c inmunología y virología immunology and virologyc.9 virus de la peste porcina africana c.10...

C

Inmunologíay VirologíaImmunologyand Virology

C.1 Transmisión de señales através del receptor para elantígeno de celulas T

C.2 Bases moleculares de lapatogenicidad y del potencialanti-tumoral de los parvovirus.

C.3 Biología de la infección decélulas por virus animales

C.4 Variabilidad genética devirus RNA

C.5 Activación del Sistema Inmune

C.6 Replicación del DNA yciclo celular

C.7 Expresión génica enprogramas de activaciónlinfocitaria y angiogénesis

C.8 Replicación y transcripcióndel DNA del bacteriófago ø29

C.9 Virus de la peste porcinaafricana

C.10 Desarrollo del sistema linfohematopoyético humano

C.11 Inmunología de los antígenos

de histocompatibilidad

C.1 Signal Transduction throughthe T cell antigen receptor

C.2 Molecular bases of parvoviruspathogenicity and anti-tumourpotential

C.3 Biology of animal virusinfection

C.4 Genetic variability of RNAviruses

C.5 Activation of the ImmuneSystem

C.6 DNA replication andcell cycle

C.7 Gene expression inlymphocyte activation andangiogenesis

C.8 Replication and transcriptionof bacteriophage ø29

C.9 African swinefever virus

C.10 Development of the humanlymphohematopoietic system

C.11 Immunology of histocompatibility antigens

Resumen de Investigación

El receptor para el antígeno de los linfocitos

T (TCR) está compuesto de 6 subunidades:

TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε y

CD3ζ. Mientras que las dos primeras son

responsables del reconocimiento del

antígeno, las demás están encargadas de

la transmisión de señales al interior celular.

El TCR no actúa como un simple interruptor

sino que es capaz de dar distintas

respuestas dependiendo de ligeras

modificaciones en el antígeno. En nuestro

laboratorio, estamos dedicados al estudio

de los mecanismos que regulan la

formación de este complejo multiproteíco

y de cómo se transmiten las señales de

activación al interior de la célula. En líneas

generales, los objetivos de nuestra línea

de investigación son los siguientes:

Dilucidar la estequiometría del TCR.

Tenemos evidencia de que cada complejo

TCR tiene dos heterodímeros TCRα/β y,

por lo tanto, el potencial de unir dos ligandos

simultáneamente. Esto nos ha llevado a un

modelo de TCR dimérico que tiene

relevancia para entender los mecanismos

de activación (modelos de activación

seriada y en paralelo) y la afinidad de su

interacción con el antígeno.

Estudiar los mecanismos de ensamblaje y

retención intracelular. Existe un mecanismo

de control de calidad que regula la expresión

de complejos completos en la superficie

celular. Los complejos incompletos y las

subunidades aisladas son retenidas

intracelularmente, en el retículo

endoplásmico y/o degradadas. Nuestro

interés se centra en la caracterización de

las señales de retención intracelular

existentes en las distintas subunidades y

en cómo son anuladas cuando se forma

un complejo TCR completo.

Redundancia/especialización funcional de

las subunidades del TCR. Estamos

estudiando hasta qué punto la existencia

de múltiples subunidades y motivos de

transmisión de señales obedece a una

necesidad de especialización funcional ó

a una mera necesidad de amplificación de

señales. Nuestros estudios se enfocan

principalmente a la dilucidación del papel

de las subunidades del TCR en los

procesos de maduración y selección tímica.

Jefe de Línea / Group Leader:

Balbino Alarcón

Becarios Postdoctorales /

Postdoctoral Fellows:

Aldo Borroto (hasta Mayo 2000)

Ester San José

Edgar Fernández

Wolfgang Schamel (desde Abril 2000)

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

Diana Gil

Pilar Delgado

Alicia Monjas (desde Octubre 1999)

Técnicos de Investigación /

Laboratory Technicians:

Maite Gómez

Toñi Cerrato (desde Junio 1999)

Transmisión de señales a través del receptorpara el antígeno de celulas T

C.1Inmunología y Virología

Immunology and Virology

44

Fernández-Miguel, G., Alarcón, B., Iglesias, A.,

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chain of the T cell receptor complex. J. Biol. Chem. (en

prensa).

Balbino Alarcón es miembro de EMBO desde Octubre

2000. Balbino Alarcón is EMBO member since October

2000.

Signal transduction through the T cellantigen receptor

Publicaciones /Publications:

Research summary

The T cell antigen receptor (TCR) is

composed of 6 subunits: TCRα, TCRβ,

CD3γ, CD3δ, CD3ε and CD3ζ. While

the first two subunits are responsibles

for antigen recognition, the others are

responsible for signal transduction. The

TCR does not act as a simple switch

but is able to produce different responses

depending on slight modifications of the

antigen. In our laboratory we are

dedicated to the study of the

mechanisms that regulate the formation

of this multiproteic complex as well as

the signal transduction mechanisms.

Our general research objectives are the

following:

To elucidate the stoichiometry of the

TCR. We have some evidence

suggesting that there are two TCRα/βheterodimers per TCR complex and

therefore, the TCR has two potential

antigen-binding sites. These results have

led us to propose a model of dimeric

TCR that is relevant to understand the

mechanisms of activation (serial and

parallel triggering) and the affinity of its

interaction with antigen.

To study the mechanisms of assembly

and intracellular retention. There is a

quality control mechanism that regulates

the expression of complete complexes

on the cell surface. Incomplete

complexes and isolated subunits are

either retained inside the cell (in the

endoplasmic reticulum) or degraded.

Our interest focuses on the

characterization of the intracellular

retention signals and how these signals

are hindered in a complete TCR.

Redundancy vs. functional specialization

of the TCR subunits. We are studying

whether the existence of multiple

subunits and signal transduction motifs

responds to a need for functional

specialization or just a requirement for

signal amplification. Our studies are

mainly oriented to elucidate the role of

the different TCR subunits in thymic

maturation and selection.

45

Otras actividades y reconocimientos/ Other merits and activities:

Inmunología y VirologíaImmunology and Virology


En el género parvovirus, la multiplicación

viral es dependiente de funciones

moduladas por la proliferación,

diferenciación y transformación de la célula

hospedadora. En nuestro laboratorio

empleamos la especie prototipo del género,

el virus diminuto del ratón (MVM), como

modelo para analizar a nivel de organismo

las bases moleculares de la patogénesis

de estos virus, y las posibilidades de su

uso racional como agentes anti-cáncer en

clínica. Estos objetivos generales son

abordados actualmente en cuatro temas

relacionados.

1. Patogénesis viral y estructura de la

cápsida. Hemos descrito dos enfermedades

nuevas en ratones SCID adultos infectados:

i) la cepa MVMi induce una severa

leucopenia acompañada de una

estimulación de los precursores eritroides

definitivos. El virus tambien infecta células

madre hematopoyéticas, lo que podría

permitir su uso como agente radiomimético

en transplantes de médula ósea. ii) la cepa

MVMp inoculada en SCID evoluciona hacia

variantes virulentos que poseen alterada la

interacción con el receptor primario. El

laboratorio ha contribuído a la resolución

de la estructura tridimensional de la cápsida

del MVMp, y se está analizando la topología

de los residuos responsables de la virulencia

de estos variantes.

2. Transporte nuclear. Se han identificado

en el laboratorio las señales de localización

nuclear (nls) de las proteínas estructurales

del virus. Mientras que VP1 posee nls

convencionales, en VP2 hemos descrito un

motivo de localización nuclear en

conformación de lámina beta, que funciona

transportando al núcleo complejos de

subunidades VP1/VP2 en células que

atraviesan la fase S tardía del ciclo. La

naturaleza de esos complejos y de los

residuos de la cápsida que participan en la

maduración del virus son objetivos

principales de esta investigación.

3. Fosforilación de la cápsida. Las

subunidades VP1 y VP2 que forman la

cápsida (T=1) del MVM están fosforiladas

en residuos de serina y treonina, pero los

sitios principales de fosforilación difieren

entre ambas proteínas (ver figura). El

dominio principal de fosforilación de la

cápsida está formado por las tres serinas

del péptido B situado en el extremo N-

terminal de VP2. Estas fosforilaciones

juegan un papel crítico en la salida del

núcleo de la partícula viral madura, y son

incorporadas por kinasas celulares cuya

identificación está en marcha.

4. Oncotropismo de MVM. Hemos descrito

importantes determinantes de tropismo

hacia células de glioblastoma humano en

la región del genoma del virus que codifica

por las proteínas no-estructurales. En

consecuencia, se han construído virus

mutantes MVM que demuestran una

capacidad anti-cáncer humano en modelos

animales. En el futuro se pretende identificar

los efectores celulares implicados en estas

interacciones, así como desarrollar nuevos

virus más oncotrópicos con efectos tóxicos

mínimos en células normales.


José M. Almendral

Personal Científico Contratado /

Scientific Personnel with a Contract:

Mari P. Rubio


Postdoctoral fellow :

Beatriz Maroto


Students :

Eva Hernando, Susana Guerra,

Alberto Lopez, Noelia Valle.

Estudiantes /

Undergraduate Students :

Javier García


Technical Assistance :

Vanesa Sánchez

Mapas bidimensionales de fosfopéptidos de las proteínas de la cápsida del MVMp. Las proteínas VP1 y VP2

aisladas de cápsidas purificadas y marcadas con 32P fueron digeridas con tripsina y analizadas por cromatografía

bidimensional en capa fina. Los péptidos de VP-2 se han designado alfabéticamente de acuerdo a su migración

en 2-D, y esta nomenclatura se mantiene para los péptidos comunes con VP-1 (D a O). P a S son los péptidos

específicos de VP-1. 1D: primera dimension. 2D: segunda dimension. O: origen. La resolución se indica por la

barra a escala.

Bases moleculares de la patogenicidad y delpotencial anti-tumoral de los pa rvovirus.

C.2

46

Molecular bases of pa rvovirus pathogenesisand anti-tumour potential


Two-dimensional phosphopeptide maps of parvovirus MVMp capsid proteins. The VP-1 and VP-2 proteins

isolated from purified 32P-labeled capsid were digested with trypsin and subjected to two-dimensional thin-

layer chromatography analysis. VP-2 tryptic peptides are alphabetically designated according to their 2-D

migration, and this nomenclature is maintained for the peptides shared with VP-1 (D to O). P to S are VP-

1 specific peptides. 1D: first dimension. 2D: second dimension. O: origin. The resolution is indicated by the

scale bar.

Research summary

In the parvovirus genus the viral

multiplication relies on functions

modulated by proliferation, differentiation,

and transformation of the host cell. We

use in our laboratory the type species

of the genus, the minute virus of mice

(MVM), as a model to analyze at the

organism level the molecular bases of

parvovirus pathogenesis, and their

possible rational use as anti-cancer

agents in the clinic. These general

objectives are currently tackled in four

related topics.

1. Viral pathogenesis and capsid

structure. We have described two novel

diseases in infected adult SCID mice: i)

a severe leukopenia together with a

stimulation of the definitive erythroid

precursors induced by the MVMi strain.

The virus also infects hemopoietic stem

cells, what might allow its use as a

radiomimetic agent in bone marrow

transplants. ii) the MVMp strain

inoculated in SCID evolves towards

virulent variants showing an alteration

in the interaction with the primary

receptor. The laboratory has contributed

to the resolution of the three-dimensional

structure of MVMp capsid, and the

topology of the residues responsible for

the virulence of these variants is being

analyzed.

