerobe s-a obinut un amestec de MetHb i nitrozohemoglobin (HbNO) [335].

n condiii anaerobe la interaciunea NaNO2 cu Fe(II) n mediu acid are loc generarea

NO [335]. Astfel, formarea HbNO este precedat de oxidarea Hb cu NO2- cu formarea

146

de MetHb i NO, iar ultimul n continuare se asociaz cu Hb i formeaz HbNO.

Curbele cinetice de consum a Hb n prezen de NO2- n condiii anaerobe nu se mai

prezint sub form de S, ca pentru condiiile aerobe. Stadiul-limit la interaciunea

HNO2 cu Hb este formarea MetHb i NO, iar a doua etap (asocierea Hb cu NO) este

rapid [335,336].

Oxidarea Hb n MetHb se realizeaz n rezultatul transferului de pe ultimul strat

al 3-d electronului de la fierul hemului. Pentru ca transferul electronului s se realizeze,

e necesar apropierea particulelor pentru interaciunea orbitalului-donor al reductoru-

lui Fe(II) cu orbitalul-acceptor al oxidantului NO2-. n cazul cnd a asea poziie coor-

dinativ a fierului nu este ocupat de ligandul O2, are loc, probabil, o interaciune efec-

tiv a orbitalului-donor al Hb cu orbitalul acceptor al NO2. Transportul 3d-electronu-

lui pe orbitalul molecular duce la formarea radicalului NO22-

, care n continuare se

poate descompune n anionul NO- i O2

2- [337].

Formarea H2O2 la protonarea anionului peroxid O22-

i interaciunea cu NO- poate

duce la generarea oxidului de azot(II). Oxidul de azot format poate interaciona cu

deoxyHbFeII

(k = 2.5107 M

-1s

-1) [338-339]:

deoxyHbFeII + NO HbFe

IINO (V.1)

V.1.1. Procese de oxidare a oxihemoglobinei cu ioni nitrii

n studierea mecanismului de oxidare a HbO2 cu ionul nitrit este destul de impor-

tant rolul O2. Unul dintre mecanismele de oxidare a HbO2 cu NaNO2 propus n [340]

include eliminarea oxigenului, dar n cantiti nensemnate:

HbO2 + NaNO2 MetHb + NaNO3 +1/2 O2 (V.2)

De rnd cu procesul normal de eliminare a O2 n organismele vii permanent are

loc i o autooxidare a HbO2 n MetHb:

HbO2 MetHb + O2

(V.3)

Din reacia de mai sus observm c are loc generarea radicalului anion-superoxid

(O2) ce posed proprieti paramagnetice. Acest radical a fost detectat n sistemul

HbO2-NaNO2 prin metoda RMN. Concentraia maximal a centrelor paramagnetice se

mrete cu creterea concentraiei de hemoglobin, iar la sfritul reaciei aceste parti-

cole de O2 dispar.

Pentru a stabili prezena radicalului O2 n sistemul HbO2-NaNO2, s-a utilizat meto-

da inhibitorilor ce include introducerea n sistemul dat a enzimei (superoxiddismutaza).

n rezultat, s-a observat efectul inhibitor n oxidarea HbO2, ceea ce demonstreaz c

O2 particip n procesul de formare a MetHb. ns, participarea O2

n mecanismul de

oxidare a HbO2 cu NO2- este prezentat diferit. Unii autori consider c O2

oxideaz

Fe(II) din HbO2 cu formarea H2O2, alii afirm c O2 nu este un oxidant direct al HbO2,

dar este necesar n autocataliz. Aceast deducere este confirmat prin faptul c super-

oxiddismutaza i manifest aciunea inhibitoare anume n stadiul autocatalitic.

n procesul de oxidare a HbO2 cu NO2- un rol important i revine anume oxigenu-

lui din molecula hemoglobinei, care este ca un autocatalizator n acest proces. Autorii

lucrrii [336] nainteaz presupunerea c n rezultatul proceselor de oxidoreducere la

147

interaciunea NO2- cu O2

are loc generarea oxidului de azot. O astfel de direcie a pro-

cesului este asigurat de potenialele de oxidoreducere ale NO2- i O2

, care alctuiesc

+0,99 i -0,33 V, corespunztor.

Un alt factor important n mecanismul de oxidare a HbO2 este formarea NO2

n

stadiul de iniiere a procesului de oxidare. Formarea acestui radical n sistem a fost

stabilit prin utilizarea aminelor (anilina), care inhib procesul de oxidare a HbO2, da-

torit formrii N-nitrozoaminelor cu NO2-. Mecanismul ion-radicalic include formarea

NO2-, care n continuare duce la propagarea procesului dat:

HbO2 +NO2- MetHb + O2

2- + NO2

(V.4)

HbO2 + NO2

MetHb + O2 NOO

- (V.5)

O2 NOO- + O2

2- NO2

- + 2O2

(V.6)

O22-

+ 2H+ NO2

(V.7)

Un intermediar important n procesul de oxidare a HbO2 cu NO2- este H2O2, care

se formeaz n rezultatul dismutaiei O2 [336]. S-a constatat c influena H2O2 asupra

reaciei de oxidare a HbO2 cu NO2- depinde de [NO2

-]0 i [H2O2]0.

n literatur sunt mai multe opinii despre rolul H2O2 n sistemul HbO2-NaNO2,

dintre care dou sunt mai principale: 1) interaciunea direct a H2O2 cu ionul nitrit;

2) interaciunea H2O2 cu intermediarii obinui n procesul de oxidare a HbO2.

Cercetrile efectuate [344] relev c la interaciunea H2O2 cu MetHb se formeaz

un intermediar supraoxidat (HbIV

=O). Concentraia lui este mic i de aceea nu poate

fi detectat prin metode optice. Studii efectuate pe diferite modele demonstreaz for-

marea unui complex intermediar al MetHb i metmioglobinei (MetMb) cu H2O2 i

descompunerea lui ulterioar.

n prima etap a acestui proces are loc oxidarea monoelectronic a MetMb

(Fe(III)Fe(IV)) cu formarea intermediarului. n etap a doua intermediarul format

sufer o reducere monoelectronic cu formarea unui radical, ns starea de oxidare a

fierului nu se schimb. n etapa a treia radicalul format sufer o reacie oxidoredu-

ctoare intern, n rezultatul creia Fe(IV) se reduce la Fe(III). Constanta de vitez

a reaciei de oxidare de ordinul doi cu H2O2 pentru o serie de proteune hem este

105 lmol

-1 s

-1.

Pentru a concretiza rolul H2O2 n procesul de oxidare a HbO2 cu nitrit-ion, s-a

studiat influena catalazei asupra acestui proces. S-a constatat c catalaza inhib pro-

cesul de oxidare a HbO2 cu NO2-, ntruct are loc o concuren ntre MetHb i NO2

-

pentru molecula de H2O2, a crei concentraie n sistem depinde de concentraia ionu-

lui nitrit.

n baza cercetrilor efectuate de ugalei [341] s-a propus mecanismul ion-radica-

lic n lan. Principalul produs intermediar, care asigur ramificarea lanului, este H2O2.

Ramificarea i propagarea lanurilor se efectueaz cu participarea radicalului NO2,

care se formeaz la interaciunea H2O2 cu ionul nitrit.

