callus from tuberosam

8/7/2019 callus from tuberosam

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P l a n t P h y s i o l . ( 1 9 8 1 ) 6 7 , 4784830 0 3 2 - 0 8 8 9 / 8 1 / 6 7 / 0 4 7 8 / 0 6 / $ 0 0 . 5 0 / 0

P l a s m a M e m b r a n e A l t e r a t i o n s i n C a l l u s T i s s u e s o f T u b e r - b e a r i n gS o l a n u m S p e c i e s d u r i n g C o l d A c c l i m a t i o n '

R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n F e b r u a r y 4 , 1 9 8 0 a n d i n r e v i s e d f o r m O c t o b e r 2 7 , 1 9 8 0MARIA A . T O I V I O - K I N N U C A N , HWEI-HWANG C H E N , P A U L H . L I 2 , AND C E C I L S T U S H N O F FL a b o r a t o r y o f P l a n t H a r d i n e s s , D e p a r t m e n t o f H o r t i c u l t u r a l S c i e n c e a n d L a n d s c a p e A r c h i t e c t u r e , U n i v e r s i t y o fM i n n e s o t a , S t . P a u l , M i n n e s o t a 5 5 1 0 8

ABSTRACTP l a s m a m e m b r a n e a l t e r a t i o n I n t w o t u b e r - b e a r i n g p o t a t o s p e c i e s d u r i n g

a 2 0 - d a y c o l d a c c l i m a t i o n p e r i o d w e r e i n v e s t i g a t e d . L e a f - c a l l u t s s u e s o ft h e f r o s t - r e s i s t a n t S o e a u m a c a u l e H a w k e s ' O k a 3 8 7 8 a n d t h e f r o s t -s u s c e p t i b l e , comly g r o w n SOa_w t u b e r o m ' R e d P o n t i a c , ' w e r e u s e d .T h e f o r m e r i s a s p e c i e s t h a t c a n b e h a r d e n e d a f t e r s u b j e c t i n g t o t h e l o wt e m p e r a t u r e , a n d t h e l a t t e r d o e s n o t h a r d e n . S a m p l e s f o r t h e e l e c t r o nm i c r o s c o p y w e r e p r e p a r e d f r o m c a l l u s c u l t u r e s a f t e r h a r d e n i n a t 2 C I nt h e d a r k f o r 0 , 5 , 1 0 , 1 5 , a n d 2 0 d a y s . A f t e r 2 0 d a y s a c c l i m a t i o n , S . a c i a li n c r e s s e d i n f r o s t h a r d i n e s s f r o m -6 t o - 9 C ( k i l l i n g t e m p e r a t u r e ) ,w h e r e a s f r o s t h a r d i n e s s o f S . t u b e m s u n r e m a i n e d u n c h a n g e d ( k i l l e d a t -3C ) . A c t u a l l y , a f t e r 1 5 d a y s a c c l i m a t i o n , a -9 C f r o s t h a r d i n e s s l e v e l I n S .a c a u d e c a l l u s c u l t u r e s h a d b e e n a c h i e v e d .

M e m b r a n e p r o t e i n p a r t i c l e a g g r e g a t i o n w a s m o n i t o r e d u s i n g f r e e z e -f r a c t u r e e l e c t r o n m i c r o s c o p y . P r o t e i n p a r t i c l e s w e r e a g e g a t e d I n S .a c a u k u p t o 1 0 d a y s a f t e r t h e i n i t i a t i o n o f a c c l i m a t i o n t r e a t m e n t a n d t h e nr e d i s t r i b u t e d a b n o s t t o t h e l e v e l o f c o n t r o l a f t e r 1 5 d a y s . No s u c h c h a n g e sw e r e o b s e r v e d f o r S . a a b e m s u m u n d e r s i m i l a r e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s . T h ec h a n g e i n p r o t e i n p a r t i c l e a g g r e g a t i o n p a t t e r n I n S . a c a d k I s i n t e r p r e t e d a sI n d i c a t i n g t h e p r e s e n c e o f an a d a p t i v e f l u d i t y c o n t r o l m e c h a n i s m I n t h a ts p e c i e s .

S t u d i e s i n o u r l a b o r a t o r y h a v e s h o w n t h a t t h e c o m m o n l y g r o w np o t a t o ( S o l a n u m t u b e r o s u m L . ) p o s s e s s e s n o f r o s t t o l e r a n c e ( 4 ) ,w h e r e a s a n u m b e r o f n o n c u l t i v a t e d s p e c i e s c a n s u r v i v e a t -4 C o rc o l d e r w i t h o u t f r o s t i n j u r y . S o m e o f t h e s e s p e c i e s , f o r e x a m p l e ,S o l a n u m a c a u l e H a w k e s a n d S o l a n u m c o m m e r s o n i i D u n . , c a n a l s ob e c o l d a c c l i m a t e d t o i n c r e a s e t h e i r f r o s t h a r d i n e s s u p t o -9 C o rt o - 1 2 C , r e s p e c t i v e l y ( 4 ) . A l s o , s i m i l a r i n c r e a s e s i n h a r d i n e s sc o u ld b e a c hi ev ed b o t h f o r p o t t e d a n d l e a f - c a l l u s c u l t u r e s ( 4 ) .C h e n e t a l . ( 4 ) s u g g e s t e d t h a t t h e c a l l u s , a h o m o g e n e o u s m a s s o fu n d i f f e r e n t i a t e d p a r e n c h y m a c e l l s , c o u l d s e r v e f o r c o l d a c c l i m a -t i o n s t u d i e s i n p l a c e o f i n t a c t p o t a t o p l a n t s . T h e s t a g e o f d i f f e r -e n t i a t i o n i s e a s i l y c o n t r o l l e d i n c a l l u s c u l t u r e s . T h e y t h u s p r o v i d ea d e s i r a b l e m a t e r i a l f o r t h e s t u d y o f f r o s t h a r d i n e s s a t c e l l u l a rl e v e l .S t u d i e s o f u l t r a s t r u c t u r a l a l t e r a t i o n s i n r e l a t i o n t o f r o s t h a r d i -n e s s i n p l a n t s a r e l i m i t e d ( 3 , 9 , 2 0 , 2 4 ) . T h e o b s e r v a t i o n s o fc h l o r o p l a s t s ( 2 6 ) a n d m i t o c h o n d r i a ( 3 ) d u r i n g c o l d a c c l i m a t i o nt r e a t m e n t s i n d i c a t e some s t r u c t u r a l a l t e r a t i o n s i n t h e s e o r g a n e l l e sw h i c h may r e l a t e t o p l a n t a d a p t a b i l i t y t o a g i v e n e n v i r o n m e n t .' S c i e n t i f i c J o u r n a l S e r i e s P a p e r 1 1 , 1 3 3 o f t h e M i n n e s o t a A g r i c u l t u r a lE x p e r i m e n t S t a t i o n . T h i s r e s e a r c h wa s s u p p o r t e d i n p a r t b y a r e s e a r c h

c o n t r a c t f r o m t h e I n t e r n a t i o n a l P o t a t o C e n t e r , L i m a , P e r u .' T o whom r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e d .