2. Nuclear transport. We have identified

the nuclear localization sequences (nls)

in the viral structural proteins. Whereas

VP1 shows conventional nls , VP2 we

have described in a nuclear localization

motif (nlm) in a beta-stranded

conformation, that functions transporting

into the nucleus VP1/VP2 complexed

subunits in cells traversing the late S

phase of the cell cycle. The nature of

these complexes as well as of the capsid

residues participating in virus maturation

are major aims of this research.

3. Capsid phosphorylation. The VP1

and VP2 subunits forming the MVM

capsid (T=1) are phosphorylated in serine

and threonine residues, but the main

phosphorylation sites differ between both

proteins (see Figure). The major

phosphorylated domain of the capsid is

formed by the three serines of peptide

B placed at VP2 N-terminus. These

phosphorylations play a key role in the

nuclear exit of the mature viral particle,

and are incorporated by cellular kinases

which identification is underway.

4. MVM oncotropism. We have

described important tropism determinants

toward human glioblastoma cells in the

region of the viral genome coding for the

non-structural proteins. Therefore, mutant

MVM viruses were constructed showing

an anti-human cancer activity in animal

models. In the future, we aim at

identifying the cellular factors involved

in these interactions, as well as to

develop new targeted oncotropic viruses

with minimal toxic effects in normal cells.

47

Segovia, J.C., Gallego, J.M., Bueren, J.A., and Almendral,

J.M. (1999). Severe leukopenia and dysregulated

erythropoiesis in SCID mice persistently infected with

the Parvovirus Minute Virus of Mice. J Virol., 73, 1774-

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Frechilla, D., Insausti, R., Rubio, M.P., Almendral, J.M.

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Hernando, E., Llamas-Saiz, A.L., Foces-Foces, C.,

Mckenna, R., Portman, I., Agbandje-McKenna, M., and

Almendral, J.M. (2000). Biochemical and physical

characterization of Parvovirus Minute Virus of Mice virus-

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Lombardo, E., Ramírez, J.C., Agbandje-McKenna, M.,

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Maroto, B., Ramírez, J.C., and J.M. Almendral (2000).

The phosphorylation status of the parvovirus minute

virus of mice particle: mapping and biological relevance

of the major phosphorylation sites. J. Virol. 74: 10892-

10902

Tesis doctorales/ Doctoral Theses

Eva Hernando Monge. “El transporte nuclear de las

proteínas de la cápsida del parvovirus MVM está regulado

por el ciclo celular". Universidad Autónoma de Madrid.

1999. Calificación: Sobresaliente cum laude.

Susana Guerra García. "Interacciones del parvovirus

MVM con células transformadas humanas: regulación

de la replicación viral por fosforilación de la proteína NS-

1". Universidad Autónoma de Madrid. 2000. Calificación:

Sobresaliente cum laude.



La mayoría de los virus animales interfierencon procesos celulares. Dos estructuralescelulares son, principalmente el blanco deacción después de la infección viral: lasmembranas celulares y la maquinaria desíntesis de proteínas. El interés de nuestrogrupo se ha centrado en analizar estainterferencia a nivel molecular. Así, hemosencontrado que las membranas celularesse permeabilizan por ciertas proteínasvirales denominadas viroporinas. Estas sonproteínas de pequeño tamaño ehidrofóbicas, capaces de formar oligómeros.La interacción de estas proteínas conmembranas da lugar a la formación deporos hidrofílicos. La función de lasviroporinas durante el ciclo de infecciónviral consiste en facilitar la salida de nuevaspartículas virales. Por otro lado, lainterferencia de los virus animales con latraducción celular apunta al factor deiniciación eIF4G como el principal candidatoresponsable de este efecto. Algunos virusanimales tales como los picornavirus y losretrovirus codifican proteasas que hidrolizanel eIF4G, mientras que otros virus talescomo el virus de la influenza o los reovirus,contienen proteínas que interaccionan coneste factor de iniciación.

Proteínas virales que modifican lasmembranas celulares . En los últimos añoshemos analizado la función de proteínasvirales que aumentan la permeabilidad delas membranas celulares. Posiblemente, laproteína viral mejor caracterizada a esterespecto es la 2B de poliovirus y suprecursor, la proteína 2BC. Nuestro interésmás reciente se ha centrado en el estudiode la protéina 6K de togavirus y la Vpu delHIV1.Tanto el virus del bosque Semliki(SFV) como el virus Sindbis (SV) codificanuna proteína muy hidrofóbica de unos 60aminoácidos (conocida como 6K), queinteracciona con membranas. La funciónde esta proteína se ha examinado mediantesu expresión individual en células, así comomediante la construcción de una serie demutantes del SV defectivos en el gen 6K.

Nuestros resultados, así como los obtenidospor otros grupos indican que la 6K participaen tres procesos: provee las secuenciasseñal para el procesamiento de lasglicoproteínas, está implicada en el tráficode las glicoproteínas virales, y facilita lacorrecta gemación de las partículas virales.La proteína Vpu del HIV1 posee variascaracterísticas parecidas a la proteína 6K.Así, la expresión individual del gen vpuaumenta la permeabilidad de la membrana,tanto en células bacterianas como demamífero. Un mutante del SV defectivo en6K que expresa el gen vpu ha corregidovarios de sus defectos.

Regulación de la traducción en célulasinfectadas por virus . Las proteasas viralesestán apareciendo como los componentesprincipales implicados en lacitopatogenicidad viral. Así, las proteasasde poliovirus 2A y 3C son capaces de matarpor ellas mismas células humanas. Laproteasa 3C de poliovirus mata a estascélulas por apoptosis, mientras que la 2Ainduce necrosis en la gran mayoría de lascélulas que las sintetizan. Además, la 2Abisecciona el eIF4G, el factor de iniciaciónde la traducción que, a su vez interaccionacon otros factores, tales como el eIF4E, eleIF4A y el eIF3. La rotura del eIF4G por la2A separa a este factor en dos dominios,dando lugar a la inhibición de la traducciónde los mRNAs celulares. Hay que resaltarque los mRNAs celulares ya implicados enla traducción son menos dependientes deleIF4G que los mRNAs que se sintetizan denovo. Resultados recientes de nuestro grupoindican que también la proteasa del HIVhidroliza el eIF4G. De esta forma estaproteasa es capaz de separar los tresdominios que se han descrito en el eIF4G.Esta hidrólisis da lugar a la inhibición delos mRNAs que contienen la estructura cap,mientras que los mRNAs con una secuenciaIRES no son bloqueados. Por lo tanto, lasproteasas de algunos picornavirus yretrovirus comparten la propiedad dehidrolizar el eIF4G, aunque el mecanismomolecular exacto de cada una de ellasdifiere.

Jefe de Linea / Group Leader:

Luis Carrasco

Personal Científico / Scientific Staff:

Mª Eugenia González, Rosario Guinea

(hasta Septiembre 1999).



Alicia Irurzun, Ivan Ventoso


Students:

Ana Oña (hasta Febrero 2000),

Celia Perales, Carlos Calandria,

Raquel Blanco, Enrique Alvarez,

Susana Molina.


Technical Assistance:

Miguel Angel Sanz,

Carmen Hermoso

Biología de la infección de células por virus

animales

C.3

48

Biology of animal virus infection


Research summary

Animal viruses interfere with a numberof cellular processes. Two mainstructures are targeted by viruses uponinfection: cellular membranes and theprotein synthesizing apparatus. Effortsdedicated by our group have beenoriented to analyze this interference atthe molecular level. Thus, the plasmamembrane becomes permeabilized bya number of viral proteins collectivelyknown as viroporins. These representa group of small, hydrophobic proteinsable to form oligomers encoded byanimal viruses, that upon interaction withmembranes form hydrophilic pores. Thefunction of viroporins during the viruslife cycle is directed to facilitate the exitof the progeny virions from cells.Besides, virus interference with hosttranslation points to the initiation factoreIF4G as a major target for this effect.Some animal viruses, such aspicornaviruses and retroviruses, encodeproteases that cleave eIF4G, while otherviruses, as influenza virus or reoviruses,contain proteins that interact with eIF4G.

Viral proteins that modify cellmembranes . We have studied in thepast several proteins that enhancemembrane permeability. Perhaps oneof the best characterized protein in thisregard was poliovirus 2B and itsprecursor 2BC. Our recent interest hasfocussed on togavirus 6K and HIV1 Vpu.Both Semliki forest virus (SFV) andSindbis virus (SV) encode a hydrophobicprotein of about sixty aminoacids (knownas 6K) that interacts with membranes.The functioning of this protein has beenexamined by the individual expressionof the 6K gene in cells and by theconstruction of several SV variantsdefective in this gene. Our results,together with the information obtainedfrom other laboratories, indicate that 6Kparticipates in three processes: providesthe signal sequences for glycoproteinprocessing, is involved in glycoprotein

trafficking and facilitates the correctbudding of virus particles.The HIV Vpuprotein has a number of characteristicsthat resemble alphavirus 6K. Thus, theisolated expression of the vpu geneenhances membrane permeability inboth bacterial and mammalian cells.Moreover a SV variant defective in 6Kthat expresses HIV Vpu has correctedsome of its defects.

The regulation of translation in virus-infected cells . Viral proteases areemerging as major components involvedin virus-induced cytopathogenicity.Notably, the poliovirus proteases 2A and3C are able to kill human cells uponexpression. Poliovirus 3C kills cells byapoptosis, while 2A induces necrosis inmost cells. In addition, 2A bisects eIF4G,the initiation factor of translation involvedin the interaction with other factors, suchas eIF4E, eIF4A and eIF3.

Cleavage of eIF4G by 2A separateseIF4G in two domains, leading to theblockade of translation of cellularmRNAs. Curiously, cellular mRNAsalready engaged in translation are notdependent on the intactness of eIF4G,while newly made mRNAs necessitatethis factor to become translated. Recentfindings from our group indicate that theHIV protease also targets eIF4G. Thus,this protease is able to separate thethree main domains of this initiationfactor. The cleavage of eIF4G by theHIV protease leads to the inhibition ofcap-dependent translation, while proteinsynthesis on mRNAs bearing an IRESsequence is still permitted. Therefore,some picornavirus and retrovirusproteases share the property to cleaveeIF4G, although the exact mechanismfollowed by each protease differs.

49

Ventoso I., Barco A. y Carrasco L. (1999). Genetic

selection of poliovirus 2Apro-binding peptides. J. Virol.

73, 814-818

Novoa I. y Carrasco L. (1999). Cleavage of eukaryotic

translation initiation factor 4G by exogenously added

hybrid proteins containing poliovirus 2Apro in HeLa

cells: effects on gene expression. Mol. Cell. Biol. 19,

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Barco A., Feduchi E. y Carrasco L. (2000). Poliovirus

protease 3Cpro kills cells by apoptosis. Virology 266,

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Martín-Belmonte F., López-Guerrero J.A., Carrasco

L. y Alonso M.A. (2000).The amino-terminal nine

amino acid sequence of poliovirus capsid VP4 protein

is sufficient to confer N-myristoylation and targeting

to detergent-insoluble membranes. Biochemistry 39,

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Barco A., Feduchi E. y Carrasco L. (2000). A stable

HeLa cell line that inducibly expresses poliovirus

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López-Guerrero J.A., Alonso M., Martín-Belmonte F.