148

n baza rezultatelor cercetrilor mecanismului procesului de oxidare a HbO2 cu

ion nitrit au fost propuse dou scheme [342]:

Schema 1 HbO2 +NO2

- + H

+ Hb +NO2

+ HO2

(V.8)

Hb +NO2 MetHb +NO2

- (V.9)

NO2-+ HO2

NO2

+HO2

- (V.10)

HO2- + H

+ H2O2 (V.11)

H2O2 + MetHb Hb(IV) = O + H2O (V.12)

Hb(IV) = O + NO2- + H

+ MetHb + NO2

+ HO

(V.13)

Schema 2

H2O2 + NO2- NO2

+ HO

+HO

- (V.14)

HO + NO2

- NO2

+ HO

- (V.15)

Mecanismele prezentate n schemele 1 i 2 descriu dou procese extremale de

parcurgere a reaciilor n sistemul HbO2-NO2-. n realitate, n mediul reactant ar putea

avea loc toate reaciile prezentate n ambele scheme.

Aportul reaciilor cu formarea Hb(IV) = O trebuie s creasc odat cu creterea

concentraiei MetHb n sistem. n acelai timp, creterea concentraiei NO2- mrete

aportul reaciilor din schema 2 i mrete viteza de formare a MetHb.

V.1.2. Participarea altor xenobiotice n oxidarea hemoglobinei

Oxidanii hemoglobinei au fost clasificai n dou grupe: 1) ce reacioneaz cu oxihemoglobina; 2) ce reacioneaz cu dezoxihemoglobina. Din grupa a doua fac parte compuii nitroaromatici, iar ceilali methemoglobinizani se clasific la grupa nti. Mecanismul de oxidare a substratului cu diferii methemoglobinizani poate fi diferit: sub aciunea oxidanilor din grupa nti reaciile parcurg dup mecanisme att n lan cu ramificare degenerat (NaNO2, N2O4, CH3(CH2)XNO2), ct i dup procesul nera-mificat (NH2OH, CH3CH2NO2, p-anizidin).

Astfel, procesul de methemoglobinizare n prezena oxidanilor din grupa nti, prin careva aproximare, se consider o reacie cu participarea fierului bivalent al com-plexului porfirinic n care unul din liganzi oxigenul molecular posed proprieti nalt electroacceptoare i, n condiii extremale, poate forma intermediari cu sarcini separate Hb

+O2

-.

Reacia de methemoglobinizare este posibil dac n calitate de reageni particip compui din grupa a doua, care posed o afinitate nalt de electron i sunt n stare uor s accepte electronul atomului de fier din hem. Astfel de proprieti posed com-puii nitroaromatici.

n cazul intoxicaiei cu nitroalcani sintetici i naturali oxidarea HbO2 i a mioglo-binei are loc dup un mecanism asemntor cu oxidarea ionilor nitrii. Este stabilit c n procesul de oxidare particip numai nitroalcanii primari i secundari. Rezultatele cercetrilor cinetice [343] duc la concluzia c mecanismul de methemoglobinizare sub aciunea nitroalcanilor este la fel ion-radicalic. O cale mai probabil de formare a

149

MetHb n sistemul dat include iniierea procesului prin oxidarea monoelectronic a anionului nitroalcanului de ctre HbO2:

R1R2CNO2- + HbO2 R1R2CNO2

+ Hb + HO2

(V.16)

n continuare, radicalul format oxideaz o molecul de HbO2 n MetHb i se for-

meaz HO2-. Anionul HO2

- n prezen de H

+ formeaz H2O2, care, la fel, interacionnd

cu HbO2, formeaz MetHb. Dar trebuie de menionat c efectul methemoglobinizant al

nitroalcanilor n comparaie cu cel al ionilor nitrii este mai slab. Nivelul concentraiei

de MetHb format in vivo este considerabil mai jos ca n cazul intoxicaiilor cu aceleai

doze de ioni nitrii. Aceast concluzie, bazat pe cercetri experimentale, se explic prin

lipsa ramificrii lanurilor n reacia cu HbO2, participarea particulelor radicalice formate

n biotransformarea nitroalcanilor i prin deteriorarea peroxidic a biostructurilor [343].

Cunoaterea mecanismelor de biotransformare a nitroalcanilor a permis elaborarea

orientat a antidoilor la intoxicarea cu aceti compui. Un efect mai puternic a fost obinut

la utilizarea compuilor care interacioneaz efectiv cu radicalii liberi [343]; astfel, se

ntrerupe procesul patologic de oxidare peroxidic a biostructurilor n starea lor iniial.

n calitate de oxidani ai HbO2 pot participa hidroperoxizii organici, de exemplu

hidroperoxidul de ter-butil (t-BOOH), care se poate forma n organism n procesul de

oxidare lipo-peroxidic. Procesele de oxidare peroxidic a HbO2 cu t-BOOH au loc

prin ruperea homoltic a legturii -O-O- cu formarea radicalilor ter-butoxil (t-BO) i

ter-butil-peroxidic (t-BOO) [344]:

HbFe(II) ROOH HbFe(III) (V.17)

HbFe(III) + ROOH HbFe(III)(-OOR) + H

+ (V.18)

HbFe(III)(-OOR) HbFe(IV) = O + RO

Hb

+Fe(IV) = O + RO

- (V.19)

HbFe(IV) = O + ROOH HbFe(III) + ROO + HO

- (V.20)

Concentraia radicalilor intermediari, generai n celule, a fost nregistrat utiliznd

metoda chemiluminescent [344]. Astfel de radicali ce se formeaz duc la modificaii

oxidative nespecifice n celule i acesta este unul din procesele cele mai periculoase

pentru celul. Efectul toxic al radicalilor liberi n celul a dus la formarea mecanismu-

lui de aprare antioxidativ. Produii intermediari supraoxidai ai hemului sunt oxidani

puternici, care pot fi antrenai n oxidarea peroxidic a lipidelor [344]. Radicalii organici

formai la oxidarea HbO2 cu hidroperoxizi organici servesc ca surse de activare a O2,

care n continuare pot participa n reglarea proceselor fiziologice destul de importante.

Rezultatele cercetrilor proceselor de oxidare n celule a HbO2 cu t-BOOH, obi-

nute prin metoda chemiluminescent [344], constat c n continuare formarea produ-

ilor duce la:

1) oxidarea peroxidazic rapid a glutationului (GSH)

ROOH + 2GSH ROH + GSSG + H2O (V.21)

2) oxidarea peroxidic a lipidelor.

La mrimi de pH7,5 n reacia de methemoglobinizare t-BOOH joac rolul de catalizator la formarea H2O2, ce particip la procesul n lan de oxidare a HbO2. Radi-

calul HO2, format la etapa de iniiere, la interaciunea cu t-BOOH duce la formarea

H2O2 i a radicalului ter-butil-peroxil.

150

HO2 + t-BOOH H2O2 + t-BOO

(V.22)

Astfel, n sistem crete concentraia peroxidului de hidrogen format i concentraia

de MetHb.

V.2. Metode de inhibiie n procesul de oxidare a HbO2 cu ioni nitrii

V.2.1. Descompunerea peroxidului de hidrogen

Conform teoriei catalizei metal-peroxidice, oxidarea proteinelor este condiionat

de sisteme specifice electrodonore, care reduc oxigenul molecular pn la H2O2. Per-

oxidul de hidrogen format n sistemele biologice este privit ca o form stabil a oxige-

nului activ, care se transport in vivo la distane mari, ceea ce duce la deteriorri grave

ale sistemului departe de locul de generare a radicalilor oxigenului n rezultatul stresu-

lui oxidativ.

Peroxidul de hidrogen format n rezultatul disproporionrii O2, ca produs inter-

mediar, n continuare particip la diferite procese peroxidice i astfel are loc ramificarea

lanului n procesul de oxidare a HbO2, provocnd creterea vitezei de methemoglobi-

nizare.