F r e e z i n g i n j u r y o f t e n a s s u m e s a s a r e s u l t o f r u p t u r e o r l o s s o fs em i p e rm ea bi l i t y o f c e l l m e m b r a n e s ( 1 3 , 2 7 ) . D u r i n g a c c l i m a t i o n ,p l a s m a m e m b r a n e a l t e r a t i o n s may o c c u r w h i c h a l l o w t h e c e l l s t os u r v i v e a t l o w e r t e m p e r a t u r e s .C o m p a r a t i v e s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t f r e e z e - f r a c t u r i n g e l e c t r o nm i c r o s c o p y c a n b e u s e d t o v i s u a l l y o b s e r v e t h e p h y s i c a l s t a t e o fm e m b r a n e s s u b j e c t e d t o p h a s e - t r a n s i t i o n t e m p e r a t u r e s ( 1 , 7 , 8 , 1 0 ,1 4 , 2 5 , 2 9 ) . I n t h e s e s t u d i e s , t h e membrane l i p i d p h a s e t r a n s i t i o nh a s b e e n s h o w n t o b e a c c o m p a n i e d b y a p r o g r e s s i v e a g g r e g a t i o no f t h e I M P 3 ( 7 , 1 5 , 1 6 ) . I n a c o m p l e x l i p i d m i x t u r e , s u c h a s i nb i o l o g i c a l m e m b r a n e s , t h e p r o t e i n p a r t i c l e s t e n d t o b e a s s o c i a t e do n l y w i t h t h e f l u i d p h a s e ( 1 2 ) . T h e p a r t i c l e - f r e e a r e a s i n t h e f r e e z e -f r a c t u r e r e p l i c a s r e p r e s e n t a r e a s o f m e m b r a n e l i p i d e x i s t i n g i n t h es o l i d s t a t e ( 1 0 , 1 6 ) . T h e r e f o r e , we u s e d f r e e z e - f r a c t u r e e l e c t r o nm i c r o s c o p y t h a t c o u ld p ro v i d e u s w i t h a d i r e c t v i s u a l p r o b e f o rd e t e c t i n g p l a s m a m e m b r a n e l i p i d p h a s e t r a n s i t i o n i n a n i n t a c t c e l ls y s t e m d u r i n g c o l d a c c l i m a t i o n .

M A T E R I A L S AND METHODSL e a f - c a l l u s c u l t u r e s f r o m t w o s p e c i e s o f t u b e r - b e a r i n g p o t a t o e sw e r e u s e d : ( a ) a n o n c u l t i v a t e d p o t a t o , S . a c a u l e H a w k e s ' O k a

3 8 7 8 ' t h a t i s f r o s t - h a r d y ( k i l l e d a t -6 C ) a n d c a n b e a c c l i m a t e d t o-9 C , a n d ( b ) t h e c o m m o n l y g r o w n p o t a t o , S . t u b e r o s u m L . ' R e dP o n t i a c ' t h a t i s f r o s t - s e n s i t i v e ( k i l l e d a t -3 C ) a n d d o e s n o ta c c l i m a t e t o c o l d ( 4 ) . T h e p ro c ed u re s o f l e a f - c a l l u s p r o d u c t i o nh a v e b e e n e s t a b l i s h e d e l s e w h e r e ( 4 ) .T h e c u l t u r e s w e r e g r o w n i n m e d i a f o r 8 t o 1 0 w e e k s a n d t h e ns u b j e c t e d t o a n a c c l i m a t i o n t r e a t m e n t . To c o m p a r e t h e i n f l u e n c eo f t i s s u e a g e t o t h e a c c l i m a t i o n r e s p o n s e , a s e c o n d g r o u p o f S .a c a u l e ' O k a 3 8 7 8 ' c u l t u r e s w e r e t r a n s f e r r e d t o t h e a c c l i m a t i o nt r e a t m e n t a t t h e a g e o f 4 w e e k s . To a c c l i m a t e t h e c a l l u s , f l a s k sc o n t a i n i n g c u l t u r e s w e r e k e p t a t 2 C i n t h e d a r k f o r 0 , 5 , 1 0 , 1 5 ,a n d 2 0 d a y s . F r o s t h a r d i n e s s o f a c c l i m a t e d c u l t u r e s a t t h e e n d o fe a c h i n t e r v a l t r e a t m e n t w a s d e t e r m i n e d ( 4 ) . S a m p l e s f r o m e a c hc u l t u r e w e r e p r e p a r e d f o r e l e c t r o n m i c r o s c o p y a t t h e same c h r o n -o l o g i c a l a g e .F r e e z e - f r a c t u r e E l e c t r o n M i c r o s c o p y . S m a l l s e g m e n t s o f t h ef r i a b l e c a l l u s w e r e f i x e d f o r 5 h i n 2 . 5 % v / v g l u t a r a l d e h y d e i n 0 . 1M N a - p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 6 . 8 ) a t 2 0 t o 2 2 C , w a s h e d w i t h t h r e ec h a n g e s o f b u f f e r , t r a n s f e r r e d t o t h e same b u f f e r c o n t a i n i n g 3 0 % ov / v g l y c e r o l , a n d i n c u b a t e d f o r a f u r t h e r 1 8 t o 2 0 h a t 5 C p r i o rt o f r e e z i n g . T h e g l y c e r o l c o n c e n t r a t i o n wa s s e l e c t e d b a s e d onp r e l i m i n a r y r e s u l t s s h o w i n g i c e - d a m a g e d c e l l s a n d c o n s i s t a n t l yp o o r r e p l i c a y i e l d s a t l o w e r g l y c e r o l c o n c e n t r a t i o n s . H o w e v e r , ac o n t r o l w i t h o u t g l y c e r o l t r e a t m e n t was c a r r i e d o u t , a l l o w i n g c r i t -i c a l e v a l u a t i o n o f t h e t r u e n a t u r e o f t h e p a r t i c l e a g g r e g a t i o n3 A b b r e v i a t i o n s : I M P , i n t r a m e m b r a n o u s p a r t i c l e ; P M , p l a s m a m e m -b r a n e ; T , t o n o p l a s t ; P F , p r o t o p l a s m i c f r a c t u r e f a c e ; E S , e x o p l a s m i c f r a c t u rf a c e .

4 7 8


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PLAS M A MEMBRANE ALTER ATIONS I N POTATO

3 | b | |__F I G . 1 . F r e e z e - f r a c t u r e d p l a s m a membranes o f S . acauk l e a f - c a l l u s