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Aragón T., de la Luna S., Novoa I., Carrasco L., Ortín

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Handbook. Edited by R. Rapley. Humana Press,

Totowa, New Jersey. pp. 783-791

Tesis Doctorales/ Doctoral Theses

Ana Oña Blanco. "Cambios en el tráfico de

glicoproteínas y en la permeabilidad de la membrana

plasmática inducidos por la proteína del virus de la

polio". Calificación: Apto "cum laude". Universidad

Autónoma de Madrid. Febrero de 2000.



Esteban Domingo

Personal Científico / Scientific

Personnel:

Cristina Escarmís,

Luis Menéndez-Arias

Becarios Postdoctorales / Postdoctoral

Fellows:

Eric Baranowski, Antonio Mas,

Eloisa Yuste, Antero Airaksinen (desde

octubre 2000/since October 2000)


Students:

Armando Arias, Clara Cases,

Juan Francisco García Arriaza,

Mónica Gutiérrez-Rivas, Nonia Pariente,

Carmen M. Ruíz-Jarabo, Saleta Sierra

Técnicos de Investigación / Technical

Assistance:

Mercedes Dávila, Gema Gómez-Mariano,

Isabel Rubio Candelas (Jul.-Dic. 2000/Jul.-

Dec. 2000)

Científicos visitantes / Visiting

Scientists:

Scott Weaver (University of Texas Medical

Branch at Galveston, Texas, USA)

Variabilidad genética de virus RNAC.4

50


Los objetivos generales del grupo son entenderlas bases moleculares de pérdida y ganancia deeficacia biológica de virus RNA, desarrollar nuevasestrategias antivirales y entender las basesmoleculares de la fidelidad de copia de laretrotranscriptasa (RT) del virus de lainmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1). En elbienio 1999-2000 los estudios principales fueron:

(1) Documentar múltiples vías molecularesalternativas tanto para la pérdida como para laganancia de eficacia biológica del virus de lafiebre aftosa (VFA) y VIH-1. La distribución demutaciones a lo largo del genoma del VIH-1, quese asocian a pérdida de eficacia biológica poractuación del trinquete de Muller, es distinta a lasobservadas durante la evolución natural del virus,subrayando la influencia de la dinámicapoblacional en las velocidades de evolución dedistintos genes del mismo virus. Mediante empleode análogos de base mutagénicos hemosestudiado la pérdida de infectividad del VFA porentrada del virus en catástrofe de error(mutegénesis letal).

(2) Se ha demostrado la existencia de memoriaen cuasiespecies del VFA, en forma decomponentes minoritarios del espectro demutantes. Esta memoria molecular es un reflejode genomas que fueron mayoritarios durante lahistoria evolutiva del virus.

(3) El VFA evoluciona en cultivos celulares demodo que un triplete Arg-Gly-Asp, esencial parael reconocimiento de integrinas que actúan comoreceptores del virus, puede ser dispensable. Dadoque el Arg-Gly-Asp se halla en un bucle antigénico,la dispensabilidad del Arg-Gly-Asp propició unacoevolución de antigenicidad y tropismo celular.Hemos obtenido evidencia de que el VFA puedeemplear tres vías alternativas para la entrada enel mismo tipo de célula. Esta flexibilidad en el usode receptores se asoció a sustituciones deaminoácidos en la superficie de la cápsida.

(4) En colaboración con los grupos de los Dres.N. Verdaguer e I. Fita (Instituto de BiologíaMolecular, CSIC, Barcelona) y de los Dres. D.Andreu y E. Giralt (Universidad de Barcelona) sehan realizado estudios de difracción de rayos Xy criomicroscopia electrónica que han establecidoque el bucle antigénico principal del VFA (quecontiene el triplete Arg-Gly-Asp) ocupa posicionesdistintas al formar un complejo con dos anticuerposdistintos. Estos estudios estrucuturales hanayudado a definir los mecanismos molecularesde coevolución de tropismo celular y antigenicidaddel VFA.

(5) Hemos demostrado que la Tyr-115 de la RTdel VIH-1 juega un papel muy importante en la

discriminación entre desoxyrribonucleótidos(dNTPs) y ribonucleótidos (rNTPs). Estacapacidad discriminatoria es independiente delcatión utilizado como cofactor (Mg2+ ó Mn2+), adiferencia de lo que sucede con la fidelidad decopia o discriminación entre dNTPs correctos eincorrectos, que se ve notablemente influida porel catión utilizado en los ensayos. Utilizando RTscon cambios de aminoácido en la posición 160hemos demostrado que la interacción entre laPhe-160 y la Tyr-115 es crítica para mantener laactividad polimerasa de la RT.

El cambio de Tyr-115 por Trp y otros cambios noconservativos en esta posición dan lugar a RTscon muy baja actividad polimerasa, y el virusresultante no es viable. En colaboración con elgrupo del Dr. Cecilio López-Galíndez (InstitutoCarlos III, Majadahonda) hemos demostrado queen el caso del mutante Y115W, el virus puederecuperar viabilidad a través del cambio Met-230 Ile, implicado en la interacción de la RT con eliniciador (o “primer”). La pérdida de afinidad porlos dNTPs experimentada por el mutante Y115Wera compensada por la acquisición del cambioM230I. En otro estudio más reciente, hemos analizadoel papel de una inserción de dos aminoácidos(frecuentemente, Ser-Ser) entre las posiciones69 y 70, que aparece en la RT de virus resistentesa AZT y otros fármacos antirretrovirales, y queen muchos casos contribuye a la pérdida deeficacia del tratamiento. Hemos demostrado quela inserción es crítica para la adquisición deresistencia a los inhibidores de la RT análogos anucleósido, y que el mecanismo molecular deresistencia al AZT se debe a que la RTmultirresistente tiene una actividad fosforolíticadependiente de ATP mucho mayor que la enzimasilvestre. Esta actividad le permite desbloqueary extender eficazmente iniciadores que tienen suextremo 3’ bloqueado con AZT.

Además de las indicadas en (4) y (5) nuestrogrupo mantiene colaboraciones con los gruposde los Dres. V. Soriano (Hospital Carlos III, Madrid),M.A. Martínez (irsi Caixa, Badalona), M. Leal yE. Lissen (Hospital Virgen del Rocío, Sevilla),Olga I. Lavrik (Novosibirsk Institute of BioorganicChemistry, Novosibirsk, Rusia), Alain Favre(Institute Jacques Monod, C.N.R.S.-Universidadde Paris-Jussieu, Francia), Eric J. Arts (Divisionof Infectious Diseases, Case Western ReserveUniversity, Cleveland, Ohio, EE.UU.), Miguel E.Quiñones-Mateu (Cleveland Clinic Foundation,Lerner Research Institute, Cleveland, Ohio,EE.UU.), así como con varios investigadores delCentro de Astrobiología (CSIC-INTA, Madrid).

Genetic variability of RNA viruses


Research Summary

Research SummaryThe main objectives of our research groupare to understand the molecular basis offitness loss and fitness gain of RNA viruses,to develop new antiviral strategies, and todefine the molecular basis of copying fidelityof reverse transcriptase (RT) of humanimmunodeficiency virus type 1 (HIV-1). In1999-2000 the main studies were:

(1) To document alternative molecularpathways for fitness loss and fitness gain offoot-and-mouth disease virus (FMDV) andHIV-1. The distribution of mutations alongthe HIV-1 genome, associated with fitnessloss through operation of Muller’s ratchet, isdifferent from the distribution observed duringthe natural evolution of this virus. Thisunderlines the influence of viral populationdynamics on the rate of evolution of differentgenes of the same virus. Using mutagenicbase analogs we have studied loss of FMDVinfectivity through virus entry into errorcatastrophe (lethal mutagenesis).

(2) The existence of memory in FMDVquasispecies, in the form of minoritycomponents of the mutant spectra, has beendocumented. Memory reflects thosegenomes which were dominant at an earlierstage of the evolutionary history of the virus.

(3) FMDV evolves in cell culture in a waythat the triplet Arg-Gly-Asp, which is essentialfor recognition of integrins which act asreceptors for this virus, can becomedispensable. Since the triplet Arg-Gly-Asp islocated on an antigenic loop, dispensabilityof Arg-Gly-Asp prompted a coevolution ofantigenicity and host cell tropism. We haveobtained evidence that FMDV may employthree alternative pathways to enter event hesame cell type. Such a flexibility in receptorusage has been associated with amino acidsubstitutions at the surface of the capsid.

(4) In collaboration with the groups of Drs.N. Verdaguer and I. Fita (Instituto de BiologíaMolecular, CSIC, Barcelona) and of Drs. D.Andreu and E. Giralt (University ofBarcelona). X-ray diffraction andcyroelectronmicroscopy studies haveestablished that the FMDV loop (whichincludes the Arg-Gly-Asp) occupies differentpositions when forming a complex withdifferent antibodies. These structural studieshave contributed to defining molecularmechanisms of coevolution of cellular tropismand antigenicity of FMDV.

(5) We have demonstrated that Tyr-115 ofRT of HIV-1 plays a pivotal role in

discriminating between deoxyribonucleotides(dNTPs) and ribonucleotides (rNTPs). Thisdiscriminatory capacity is independent of thecation used as cofactor (Mg2+ or Mn2+), unlikein the case of fidelity of DNA synthesis (ordiscrimination between correct or incorrectdNTPs) which is notably influenced by thecation used in the assays. Using RTs withamino acid substitutions at position 160 wedemonstrated that the interaction betweenTyr-115 and Phe-160 is critical for thepolymerase activity of the RT. The replacement of Tyr-115 by Trp and othernonconservative substitutions renderedenzymes with very low polymerase activityand nonviable virus. In collaboration with thegroup of Dr. Cecilio López-Galíndez (InstitutoCarlos III, Majadahonda) we showed that inthe case of mutant Y115W, it was possibleto recover virus viability through theacquisition of an additional mutation (M230I),at the primer grip of the RT. The diminishedactivity shown by mutant Y115W, whichresults from a loss of dNTP binding affinity,was compensated by the acquisition of themutation at position 230, that probably impliesthe repositioning of the primer relative to theincoming dNTP. In another study carried out recently, weanalyzed the role of an insertion of two aminoacids (frequently, Ser-Ser) at positions 69-70, that appears in the RT of viral isolatesresistant to AZT and other antiretroviral drugs,and contributes to the loss of therapeuticefficiency. The characterisation of severalmutants obtained by site-directedmutagenesis revealed that the AZT resistancemechanism involved an ATP-dependentphosphorolytic activity which is much higherin the resistant isolate than in the wild-typevirus. This activity allows the virus to unblockand extend efficiently those primers bearingan AZT-terminated 3’ end.

In addition to those indicated in (4) and (5),our group has collaborations with the groupsof Drs. V. Soriano (Hospital Carlos III,Madrid), M.A. Martínez (irsi Caixa, Badalona),M. Leal and E. Lissen (Hospital Virgen delRocío, Sevilla), Olga I. Lavrik (NovosibirskInstitute of Bioorganic Chemistry, Novosibirsk,Rusia), Alain Favre (Institute Jacques Monod,C.N.R.S.-Universidad de Paris-Jussieu,Francia), Eric J. Arts (Division of InfectiousDiseases, Case Western Reserve University,Cleveland, Ohio, EE.UU.), Miguel E.Quiñones-Mateu (Cleveland ClinicFoundation, Lerner Research Institute,Cleveland, Ohio, EE.UU.), as well as withseveral scientists from Centro deAstrobiología (CSCI-INTA, Madrid).