Pentru a inhiba procesul de oxidare a hemoglobinei n sistemul HbO2NaNO2,

este necesar de a nltura H2O2 din acest sistem. Exist diferite ci de diminuare a ace-

stui produs intermediar din sistem. Unul dintre procedee poate fi fixarea H2O2 cu bicar-

bonatul de sodiu i formarea peroxo-hidrocarbonatului (Na2CO31.5H2O2) [345,371]:

NaHCO3 + H2O2 NaHCO3 H2O2 (V.23)

2NaHCO3 H2O2 Na2CO31,5H2O2 + CO2 + 1,5H2O + 0,25 O2 (V.24)

Factorul de autoaccelerare () se micoreaz odat cu creterea concentraiei

NaHCO3, iar timpul de stabilizare a vitezei maxime de oxidare a hemoglobinei la

creterea concentraiei de NaHCO3 se atinge la un grad mai nalt de conversie () a

HbO2 n MetHb.

n afar de influena direct a NaHCO3 n procesul de oxidare a HbO2 n MetHb,

menionat mai sus, este posibil i un alt mecanism, legat de formarea bioxidului de

carbon, ce se alipete la gruprile libere NH2 din HbO2. n rezultat, hemoglobina i

micoreaz afinitatea fa de O2:

HbO2 Hb + O2 (V.25)

Deoarece o parte din NaHCO3 la pH 6,65 se transform n H2CO3, n rezultat CO2

format se poate lega cu hemoglobina. Lund n consideraie c predecesorul peroxidu-

lui de hidrogen n reacia cu NO2- este numai oxihemoglobina, concentraia de H2O2

format se micoreaz.

Un alt tip de inhibitori care duc la diminuarea H2O2 n sistem sunt tiolii (cista-

mina, cisteina, glutationul redus) [346]. n prezena acestor compui are loc reducerea

vitezei procesului de methemoglobinizare n sistemul HbO2-NaNO2 i diminuarea

factorului de autoaccelerare () de 1,5-2,0 ori.

Deplasarea nensemnat a maximului vitezei (d/d) n direcia creterii gradului

de conversie () odat cu creterea concentraiei tiolilor, la fel ca n sistemul HbO2

NaNO2H2O2 , duce la micorarea concentraiei H2O2 n prezena acestor inhibitori.

151

Constantele efective de vitez (kef) pentru cistamin, cistein i glutation n sistemul

HbO2NO2tiol se micoreaz, n comparaie cu sistemul fr tioli. S-a constatat c

concentraia H2O2 este prezent numai n expresia cinetic a kef i nu intr n expresia

factorului de autoaccelerare (). Din aceste considerente, exist o dependen nensem-

nat a d/d n f() n perioada iniial i o influen mai mare a tiolilor asupra kef

(dup punctul de curbur a curbei cinetice).

Superoxiddismutaza (SOD) micoreaz viteza de autooxidare a HbO2 n MetHb

datorit dismutaiei radicalului HO2 i micorrii concentraiei H2O2 n comparaie cu

sistemul fr aceast enzim. n prezena SOD din doi moli de O2 se formeaz numai

o molecul de H2O2:

2 O2

+ 2 H+

SOD H2O2 + H2O (V.26)

Astfel, concentraia H2O2 se micoreaz de 2 ori n prezena SOD fa de autooxi-

darea natural. La introducerea n sistemul HbO2-NO2-SOD a diferiilor reglatori

peptidici, obinui din plasma sngelui uman, se observ variaia activitii SOD. Pre-

zena activatorilor SOD in vitro (s-a utilizat mas eretrocitar uman i animal) mic-

oreaz, iar a inhibitorilor SOD mrete viteza de methemoglobinizare. La utilizarea acestor reglatori ai activitii SOD n cercetrile experimentale

in vivo s-a constatat c are loc diminuarea efectului de methemoglobinizare la intoxi-carea cu nitrit de sodiu n prezena activatorului SOD i creterea lui n prezena inhibitorului SOD.

V.2.2. Dezactivarea radicalilor activi ai oxigenului

Dereglrile majoritii funciilor organismului (procesele infamatorii, reaciile

alergice, bolile infecioase, cancerul, SIDA, mbtrnirea) sunt determinate de variaia

coninutului de radicali activi ai oxigenului n esuturi [336]. Cunoaterea mecanisme-

lor reaciilor dintre biomolecule cu forme active ale oxigenului i a constantelor reac-

iilor cinetice, care n majoritatea lor sunt n lan, permite de a selecta preparate anti-

oxidante pentru corecia diferitelor stri patologice i mbuntirea calitii vieii.

Antioxidanii au proprietatea de a interaciona cu forme active ale oxigenului,

micornd intensitatea proceselor de oxidare radicalic, neutraliznd radicalii liberi

prin reacii de schimb al atomului de hidrogen (n majoritatea cazurilor) cu radicali

liberi de oxigen. Compuii din grupa dat au un atom mobil de oxigen i astfel interac-

ioneaz cu radicalii liberi sau cu metalele cu valen variabil, ce au rolul de cataliza-

tor. Mobilitatea atomului de hidrogen este determinat de legtura slab cu atomii de

carbon (C-H) sau sulf (S-H). n rezultatul interaciunii se formeaz radicali mai puin

activi ai antioxidanilor (care nu au proprietatea de a prelungi lanul). Conform cerce-

trilor, aceti radicali sunt eliminai din organism sub form de compui moleculari,

formai la interaciunea lor cu ali radicali asemntori.

Radicalul anion-superoxid (HO2-hidroperoxid) se formeaz n prezena diferiilor

methemoglobinizani (NO2-, hidroxilamina, 1-halogen-1-nitro-alcani), reageni donori

de electroni i n procesul de autooxidare a HbO2. Ambele procese sunt unificate prin

152

stadia monoelectronic a oxigenului cu eliberarea anionului superoxid, care n conti-

nuare duce la iniierea procesului n lan.

Pentru inhibarea procesului de oxidare al HbO2, care este ion-radicalic n lan, este

necesar de a capta particulele active ale oxigenului prin utilizarea diferiilor inhibitori.

La prima etap protecia de radicalii activi ai oxigenului este nfptuit de enzi-

mele antioxidante: superoxiddismutaza, catalaza, peroxidaza. SOD catalizeaz reacia

de dismutaie a O2, adic inactiveaz aceti radicali care apar n reaciile de transfer al

electronului:

2H+ + 2O2

SOD H2O2 + O2 (V.27)

Peroxidul de hidrogen format n celule la oxidarea aerob este descompus de

catalaz (Ct):

H2O2 + H2O2 Ct O2 + 2H2O (V.28)

Viteza reaciilor prezentate cu participarea enzimelor este determinat de procesul

de difuzie i nu necesit energie de activare.

Dintre inhibitorii solubili n ap face parte hidrochinona. Procesul de inhibiie n

prezena hidrochinonei este determinat de consumul ion-radicalului superoxid [366] ce

s-a generat n etapa de iniiere. S-a stabilit [347] c cu creterea concentraiei inhibito-

rului are loc creterea perioadei de inducie.

n prezena diferiilor derivai ai hidrochinonei la fel are loc procesul de inhibiie,

ns gradul de inhibiie este mai mic [348]. Efectul inhibitor mai nalt al hidrochinonei

este determinat de structura plan i de posibilitatea repartizrii efective a surplusului

de sarcini negative n radicalul semichinonic, adic de posibilitatea maxim de a delo-

caliza electronul necuplat.

Efectul de inhibiie a acestor inhibitori este detectat att pe sectorul iniial de auto-

oxidare al curbei cinetice, determinat dup variaia factorului de autoaccelerare (),

ct i dup punctul de curbur al curbei cinetice, determinat prin variaia constantei

efective de vitez de ordinul unu (kef).

Un efect inhibitor prin captarea radicalilor HO2 (O2

) l au fenolii [338] cu struc-

tur spaial complex. Intre aceti inhibitori ionolul (2,6-di-tret-butil-4-metilfenol)

s-a dovedit a fi cel mai efectiv. Complexitatea structurii conduce la slbirea sau la

pierderea proprietilor inhibitoare.