c e l l s s h o w i n g various d e g r e e s o f p a r t i c l e a g g r e g a t i o n on t h e PF d u r i n gc o l d - a c c l i m a t i o n t r e a t m e n t a t 2 C . Th e p h o t o g r a p h s show g r a d u a l l y i n-c r e a s i n g a g g r e g a t i o n an d p r o v i d e a s et of s t a n d a r d s w i t h a r b i t r a r i l y a s -s i g ne d a g g re g at i o n (AGG) v a l u e s o f 0 , 2 , 4 , 6 , an d 8 . The e x p e r i m e n t a lt r e a t m e n t s o f t h e S . a c a u l e c u l t u r e s u s e d were: 5 - d a y a c c l i m a t i o n ( a t 2 C )a t t h e ag e o f 4 w e e k s ( A an d B ) ; 5 - d a y a c c l i m a t i o n a t t h e a g e o f 8 weeks( C a n d D ) ; 1 0 - d a y a c c l i m a t i o n a t t h e ag e o f 8 weeks ( E ) . I n a l l m i c r o g r a p h s ,b a r r e p r e s e n t s 0 . 2 pm . CE : c e l l w a l l .p a t t e r n s i n t h e f r ac t u re d s p e c i m e n s .The s a m p l e s w e r e f r o z e n o n t o g o l d s p e c i m e n mounts b y i m -m e r s i o n i n l i q u i d n i t r o g e n - c o o l e d F r e o n 2 2 ( - 1 5 6 C ) a n d t h e nq u i c k l y p l u n g e d i n t o l i q u i d n i t r o g e n ( - 1 9 6 C ) . F r o z e n s p e c i m e n sw e r e s t o r e d i n a l i q u i d - n i t r o g e n c r y o s t a t . F r a c t u r i n g was d o n ew i t h i n a 2 - m o n t h p e r i o d f r o m i n i t i a l f r e e z i n g u s i n g a B a l z e r s 3 6 9M u n i t a t -105 C an d a t 2 x 1 0 - t o f f . A f t e r minimum e t c h i n g ,p l a t i n u m / c a r b o n s h a d o w i n g a n d r e p l i c a t i n g m a t e r i a l s w e r e evap-o r a t e d on t h e f r a c t u r e s u r f a c e s . The t h i c k n e s s o f p l a t i n u m s h a d o w -i n g was m o n i t o r e d t o 1 t o 2 amu s i n g a q u a r t z c r y s t a l QS G 2 0 1 .R e p l i c a s w e r e c l e a n e d u s i n g 2% w/ v C e l l u l y s i n ( l o t 8 0 0 5 9 1 , Bg r a d e ; C a l b i o c h e m ) ( 1 - 2 d a y s ) , f o l l o w e d b y H N O 3 ( 7 0 % o v / v ) ( 3 -4 d a y s ) , an d 2 . 5 % v / v NaOCl ( d i l u t e d c o m m e r c i a l b le a c h " C l o -r o x " ) ( 1 h ) , w i t h a t h o r o u g h wash i n g l a s s - d i s t i l l e d H20 a f t e r e a c ht r e a t m e n t . R e p l i c a s w e r e p i c k e d up w i t h 3 0 0 - m e s h copper s p e c i -men support g r i d s an d e x a m i n e d w i t h a P h i l i p s 3 0 0 t r a n s m i s s i o ne l e c t r o n m i c r o s c o p e . The memb ra ne f r a c t u r e f a c e n o m e n c l a t u r e

F I G . 2 . F r e e z e - f r a c t u r e d c e l l s o f S . a c a u l e ( A ) a n d S . t u b e r o s u m ( B )g r o w n a t 2 7 C c o n s t a n t t e m p e r a t u r e i n t h e d a r k f o r 8 w e e k s ( c o n t r o l s ) .C e l l s w e r e f i x e d w i t h 2 . 5 % g l u t a r a l d e h y d e a t 2 0 t o 2 2 C f o r 5 h a n di n c u b a t e d i n 3 0 % g l y c e r o l a t 5 C f o r o v e r n i g h t b e f o r e f r e e z i n g a n df r a c t u r i n g . N e i t h e r PM n o r T e x h i b i t s a n y p a r t i c l e a g g r e g a t i o n o n e i t h e rt h e PF o r t h e E F . CW , c e l l w a l l . D i r e c t i o n o f p l a t i n u m s h a d o w i n g i si n d i c a t e d ( T ) . B a r e q u a l s 0 . 5 p m .i s t h a t o f B r a nt o n e t a l . ( 2 ) .

Membrane P a r t i c l e D i s t r i b u t i o n . Membrane p a r t i c l e d i s t r i b u -t i o n w a s d e t e r m i n e d u s i n g t e c h n i q u e s d e s c r i b e d b y J a m es a n dB r a n t o n ( 1 0 ) . I n t h e f i r s t m e t h o d , e l e c t r o n m i c r o g r a p h s w e r ec o m p a r e d t o a p r e d e t e r m i n e d s e t o f s t a n d a r d p i c t u r e s s h o w i n gv a r i o u s d e g r e e s o f p a r t i c l e a g g r e g a t i o n o n t h e PF ( F i g . 1 ) . T h es c a l e o f 0 t o 8 w a s u s e d t o d e s c r i b e t h e d e g r e e o f a g g r e g a t i o n , s ot h a t a l o w mean v a l u e w o u l d i n d i c a t e l i t t l e a g g r e g a t i o n a n d a h i g hv a l u e w o u l d i n d i c a t e g r e a t a g g r e g a t i o n . T h e s e c o n d m e t h o d i n -v o l v e d t h e a n a l y s i s o f p a r t i c l e d i s t r i b u t i o n o n p r i n t s ( t o t a l m a g -n i f i c a t i o n , x 6 7 , 0 0 0 ) w h i c h w e r e o v e r l a i d w i t h a g r i d o f 1 - c ms q u a r e s . P a r t i c l e s i n 2 5 a d j a c e n t 1 - c m s q u a r e s w e r e c o u n t e d f o re a c h m e m b r a n e . C o u n t s w e r e n o r m a l i z e d a s p e r c e n t o f t o t a lc o u n t f o r e a c h m e m b r a n e t o e l i m i n a t e t h e e f f e c t o f v a r i a t i o nb e t w e e n t o t a l p a r t i c l e c o u n t s i n d i f f e r e n t m e m b r a n e s . T h e c o u n t sa re p r e s e n t e d b y p l o t t i n g t h e n u m b e r o f a r e a s w i t h v a r y i n g p a r t i c l ed e n s i t y ( t h e mean d e n s i t y f o r e a c h m e m b r a n e i s 4 % = 1 0 0 % od i v i d e d b y t h e n u m b e r o f c o u n t s p er m e m b r a n e , 2 5 ) f o r e a c ht r e a t m e n t . E a c h t r e a t m e n t w a s e v a l u a t e d b y t h e s e t w o t e c h n i q u e su s i n g 5 t o 1 0 m e m b r a n e p h o t o g r a p h s t a k e n f r o m d i f f e r e n t c e l l s .S t a t i s t i c a l a n a l y s i s c o n f i r m e d t h a t b o t h m e t h o d s g a v e s i m i l a rr e s u l t s . C o u n t s w e r e made o n l y i n r e g i o n s w h e r e n o membraned i s t o r t i o n s w e r e e v i d e n t .

R ESULTST h e l e a f c a l l u s p r o d u c e d f r o m S . t u b e r o s u m s h o w e d n o i n c r e a s ei n f r o s t h a r d i n e s s i n r e s p o n s e t o l o w t e m p e r a t u r e . The f r o s t - k i l l i n gt e m p e r a t u r e o f ' R ed P o n t i a c ' c a l l u s e s w a s -3 C , s i m i l a r t o t h a t o fp o t t e d g r o w n p l a n t l e a v e s ( 4 ) . T h e l e a f c a l l u s o f S . a c a u l e c a n b e

P l a n t P h y s i o l . V o l . 6 7 , 1 9 8 1 4 7 9


3/6

TOIVIO-KINNUCAN ET A L . P l a n t P h y s i o l . V o l . 6 7 , 1 9 8 1T a b l e L . D e n s i t y o f P r o t e i n P a r t i c l e s S D o n F r a c t u r e F a c e s a n d Mean A g g r e g a t i o n V a l u e s ( A G G ) f o r P l a s m aM e m b r a n e s o f S . a c a u l e a n d S . t u b e r o s u m L e a f - c a l l u s C u l t u r e C e l l s w i t h V a r i o u s C o l d T r e a t m e n t P e r i o d s ( a t 2 C )