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dirigida por el Dr. Luis Menéndez-Arias y codirigida por

el Dr. Esteban Domingo). Universidad Autónoma de Madrid.

2000. Calificación: Sobresaliente Cum Laude por

unanimidad.

Premios y Distinciones/Prizes and Distinctions

Esteban Domingo, Miembro del Consejo Científico del

Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer

(IDIBAPS), Barcelona/Member of the Scientific Board of

Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer

(IDIBAPS), Barcelona.

Miembro del Consejo Asesor de la División de Virología

de la Unión Internacional de Sociedades de Microbiología

(IUMS)/Member of the Advisory Council of the Division of

Virology of the International Union of Microbiological

Societies (IUMS).

Miembro del Panel Editorial de AIDS Reviews/Member of

the Editorial Board of AIDS Reviews.

Placa de la Sociedad Española de Virología (SEV)

(1999)/Award from the Spanish Society for Virology (SEV)

(1999).

Doctor Honoris causa por la Universidad de Lieja (Bélgica)

(1999)/Doctor Honoris causa from Université de Liège

(Belgium) (1999).

C M Y CM MY CY CMY K



Mauricio García Mateu

Becarios Predoctorales / Predoctoral

Students:

Roberto Mateo Fernández

Estudiantes / Undergraduate Students:

Ana Isabel Díaz Franco

Científicos visitantes / Visiting

Scientists:

Marc Martinell (Universidad de Barcelona)

Estabilidad e ingeniería de proteínas víricasStability and engineering of viral proteins

C.4

50b


M.G. Mateu ha iniciado durante este períodoun grupo de investigación independiente en unnuevo laboratorio. El grupo estudia losdeterminantes moleculares de la estabilidad decápsidas víricas mediante ingeniería deproteínas, y las posibles aplicaciones para eldiseño de nuevas vacunas y antivirales. Estánen marcha dos proyectos que utilizan comomodelos el virus de la fiebre aftosa y el parvovirusdiminuto de ratón, respectivamente. El análisisestructural ha revelado interaccionespotencialmente relevantes para elensamblaje/desensamblaje y la estabilidad decápsidas. Se están explorando los efectos demutaciones en estos y otros residuos interfásicossobre la estabilidad de viriones y cápsidasvacías. El segundo proyecto se realiza encolaboración con el grupo del Dr. J.M.Almendralde este Centro. Se han completado estudiossobre el supresor de tumores p53 iniciados porM.G.Mateu durante una estancia sabática (1996-98) en el grupo del Prof. A.Fersht (Centre forProtein Engineering, Cambridge, UK), y se haniniciado otras colaboraciones con el grupo delProf. E. Giralt (Universidad de Barcelona) y conel Dr. J.L.Neira (Centro de Biología Moleculary Celular).

Research Summary

M.G. Mateu has started a new research groupworking in a separate laboratory. His group hasfocused on the study of the moleculardeterminants of viral capsid stability, and on theexploration of possible applications for the designof new vaccines and antivirals. Two ongoingprojects respectively contemplate foot-and-mouthdisease virus and minute virus of mice as models.Structure-based analysis has led to theidentification of potentially relevant interactionsfor capsid assembly/disassembly and stability.The effects of mutations of some interfacialresidues on the stability of virions and viral-likeparticles are being explored. The latter projectis being carried out in collaboration with Dr.J.M.Almendral´s group from this Institution. Somestudies on tumour suppressor p53 initiated byM.G.Mateu during a sabbatical stay (1996-98)in Prof. A.Fersht´s group (Centre for ProteinEngineering, Cambridge, UK) have beencompleted. Other collaborations involve Prof.E.Giralt´s group (Universidad de Barcelona) andDr. J.L.Neira (Centro de Biología Molecular yCelular)

Mateu, M.G., Sánchez del Pino, M.M. and Fersht,A.R. (1999). Mechanism of folding and assembly ofa small tetrameric protein domain from tumoursuppressor p53. Nature Struct. Biol. 6, 191-198.

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C M Y CM MY CY CMY K

Desarrollo de nuevas estrategias para el controly prevención de enfermedades virales: el virusde la fiebre aftosa como modelo




Francisco Sobrino


Fellows:

Jose Ignacio Núñez,

Margarita Sáiz,

María Flora Rosas


Students:

Esther Blanco (1999),

Mercedes García Briones,

Silvia Gómez


Assistance:

Teresa Hernández (1999)

Científicos Visitantes / Visiting

Scientist:

Gilliane Ganges (CENSA, Cuba),

Eliandre de Oliveira (U. Barcelona),

Jordi Feliu (U.A.Barcelona)

C.4

51b


Se trabaja en el desarrollo de nuevas vacunasy de estrategias antivirales. Para ello se utilizael virus de la fiebre aftosa (VFA) como modelo,debido a su interés básico y a la importancia dela enfermedad que produce.

Se ha caracterizando la respuesta inmune celularinducida por el VFA y por vacunasconvencionales, peptídicas y basadas envectores virales, en dos importanteshospedadores (cerdo y vaca). Se ha trabajado,también, en el análisis funcional de elementosreguladores del RNA y de proteínas noestructurales del VFA y de otros virusrelacionados. Finalmente, se están desarrollandométodos aplicables a la epidemiolgía molecularde virus RNA.

Parte de este trabajo ha sido desarrollado en ellaboratorio del que se dispone en CISA-INIA.Se está colaborado con: V. Ley (INIA), E.Martínez-Salas (CBMSO), E. Domingo(CBMSO), E. Giralt y D. Andreu (U. Barcelona),K. McCullough (IVI, Suiza), L. Glass (RoslindInst., RU), P. Barnnet (IAH, RU), E.L Palma(INTA, Argentina), A, Villaverde (U.A. Barcelona),R. Moreno (H. de la Princesa) y M.T Frías(CENSA, Cuba).

Research Summary

Research work is focused on the developmentof new vaccines and antiviral strategies, usingfoot-and-mouth disease virus (FMDV) as amodel, due to its basic interest and the relevanceof the disease it produces.

We have analyzed the immune response elicitedby the virus, its conventional and peptidevaccines and by recombinant adenoviruses intwo important hosts (cattle and swine). We havealso analyzed the functional role of RNAregulatory elements and non-structural proteinsin FMDV and related viruses. Finally, we havedeveloped methods for molecularepidemiological analyses of RNA viruses.

Part of these activities has been carried out inthe Laboratory that F. Sobrino utilizes at CISA-INIA (Valdeolmos). During this period we havealso collaborated with the following groups: V.Ley (INIA), E. Martínez-Salas (CBMSO), E.Domingo (CBMSO), E. Giralt y D. Andreu (U.Barcelona), E.L Palma (INTA, Argentina), K.McCullough (IVI, Switzerland), L. Glass (RoslindInst, UK), P. Barnnet (IAH, UK), A. Villaverde(U.A. Barcelona), R. Moreno (H. de la Princesa)y M.T Frías (CENSA, Cuba).

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Resumen de investigación

TNF regula de modo autocrino LA

activación del linfocito T, mediante el

control de la activación del factor de

transcripción NF-κB, especialmente c-rel.

Este control tiene lugar mediante la

fosforilación de varias serinas entre la

posición 309-540 de c-rel. La infección de

linfocitos T por el virus HIV-1 requiere de

la secreción autocrina de TNF que a su

vez activa el LTR viral vía NF-κB. Esta

infección induce la expresión de la iNOS,

que secreta NO el cual activa la

replicación viral. Además, la proteína tat

de HIV afecta la activación del linfocito T,

uniéndose a los factores de transcripción,

c-rel y AP-1 impidiendo su asociación,

conduciendo a una inhibición de la

transcripción de IL-2.

La activación del linfocito T induce la

expresión de ciclooxigenasa-2 (COX-2),

implicada en la síntesis de

prostaglandinas, cuya expresión y función

en linfocitos T no habían sido descritas

anteriormente. La inducción de COX-2

tiene lugar mediante la activación del

factor de transcripción NFAT. Además,

COX-2 juega un papel importante en la

activación del linfocito T, ya que la

inhibición específica de esta enzima

conduce a la inhibición de NF-κB, NFAT y

AP-1 con la consiguiente inhibición de la

secreción de citoquinas (IL-2, TNF, IFN-γ).

Estos resultados añaden un nuevo

mecanismo para explicar el modo de de

los antiinflamatorios no esteroideos,

inhibidores de esta enzima.

El protozoo parásito Trypanosoma cruzi

causa de la enfermedad de Chagas que

cursa con una inmunosupresión en la fase

aguda y autoinmunidad en la fase crónica.

Hemos caracterizado una mucina, AgC10

de T. cruzi, que parece ser la responsable

de la inhibición de la producción de

citoquinas en la fase aguda. Además,

hemos descrito la existencia de 2

mecanismos de inmunosupresión en la

fase aguda, uno mediado por AgC10, y

otro por la inducción de células

inmunosupresoras mieloides inmaduras

Gr1+Mac1+ que secretan NO que inhibe la

activación T. Además, hemos demostrado

claramente que la autoinmunidad juega

un papel importante en la patología de la

fase crónica. Así, hemos identificado en

nuevo autoantígeno, Cha, que es

reconocido por la mayoría de los sueros

chagásicos y presenta reacción cruzada

con 2 proteínas de T. cruzi. Un epítopo es

reconocido por linfocitos T y otro por

linfocitos B. Además, la transferencia de

células T autoreactivas es capaz de

inducir patología similar a la causada por

la infección.


Manuel Fresno


Personnel:

Pedro Bonay Miarons, Eugenio

Carrasco Marín, Miguel Angel Iñiguez

Peña



Iñigo Angulo Barturen, Angel García

Martín, Núria Gironès Pujol, Esther

González San Martín, Oscar Goñi

Laguardia, Clara Isabel Rodríguez

López


Students:

Pilar Alcaide Alonso, Javier Duque

Muñoz, Raquel Grau Simón, Carmen

Punzón Galvez, Belén San Antonio de

Felipe, Carmen Mª Sánchez-

Valdepeñas, Virginia Vila del Sol


Technical Assistance:

María Cazorla Plaza, Mª de los Angeles

de Chorro y de Villa-Ceballos, Consuelo

Muñoz Fernández

Activación del Sistema InmuneC.5

52

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Activation of the Immune System


Research Summary

TNF regulates T cell activation in an

autocrine fashion, through the control of

the activation of the NF-κB transcription

factor. This control takes place through

phosphorylation of several serines in the

309-540 region of c-rel. HIV-1 on

infection of T lymphocytes requires

autocrine TNF secretion that in turn

activates LTR via NF-κB. HIV-1 infection

induce iNOS expression which

synthesize NO and activates viral

replication. Besides, HIV-1 tat protein

alters T cell activation, being able to bind

to c-rel and AP-1 transcription factors,

preventing their association. Thus,

leading to IL-2 transcription inhibition.

T cell activation induces

cyclooxygenase-2 (COX-2) expression,

involved in protaglandin synthesis.

COX-2 expression and function had not

been previously described in T cells.

COX-2 induction taken place through

activation of NFAT transcription factor.

Besides, COX-2 plays a very important

role in T cell activation, since its specific

blockade leads to inhibition of NF-κB,

NFAT and AP-1 activation. Those results

add a new mechanism to explain the

mode of action of non-steroid

antiinflammatory drugs.

Trypanosoma cruzi, a parasite, causes

Chagas’ disease characterized by

immunosupression in the acute phase

and autoimmunity in the chronic phase.