Compuii polifenolici (flavonoizii, polifenolii) conin n structura de baz grupe hidroxilice, metilenice, metoxilice i a. Ei au proprietatea s cedeze treptat electroni i

posed dou mecanisme de activitate antioxidant: inactiveaz radicalii liberi oxidani

(O2

, HO2

) i formeaz compleci stabili cu metalele (fierul, cuprul, cobaltul i a.).

Activitate antiradicalic posed numai formele reduse ale compuilor fenolici, pe cnd formele chinonice sunt antioxidani slabi. Ele pot fi restabilite n prezena acidului

ascorbic, recptnd proprietile de antioxidani.

Un rol important n inhibiia procesului de oxidare a HbO2 cu ion nitrii are capta-

rea radicalilor hidroxili (OH), care se genereaz n acest proces de oxidare. S-a stabi-

lit c acidul uric este o capcan efectiv pentru radicalii HO. Un analog structural al

153

acidului uric este acidul violuric i derivaii lui. Derivaii acidului violuric la fel pose-

d proprieti inhibitoare, dar mai puin pronunate. Aceast aciune este determinat

de mobilitatea atomului de hidrogen n poziia 3 i a hidrogenului din grupa iminoxilic.

Rolul atomului de hidrogen n poziia 3 se confirm prin micorarea brusc a efectu-

lui de inhibiie la introducerea substituenilor n aceast poziie. Efectul inhibitor se

manifest la fel la etapa de iniiere i dup punctul de curbur. Astfel, acidul violuric

capteaz n afar de radicalii activi ai oxigenului i ali intermediari. n calitate de

inhibitori n procesul de methemoglobinizare a fost studiat 5-hidroxi-6-metiluracilul.

S-a stabilit c introducerea dozelor de acest inhibitor n sistemul HbO2NaNO2

n concentraii de 3,2-19,2 mol% din concentraia NaNO2 conduce la micorarea vite-

zei reaciei de oxidare a HbO2. Reacia se descrie prin curba cinetic sub form de S,

n care perioada de inducie nu este reprezentativ. Influena acestui antioxidant, ce se

manifest asupra mrimii i nu influeneaz asupra mrimii kef de ordinul pseudo-

nti dup punctul de curbur al curbei cinetice, se explic prin particularitatea meca-

nismului de inhibiie. Principalele particule ce interacioneaz cu 5-hidroxi-6-metilura-

cilul sunt forme active ale oxigenului.

n reacia de oxidoreducere cu radicalii HO2 i HO

particip

ferocenele, compui

ce conin Fe2+

. n rezultatul reaciei n sistemul HbO2NaNO2 radicalii HO sunt elimi-

nai i astfel are loc inhibiia acestui proces, pronunat n prima etap a curbei cinetice.

V.2.3. Captarea radicalilor NO2

Analiza produselor intermediare n reacia de oxidare a HbO2 cu ion nitrit i legi-

tile cinetice de parcurgere au permis de a constata c acest proces este ion-radicalic

n lan [349]. n cadrul realizrii reaciei se formeaz radicalul NO2, peroxidul de

hidrogen i forme supraoxidate de Hb(IV). Radicalul NO2se manifest ca un agent de

baz n oxidarea hemoglobinei i ca particul principal n prelungirea lanului. Con-

form schemei propuse de ugalei [340], radicalul NO2 se formeaz la diferite etape de

parcurgere a procesului.

Formarea particulelor supraoxidate de Hb(IV)=O se realizeaz cnd n sistem

crete concentraia de MetHb.

Pentru a inhiba procesul de oxidare a hemoglobinei, este necesar de a recombina

radicalul NO2 cu alte particule radicalice stabile. Din literatur este cunoscut proprie-

tatea radicalilor NO2 de a interaciona cu radicalii nitroxili.

Stabilitatea radicalilor nitroxili este determinat de doi factori principali: gradul

de delocalizare a electronului necuplat la legturile cu substitueni (factor termodina-

mic) i dificultile sterice din apropierea atomului cu densitate nalt de spin (factor

cinetic). Pentru procesul de inhibiie n oxidarea HbO2 cu NO2- s-au utilizat diferii de-

rivai tetrametilpiperidinici n care electronul necuplat, n general, este localizat la grupa

nitroxil, care, fiind steric ecranat, i confer o stabilitate nalt acestui radical [349].

Efectul de inhibiie pentru diferii derivai nitroxilici nu depinde de structura lor,

iar timpul de inducie crete odat cu creterea concentraiilor acestor inhibitori. Acea-

154

st proprietate de nalt reactivitate a diferiilor derivai nitroxilici este legat de loca-

lizarea electronului necuplat pe fragmentul N-O.

Radicalii NO2 pot fi captai efectiv de aminele aromatice. n irul aminelor aro-

matice complexitatea structurii i introducerea substituenilor acceptori conduce la

diminuarea efectului de inhibiie.

Aminele aromatice inhib procesul de methemoglobinizare n sistemul HbO2

NaNO2. n acest scop, n cinetica de methemoglobinizare au fost utilizate difenilamina,

N-benzil-2-naftilamina i derivaii p-fenilendiaminei. n curbele cinetice obinute la

oxidare dispare forma S. Dispariia ei este legat de captarea radicalului NO2 de ctre

inhibitor n concurena lui cu hemoglobina.

n calitate de concureni ai hemoglobinei pentru NO2 particip i ferocenele, care

sunt compui reductori i care la fel posed i proprietatea de a descompune H2O2. n

irul ferocenelor cele nesubstituite posed efect maxim de inhibiie. Introducerea gru-

pelor -NH, -SH i a substituenilor acceptori nu influeneaz esenial asupra activitii

inhibitoare, deoarece fragmentul structural de baz, ce particip n procesul de inhi-

biie, este ionul de fier. Efectul de inhibiie sub aciunea ferocenelor se observ n toat

perioada de reacie.

V.2.4. Reducerea methemoglobinei

Un alt procedeu de protejare a HbO2 de oxidare este reducerea produsului oxidat

al reaciei-MetHb [372]. Principala cale de reducere in vivo este participarea enzimelor

NADH i NADPH (hemoglobin-reductaze).

NADH-citocrom b5-reductaza are un rol important n reducerea MetHb din eri-

trocite, iar aportul NADPH este mai redus. ns, acest proces se activeaz n prezena

albastrului de metilen [350]. Albastrul de metilen (AM) este un donor de electroni n

reducerea neenzimatic a MetHb [350]:

MetHb(Fe3+

) + R = N+(CH3)2 Hb(Fe

2+) + R-N(CH3)2 (V.29)

AM (red) AM(oxid)

Acest transfer neenzimatic al electronului de la AM(red) la MetHb reduce Fe(III)

din hem n Fe(II), iar AM(red) trece n stare oxidat. n absena NADPH methemo-

globinreductaz se reduce numai n jur de 6% MetHb din eritrocite, iar n prezena

acestei reductaze are loc reducerea mai intens a AM(oxid) [351]:

AMoxid + NADPH AMred + NADP+ (V.30)

Astfel, aceast enzim este mai activ in vivo n prezena albastrului de metilen.

La concentraii mari de AM nu are loc reducerea MetHb, ci oxidarea HbO2.

Este cunoscut c cofermenii NADH i NADPH reduc activ metalele cu valen

variabil [351]. n lucrare a fost studiat influena cofermenilor NADH i NADPH

asupra oxidrii HbO2, la pH 6,53. S-a observat c la [NADH]- i [NADPH]- mrimea

factorului de autoaccelerare este mai mic fa de sistemul fr cofermeni.