K i l l i n g P l a s m a M e m b r a n eS p e c i e s T i m e T e m - PF EFa t 2 C p e r a -____________ _______ _____t u r e D e n s i t y AGG D e n s i t y AGG

d a y s C p a r t i c l e s ! l I m 2 p a r t i c l e k s m 2S . a c a u l e 0 -6 2 8 9 9 6 8 3 1 . 2 1 . 1 4 7 3 1 5 4 1 . 6 1 . 55 -7 2 7 2 7 6 3 3 4 . 6 2 . 2 370 1 7 8 1 . 5 1 . 31 0 -8 1 7 4 2 2 3 0 6 . 4 1 . 5 4 3 8 2 5 7 5 . 3 2 . 21 5 -9 2 1 5 3 290 2 . 5 1 . 8 530401 1 . 0 1 . 22 0 -9 1 6 8 2 3 6 3 2 . 7 1 . 0 2 3 4 7 2 0 . 6 1 . 1S . t u b e r o s u m 0 - 3 2 2 9 2 6 1 8 0 . 4 0 . 5 2 3 8 1 1 7 0 05 -3 3435485 0 . 5 0 . 5 4 1 9 4 7 0 01 0 -3 1 7 3 5 9 4 3 0 . 8 1 . 0 4 4 5 1 5 9 0 . 4 0 . 51 5 -3 2 6 0 1 4 3 5 0 . 5 0 . 5 4 0 0 2 3 0 0 . 1 0 . 42 0 -3 1 7 2 9 1 3 2 0 . 4 0 . 5 2 6 0 9 4 00

. ? M , - ,- ,W 100 5 DAYS Mean A g g . V o l u e s 4 . 6N = 1 2 5 080

6040 0z_ 2040 1 0 D A Y S M e a n A g g . V o l u e 6 4 _N =12520

15 DAYS Mean A g g . V a l u e * 2 . 51 0 0 2 3 250Cl ) 60

cr 40-w20-

60-20DAYS Mean A g g . V a l u e 2.7N =15040-

20

F A R I C L E D E N S I T Y [PERCENT SQUARE C O U N T ( l c m 2 )OF THE TOTAL MEMBRANE C O U N T ( 2 5 c m 2 ) ]

F I G . 3 . P a r t i c l e d i s t r i b u t i o n on t h e PF o f f r e e z e - f r a c t u r e d membranesf r o m S . acaule l e a f - c a l l u s c e l l s a c c l i m a t e d a t 2 C f o r 0 , 5 , 1 0 , 1 5 , or 2 0d a y s . Th e h i s t o g r a m shows t h e n u m b e r of m e m b r a n e areas ( I cm 2 p h o -t o g r a p h = 2 . 2 3 X 1 0 - 2 A m 2 m e m b r a n e ) o f p a r t i c u l a r d e n s i t y ( 4 % m e d i a n )f o u n d a t d i f f e r e n t s t a g e s o f a c c l i m a t i o n . The c o r r e s p o n d i n g v i s u a l a g g r e -g a t i o n v a l u e an d t h e t o t a l n u m b e r o f 1 - c m s q u a r e s c o u n t e d ( N ) f o r eacha c c l i m a t i o n p e r i o d i s i n d i c a t e d i n t h e h i s t o g r a m s .h a r d e n e d t o -9 C a f t e r 1 5 d a y s a t 2 C , a t 3 C i n c r e a s e i n f r o s th a r d i n e s s . A g a i n , t h e s e r e s u l t s a g r e e w i t h o b s e r v a t i o n s o f p o t t e dp l a n t s ( 4 ) .T h r o u g h o u t t h e e x p e r i m e n t , mean p a r t i c l e c o u n t s on t h e mem-

FIG. 4. Fracture faces of pla s m a membranes after 5 d a y s of colacclimation at 2 C. The PF of S. acaule ( 8 - w e e k - o l d cultures) pla s m amembrane (A) showed h i g h ag g re g ation of protein p a r t i c l e s . Similaag g re g ation is not evident in the PF of the S. t u b e r o s u m (B ) pla s mmembrane (also 8-week-old cultures). Bar equals 0.5 t t m .brane EFweresigiiatydifferent (P=0 . 0 0 1 ) from thoseobserved onmembrane PF whether the callus tissues of bothspecies weregrown at 2 or27 C( F i g . 2 ) . Onthe average, EFhadabout one-fifth of the particles observed onPF. Ov e r-all, the twospecies had similar trends in their to ta l p a r t i c l e counts d u r i n g thacclimation treatment. After 20 d ay s at 2 C, both species showeds i g n i f i c a n t l y (P=0. 01) reduced ( 1 7 % ) p a r t i c l e counts. However,after 5 d a y s a ccl i m a t i o n , S. tuberosum showed a s i g n i f i c a n t (P=0. 05) i n i t i al increase in the total protein p a r t i c l e count (T a b l e I ) .The main objective of the p a r t i c l e cou n t i n g wasto determine

the time courseof particle a gg rega t io n after the beginigofacclimation treatment. The h isto g ra ms ( F i g . 3) show thatmem-branes ofS. acaule callus cultures treated at 2Cfor 5 d a y s orl e s sor15 d a y s ormore,hadmostoftheir particles in themeandensityclass ( 4 1 % ) . However, as early as 5 d a y s after tran sf er r in g to 2 C,the particles hadbegun to aggregate ( F i g . 4 ) . This is shownin thh isto g ra ms ( F i g . 3 ) by a decrease in the median peak and thappearance of someareas where the particle density wasl e s s og r e a t e r than observed in the control. Maximuma gg rega t io n occurred at the 1 0 - d a y acclimation pe r i od for S. a c a u l e ( 1 0 - w e e k -old callus), after which the particles started r edistr ib utin g aroundthe mean4%value. Maximumhardiness could be achieved iabout 15 d a y s in S. acauke by acclimating at 2C( 4 ) .Whenthe standard picture scalewasused to analyze the p r i n t s

similar results wereobtained ( T a b l e I ) . The simple correlatio

4 8 0


4/6

PLAS M A MEMBRANE A L T E R A T I O N S IN POTATO

C L iJ

w0 .( I )- J

4a .zf r -0a.

I JJ4- i

z0I -4 J

L I )4 1

0 5 1 0 0 5 1 0 1 5 2 0DAYS AT 2 C

F I G . 5 . E f f e c t o f a c c l i m a t i o n a t 2 C on t h e number ( b a r g r a p h ) a n da g g r e g a t i o n ( l i n e g r a p h ) o f I M P on mem b ra n e PF o f S . a c a u l e l e a f - c a l l u st i s s u e s a t t h e ag e o f 4 an d 1 0 w e e k s .

I 2 0 CwI - -4 t

w

- T h ; 1 0 d

-Th;15d- Tq- T I ; 1 0 d

-T I ; 1 5 d

F I G . 6 . S c h e m a t i c p r e s e n t a t i o n o f t h e i n fl u en ce on membrane p h a s e -t r a n s i t i o n b e h a v i o r o f a s h i f t t o l o w e r t e m p e r a t u r e s i n S . a c a u l e membranem e l t i n g c u r v e a f t e r 1 5 d a y s o f a c c l i m a t i o n , as i n d i c a t e d b y i n t r a m e m b r a n -ous p r o t e i n p a r t i c l e a g g r e g a t i o n p a t t e r n s . Th e h i g h e n d o f m e l t i n g r a n g e( T h ) a n d t h e l o w e n d o f t h e m e l t i n g ran ge ( T , ) i n d i c a t e t h e h y p o t h et i c a lh i g h a n d l o w e nd s o f t h e m e l t i n g r a n g e f o r m e l t i n g cur ves a f t e r 1 0 a n d 1 5d a y s o f a c c l i m a t i o n . Th e q u e n c h i n g t e m p e r a t u r e ( T q ) i s c o n s t a n t 2 C .c o e f f i c i e n t ( r ) f o r t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n o f t h e n o r m a l i z e d p a r t i c l ec o u n t s on PF a n d t h e v i s u a l a g g re g a t i o n v a l u e f o r t h e samemembrane f a c e was 0 . 8 5 . H o w e v e r , t h e g r i d - c o u n t i n g method