We have characterized AgC10, a mucin,

responsible for the inhibition of cytokine

production in the acute phase. Besides,

we have identified 2 mechanism of

immunosuppression: one mediate by

AgC10 and another that involves the

induction of Gr1+Mac1+ immature

myeloid cells that secrete NO that in

turns inhibits T cell activation. Besides,

we have clearly demostrated the role of

autoimmunity in the pathology of the

chronic phase. Thus, we have identified

a new autoantigen, named Cha,

recognized by the vast majority of

chagasic sera, and has crossreactivity

with 2 T. cruzi proteins. One

crossreactive epitope is recognized by T

cells and the other by B cells. Besides,

adoptive transfer of T cells to naive

recipients causes a disease similar to

infected mice.

53

Tesis doctorales dirigidasDirected Doctoral Theses"Caracterización de un nuevo factor de transcripciónhumano del tipo bHLH como un autoantígenodominante en la enfermedad de Chagas" Clara IsabelRodríguez López Universidad Autónoma de Madrid1999 Apto "cum laude”

"Modulación del factor NF-kB por TNF en la activacióndel linfocito T. Bases moleculares de la activación de c-Rel" Angel García Martín Universidad Autónoma deMadrid 1999 Sobresaliente "cum laude”

"Efectos de la proteína tat de VIH en la activación delinfocitos T". Esther González San Martín UniversidadAutónoma de Madrid 2000 Sobresaliente "cum laude”



La duplicación del material genético y su

coordinación con el ciclo celular son

procesos cruciales para la proliferación

celular. La salida y entrada del ciclo celular

constituyen puntos de control con

implicaciones en diferenciación celular y

desarrollo. Aunque la estrategia de control

del ciclo celular y la replicación del DNA

parece estar mecanísticamente conservada

en eucariontes, existen diferencias

fundamentales en los elementos

reguladores presentes en levaduras,

animales y plantas.

Nuestro interés se centra en entender cómo

se regulan estos procesos en plantas,

organismos que poseen unas características

únicas de crecimiento y desarrollo

derivadas, fundamentalmente, de su

inmovilidad y de la estrecha coordinación

entre división celular y desarrollo. Para

ello, trabajamos en varias líneas

complementarias integrando el estudio de

la replicación del DNA de geminivirus, los

efectos de las proteínas virales en la célula

huésped, la regulación de la transición G1/S

y el control de la replicación el DNA celular.

Las proteínas Rep y RepA de geminivirus,

que forman oligómeros, son importantes

para el ciclo replicativo. Hemos identificado,

entre otros, un complejo de Rep, la proteína

iniciadora de la replicación, con el DNA del

origen y estamos estudiando las proteínas

celulares que interaccionan con Rep. RepA

secuestra la proteína relacionada con

retinoblastoma (RBR), homóloga del

supresor de tumores.

Esto posiblemente permite la activación

transcripcional de genes, dependientes de

E2F/DP, necesarios para la iniciación del

período S y la replicación del DNA viral y

celular. Estamos interesados en estudiar

la ruta de RBR/E2F/DP, los genes que

regulan y su función durante el ciclo celular,

la replicación del DNA y el desarrollo

mediante un abordaje de biología molecular

y de genómica funcional en Arabidopsis

thaliana.


Crisanto Gutiérrez



M. Beatrice Boniotti

Juan Carlos del Pozo (desde enero 2000)

Corinne Fründt

Alejandro Luque

Riccardo Missich (hasta mayo 1999)

Elena Ramirez-Parra (desde julio 2000)

Andrés P. Sanz-Burgos (hasta

diciembre 1999)


Students:

M. Mar Castellano, Elena Ramírez-

Parra (hasta julio 2000)

Andrés P. Sanz-Burgos (hasta

diciembre 1998)

Visitantes / Visiting:

Javier Plasencia (UNAM, Mexico)

Damian Fonseca (IB, La habana)

Replicación del DNA y ciclo celularC.6

54

La ruta de retinoblastoma en plantas y su conexión con la replicación del DNA degeminivirus, la activación transcripcional de genes regulados por E2F y la proliferacióncelular.

DNA replication and cell cycle

Research Summary

Duplication of genetic material and its

coordination to cell cycle progression are

crucial for cell proliferation. The regulated

exit from and re-entry to the cell cycle

constitute key events during cellular

differentiation and development. The

basic strategy for cell cycle and DNA

replication control seems to be

mechanistically well-conserved in

eukaryotes. However, differences exist

in the regulatory elements evolved in

yeast, animals and plants.

Our research is aimed at understanding

how those processes are regulated in

plants, sessile organisms with a unique

body architecture, growth and

development in which cell division is tightly

coupled to development. To this end, we

follow complementary approaches to

study geminivirus DNA replication, the

cellular effects of viral proteins, the G1/S

transition and the cell cycle regulation of

DNA replication. Geminivirus Rep and

RepA proteins, which form oligomers, are

crucial for the replicative cycle.

We have identified, among others, a

complex of Rep, the initiator protein, with

origin DNA and we are studying cellular

proteins that interact with Rep. RepA

sequesters the retinoblastoma-related

(RBR) protein, a homologue of the human

tumor suppressor RB protein.

This, most likely, allows the transcriptional

activation of E2F/DP-responsive genes

required for S phase progression and viral

and cellular DNA replication. We are

interested in studying the RBR/E2F/DP

pathway, the E2F-responsive genes and

their role during plant cell cycle, cellular

DNA replication and development with a

combination of molecular biology and

functional genomics in Arabidopsis

thaliana.

55


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Patentes/ Patents

Gutiérrez, C., Ramirez-Parra, E., Xie, Q. (1999) "Transgenic plants

(E2F)", CSIC-BTG, PCT / EP99 / 03158 (España-Europa-USA-

Canadá-Japón).

Gutiérrez, C., Castellano, M. M., Sanz-Burgos, A. P. (1999), "Nuevo

método de obtención de plantas transgenicas resistentes a

geminivirus", CSIC-BTG, (España).

Gutierrez, C., Ramirez-Parra, E. (1999, 2000) "Wheat DP proteins

and uses thereof", CSIC-BTG PCT / ES99 / 02474 (España, Europa,

USA, Canada, Japon)

Tesis doctorales/ Doctoral Theses

Elena Ramirez-Parra: "Identificación y análisis del factor de

transcripción E2F/DP de plantas". Universidad Autónoma de Madrid,

Julio, 2000. Calificación: Sobresaliente cum laude.

The retinoblastoma pathway in plants and its conenction with geminivirus DNAreplication, transcriptional activation of E2F-responsive genes and cellular proliferation.



Nuestro interés científico se centra en el

estudio de la regulación de la expresión

génica en la activación de linfocitos y células

endoteliales. En estos modelos celulares

estamos analizando los mecanismos que

integran la transducción de señales

extracelulares con la activación de factores

de transcripción, a su vez encargados de

regular programas específicos de inducción

génica.

En linfocitos gran parte de nuestros

objetivos están dirigidos al estudio de la

regulación de la familia de factores de

transcripción NFAT, cuyos miembros

controlan la expresión de gran número de

genes del sistema inmune,. Esta familia

está constituida por al menos 4 miembros

que residen en el citoplasma en células en

reposo y se translocan al núcleo en

respuesta a aumentos intracelulares de

calcio. Este proceso conlleva la

desfosforilación y translocación al núcleo

de NFAT mediada por calcineurina, y más

tarde, al cesar las señales de calcio, su

exportación al citoplasma por la acción de

quinasas nucleares poco caracterizadas.

Un objetivo del laboratorio es analizar la

regulación por MAPKs de la localización

nucleo-citoplasmática de NFAT. Hemos

demostrado que la activación de JNK y

p38 conduce respectivamente a la

exclusión de NF-AT en el núcleo y

modificación de sus propiedades

transactivadoras. Por ello, intentamos

identificar los residuos fosforilados por

MAPKs para determinar su funcionalidad

“in vivo”. Por otro lado, mediante

abordajes proteómicos usando

espectrometría de masas y transfectantes

estables de los distintos miembros de la

familia, estamos analizando la

composición de los complejos integrados

por las proteínas interaccionantes con

NFAT.

En células endoteliales estamos

analizando las rutas de señalización y el

papel de distintos factores de

transcripción en la respuesta a VEGF

(factor de crecimiento del endotelio

vascular), un factor mitogénico y

angiogénico muy potente. Recientemente,

hemos determinado que la respuesta

endotelial a VEGF conduce a la activación

de NFAT, lo que se requiere para la

expresión de Ciclooxigenasa-2. Dado el

papel de este gen en angiogénesis y

cáncer, estamos estudiando el efecto de

inhibidores de NFAT en modelos de

angiogénesis en ratón y en la formación

de estructuras capilares a partir de células

endoteliales primarias. Hemos

determinado que la inhibición de NFAT

por Ciclosporina A produce inhibición

selectiva de angiogénesis por VEGF y no

por FGF. Estos resultados nos han

conducido distintos inhibidores de NFAT,

pueden interferir en patologías que cursan

con neovascularización debida a VEGF,

como la retinopatía diabética o la

retinopatía inducida por hiperoxia en

ratones neonatos.

Jefe de Línea/Group Leader:

Juan Miguel Redondo

Personal Científico /Scientific Staff:

Eva Cano López1, Antonio Rodríguez

Márquez1

Becarios Postdoctorales

/Postdoctoral Fellows:

Pablo Gómez del Arco2, Gabriela

Hernández, Sara Martínez Martínez

Becarios Predoctorales /Graduate

Students:

Janet Lynn Maldonado2, Elisa

Lorenzo Alvarez, Inmaculada Ortega

Perez, Antonio J. Quesada Navidad1.

Técnicos de Investigación

/Technicians:

Vanesa Gómez Navajo1

Científicos Visitantes/Visiting

Scientists:

Abelardo López Rivas (IPB Lopez-

Neyra, CSIC, Granada)

1 Incorporación en al año 20002 Baja en el año 2000

Expresión génica en programas de activaciónlinfocitaria y angiogénesis

C.7

56

A model for the role of p38 in the shuttling of NFAT1. In resting lymphocytes, phosphorylated NFAT1 islocated in the cytoplasm as a complex that includes calcineurin (CnA and CnB) and p38 MAPK. Upon calcium

signaling, calmodulin (CaM) binds NFAT1 and calcineurin is activated resulting in the dephosphorylation ofNFAT1 and the unmasking of the nuclear localization sequences (NLS) and DNA-binding domain (DBD).

Dephosphorylated NFAT1, p38 and calcineurin translocate to the nucleus as a complex and calcineurinmaintains NFAT1 active for the duration of calcium signals. At some time point after cell activation, NFAT1 is

phosphorylated by p38 MAPK and exported to the cytoplasm upon cessation of calcium signals.

Un modelo del papel de p38 en la localización subcelular de NFAT. En linfocitos en reposo, NFAT resideen el citoplasma en estado fosforilado formando un complejo con calcineurina y la MAPK p38. Los incrementosen calcio intracelular conducen a la activación de la calcineurina que desfosforila NFAT1 y éste expone sus

secuencias de localización nuclear (NLS) y de unión al ADN (DBD). NFAT1 desfosforilado, p38 y calcineurinaforman un complejo y se translocan al núcleo donde calcineurina mantiene NFAT activo mientras duran las

señales de calcio. Cuando éstas cesan, NFAT1 es refosforilado por p38 y exportado al citosol.