Mrimea kef la fel se micoreaz n prezena acestor coenzime i n acelai mod.

Efectul de inhibiie asupra mrimilor i kef este practic acelai, ceea ce poate fi expli-

155

cat prin aciunea de reducere a acestor enzime asupra fierului din MetHb din particu-

lele intermediare de Hb(IV) i incapacitatea acestor enzime reductoare de a participa

la protejarea mpotriva oxidrii antiperoxidazice.

Procesul de reducere a MetHb in vitro se efectueaz la fel cu participarea diferi-

ilor reductori cu greutate molecular mic [352]. Un astfel de reductor este acidul

ascorbic (AAs), care se caracterizeaz prin proprietatea de reducere a MetHb n Hb [352].

Cercetrile au fost efectuate att n condiii aerobe, ct i n condiii anaerobe. n con-

diii aerobe, n prezena hexafosfatului, procesul de reducere a MetHb cu AAs se inten-

sific. Un rol important n reducerea MetHb l au compuii tiolici, care sunt reductori

naturali: glutationul redus [351,353], cisteina, cistina [352,354,355].

Inhibitorul trebuie s interacioneze cu radicalii ce prelungesc lanul cu mult mai

rapid, dect aceti radicali ar interaciona cu substratul de oxidare [340]. Stabilizarea

proceselor radicalice i reglarea lor st la baza selectrii multor preparate farmaceutice

din ultima generaie.

V.3. Noi metode de inhibiie n procesul de oxidare

a hemoglobinei cu nitrii

Methemoglobinemia este provocat, n majoritatea cazurilor, de prezena nitrai-

lor n ap i n produse alimentare, care sub aciunea microflorei nitratreductoare din

cavitatea bucal i tractul gastrointestinal, se transform n nitrii. Ultimii, intrnd n

reaciile de oxidoreducere, duc la formarea methemoglobinei sau nitrozocomplecilor

hemoglobin-NO [373]. n Moldova, problema nitrailor n ap trezete ngrijorare,

deoarece cca 62% din fntni i 5% din sondele arteziene, folosite de populaie, conin

ap cu concentraii mai mari dect CMA [357,358,378,379]. Cele mai afectate din acest

punct de vedere sunt raioanele Teleneti, Cahul, Drochia, Edine, Rezina, Cantemir

.a., unde n unele surse de ap concentraia de nitrai atinge 100-750 mg/l (depind

de 2-15 ori limita maxim admisibil). Exist un ir de factori ce duc la formarea me-

themoglobinemiei: factori nnscui, de provenien toxicologic exogen, provocat

de diferii toxicani ce oxideaz hemoglobina n MetHb i de provenien endogen,

determinat de micorarea sau insuficiena dezvoltrii sistemelor methemoglobin-

reductoare.

Deseori, proveniena toxicologic cauzat de nitrai i activitatea endogen a siste-

melor reductoare sunt legate ntre ele. n cazul unui organism cu deficiene n ceea ce

privete secreia gastric, stomacul este populat de bacterii i nitratul se transform n

mare parte n nitrit (se pot forma de la 100-1000 mg NO2-/kg), adic fr intoxicare

grav formarea MetHb depete ritmul de reducere al ei i procesul devine ireversibil

[358,359,376].

n perioada anilor 70-80 ai secolului XX, principiile i concepiile de studiere a

reaciilor n lan au fost cu succes folosite pentru descrierea proceselor ion-radicalice

n lan reacii ce includ etapa de transfer al electronului [340].

156

Diversitatea proceselor n lan se descrie prin trei tipuri de legiti cinetice: 1) pro-

cese n lan neramificate; 2) ramificate; 3) procese ramificate degenerate cu ruperea

liniar, ptratic i crucial a lanului.

S-a stabilit c procesul de oxidare a hemoglobinei cu ioni nitrii este de tipul trei;

adic este un proces n lan i parcurge cu ramificarea degenerat a lanului, iar radica-

lul care prelungete lanul este NO2.

Una dintre particularitile principale ale reaciei dintre HbO2 i ioni nitrii este

caracterul ei autocatalitic: curba cinetic are forma S.

V.3.1. Metode experimentale de cercetare

Studiile experimentale au fost efectuate cu utilizarea masei eritrocitare de la donori sntoi, care a fost supus hemolizei timp de 18-20 ore, pentru distrugerea membranei eritrocitelor sub aciunea cloroformului. Concentraia hemoglobinei n hemolizat a fost de-terminat prin metoda spectrofotometric din curba de etalonare, unde ca soluii etalon s-au utilizat soluiile de albumin de bovin de diferite concentraii determinate la = 280 nm. Studiul legitilor cinetice ale reaciei s-a efectuat prin metoda spectrofotometric, utili-znd n acest scop spectrofotometrul SF-46 i cuve de cuar de 1 cm. Pentru meninerea constant a temperaturii s-a utilizat ultratermostatul U-10 i celula termostatat de sticl.

Determinarea concentraiei HbO2 s-a efectuat n baza maximului de absorbie la max= 540 nm i al MetHb la max= 630 nm. A fost calculat gradul de transformare () dup consumul HbO2 utiliznd relaia = D0 D / D0 D i gradul de formare a MetHb dup relaia = D / D. n conformitate cu caracterul curbelor cinetice sub forma S, viteza reaciei a fost calculat ca derivata gradului de conversie la timp (d/d).

Coeficientul unghiurilor dependenei de (se calculeaz ca tangenta unghiului ) determin factorul de autoaccelerare ce caracterizeaz ramificarea lanurilor [360].

Lucrrile experimentale conin studii ale inhibiiei procesului de oxidare a HbO2 cu ioni nitrii. n acest scop au fost studiate sistemele: 1) HbO2 NO2

-; 2) HbO2

NO2- H2O2; 3) HbO2 NO2

- Inhibitor (Inh); 4) HbO2 NO2

- H2O2 Inhibitor.

Pentru evaluarea gradului de inhibiie cu diferii reductori, obinui din produse secundare vinicole, au fost studiate legitile cinetice de oxidare a HbO2 cu NO2

- n

funcie de diferii parametri: 1) concentraia nitritului; 2) concentraia substratului (HbO2); 3) pH-ul mediului de reacie. n continuare s-a determinat gradul de inhibiie n sistemele studiate n prezena i absena peroxidului de hidrogen.

V.3.2. Legitile cinetice n sistemele HbO2 NO2- i HbO2 NO2

- H2O2

Studiile cinetice de oxidare a HbO2 cu NO2- [362,364,365] au fost efectuate n ur-

mtoarele intervale de concentraii: [HbO2] = 510-5

mol/l; [NO2-] = 310

-4 - 110

-3 mol/l;

pH-ul mediului 7,2; t = 20C. Legitile cinetice obinute la oxidarea masei eritrocitare selectate confirm rezultatele primite anterior n literatur [360]. Curbele cinetice de acumulare a MetHb (Fig. V.1) n funcie de concentraia ionilor nitrii se caracterizea-z prin micorarea perioadei de inducie odat cu creterea concentraiei ionilor nitrii.

Legitile cinetice la variaia concentraiei NO2- se caracterizeaz prin caracterul

constant al curbelor cinetice, care pot fi transformate ntr-o singur curb numai prin schimbarea scrii pe axa timpului.

157

Coeficienii de transformare () pentru diferite [NO2-]0 sunt determinai de rapor-

turile concentraiilor reagenilor pentru curbele transformate (Tab. V.1). Din dependena lg i logaritmul raporturilor concentraiilor reagenilor curbei

standard i ai curbei transformate [lgCstand/Ctrans] la variaia concentraiei reagenilor, s-a stabilit [361]:

lg = n

s tan d

trans

lgC,

lgC

unde n este tangenta unghiului (tg) al dreptei corespunztoare. Pentru diferite [NO2-]0

s-a calculat tg, care este egal cu 2.