F I G . 7 . P l a s m a m e m b r a n e ( P M ) PF o f S . a c a u l e c a l l u s t i s s u e a f t e r 5d a y s a c c l i m a t i o n a t 2 C . N o t e t h e l i n e a r s t r u c t u r e s on t h e m e m b r a n ef r a c t u r e f a c e . C , c y t o p l a s m a . B a r e q u a l s 0 . 5 , u m .u s i n g a 1 - c m s q u a r e u n i t d i d n o t d e s c r i b e a c c u r a t e l y t h e p a r t i c l ea g g r e g a t i o n o n m e m b r a n e EF d u e t o t h e l o w t o t a l p a r t i c l e c o u n t so n t h a t m e m b r a n e f a c e ( r = 0 . 5 9 ) . T h u s , t h e v i s u a l a g g r e g a t i o nv a l u e b e t t e r d e s c r i b e d t h e a g g r e g a t i o n s i t u a t i o n on m e m b r a n e E F .T h e m a j o r d i s c o v e r y o f o u r e x p e r i m e n t wa s t h e s u d d e n d r o p i nt h e a g g r e g a t i o n v a l u e o f S . a c a u l e m e m b r a n e s a f t e r 1 0 d a y sa c c l i m a t i o n . I M P t h r o u g h o u t t h e e n t i r e e x p e r i m e n t s h o w e d v e r yl i t t l e o r n o a g g r e g a t i o n o n t h e m e m b r a n e f a c e s o f S . t u b e r o s u m( T a b l e I ) .T h e f i r s t 1 0 d a y s a c c l i m a t i o n w e r e r e p e a t e d f o r S . a c a u l ec u l t u r e s a t t h e a g e o f 4 w e e k s . T h e t w o a g e g ro u p s r e s p o n d e dd i f f e r e n t l y u n d e r s i m i l a r a c c l i m a t i o n c o n d i t i o n s . A l t h o u g h t h ey o u n g e r c u l t u r e s h a d a n a v e r a g e o f 2 , 6 3 6 I M P / t i m 2 , t h e o l d e rc u l t u r e s s h o w e d 2 , 8 3 2 p a r t i c l e s ( 7 % m o r e ) ( F i g . 5 ) . B o t h a g eg r o u p s s h o w e d a d e c r e a s i n g t r e n d i n t o t a l p r o t e i n p a r t i c l e c o u n t sd u r i n g a c c l i m a t i o n . H o w e v e r , i n t h e y o u n g e r c u l t u r e s , t h e I MPa g g r e g a t i o n p e a k o c c u r r e d a t a n e a r l i e r s t a g e o f a c c l i m a t i o n t h a ni n t h e o l d e r c u l t u r e s . Maximum a g g r e g a t i o n w a s a c h i e v e d i n t h e4 - w e e k - o l d c a l l u s c u l t u r e s a f t e r 5 d a y s a c c l i m a t i o n , w h e r e a s t h e1 0 - w e e k - o l d c u l t u r e s s h o w e d more p r o n o u n c e d a g g r e g a t i o n p e a ka f t e r 1 0 d a y s c o l d a c c l i m a t i o n . B o t h m e m b r a n e s s h o w e d l e s sp a r t i c l e a g g r e g a t i o n b e y o n d t h e p e a k , i m p l y i n g t h a t m e m b r a n ef l u i d i t y w a s r e g a i n e d i n b o t h c u l t u r e t y p e s .

DISCUSSIONT h e a g g r e g a t i o n o f I MP a s t h e m e m b r a n e i s c o o l e d t o w a r d s i t sp h a s e t r a n s i t i o n t e m p e r a t u r e i s w e l l d o c u m e n t e d f o r s e v e r a l o r -g a n i s m s ( 1 , 7 , 1 0 ) . H o w e v e r , n o v i s u a l o b s e r v a t i o n s o f p a r t i c l ea g g r e g a t i o n e x i s t d u r i n g a c c l i m a t i o n t r e a t m e n t i n p l a n t s . E v i d e n c ef r o m e l e c t r o n s p i n r e s o n a n c e ( 2 8 ) a n d f l u o r e s c e n t p r o b e ( 2 1 )s t u d i e s i n d i c a t e s t h a t c o o l c l i m a t e h e r b a c e o u s p l a n t s may h a v et e m p e r a t u r e - d e p e n d e n t m e c h a n i s m s w h i c h a l l o w a l t e r a t i o n o f t h e

t e m p e r a t u r e a t w h i c h membrane s o l i d i f i c a t i o n b e g i n s . T h i s mayb e a c h i e v e d e i t h e r b y a c c u m u l a t i n g p o l y u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d sw i t h l o we r p h a s e t r a n s i t i o n t e m p e r a t u r e s ( 7 ) a n d / o r b y i n c r e a s i n gt h e p l a n t s t e r o l c o n t e n t t h a t h a s a n o r d e r i n g i n f l u e n c e o n t h ep h a s e p r o p e r t i e s o f p h o s p h o l i p i d b i l a y e r s ( 1 7 ) .T h e d r a s t i c d r o p i n t h e a g g re g a t i o n v a l u e o f S . a c a u l e mem-b r a n e s t h a t w a s o b s e r v e d a f t e r 1 5 d a y s a c c l i m a t i o n c o u l d p o s s i b l yb e e x p l a i n e d b y a d e c r e a s e i n p h a s e t r a n s i t i o n t e m p e r a t u r e o ft h o s e m e m b r a n e s . F i g u r e 6 i s a d i a g r a m m a t i c p r e s e n t a t i o n o fh y p o t h e t i c a l m e l t i n g c u r v e s f o r t h e membrane l i p i d s f r o m 1 0 - a n d1 5 - d a y - a c c l i m a t e d S . a c a u l e c a l l u s . T h e h i g h a n d l o w e n d s o f t h em e l t i n g r a n g e f o r e a c h c u r v e a r e i n d i c a t e d b y t e m p e r a t u r e s T h a n dT i . T h e q u e n c h i n g t e m p e r a t u r e ( T ) w a s t h e a c c l i m a t i o n t e m p e r -a t u r e ( 2 C ) i n o u r e x p e ri m e nt a n d i t w a s k e p t c o n s t a n t t h r o u g h o u tt h e s t u d y . B e c a u s e t h e p h a s e t r a n s i t i o n o c c u rs o v e r a r a n g e i nt e m p e r a t u r e , q u e n c h i n g t h e 1 0 - d ay a c c li m at ed t i s s u e s f r o m 2 C

4 8 1P l a n t P h y s i o l . V o l . 6 7 , 1 9 8 1


5/6

TOIVIO-KINNUCAN E T A L .c a n p r o d u c e f r a c t u r e f a c e s i n w h i c h 8 0 % o f t h e m e m b r a n e i s i nt h e s o l i d s t a t e , w h e r e a s , i f t h e same m e m b r a n e i s q u e n c h e d a f t e rt h e m e l t i n g c u r v e h a s b e e n l o w e r e d , t h a t i s a f t e r 1 5 d a y s o fa c c l i m a t i o n , i t i s p o s s i b l e t h a t o n l y 2 5 % o f t h e m e m b r a n e l i p i d sa re i n t h e s o l i d s t a t e . T h u s , a d e c r e a s e i n t h e I MP a g g r e g a t i o n i sp r o d u c e d . T h e b i o c h e m i c a l n a t u r e o f s u c h a d e c r e a s e i n t h ep l a s m a m e m b r a n e p h a s e t r a n s i t i o n t e m p e r a t u r e f o r S . a c a u l e i su n d e r i n v e s t i g a t i o n .