Gene expression in lymphocyte activationand angiogenesis

Research Summary

Our research interest is focussed on the

study of the regulation of gene

expression in the activation of

lymphocyte and endothelial cells. We

are analyzing the mechanisms that

integrate extracellular signal

transduction with the activation of

transcription factors which regulate

specific gene expression programs.

A major goal of our research is the

characterization of the molecular

mechanisms that control the subcellular

localization of the NFAT family of

transcription factors. This family is

composed of at least four members that

are found in the cytoplasm of resting

cells and translocate to the nucleus in

response to calcium signals triggered

upon cell activation. Initially, this

process involves the calcineurin-

mediated dephosphorylation of NFAT,

and later on , once calcium signals are

curtailed NFAT is exported from the

nucleus to the cytoplasm through the

action of nuclear kinases not completely

identified. We have demonstrate that

the activation of p38 and JNK results in

the nuclear exclusion and

transactivation of NFAT, respectively.

We are mapping the NFAT regions that

interact with MAPKs to perform site

directed mutagenesis of the NFAT sites

phosphorylated by MAPKs to further

identify the mutants that result in

changes in the shuttling of NFAT

members in vivo. These analyses may

help to define new mechanisms by

which eukaryotic transcription factors

are deactivated and contribute to the

identification of new therapeutic targets

for immnosuppression. As an additional

aim, by using mass spectrometry and

stable transfectants overexpressing the

different family members we are

analyzing the cellular complexes that

integrate NFAT-interacting proteins.

In endothelial cells, we are analyzing the

signaling pathways and the role of

transcription factors involved in the

activation induced by Vascular

Endothelial Growth Factor (VEGF), a

very potent mitogen and angiogenic

factor for endothelial cells. Recently, we

have found that VEGF induces the

transcriptional activation of NFAT in

human endothelial cells, which is

required for Cyclooxygenase-2 –gene

expression. Given the role of this gene

in angiogenesis and cancer, we are

analyzing the effect of NFAT inhibitors in

corneal angiogenesis in mice and on the

ability of endothelial cells to form

capillary-like structures. Initially, we

have found that the inhibition of NFAT by

Cyclosporin A results in the selective

inhibition of VEGF-mediated

angiogenesis. These results have also

encouraged us to investigate whether

NFAT inhibitors display therapeutic

properties in diseases that occurs with

neovascularization mediated by VEGF

such as the diabetic and the prematurity

retinopathies.

57


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Biol. Chem. 275, 23627-23635.

Tesis doctorales/ Doctoral theses

Pablo Gómez del Arco “Función de las MAP

Quinasas en la regulación de la actividad de los

factores de transcripción AP-1 y NFAT en

linfocitos. Efecto de Agentes antioxidantes”:

Autónoma de Madrid. Sobresaliente Cum laude.

Sara Martínez Martínez “Interferencia de los

Ditiocarbamatos con la función de los factores de

transcripción NFAT y NFKB: Inmunosupresión y

shock séptico” Universidad Autónoma de

Madrid.1999. Sobresaliente Cum laude.



Replicación del DNA de ø29

El objetivo del trabajo es profundizar en elconocimiento del mecanismo de iniciaciónde la replicación del DNA de ø29 medianteproteína terminal (TP), así como de lasproteínas implicadas en replicación.

El estudio de las secuencias necesariaspara la iniciación de la replicación medianteTP y la elongación del DNA de ø29 hamostrado que se requiere una repeticiónterminal de dos nucleótidos en los extremosdel DNA para ambos procesos. Por otraparte, los residuos Asn80 y Tyr82 en la TP,así como el posible dominio "coiled coil"que está en su proximidad, son elementosde reconocimiento de los orígenes dereplicación del DNA de ø29. Además, existeun reconocimiento específico de losorígenes mediante la interacción entre laDNA polimerasa y la TP paterna.

Los residuos I8 y A44 de la proteína p6 deø29, que es una proteína tipo histona, estánimplicados en la formación de dímeros. Unamutación en uno de estos residuos produceuna disminución de la capacidad de unióna los extremos del DNA de ø29 y deactivación de la iniciación de la replicación.

Mediante proteolisis parcial de la DNApolimerasa de ø29 hemos demostrado queel DNA y la TP se unen al mismo sitio deunión de DNA de doble banda y protegenlas mismas regiones de la DNA polimerasa.Por otra parte, dicha polimerasa corrige loserrores de polimerización usando unmecanismo intracelular, es decir, el extremodel "primer" va desde el sitio activo depolimerización al de exonucleasa 3'–5' sindisociarse del DNA. También hemosdemostrado que los residuos Tyr59, His61y Phe69 de la DNA polimerasa de ø29 estánimplicados en la estabilización correcta delextremo del "primer" en el sitio activoexonucleasa 3'–5'. En el extremo C-terminal,el Asp332, presente en una región

específica de DNA polimerasas que iniciancon TP, se requiere en la polimerasa deø29 para la interacción funcional con la TPiniciadora.

Por mutagenesis dirigida estamosestudiando la relación estructura-funciónde las proteínas SSB de ø29 y GA-1, quese requieren en el proceso de elongaciónde la replicación.

Hemos demostrado que la proteína p1, quese asocia a membranas, interacciona conla TP iniciadora. Hemos propuesto unmodelo para la inciación de la replicacióndel DNA de ø29 in vivo en el cual elreplisoma viral se une a una estructuraformada por la proteína p1 unida amembranas.

Mediante el uso de técnicas defluorescencia, hemos demostrado quedurante la replicación tiene lugar unarelocalización dinámica del DNA de ø29.La proteína p16.7 de ø29, que es unaproteína integral de membrana y estáimplicada en la replicación del DNA de ø29,interviene en dicho proceso de relocalizacióndel DNA.

Transcripción del DNA de ø29

La proteína reguladora p4 de ø29 activa elpromotor tardío A3 estabilizando la uniónde la RNA polimerasa (RNAP) como uncomplejo cerrado. Una mutación en elresiduo Glu297 en el dominio C-terminalde la subunidad alfa de la RNAP de Bacillussubtilis desestabiliza la formación decomplejos abiertos en el promotor A3.

La proteína viral p6, que se requiere parala iniciación de la replicación del DNA deø29, tiene un efecto pleiotrópico. Por unaparte, reprime el promotor temprano C2.Además, en presencia de la proteínareguladora p4, reprime el promotortemprano A2c y activa el promotor tardíoA3.


Margarita Salas

Personal Científico /Scientific

Personnel:

Alicia Bravo, Ana Camacho,

José Miguel Hermoso.

Becarios Postdoctorales

/Postdoctoral Fellows:

Ana Abril, Ana Bonnin,

Paola Crucitti, Emmanuelle Dufour,

Ralf Eisenbrandt, Belén Illana,

Wilfried Meijer, Javier Saturno,

Verónica Truniger, Miguel de Vega.

Becarios Predoctorales

/Predoctoral Students:

Belén Calles, Irene Gascón,

Víctor González-Huici,

José A. Horcajadas, Alejandro Serna-

Rico, Gema Serrano

Técnicos de Investigación

/Technical Assistance:

José M. Lázaro,

Angeles Martínez, Laurentino Villar.

Estudiantes /Students:

Laura Pérez


Scientists:

Arjan Brenkman.

Deparment of Physiological chemistry.

Universiteitsweg Utrecht.

The Netherlands

Replicación y transcripción del DNA delbacteriófago ø29

C.8

58

Margarita Salas– Socia de Honor de la Sociedad Española de Bioquímica

y Biología Molecular (1999–).

– Distinción de la Fundación Ciencias de la Salud en

Virología (1999).

– Académica de Honor de la Real Academia de Medicina

de Santa Cruz de Tenerife (1999–)

– Premio L’Orèal-UNESCO for “Women in Science” (1999).

– Premio Hipócrates 2000. Fundación Marathon (2000).

– Doctora Honoris Causa por la Universidad Politécnica

de Madrid (2000).

– Premio Nacional de Investigación Santiago Ramón y

Cajal (1999).

– Nombrada Española Universal por la Fundación

Independiente (2000).

– Co-dirigió el curso: "Los retos actuales de la Biología

Molecular" de la Escuela de Biología Molecular "Eladio

Viñuela" Universidad Internacional Menéndez Pelayo

(2000).

Premios y Distinciones/ Prizes and Distinctions

Replication and transcription ofbacteriophage ø29

Research Summary

Replication of ø29 DNA

The aim of the research is to get furtherinsight in the mechanism of initiation ofø29 DNA replication primed by theterminal protein (TP) as well as on theproteins involved in replication.

The study of the sequences needed forprotein-primed initiation and elongationof ø29 DNA replication has revealed thata terminal repetition of two nucleotidesat the DNA ends is the major requirementfor both initiation and elongation. On theother hand, residues Asn80 and Tyr82 inthe TP, as well as the putative coiled coildomain close to them, are recognitionelements of the ø29 DNA replicationorigins. In addition, specific recognitionof the origins is brought through aninteraction between DNA polymerase andparental TP.

Amino acid residues I8 and A44 in theø29 histone-like protein p6 have beenshown to be involved in dimer formation.Mutation in these residues results in areduced capacity to bind the ø29 DNAends and to activate the initiation of ø29DNA replication.

We have analyzed ø29 DNA polymeraseby partial proteolysis with the finding thatboth, DNA and TP, fit in the same double-stranded DNA binding channel and protectthe same regions of ø29 DNA polymerase.On the other hand, we have shown thatø29 DNA polymerase edits thepolymerization errors using anintramolecular pathway; that is, the primerterminus travels from the polymerizationto the 3'–5' exonuclease active siteswithout dissociation from the DNA. Wehave also shown that amino acid residuesTyr59, His61 and Phe69 of ø29 DNApolymerase are involved in the proper

stabilization of the primer-terminus at the3'–5' exonuclease active site. At the C-terminal domain, Asp332 present in aspecific region of protein-primed DNApolymerases, is required in ø29 DNApolymerase for the functional interactionwith the primer TP.

By site-directed mutagenesis we arestudying the structural and functionalrelationship of the ø29 and GA-1 SSBproteins, required for the elongation ofreplication.

The membrane-associated protein p1 hasbeen shown to interact with the primerTP. A model for initiation of in vivo ø29DNA replication has been proposed inwhich the viral replisome attaches to amembrane-associated p1-basedstructure.

By using immunofluorescence techniques,a dynamic relocalization of ø29 DNAduring replication has been shown tooccur. The ø29 integral membrane proteinp16.7, involved in ø29 DNA replication,plays a role in the latter process.

Transcription of ø29 DNA

Phage ø29 regulatory protein p4 activatesthe viral late promoter A3 by stabilizingthe binding of RNA polymerase (RNAP)as a closed complex. Mutation at Glu297in the C-terminal domain of the Bacillussubtilis RNAP alpha subunit destabilizesthe formation of open complexes at theA3 promoter.

The viral protein p6, required for theinitiation of ø29 DNA replication, has apleiotropic effect. On the one hand, itrepresses the early C2 promoter. Inaddition, in the presence of the regulatoryprotein p4, it represses the early A2cpromoter and activates the late A3promoter.

59


Salas M. (1999) Bacillus phage ø29. In: Encyclopedia of Virology, second

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Abril A.M. , Salas and Hermoso J.M. (2000) Identification of residues

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Meijer W., Lewis P.J., Errington J. and Salas M. (2000) Dynamic

relocalization of phage ø29 DNA during replication and the role of the viral

protein p16.7. EMBO J. 19, 4182-4190.