Fig. V.1. Curbele cinetice de acumulare a MetHb la diferite concentraii de nitrii:

pH 7,1, t = 38oC, = 630 nm, [HbO2] = 5x10

-5 mol/l.

Tabelul V.1

Transformarea curbelor cinetice de formare a MetHb ( = 630 nm) i determinarea

n funcie de [NO2-]0; pH 7,1, [HbO2]0 = 510

-5 mol/l

[NO2-]0 x 10

4,

mol/l max, s =

1

2

Cstand/Ctrans lg Cstand/Ctrans lg

10 300 1 - - -

8 900 3,0 1,25 0,097 0,48

5 1800 6,0 2,0 0,30 0,78

3 3300 11,0 3,33 0,52 1,04

n conformitate cu forma S a curbelor cinetice, viteza reaciei, exprimat ca deri-vata gradului de conversie n funcie de timp, la nceput crete pn la viteza maxim i apoi scade (Fig.V.2). S-a stabilit experimental c, cu creterea concentraiei NO2

-,

viteza maxim a reaciei crete. Astfel, la [NO2-]0 = 110

-3 mol/l, viteza maxim este de

0,128 la t = 6 min., iar pentru [NO2-]0 = 310

-4 mol/l, d/d = 0,09 la t = 58 min.

2[NO ] 5 10 4 mol / l

2[NO ] 1 10 4 mol / l

2[NO ] 3 10 4 mol / l

2

[NO ] 8 10 4 mol / l

158

Fig. V.2. Variaia vitezei reaciei (d/d) n funcie de timp n sistemul HbO2-NO2-, la variaia

concentraiei nitritului, soluie-tampon fosfatic, pH 7,2, t = 23C.

Acumularea MetHb, ca produs al reaciei de oxidare a HbO2, n perioada de acce-lerare are loc dup legitatea parabolic, despre care fapt indic dependena liniar de timp (). n literatura de specialitate [362] astfel de legitate a parcurgerii i dezvol-trii reaciei se observ la procesele n lan cu ntreruperea ptratic a lanului. Coefi-cientul unghiular al dependenei de (factorul de autoaccelerare = tg) crete cu mrirea concentraiei NO2

-.

Procesul de oxidare a HbO2 cu NO2- depinde de pH-ul mediului reactant (Fig. V.3).

Gradul de transformare () a HbO2 pentru diferite pH-uri (6,72; 6,90; 7,10; 7,61) variaz n funcie de pH. Cu ct pH-ul este mai mic, cu att max se atinge mai rapid (pentru pH 6,72 max se atinge la 5 min., iar pentru pH 7,69 la 80 min.) [370].

Fig. V.3. Dependena gradului de transformare () n funcie de timp n sistemul HbO2- NO2-,

la variaia pH-ului, soluie-tampon fosfatic, = 540 nm, [HbO2] = 5x10-5

mol/l,

[NO2-] = 5x10

-4 mol/l.

Conform schemei procesului de oxidare, reaciile (V.8), (V.11) includ participarea ionilor de hidrogen.

Cu ct [H+]0 va fi mai nalt, cu att mai mare va fi viteza reaciei (V.4), adic la

acidularea mediului reactant legtura ntre hemoglobin i O2 se slbete i, astfel, la ndeprtarea moleculei de O2 ionul nitrit mai uor se apropie de fierul hemic. n rezultat, are loc transferul mai rapid al electronului 3d al orbitalului donor al Fe(II) pe orbitalul acceptor al NO2

-. Iar n cazul creterii pH-ului are loc intensificarea legturii ntre ligand

i O2, ceea ce duce la micorarea vitezei reaciei (V.8) [370]. Principala particul ce oxideaz hemoglobina este radicalul NO2

, care n conti-

nuare conduce la prelungirea lanului (reaciile V.5, V.6).

2

[NO ] 5 10 4 mol / l

2[NO ] 1 10 4 mol / l

2

[NO ] 3 10 4 mol / l

2[NO ] 8 10 4 mol / l

t. min

159

Procesul de ramificare a lanului este determinat de formarea H2O2 (reacia V.11) n sistemul reactant, care, la rndul su, oxideaz MetHb la o stare supraoxidat (Hb(IV) = 0) (reacia V.12) la interaciunea cu NO2

-.

n studiile experimentale, la oxidarea HbO2 cu NO2-, au fost utilizate diferite con-

centraii de peroxid de hidrogen n intervalul 110-6

- 510-5 mol/l i s-au obinut curbele

cinetice de consum al HbO2 i de formare a MetHb pentru diferite concentraii de H2O2. Variaia vitezei procesului n timp este prezentat n Figura V.4. Concentraiile altor componeni din sistem au fost constante. Analiznd datele experimentale prezentate n Figura V.4, observm c variaia vitezei maxime d/d n timp scade cu micorarea [H2O2]0 [368,374].

Fig. V.4. Variaia vitezei reaciei (d/d) n funcie de timp n sistemul HbO2 NO2- H2O2,

la variaia concentraiei nitritului, soluiei-tampon fosfatice, pH 7,1, t = 37C,

= 540 nm, [HbO2] = 5x10-5

mol/l, [NO2-] = 5x10

-4 mol/l.

Dac comparm datele experimentale de acumulare a MetHb obinute n sistemul HbO2 NO2

- (Fig. V.1) cu sistemul HbO2 NO2

- H2O2 (Fig. V.5), observm c pentru

[NO2-]0 = 510

-4 mol/l timpul 1/2 este aproximativ de 30 min., iar pentru aceleai con-

diii, n prezen de H2O2, 1/2 se micoreaz cu creterea [H2O2]0 de la 25 min. pn la 6 min.

d

/d

0

0.05

0.1

0.15

0 10 20 30 40 50 60

t, min [H2O2]=1*10^-4 mol/l [H202]=5*10^-5 mol/l

[H2O2]=1*10^-5 mol/l [H2O2]=5*10^-6 mol/l

2 2[N O ] 1 10 4 mol / l

2 2[N O ] 5 10 6 mol / l

2 2[N O ] 5 10 5 mol / l

2 2[N O ] 1 10 5 mol / l

160

Fig. V.5. Curbele cinetice de acumulare a MetHb n sistemul HbO2 NO2-

H2O2, soluia-

tampon fosfatic, pH 7,1, t = 37C, = 630 nm, [HbO2] = 5x10-5

mol/l, [NO2-] = 5x10

-4 mol/l.

n prezena H2O2 are loc micorarea perioadei de inducie. La creterea [H2O2]0, factorul de autoaccelerare a procesului de oxidare a HbO2 cu NO2

- crete [368,370,374].

V.3.3. Cinetica procesului de oxidare a HbO2 cu NO2- n prezena inhibitorilor

n rezultatul reaciei de oxidare a HbO2 cu NO2- se formeaz ion-radicalul super-

oxid O2 i NO2

. Aceti radicali se formeaz n rezultatul urmtoarelor reacii:

Hb(O2)4 + NO2- [Hb(O2)4]

+ NO2

(V.31)

[Hb(O2)4] O2

+ Hb(O2)3 .a.m.d. (V.32)

Pentru a micora viteza procesului de oxidare a HbO2 cu NO2- este necesar de a

nltura particulele radicalice NO2 i O2

(HbO2

). n acest scop au fost utilizai diferii

inhibitori [364,366,368].