M i c r o s c o p y w a s a l s o c a r r i e d o u t w i t h a c o n t r o l t h a t was f r o z e nw i t h o u t t h e c r y o p r o t e c t a n t g l y c e r o l t o e v a l u a t e t h e r e a l n a t u r e o ft h e p a r t i c l e a g g r e g a t i o n p a t t e r n s d u r i n g t h e a c c l i m a t i o n p e r i o d .G l y c e r o l a p p l i e d b e f o r e t i s s u e f i x a t i o n h a s b e e n k n o w n t o i n d u c ea r t i f i c i a l p a r t i c l e a g g r e g a t i o n ( 5 ) . I n o u r e x p e r i m e n t , t h e m e m -b r a n e s f r a c t u r e d w i t h o u t g l y c e r o l p r e t r e a t m e n t t u r n e d o u t t o b ev e r y r o u g h ( i c y ) a n d i t wa s h a r d t o c o u n t p a r t i c l e s on t h e m .H o w e v e r , s i m i l a r a g g r e g a t i o n p a t t e r n s c o u l d b e d i s t i n g u i s h e d i ns a m p l e s t r e a t e d w i t h a n d w i t h o u t g l y c e r o l a n d , t h u s , t h e r e p o r t e dp a r t i c l e a g g r e g a t i o n p a t t e r n s s h o u l d b e r e a l .O f t e n t h e S . a c a u l e c e l l s t h a t s h o w e d t h e m o s t p a r t i c l e a g g r e -g a t i o n w e r e s o m e w h a t p l a s m o l y z e d . A s p a c e , f i l l e d w i t h i c e , waso b s e r v e d t o s e p a r a t e t h e p l a s m a m e m b r a n e f r o m t h e c e l l w a l l .S u c h a p l a s m o l y s i s c o u l d r e s u l t a s a c o n s e q u e n c e o f an i n c r e a s e dw a t e r p e r m e a b i l i t y i n t h e p l a s m a m e m b r a n e d u r i n g p h a s e t r a n s i -t i o n . [ T h e r e h av e b e e n s e v e r a l s t u d i e s p u b l i s h e d s h o w i n g l a r g ei n c r e a s e s i n p a s s i v e p e r m e a b i l i t y i n m e m b r a n e s w i t h i n t h e i r p h a s et r a n s i t i o n ; s e e , f o r e x a m p l e , t h e a r t i c l e b y M u r a t a a n d F o r k ( 1 9 )a n d r e f e r e n c e s c i t e d t h e r e i n . ] S i m i l a r p l a s m o l y s i s w a s n o t o b s e r v e di n t h e r e p l i c a s o f S . t u b e r o s u m w h i c h d i d n o t s h o w a n y p a r t i c l ea g g r e g a t i o n e i t h e r .P a r t i a l l i p i d c r y s t a l l i z a t i o n d u r i n g t h e e a r l y s t a g e o f a c c l i m a t i o np r o c e s s may t u r n o u t t o b e a n e c e s s a r y s t e p o f a s u c c e s s f u la c c l i m a t i o n . T h e e x c e s s w a t e r n e e d s t o b e r e m o v e d f r o m t h e c e l l sv i a t h e p l a s m a m e m b r a n e d u r i n g f r e e z i n g i n o r d e r t o a v o i d l e t h a li n t r a c e l l u l a r f r e e z i n g . S o m e w a t e r may e s c a p e t h r o u g h t h e i n t e r -f a c i a l r e g i o n s b e t w e e n t h e s o l i d a n d l i q u i d a r e a s o f t h e m e m b r a n ea t l o w t e m p e r a t u r e ( 2 C ) . H o w e v e r , i f t h e l i p i d p h a s e t r a n s i t i o n i sa l l o w e d t o p r o c e e d t o o f a r , p h y s i o l o g i c a l l y s i g n i f i c a n t p o r t i o n s o ft h e p l a s m a m e m b r a n e may b e c o m e s o l i d i f i e d a n d n o n f u n c t i o n a l( 1 4 ) .T h e a c c l i m a t i o n t e m p e r a t u r e u s e d i n ou r e x p e r i m e n t i s a p p a r -e n t l y a b o v e t h e l o w e r e n d o f t h e m e l t i n g r a n g e f o r S . a c a u l e . F o rS . t u b e r o s u m t h e p h a s e t r a n s i t i o n t e m p e r a t u r e h a s b e e n d e t e r -m i n e d t o b e 3 C b y e l e c t r o n - s p i n resonance ( 6 ) . H o w e v e r , s t u d i e sc o n d u c t e d b y F e y e t a l . ( 6 ) a n d P i k e a n d B e r r y ( 2 1 ) i n d i c a t e t h a tp h a s e t r a n s i t i o n t e m p e r a t u r e s f o r c o o l - c l i m a t e h e r b a c e o u s p l a n t smay w e l l l i e b e l o w 0 C . I t i s p o s s i b l e t h a t a t t h e t e m p e r a t u r e se m p l o y e d i n o u r e x p e r i m e n t , a c c l i m a t i o n may s t i l l p r o c e e d nor-m a l l y i n S . a c a u l e a n d t h e c e l l s a d a p t t o c o o l i n g t e m p e r a t u r e s b ya l t e r i n g t h e i r l i p i d c o m p o s i t i o n . E v i d e n c e f r o m s t u d i e s w i t h at h e r m o t o l e r a n t c l o n e o f T e t r a h y m e n a p y r y f o r m i s h a s i n d i c a t e d t h a tm e m b r a n e f l u i d i t y i s s e l f - r e g u l a t i n g . T h e r e f o r e , t h e a c t i o n o f t h em e m b r a n e - b o u n d p h o s p h o l i p i d d e s a t u r a s e s ( 2 2 ) ca n be m o d u -l a t e d by t h e p h y s i c a l s t a t e o f t h e i r m e m b r a n e e n v i r o n m e n t ( 1 5 ) .T h e p a r t i a l l y s o l i d i f i e d m e m b r a n e s i n S . a c a u l e may s i g n a l t h em e m b r a n e p r o t e i n s t o m o d i f y t h e i r l i p i d e n v i r o n m e n t , t h a t i s , t h ef l u i d i t y o f t h e m e m b r a n e w h i c h t h e y i n h a b i t . T h i s h a p p e n s a s ar e s p o n s e t o t h e c o o l a c c l i m a t i o n t e m p e r a t u r e . How t h e i n i t i a ls i g n a l i s m o d u l a t e d i n t o a m e m b r a n e f l u i d i t y c h a n g e i s n o t k n o w n ,a l t h o u g h i t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e a c t i o n o f g r o w t h h o r m o n e smay a l s o b e m e d i a t e d t h r o u g h m e m b r a n e f l u i d i t y . F o r e x a m p l e ,I A A d e c r e a s e s t h e t h i c k n e s s o f m e m b r a n e s , w h i c h h a s b e e n t a k e na s an i n d i c a t i o n o f an i n c r e a s e d m e m b r a n e f l u i d i t y ( 1 8 ) . T h i sc o u l d e x p l a i n w h y t h e y o u n g e r S . a c a u l e c a l l u s , w h i c h s t i l l h a sm o s t o f i t s r e s i d u e a u x i n r e s e r v e l e f t i n t h e m e d i u m , i s a b l e t oa d j u s t i t s m e m b r a n e f l u i d i t y t o a c c l i m a t i o n t e m p e r a t u r e f a s t e rt h a n o l d e r c u l t u r e s . A l s o , l i p i d c o m p o s i t i o n ( 1 1 ) may v a r y a c c o r d -i n g t o t h e p h y s i o l o g i c a l a g e o f t h e t i s s u e a f f e c t i n g t h e i r m e m b r a n e