Bravo A., Illana B. and Salas M. (2000) Compartmentalization of phage

ø29 DNA replication: Interaction between the primer terminal protein and

the membrane-associated protein p1. EMBO J. 19, 5575-5584.

Dufour E., Méndez J., Lázaro J.M., de Vega M., Blanco L. and Salas M.

(2000) An aspartic acid residue in TPR-1, a specific region of protein-

priming DNA polymerases, is required for the functional interaction with

primer terminal protein. J.Mol.Biol. 304, 289-300.

de Vega M., Lázaro J.M. and Salas M. (2000) Phage ø29 DNA polymerase

residues involved in the proper stabilisation of the primer-terminus at the

3'-5' exonuclease active site. J.Mol.Biol. 304, 1-10.

González-Huici V., Salas M. and Hermoso J.M. (2000) Sequence

requirements for protein-primed initiation and elongation of phage ø29

DNA replication. J.Biol.Chem. 275, 14678-14683.

Camacho A. and Salas M. (2000) Pleitropic effect of protein p6 on the

viral cycle of bacteriophage ø29. J. Bacteriol. 182, 6927-6932.

Serna-Rico A., Illana B., Salas M. and Meijer W.J.J.. (2000) The putative

coiled coil domain of the ø29 terminal protein is a major determinant

involved in recognition of the origin of replication. J. Biol. Chem. 275,

.40529-40538.

Miguel de Vega José: "Análisis mutacional del centro

activo exonucleasa 3'–5 de la DNA polimerasa del

bacteriófago ø29". (1998). Apto cum laude.

Javier Saturno de la Villa: "Análisis mutacional del

centro activo de polimerización de la DNA polimerasa

del bacteriofago ø29". Universidad Autónoma de

Madrid (1999). Sobresal iente cum laude.

Ana Abril Gallego: "Autoasociación de la proteína p6

del bacteriófago ø29 de Bacillus subtilis". Universidad

Autónoma de Madrid (2000). Sobresaliente cum laude.

José Antonio Horcajadas Almansa: "Control de la

transcripción del bacteriófago GA-1 de Bacillus".

Universidad Autónoma de Madrid (2000). Sobresaliente

cum laude.

Tesis/ Theses



Uno de los objetivos de nuestra línea es el

estudio de los mecanismos de replicación

del DNA del virus de la peste porcina

africana (VPPA) y de los enzimas que

participan en dicho proceso. Este estudio

tiene un interés especial debido a la

estructura del genoma viral, que está

cerrado covalentemente mediante enlaces

terminales, y a la existencia de una fase

replicativa nuclear durante el ciclo infectivo.

Nuestros resultados sugieren que la

replicación del DNA viral tiene lugar por un

mecanismo de iniciación de novo con la

síntesis de fragmentos pequeños en el

núcleo que se convierten posteriormente

en moléculas de mayor tamaño en el

citoplasma. Estas moléculas originan

concatémeros diméricos que se resolverían

para generar el DNA genómico maduro con

horquillas terminales.

Nuestros estudios tienen también como

finalidad comprender los procesos de

ensamblaje de la partícula viral y los

mecanismos implicados en la diseminación

del virus. Estos estudios se están abordando

mediante la utilización de virus

recombinantes que expresan

induciblemente proteínas estructurales y la

caracterización de genes virales que

participan en los distintos pasos

morfogenéticos. Uno de estos genes

codifica por la proteasa implicada en el

procesamiento de las poliproteínas del virus

que forman parte del dominio intermedio

de la partícula viral. La caracterización de

este enzima, que pertenece a la familia de

cisteín proteasas que procesan proteínas

sumoiladas, permitirá comprender mejor el

papel que juega el procesamiento de las

poliproteínas en la morfogénesis del virus.

Otro objetivo de nuestro trabajo es investigar

los mecanismos que utiliza el virus para

evadir los sistemas de defensa del huésped.

Hemos demostrado recientemente que el

gen viral homólogo al IAP celular tiene una

función anti-apoptótica, modulando la

actividad de la caspasa-3 celular. Una

función similar parece poseer la proteína

pEP153R del VPPA que contiene un

dominio de lectinas tipo C y es homóloga

al CD44 celular. Además, esta proteína está

implicada, junto con el homólogo viral del

CD2, en el fenómeno de hemadsorción

inducido en células infectadas. El control

del factor de transcripción NFkB por los

homólogos virales del IkB e IAP es otro de

los aspectos relacionados con la evasión

de la respuesta inmune que está siendo

estudiado en nuestro laboratorio.


María Luisa Salas


Personnel:

Ángel L. Carrascosa, Yolanda Revilla,

Javier M. Rodríguez, José Salas


Fellows:

Germán Andrés, Ramón García,

Riccardo Missich, Clara Rodríguez

Becarios Predoctorales / Predoctoral

Fellowships:

Alí Alejo, Juán Francisco Aranda,

Ana Cebrián, Beatriz Cubelos,

Carolina Epifano, Inmaculada Galindo,

Gema Rojo


Assistance:

María José Bustos, María Luisa Nogal

Virus de la peste porcina africanaC.9

60

La morfogénesis del VPPA tiene lugar en zonas discretas del citoplasma denominadas factorías virales. las

partículas intracelulares del VPPA adquieren sus envueltas internas del retículo endoplásmico, que se

colapsa, generándose así las membranas precursoras virales. A continuación, se forma la cápsida sobre

una de las caras de la envuelta interna. Sobre la otra cara se ensambla simultáneamente el dominio

intermedio. posteriormente, se ensamblaría el material nucleoproteico que forma el nucleoide. Finalmente,

se liberan las partículas virales maduras hacia el espacio extracelular mediante un proceso de gemación

en la membrana plasmática, adquiriéndose durante este proceso una envuelta externa.

African swine fever virus

Research Summary

One objective of our research line is the

study of the mechanisms of African swine

fever virus (ASFV) DNA replication and

of the enzymes involved in this process.

This study is of particular interest due to

the structure of the viral genome, which

contains covalently closed ends, and to

the existence of a nuclear replicative

phase during the infective cycle. Our

results suggest that the replication of the

viral DNA occurs by a de novo initiation

mechanism with the synthesis of small

fragments in the nucleus which are then

converted into larger size molecules in

the cytoplasm. These molecules originate

dimeric concatemers which are resolved

to generate the mature genomic DNA

with terminal cross-links.

Our studies are also directed to

understand the assembly processes of

the viral particle and the mechanisms

involved in virus dissemination. We are

approaching these studies by using ASFV

recombinants that inducibly express

structural proteins and by characterizing

viral genes that participate in the different

morphogenetic steps. One of these genes

codes for the protease involved in the

processing of the viral polyproteins which

constitute the core-shell domain of the

viral particle. The characterization of this

enzyme, which belongs to the cystein

protease family specific for sumoylated

proteins, will allow to understand the role

of polyprotein processing in virus

morphogenesis.

Another objective of our work is to

investigate the mechanims used by the

virus to evade the host defense systems.

We have recently shown that the virus

gene homologous to the cellular IAP has

an anti-apoptotic function, modulating the

activity of the cellular caspase-3. A similar

function has been demonstrated for the

ASFV protein pEP153R that contains a

C-type lectin-like domain and is

homologous to cellular CD44.

Furthermore, this protein is involved,

together with the viral CD2 homolog, in

the hemadsorption phenomenon induced

in infected cells. The control of the

transcription factor NFkB by the viral

homologs of IkB and IAP is another aspect

related to the immune response evasion

which is being studied in our laboratory.

61


Carrascosa, A.L., Bustos, M. J., Galindo, I., and Viñuela, E. (1999). Virus-

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M. Lemon, J. Maniloff, M. A. Mayo, D. J. McGeoch, C. R. Pringle, y R. B.

Wickner. Academic Press, New York, San Diego.

Galindo, I., Almazán, F., Bustos, M. J., Viñuela, E. y Carrascosa, A. L. (2000).

African swine fever virus EP153R open reading frame encodes a glycoprotein

involved in the hemadsorption of infected cells. Virology 266, 340-351.

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Inmaculada Galindo Barreales: "Naturaleza y papel del receptor celular del

virus de la peste porcina africana. Caracterización de los genes virales B438L

y EP153R". Universidad Autónoma de Madrid. 1999. Calificación: Sobresaliente

cum laude.

Ana Cebrián Baux: "La proteína pA179L del VPPA: un inhibidor de apoptosis".

Universidad Autónoma de Madrid. 1999. Calificación: Sobresaliente cum laude.

Ma Gema Rojo Carrascosa: "Estudio de la replicación del ADN del virus de

la peste porcina africana. Migración de mitocondrias a las áreas de ensamblaje

del virus". Universidad Autónoma de Madrid. 1999. Calificación: Sobresaliente

cum laude.

Alí Alejo Herberg: "Estudio de la geranilgeranilpirofosfato sintasa codificada

por el virus de la peste porcina africana". Universidad Autónoma de Madrid.


Premios y Distinciones/ Prizes andDistinctions

Eladio Viñuela

Medalla de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular (1999)

Medalla de la Universidad Autónoma de Madrid (1999)

Laboratorio "Eladio Viñuela" en el Centro de Investigación en Sanidad Animal

del INIA (1999)

Medalla de la Junta de Extremadura (1999)

Creación del Escuela de Biología Molecular "Eladio Viñuela" en la Universidad

Internacional Menéndez Pelayo

Edificio "Eladio Viñuela" en el Campus de la Universidad de Extremadura

(2000)

ASFV morphogenesis takes place in discrete cytoplasmic ares designated the viral factories. Intracellular

ASFV particles acquire thei inner envelopes from the endoplasmic reticulum, wich is collapsed to give rise

to precursor viral membranes. Subsecuently, the capsid is gradually assembled on one side of the inner

envelope whereas the core shell forms beneath the opposite face. At the time the particle is closing, the

nucleoprotein material of the nucleoid would become engulfed. Finally, the intracellular particles are released

from the cell by budding at the plasma membrane, thus acquiring the extracellular envelope.



El objetivo general de nuestro grupo durante

los últimos años se ha centrado en el

entendimiento de los mecanismos que

determinan la diversificación de un precursor

hematopoyético multipotencial en

precursores restringidos a un linaje celular

concreto.

En particular, nos hemos centrado en los

precursores hematolinfoides que colonizan

el timo humano, y en las rutas madurativas

de generación de tres linajes celulares:

linfocitos T, células dendríticas (DC) y células

“natural killer” (NK). Mediante estudios

fenotípicos ex vivo, hemos identificado

precursores intermediarios de cada uno de

los tres linajes, cuyo potencial

hematopoyético y relaciones precursor-

progenie han sido analizados tras el

establecimiento de los sistemas de

diferenciación in vitro apropiados.

Este sistema experimental, junto con la

optimización de técnicas de manipulación

genética de precursores hematopoyéticos

por transducción retroviral, nos ha permitido

analizar la implicación de genes de interés

en procesos madurativos concretos.

El objetivo final es llegar al conocimiento

de los programas genéticos implicados en

la especificación de cada linaje

hematolinfoide.

Durante los dos últimos años, nos hemos

centrado en el linaje T, y en la función del

gen que codifica para la cadena pTα del

pre-receptor T (pre-TCR).