V.3.3.1. Utilizarea acidului ascorbic n inhibiia procesului de oxidare a HbO2 Introducerea acestui inhibitor n reacia de oxidare a HbO2 cu NO2

- n cantitate de

2-10% din [HbO2]0 duce la creterea perioadei de inducie (Fig. V.6.) odat cu creterea concentraiei lui (C

1AAs = 0, C

2AAs = 210

-6 mol/l, C

3AAs = 310

-6 mol/l, C

4AAs = 410

-6 mol/l,

C5AAs = 510

-6 mol/l). Oxidarea HbO2 s-a efectuat n soluie-tampon fosfatic (pH 7,2),

[NO2-]0 = 510

-4 mol/l, [HbO2]0= 510

-5 hem/l.

Fig. V.6. Curbele cinetice de acumulare a MetHb n sistemul HbO2 NO2- AAs,

la variaia concentraiei [AAs], soluie-tampon fosfatic t = 24C, = 630 nm,

[HbO2] = 5x10-5

mol/l, [NO2-] = 5x10

-4 mol/l.

La compararea concentraiei MetHb formate n sistem la diferite concentraii de [AAs], s-a constatat c valoarea maxim a [MetHb] pentru C

1AAs apare la 30 min., iar

cu creterea [AAs]0 timpul de stabilire maxim a [MetHb] crete aproape de trei ori pentru C

5AAs. Creterea concentraiei AAs n sistem duce la micorarea neesenial a

factorului de autoaccelerare de la 2,510-4

s-1

pentru [AAs]0 = 210-6

mol/l pn la 1,910

-4 s

-1 pentru [AAs]0 = 410

-6 mol/l (Fig. V.7), care s-a calculat din dependena

n f() ca tg la diferite [AAs].

Fig.7 Dependena factorului de autoaccelerare de [AAs] i [DFH3Na] la

oxidarea HbO2 cu NO2-: pH 7,1, [NO2-}= 5*10^-4 mol/l

0

1

2

3

4

5

6

7

1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5

[red]*10^6, mol/l

f*10

^4,s

^-1

[Aas] [DFH3Na]

([DFH3Na]) ([Aas])

161

Fig. V.7. Dependena factorului de autoaccelerare de [AAs] i [DFH3Na]

la oxidarea HbO2 cu NO2-, pH 7,1, [NO2

-] = 5x10

-4 mol/l.

n condiiile de realizare a reaciilor (V.31), (V.32) a fost stabilit o dependen

neesenial a poziiei maximului vitezei de oxidare a HbO2 (d/d) n funcie de pentru

diferite concentraii de AAs, ndreptat spre creterea gradului de conversie . O depla-

sare asemntoare are loc la micorarea concentraiei H2O2 n sistemul HbO2 NO2-

[346]. Reieind din cele expuse i n baza datelor din literatur [20] putem constata c

n sistemul HbO2 NO2- AAs odat cu creterea concentraiei inhibitorului are loc

diminuarea concentraiei H2O2. Acidul ascorbic influeneaz asupra perioadei de ini-

iere, i anume: capteaz radicalii O2 (HO2

), care se formeaz conform reaciei (V.8).

Reacia (V.10) va parcurge cu o vitez mai mic, astfel concentraia H2O2 format

dup reacia (V.11) se va micora. Reieind din cele expuse, principalul oxidant al

HbO2 va fi radicalul NO2. n cazul creterii concentraiei AAs, comparabil cu con-

centraia HbO2, vom putea mri gradul de inhibiie.

Dac n sistemul HbO2 NO2- AAs se introduce H2O2 de concentraia 510

-5 mol/l,

n acest caz se observ o intensificare a procesului de oxidare a HbO2 i de stabilire a

concentraiei maxime de MetHb i tmax se micoreaz de la 50 min. la 10 min. n absena

i n prezena H2O2 (510-5

mol/l), corespunztor. Astfel, constatm c AAs poate inhiba

procesul la stadia de iniiere, micornd concentraia radicalilor formai.

n literatura de specialitate se propune utilizarea AAs pentru tratarea methemo-

globinemiei. ns, o serie de publicaii tiinifice contrazic aceast constatare [356].

Conform rezultatelor experimentale obinute, s-a constatat c MetHb format n sistem

nu interacioneaz cu AAs. Astfel, AAs poate fi utilizat pentru prentmpinarea formrii

MetHb, dar nu a reducerii ei.

V.3.3.2. Influena dihidroxifumaratului acid de sodiu asupra oxidrii HbO2 cu NO2-

Un alt inhibitor care a fost utilizat n sistemul HbO2NO2- este hidrogenodihidroxi-

fumaratul de sodiu (DFH3Na) [363,366,368]. Pentru a stabili gradul de inhibiie s-a

studiat cinetica procesului de consum al HbO2 (max = 540 nm) i de acumulare a MetHb

(max = 630 nm) [376]. Formarea MetHb n sistemul HbO2 NO2- n prezena DFH3Na

la t = 20C, pH 7,2 (soluie-tampon fosfatic), [HbO2]0 = 510-5

mol/l n funcie de di-

ferite concentraii de DFH3Na este prezentat n Figura V.8. Din datele experimentale

prezentate n aceast figur la variaia [DFH3Na]0 (3

1

DFH NaC 0; 32 6

DFH NaC 2 10 mol/l;

f*10^

4,s

^-1

162

3

3 6

DFH NaC 3 10 mol/l;

3

4 6

DFH NaC 4 10 mol/l;

3

5 6

DFH NaC 5 10 mol/l ) constatm c

concentraia maxim de MetHb se atinge dup t = 30 min. pentru 3

1

DFH NaC i crete

pn la t 60 min. pentru 3

5

DFH NaC .

La oxidarea HbO2 cu NO2- n prezena AAs viteza procesului dup punctul de

curbur n funcie de [AAs]0 variaz cu mult mai puin (Fig. V.6) n comparaie cu

oxidarea HbO2 cu NO2- n funcie de concentraia DFH3Na (Fig. V.8). Pentru AAs este

caracteristic influena asupra perioadei de inducie. n schimb, pentru sistemul cu

DFH3Na durata perioadei de inducie variaz cu mult mai puin n funcie de concen-

traia lui, dar mai mult se schimb viteza dup punctul de curbur a procesului auto-

catalitic (Fig. V.8) [366-370].

Fig. V.8. Curbele cinetice de formare MetHb n sistemul HbO2 NO2- DFH2Na2,

la variaia concentraiei DFH2Na2, soluie-tampon fosfatic, pH 7,2, t = 21C,

= 630 nm, [HbO2] = 5x10-5

mol/l, [NO2-] = 5x10

-4 mol/l.

Fig. V.9. Variaia vitezei reaciei (d/d) n funcie de timp n sistemul HbO2 NO2- DFH2Na2,

2 2[DFH Na ] 3 10 6 mol / l

2 2[DFH Na ] 4 10 6 mol / l

2 2[DFH Na ] 2 10 6 mol / l

2 2[DFH Na ] 5 10 6 mol / l

2 2[DFH Na ] 0 mol / l

2 2[DFH Na ] 4 10 6 mol / l

2 2[DFH Na ] 2 10 6 mol / l

2 2[DFH Na ] 5 10 6 mol / l

2 2[DFH Na ] 3 10 6 mol / l

163

la variaia concentraiei DFH2Na2, soluie-tampon fosfatic, pH 7,2, t = 21C,

= 540 nm, [HbO2] = 5x10-5

mol/l, [NO2-] = 5x10

-4 mol/l.