f l u i d i t y c h a r a c t e r i s t i c s .O r g a n i z e d r o w s o f u n k n o w n m a t e r i a l w e r e o b s e r v e d on t h e PFo f t h e p l a s m a m e m b r a n e d u r i n g t h e e a r l y s t a g e s o f S . a c a u l ea c c l i m a t i o n ( F i g . 7 ) . T h e o r i e n t a t i o n p a r a l l e l s t h a t o f t h e w a l lm i c r o f i b r i l s a n d a m i c r o f i b r i l s y n t h e t i c f u n c t i o n b y t h i s m a t e r i a li s p o s s i b l e . T h e y m i g h t r e p r e s e n t a l i n e a r e n z y m e c o m p l e x f o rm i c r o f i b r i l b i o s y n t h e s i s a n d o r i e n t a t i o n a s p r o p o s e d b y R o b e n e c ka n d P e v e l i n g ( 2 3 ) . T h e s e l i n e a r s t r u c t u r e s c o u l d b e a s s o c i a t e d w i t ha m e m b r a n e r e s p o n s e t o e a r l y s t a g e s o f a c c l i m a t i o n a n d b ei d e n t i f i e d a s s t r e s s f i b e r s . H o w e v e r , t h e r e i s no e v i d e n c e a v a i l a b l eo f t h e i r e x i s t e n c e i n p l a n t s .W e h a v e s h o w n t h a t , i n t h e t u b e r - b e a r i n g p o t a t o s p e c i e s S .a c a u l e , c o l d a c c l i m a t i o n a t 2 C f o r 1 0 d a y s c a u s e s a p a r t i a l p h a s et r a n s i t i o n a s i n d i c a t e d b y I MP a g g r e g a t i o n . T h i s i s b e l i e v e d t of a c i l i t a t e t h e movement o f c e l l u l a r w a t e r i n t o t h e e x t r a c e l l u l a rs p a c e a n d t o t r i g g e r o p e r a t i o n o f a s e l f - r e g u l a t i n g m e m b r a n ef l u i d i t y r e s t o r a t i o n m e c h a n i s m . T h e p r o t e c t i n g r o l e o f s u c h m e m -b r a n e a l t e r a t i o n s b e f o r e o r d u r i n g t h e a c t u a l f r e e z e - t h a w s t r e s sr e m a i n s t o b e d i s c o v e r e d .

A c k n o w l e d g m e n t s - W e w i s h t o t h a n k H e n r y W. K i n n u c a n f o r h i s s t a t i s t i c a l h e l p .T h e f r e e z e - f r a c t u r e e l e c t r o n m i c r o s c o p y wa s c a r r i e d o u t a t t h e E l e c t r o n M i c r o s c o p eL a b o r a t o r y o f B i o l o g y , U n i v e r s i t y o f M i n n e s o t a , S t . P a u l . W e a r e g r a t e f u l t o S h a r o nR o b i n s o n a n d P r o f . W. C u n n i n g h a m f o r m a k i n g t h e s e f a c i l i t i e s a v a i l a b l e a n d w i s ht o t h a n k t h e m f o r t h e i r i n t e r e s t a n d h e l p d u r i n g t h e s t u d y .LITERATURE CITED

1 . A R M o N D P A , LA S T A E H E L N 1 9 7 9 L a t e r a l a n d v e r t i c a l d i s p l a c e m e n t o f i n t e g r am e m b r a n e p r o t e i n s d u r i n g l i p i d p h a s e t r a n s i t i o n i n A n a c y s t i s n i d u l a n s . P r oN a t l A c a d S c i US A 7 6 : 1 9 0 1 - 1 9 0 52 . BRANTON D , S B u L U V A N T , N B G I L U L A , M J K A R N O V S K Y , H M O O R , K M U H L E -T H A L E R , DH N O R T H C O T E , L P A C K E R , B S A T I R , P S A T I R , V S p E m T , LA S T A EH E L I N , R L S q m E a , R S W E I N S T E I N 1 9 7 5 F r e e z e - e t c h i n g n o m e n c l a t u r e . S c i e n c e1 9 0 : 5 4 - 5 63 . CHAPMAN E , LC W R I G H T , J K R A I S O N 1 9 7 9 S e a s o n a l c h a n g e s i n t h e s t r u c t u ra n d f u n c t i o n o f m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s o f a r t i c h o k e t u b e r s : r e q u i s i t e f os u r v i v i n g l o w t e m p e r a t u r e d u r i n g d o r m a n c y . P l a n t P h y s i o l 6 3 : 3 6 3 - 3 6 64 . C H E N H H , P G A V I N L E R T V A T A N A , PH L i 1 9 7 9 C o l d a c c l i m a t i o n o f s t e m - c u l t u r ep l a n t s a n d l e a f c a l l u s o f S o l a n u m s p e c i e s . B o t G a z 1 4 0 : 1 4 2 - 1 4 75 . DAVEY M R , R J M A T H I A s 1 9 7 9 C lo s e p a c k i n g o f p l a s m a - m e m b r a n e p a r t i c l ed u r i n g w a l l r e g e n e r a t i o n b y i s o l a t e d h i g h e r - p l a n t p r o t o p l a s t s : f a c t or a r t i f a c tP r o t o p l a s m a 1 0 0 : 8 5 - 9 9