El desarrollo de sistemas de diferenciación

basados en cultivos organotípicos

humano/ratón (hu/mo FTOC), nos ha

permitido establecer relaciones precursor-

progenie e identificar un nuevo estadio

intratímico, caracterizado como

CD4+CD8αα+, en el que se inducen

importantes procesos madurativos

específicos de las células Tαβ, entre ellos:

1) el reordenamiento de los genes del locusTCRβ , 2) la expresión en membrana del

pre-TCR, 3) la adquisición del heterodímero

CD8αβ, y 4) la selección y expansión de

la población intratímica CD4+CD8αβ+,

proceso conocido como selección β, que

determina finalmente el reordenamiento en

el locus TCRα y la expresión del TCRαβmaduro.

En la actualidad estamos analizando el

efecto de la sobre-expresión de dos formas

de procesamiento alternativo de pTα en la

determinación de los linajes Tαβ, DC y NK.


María Luisa Toribio


Personnel:

Susana Rojo



Marina García Peydró,

Almudena R. Ramiro,

César Trigueros


Students:

Yolanda R. Carrasco,

Virginia G. de Yébenes,

Aura Carreira,

María de las Nieves Navarro

Técnico de Investigación/ Technical

Assistance :

Vanesa López

Desarrollo del sistema linfohematopoyéticohumano

C.10

62

Análisis por microscopía de contraste de fase (arriba) o de fluorescencia (abajo) de

células dendríticas generadas in vitro a partir de precursores multipotenciales CD34+

intratímicos transducidos con vectores retrovirales portadores del gen EGFP.

Development of the humanlymphohematopoietic system

Research Summary

Our main interest in the last few years

has focussed on the mechanisms that

control commitment of a multipotent

hematopoietic progenitor into intermediate

lineage-restricted precursors.

Particularly, we have approached the

study of the developmental potential of

the earliest hematolymphoid precursors

that colonize the human thymus, with the

final aim of understanding the

mechanisms that control their

diversification into three distinct cell

lineages: T lymphocytes, dendritic cells

(DC) and natural killer (NK) cells.

Phenotypic studies had led to the

identification of distinct intermediate

progenitor subsets that have been isolated

ex vivo and analyzed for their T, NK, and

DC potential, in the corresponding in vitro

differentiation assays. The availability of

such experimental systems, in

combination with the development of gene

transfer approaches of human

hematopoietic precursors, based on

retroviral transduction, has allowed us to

analyze the involvement of critical genes

in particular maturation events.

Our final aim is the understanding of the

genetic programs involved in

hematolymphoid lineage-specification.

In the last two years, we have focussed

on the T-cell pathway, and on the

functional role of the gene encoding the

pre-T-cell receptor (pre-TCR) pTα chain.

The development of human/mouse fetal

thymic organ cultures (hu/moFTOC) has

allowed us to establish T-lineage

precursor-product relationships, and to

identify a novel intrathymic population,

characterized as CD4+CD8αα+, that

represents a critical pre-T cell stage. In

fact, we have shown that several T-cell

specific maturation events are induced

at this developmental point, including: 1)

rearrangements at the TCRβ locus , 2)

membrane expression of the pre-TCR

complex, 3) acquisition of the CD8αβheterodimer, and 4) selection and

expansion of CD4+ CD8αβ+ pre-T cells,

a process termed β selection, that finally

results in TCRα gene rearrangement and

surface expression of the mature TCRαβ.

We are presently analyzing the role that

overexpression of two pTα spliced

isoforms could play on T, DC, and NK cell

commitment.

63


Valentin, H., Azocar, O., Horvat, B., Williems, R., Garrone,

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Madrid. 2000. Calificación: Sobresaliente cum laude.

Bright-field (top) and fluorescense (bottom) microscopic images of a typical dendritic cell generated in

vitromfrom EGFP- transduced CD34+ intrathymic progenitors. Original magnification x 630.



La función de los antígenos HLA de clase

I es presentar péptidos a los linfocitos T

citotóxicos (CTL). Tres aspectos se

investigan en nuestro laboratorio: papel en

autoinmunidad, alorreactividad, y defensa

inmune.

HLA-B27 y espondilitis anquilosante

(AS). Esta artropatía afecta principalmente

a individuos HLA-B27+ y se asocia a ciertos

alotipos (B*2705, B*2704), pero no a otros

(B*2706, B*2709). El análisis de los

repertorios peptídicos de subtipos asociados

diferencialmente a AS sugiere que: 1) la

asociación de B*2705 a AS podría radicar

en solo un 10% de su repertorio peptídico;

2) B*2704 y B*2706 difieren en su afinidad

por péptidos con Tyr C-terminal y en su

especificidad por la posición 3. Estos

estudios tienden a definir las características

de posibles ligandos artritogénicos de HLA-

B27.

Base molecular y antagonismo de la

alorreactividad. Los CTL alorreactivos,

responsables en parte del rechazo agudo

de trasplantes, reconocen péptidos,

generalmente desconocidos, unidos al

aloantígeno de clase I. Hemos caracterizado

el primer ligando de HLA-B27 implicado en

alorreactividad (Figura 1) y establecido que:

1) el proteasoma lo genera directamente y

factores adicionales limitan la presentación

de péptidos relacionados, 2) la estructura

pep t íd i ca es esenc ia l pa ra e l

alorreconocimiento, pero algunas posiciones

toleran cambios conservativos, 3) la

sustitución de Pro5 (Figura 1) conlleva

pérdida de alorreactividad e induce

antagonismo. Estos estudios se encaminan

a una interpretación molecular de la

alorreactividad y a su inmunomodulación

específica.

Evolución diferencial del polimorfismo

de HLA en poblaciones no relacionadas.

Es posible evaluar la contribución del

polimorfismo de HLA a la defensa inmune

por su evolución en poblaciones dispares.

Hemos analizado la especificidad peptídica

de alotipos de HLA-B39 originados en Africa

(B*3910) y Sudamérica (B*3905, B*3909).

B*3910 posee una mutación que lo

aproxima a HLA-B53, asociado en Africa a

p r o t e c c i ó n c o n t r a m a l a r i a . E n

Sudamerindios, cuyo limitado repertorio

fundador de alelos HLA-B experimentó una

intensa evolución local, las nuevas variantes

de HLA-B39 poseen una especificidad

peptídica más próxima a alotipos ausentes

en dichas poblaciones. Ello produce una

diversificación funcional efectiva de HLA y,

presumiblemente, mayor capacidad

defensiva.

Ligandos naturales de HLA con

modificaciones post-traduccionales.

Estas son frecuentes en el proteoma, pero

poco conocidas en ligandos de HLA. Hemos

identificado N-acetilación y dimetilación

asimétrica de arginina en dichos péptidos.

La primera demuestra que el grupo amino-

terminal libre, una característica canónica

de ligandos de clase I, no es imprescindible.

La dimetil-Arg es frecuente en proteínas

nucleares pero nueva en ligandos de HLA.

En nuestro péptido, está en posición central

y flanqueada por cuatro residuos de Gly.

Presumiblemente, constituye gran parte de

la superficie peptídica accesible al TCR y

es antigénicamente crucial.


José A. López de Castro



Stefan Krebs; José R. Lamas; Mercè

Martí; Alberto Paradela.


Students:

Iñaki Alvarez; Marina García-Peydró;

Violeta Gómez; Verónica Montserrat;

Manuel Ramos; Laura Sesma; Jesús

Yagüe.

Estudiantes/Undergraduate

Students:

Miguel Marcilla.


Scientists:

James Archer (Royal London Hospital,

U.K.)

Inmunología de los antígenos dehistocompatibilidad

C.11

62b

Figura 1. Modelo molecular del complejo B*2705 (blanco)/peptido alorrectivo RRFFPYYV

(azul). Los residuos peptídicos involucrados en la unión a HLA están ocultos.

Figure 1. Molecular model of B*2705 (white) in complex with the alloreactive peptide

RRFFPYYV. Peptide residues involved in HLA-B27 binding are hidden.

José Ramón Lamas López: “Base molecular de la especificidad peptídica de HLA-B27.”Universidad Autónoma de Madrid, 1999. Calificación: Sobresaliente "cum laude" porunanimidad.

Alberto Paradela Elizalde: “Caracterización bioquímica del procesamiento ypresentación de determinantes aloantigénicos por HLA-B27”. Universidad Autónomade Madrid, 1999. Calificación: Sobresaliente "cum laude" por unanimidad.

Marina García-Peydró: ”Base molecular y modulación del reconocimiento aloespecíficode HLA-B27 por linfocitos T citotóxicos”. Universidad Autónoma de Madrid, 2000.Calificación: Sobresaliente "cum laude" por unanimidad

Jesús Yagüe Gallardo: “Modulación de la especificidad peptídica por el polimorfismode HLA-B39. Implicaciones evolutivas y presentación de ligandos con modificacionespost-traduccionales”. Universidad Autónoma de Madrid, 2000. Calificación: Sobresaliente"cum laude" por unanimidad


Immunology of histocompatibility antigens

63b


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Research Summary

HLA class I proteins present peptides to

cytotoxic T lymphocytes (CTL). Our

laboratory is focused on three issues: role

in autoimmunity, alloreactivity, and

immune defence.

HLA-B27 and ankylosing spondylitis

(AS). This disease affects mainly HLA-

B27+ individuals. It is associated to some

allotypes (B*2705, B*2704), but not to

others (B*2706, B*2709). Analysis of the

peptide repertoires from subtypes

differentially associated to AS suggests

that: 1) association of B*2705 to AS may

be related to just about 10% of its peptide

repertoire; B*2704 and B*2706 differ in

their affinity for peptides with C-terminal

Tyr and in their specificity for residues at

position 3. These studies aim to defining

putat ive ar thr i togenic pept ides.

Molecular basis and antagonism of

alloreactivity. Alloreactive CTL are

involved in acute graft rejection. They

recognise generally unknown peptides

bound to the allo-class I molecule. We

have identified the first HLA-B27 ligand

involved in alloreactivity (Figure 1) and

established that: 1) it is directly generated

by the proteasome, whereas additional

factors limit presentation of related

peptides, 2) the structure of the peptide

is essential for allorecognition, but at some

positions conservative changes are

tolerated, 3) changing Pro5 (Figure 1)

abolishes allorecognition and induces

antagonism. Goals of these studies are

to achieve a molecular understanding

and specific immunomodulation of

alloreactivity.

Dif ferent ia l evolut ion of HLA

p o l y m o r p h i s m i n u n r e l a t e d

populations . It is possible to assess the

contribution of HLA polymorphism to

immune defence through its evolution in

distinct populations. We analysed the

peptide specificity of HLA-B39 allotypes

from Africa (B*3910) and South America

(B*3905, B*3909). B*3910 has a mutation

that makes this subtype closer to HLA-

B53, an antigen associated with protection

against malaria in Africa. In South-

Amerindians, whose limited repertoire of

founder HLA-B alleles experienced an

intense local evolution, new HLA-B39

variants are closer in their peptide

specificity to class I allotypes absent from

this population. This implies an effective

functional diversification of HLA and,

presumably, increased defensive capacity.

Post-translational modifications in

natural HLA ligands.

Post-translational modifications are

frequent in the proteome, but little known

in HLA ligands. We have identified N-

acetylat ion and asymmetric Arg

dimethylation in these peptides. The

former modification demonstrates that a

free amino-terminus, a canonical feature

of class I ligands, is not necessarily

essential. Dimethyl-arg is frequent in RNA-

binding nucleoproteins, but novel among

HLA ligands. In our peptide, it is located

in a central position and is flanked by four

Gly residues. Presumably, it contributes

most of the accessible peptide surface

and is antigenically crucial.

c inmunología y virología immunology and virologyc.9 virus de la peste porcina africana c.10...

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