Variaia vitezei (d/d) n funcie de timp, calculat din datele experimentale ob-

inute la = 540 nm i la = 630 nm, depinde de [DFH3Na]0. Cu creterea [DFH3Na]0,

variaia maxim a vitezei (d/d) de formare a MetHb n f() scade. S-a stabilit c po-

ziia maximului curbei cinetice d/d se schimb nensemnat n funcie de i cores-

punde intervalului = (0,5-0,7) [370,376]. Deplasarea maximului d/d = f() n direcia mrimilor mai mari ale la con-

centraii mai mici ale DFH3Na este determinat de prezena n mediul de reacie a radicalilor NO2

n concentraie mai nalt, ce asigur un aport mai mare n etapa de

ramificare a procesului cu participarea acestui radical i atingerea mai rapid a vitezei maxime. n acelai context constatm c mrimea d/d depinde de [DFH3Na]0 i

crete odat cu micorarea [DFH3Na]0. La 3

5

DFH NaC obinem d/d maxim aproximativ

de dou ori mai mic dect la 3

2

DFH NaC [365,370,376].

Coeficientul unghiular al dependenei de (factorul de autoaccelerare = tg) se micoreaz cu creterea concentraiei inhibitorului (Fig. V.7). Deoarece n sistem are loc micorarea factorului de accelerare cu creterea [DFH3Na]0, putem presupune c concentraia catalizatorului, adic a H2O2, n procesul autocatalitic se micoreaz cu creterea concentraiei de DFH3Na. Astfel, constatm c acest inhibitor influeneaz asupra procesului de ramificare a lanului n oxidarea HbO2, micornd viteza procesu-lui de autoaccelerare n mediul reactant.

Introducerea n sistemul HbO2 NO2- DFH3Na a H2O2 duce la micorarea peri-

oadei de inducie de la 25 min. pn la 7 min. Dac comparm datele experimentale ale variaiei vitezei n sistemele HbO2 NO2

- DFH3Na (Fig. V.9) i HbO2 NO2

-

DFH3Na H2O2, constatm c variaia maxim a vitezei n sistemul fr H2O2 apare la = 25 min., pentru [DFH3Na] = 210

-6 mol/l, iar n prezena a [H2O2] = 510

-5 mol/l,

pentru aceleai concentraii ale reductorului la = 7 min. Peroxidul de hidrogen poate interaciona cu NO2

- (reacia V.14) i astfel se formeaz radicalul NO2

care con-

duce n continuare procesul. Dar, de rnd cu radicalul NO2

, se formeaz i radicalul HO

care n continuare

particip la propagarea reaciei i la mrirea concentraiei radicalului NO2 (ec. V.15).

n prezena inhibitorului, cu creterea concentraiei lui, viteza de oxidare a HbO2 se micoreaz. Variaia maxim a vitezei d/d = 0,18 pentru [DFH3Na] = 210

-6 mol/l

i se micoreaz pn la 0,06 la [DFH3Na] = 510-6

mol/l (Fig. V.9). Viteza procesului de formare a MetHb crete n prezena H2O2 datorit mririi concentraiei radicalului NO2

ce se formeaz adugtor la interaciunea H2O2 cu NO2

- i care este un agent de

oxidare a Fe2+

n Fe3+

din hem (ec. V.5). Mecanismul de aciune a inhibitorului se bazeaz pe interaciunea lui cu radicalul

OH ce se formeaz dup reacia (14) cu formarea de particule mai stabile [370,375].

Efectul de inhibiie va depinde de raportul constantelor de vitez k1/k2, unde k1 este constanta de vitez la interaciunea OH

- radicalilor cu inhibitorul, iar k2 constanta

de vitez a reaciei dintre OH i ionul nitrit (reacia V.15). n cazul n care k1/k2 >1,

164

putem obine efectul de inhibiie, adic viteza procesului ce duce la oxidarea Fe2+

n Fe

3+ este mai mic dect viteza de generare a particulelor radicalice oxidative, deoare-

ce aceste particule n continuare interacioneaz nu cu substratul, dar cu inhibitorul. Reieind din rezultatele prezentate n Figura V.8, constatm c DFH3Na poate in-

teraciona att cu radicalul OH, ct i cu radicalul HO2

, care se formeaz n perioada

de iniiere. Cu ct mai mare este concentraia inhibitorului, cu att mai mic este viteza de autoaccelerare, deoarece concentraia peroxidului de hidrogen, care joac rolul de catalizator n acest proces, se micoreaz, dat fiind c scade [HO2

]. La fel, viteza pro-

cesului de oxidare a HbO2 se micoreaz datorit micorrii [NO2] dup reacia (V.15).

n studiile experimentale s-a constatat la fel i efectul inhibitor al rezveratrolului asupra oxidrii HbO2. Cercetrile aciunii DFH3Na asupra oxidrii HbO2 cu NO2 s-au efectuat in vivo i la fel s-a constatat efectul de inhibiie n formarea MetHb.

Concluzii

Cercetrile procesului de oxidare a HbO2 cu ioni nitrii n prezena acidului ascor-bic, hidrogenodihidroxifumaratului de sodiu i rezveratrolului indic la faptul c

aceti inhibitori n domeniul de concentraie (110-6

- 510-6

) mol/l nu influeneaz

asupra caracterului curbelor cinetice i legitilor generale de parcurgere a pro-

cesului.

La introducerea acestor compui n sistem are loc inhibiia procesului de oxidare a HbO2 cu ioni nitrii, determinat dup variaia concentraiilor de HbO2 i MetHb.

Timpul de stabilire a gradului maxim de transformare a substratului crete de

trei ori odat cu mrirea concentraiei inhibitorilor n intervalul (110-6

-510-6

)

mol/l.

n cazul utilizrii acidului ascorbic n calitate de inhibitor n acest sistem are loc o inhibiie mai pronunat la etapa de iniiere. Astfel, constatm c AAs interacio-

neaz cu radicalul O2 (HO2

), care se formeaz la etapa de iniiere. Creterea con-

centraiei AAs n sistem duce la micorarea neesenial a factorului de autoacce-

lerare de la 2,510-4

s-1

pentru [AAs]0 = 210-6

mol/l pn la 1,610-4

pentru

[AAs]0 = 410-6

mol/l. Variaia nensemnat a n funcie de [AAs]0 confirm c

inhibitorul, micornd concentraia HO2 la etapa de iniiere, micoreaz n acelai

timp concentraia catalizatorului ce se formeaz (peroxidul de hidrogen) i, astfel,

nu obinem variaii mari ale vitezei n perioada a doua de propagare a lanului.

Hidrogenodihidroxifumaratul de sodiu influeneaz asupra vitezei din perioada ra-pid de oxidare a HbO2 cu ioni nitrii i, cu creterea [DFH3Na]0, are loc micorarea

vitezei dup punctul de curbur al procesului autocatalitic. Aceste rezultate indic

la participarea DFH3Na n captarea nu doar a radicalilor HO2 n perioada de ini-

iere, dar i a radicalilor OH care, la interaciunea cu NO2

-, formeaz radicalii

NO2; astfel, are loc diminuarea vitezei n perioada rapid.

Capitolul V. Formarea methemoglobinei sub aciunea ionilor nitrii la oxidarea oxihemoglobinei cu nitriiV.1. Mecanismele de oxidare a hemoglobinei cu ioni nitrii i alte xenobioticeV.1.1. Procese de oxidare a oxihemoglobinei cu ioni nitriiV.1.2. Participarea altor xenobiotice n oxidarea hemoglobinei

V.2. Metode de inhibiie n procesul de oxidare a HbO2 cu ioni nitriiV.2.1. Descompunerea peroxidului de hidrogenV.2.2. Dezactivarea radicalilor activi ai oxigenuluiV.2.3. Captarea radicalilor NO2(V.2.4. Reducerea methemoglobinei

V.3. Noi metode de inhibiie n procesul de oxidare a hemoglobinei cu nitriiV.3.1. Metode experimentale de cercetareV.3.2. Legitile cinetice n sistemele HbO2 NO2- i HbO2 NO2- H2O2V.3.3. Cinetica procesului de oxidare a HbO2 cu NO2- n prezena inhibitorilorConcluzii