6 . F E Y R L , M W o R K m A N , H M A R C E L L o s , M J B u R K E 1 9 7 9 E l e c t r o n s p i n resonanco f 2 , 2 , 6 , 6 , - t e t r a m e t h y l p i p e r i d i n e - l - o x y l ( T E M P O ) - l a b e l e d p l a n t l e a v e s . P l a nP h y s i o l 6 3 : 1 2 2 0 - 1 2 2 27 . F U K U S H i M A H , CE M A R T I N , H I I D A , Y K I T A J I M A , GA T H O M P S O N , Y NOZAWA1 9 7 6 C h a n g e s i n m e m b r a n e l i p i d c o m p o s i t i o n d u r i n g t e m p e r a t u r e a d a p t a t i ob y a t h e r m o t o l e r a n t s t r a i n o f T e t r a h y m e n a p y r i f o r m i s . B i o c h i m B i o p h y s A c t4 3 1 : 1 6 5 - 1 7 98 . G R A N T CWM 1 9 7 5 L i p i d l a t e r a l p h a s e s e p a r a t i o n s . S p i n l a b e l a n d f r e e z e - f r a c t u re l e c t r o n m i c r o s c o p y s t u d i e s . B i o p h y s J 1 5 : 9 4 9 - 9 5 29 . I L K E R R , AJ W A R I N G , JM L Y O N S , RW B R E I D E N B A C H 1 9 7 6 T h e c y t o l o g i c ar e s p o n s e s o f t o m a t o - s e e d l i n g c o t y l e d o n s t o c h i l l i n g a n d t h e i n f l u e n c e o f m e mb r a n e m o d i f i c a t i o n s u p o n t h e s e r e s p o n s e s . P r o t o p l a s m a 9 0 : 2 2 9 - 2 5 21 0 . J A M E S R , D B R A N T O N 1 9 7 3 L i p i d a n d t e m p e r a t u r e d e p e n d e n t s t r u c t u r a l c h a n g ei n A c h o l e p l a s m a l a i d l a w i i c e l l m e m b r a n e s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 3 2 3 : 3 7 8 - 3 91 1 . K A J I M O T O G , H Y O S H I D A , A S H I B A H A R A , S Y A M A S H O I n 1 9 7 9 C h a n g e s i n t hc o m p o s i t i o n o f l i p i d s a n d f a t t y a c i d s i n c o t t o n s e e d s d u r i n g m a t u r a t i o n . J A g r iChem S o c J a p a n 5 3 : 3 1 7 - 3 2 11 2 . K L E E M A N N W , CWM G R A N T , HM McCoNNELL 1 9 7 4 L i p i d p h a s e s e p a r a t i o na n d p r o t e i n d i s t r i b u t i o n i n m e m b r a n e s . J S u p r a m o l S t r u c t 2 : 6 0 9 - 6 1 61 3 . L E v n r r J 1 9 7 2 R e s p o n s e s o f P l a n t t o E n v i r o n m e n t a l S t r e s s e s . A c a d e m i c P r e s sN e w Y o r k1 4 . LUNA E J , HM M c C O N N E u . 1 9 7 7 L a t e r a l p h a s e s e p a r a t i o n s i n b i n a r y m i x t u r eo f p h o s p h o l i p i d s h a v i n g d i f f e r e n t c h a r g e s a n d d i f f e r e n t c r y s t a l l i n e s t r u c t u r eB i o c h i m B i o p h y s A c t a 4 7 0 : 3 0 3 - 3 1 61 5 . M A R T I N C E , K H M I A m T s u , Y K I T A J I A , Y N O Z A W A , L S c R I v E R , GA T H O M P S OJ R 1 9 7 6 M o l e c u l a r c o n t r o l o f m e m b r a n e p r o p e r t i e s d u r i n g t e m p e r a t u r e a c c lm a t i o n . F a t t y a c i d d e s a t u r a s e r e g u l a t i o n o f m e m b r a n e f l u i d i t y i n a c c l i m a t i nT e t r a h y m e n a c e l l s . B i o c h e m i s t r y 1 5 : 5 2 1 8 - 5 2 2 71 6 . M C E L t A N E Y RN 1 9 7 4 T h e e f f e c t o f m e m b r a n e - l i p i d p h a s e t r a n s i t i o n o n memb r a n e s t r u c t u r e a n d on t h e g r o w t h o f A c h o l e p l a s m a l a i d l a w i i B . J S u p r a m oS t r u c t 2 : 6 1 7 - 6 2 81 7 . M c K E R s I E B D , J E T H O M P S O N 1 9 7 9 I n f l u e n c e o f p l a n t s t e r o l s on t h e p h a sp r o p e r t i e s o f p h o s p h o l i p i d b i l a y e r s . P l a n t P h y s i o l 6 3 : 8 0 2 - 8 0 51 8 . M o R R E D J , CE B R A C K E R 1 9 7 6 U l t r a s t r u c t u r a l a l t e r a t i o n o f p l a n t p l a s m a memb r a n e s i n d u c e d b y a u x i n a n d c a l c i u m i o n s . P l a n t P h y s i o l 5 8 : 5 4 4 - 5 4 71 9 . M U L R A T A N , D C F o u x 1 9 7 6 T e m p er a t u re d e p en d en c e o f t h e l i g h t - i n d u c e

4 8 2 P l a n t P h y s i o l . V o l . 6 7 , 1 9 8 1


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PLASMA MEMBRANE ALTERAT IONS I N POTATOs p e c t r a l s h i f t o f c a r o t e n o i d s i n C y a n i d i u m c a l d a r i w m a n d h i g h e r p l a n t l e a v e s .E v i d e n c e f o r a n e f f e c t o f t h e p h y s i c a l p h a s e o f c h l o r o p l a s t m e m b r a n e l i p i d s o nt h e p e r m e a b i l i t y o f t h e m e m b r a n e t o i o n s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 4 6 1 : 3 6 5 - 3 7 82 0 . N u T , S Y O S H I A , A SAKM 1 9 7 8 S t u d i e s o n c h i l l i n g i n j u r y i n p l a n t c e l l s . L .U l t r a s t r u c t u r a l c h a n g e s a s s o c i a t e d w i t h c h i l l i n g i n j u r y i n c a l l u s t i s s u e s o fC o r n u s s t o l o n i f e r a . P l a n t C e l l P h y s i o l 1 9 : 1 3 9 - 1 4 82 1 . P i K E C S , JA B m E R Y 1 9 8 0 M e m b r a n e p h o s p h o l i p i d p h a s e s e p a r a t i o n s i n p l a n t sa d a p t e d t o o r a c c l i m a t e d t o d i f f e r e n t t h e r m a l r e g i m e s . P l a n t P h y s i o l 6 6 : 2 3 8 -2 4 12 2 . PUGH E L , M KATS 1 9 7 9 M e m b r a n e - b o u n d p h o s p h o l i p i d d e s a t u r a s e s . L i p i d s 1 4 :1 5 9 - 1 6 5

2 3 . R O B E N E C K H , E P E V E L W G 1 9 7 7 U l t r a s t r u c t u r e o f t h e c e l l w a l l r e g e n e r a t i o n o fi s o l a t e d p r o t o p l a s t s o f S k i m m i a j a p o n i c a T h u n b . P l a n t a 1 3 6 : 1 3 5 - 1 4 52 4 . S I N G H J 1 9 7 9 U l t r a s t r u c t u r a l a l t e r a t i o n s i n c e l l s o f h a r d e ne d a n d n o n - h a r d e n e dw i n t e r ry e d u r i n g h y p e r o s m o t i c a n d e x t r a c e l l u l a r f r e e z i n g s t r e s s e s . P r o t o p l a s m a9 8 : 3 2 9 - 3 4 1

4 8 32 5 . S P E T H V , F W U N D E R L I C H 1 9 7 3 M e m b r a n e s o f T e t r a h y m e n a I I . D i r e c t v i s u a l i z a -t i o n o f r e v e r s i b l e t r a n s i t i o n s i n b i o m e m b r a n e s t r u c t u r e i n d u c e d b y t e m p e r a t u r e .B i o c h i m B i o p h y s A c t a 2 9 1 : 6 2 1 - 6 2 82 6 . S T E P O N K U S P L , MP G A B m E R , S P M E Y E R S , RD L I N E B E R G E R 1 9 7 7 E f f e c t s o f c o l da c c l i m a t i o n a n d f r e e z i n g o n s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f c h l o r o p l a s t t h y l a k o i d s .C r y o b i o l o g y 1 4 : 3 0 3 - 3 2 12 7 . S T E P O N K U S , P L , SC W I E s T 1 9 7 8 P l a s m a m e m b r a n e a l t e r a t i o n s f o l l o w i n g c o l da c c l i m a t i o n a n d f r e e z i n g . I n PH L i A S a k a i , e d s , P l a n t C o l d H a r d i n e s s a n dF r e e z i n g S t r e s s . A c a d e m i c P r e s s , Ne w Y o r k , p p 7 5 - 9 12 8 . VIGH L , I H O R V A T H , T F A R K A s , L I H O R V A T H , A B E L E A 1 9 7 9 A d a p t a t i o n o fm e m b r a n e f l u i d i t y o f r y e a n d w h e a t s e e d l i n g s a c c o r d i n g t o t e m p e r a t u r e .

P h y t o c h e m i s t r y 1 8 : 7 8 7 - 7 9 02 9 . WALLACE B A , DM ENGELMAN 1 9 7 8 T h e p l a n a r d i s t r i b u t i o n s o f s u r f a c e p r o t e i n sa n d i n t r am e mb ra n e p a r t i c l e s i n A c h o l e p l a s m a l a i d l a w u a r e d i f f e r e n t i a l l y a f -f e c t e d b y t h e p h y s i c a l s t a t e o f m e m b r a n e l i p i d s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 5 0 8 :4 3 1 - 4 4 9

P l a n t P h y s i o l . V o l . 6 7 , 1 9 8 1

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