BRINE SHRIMP LETHALITY TEST (BSLT) DARI DAUN SIRIH MERAH(Piper crocatum Ruiz & Pav)

Inda Mapiliandari dan Candra IrawanAkademi Kimia Analisis

ABSTRACT

Having been researched toxicity bioassay with Brine Shrimp Lethality Test (BSL T)method using Artemia salina egg of n-hexane, ethyl acetic, and methanol extracts ofleaf Piper crocatum Ruiz & Pav. The LCso values using Probit analysis method for n-hexane, acetic ethyl, and methanol extracts were 133,20 ppm; 36,41; dan 16,15 ppm.

Key Word: Artemia salina Leach; Brine Shrimp Lethality Test; Piper crocatumRuiz & Pav

PENDAHULUAN

Daun sirih merah (Piper

crocatum Ruiz & Pav) merupakan

bagian tanaman yang sering digunakan

sebagai ramuan obat tradision untuk

mengatasi berbagai penyakit seperti

kanker, tumor, gangguan ginjal, lever,

asam urat, hipertensi, radang prostat,

nyeri sendi, dan diabetes melitus (Feri

Manoi, 2007) yang pembuktiannya

dilakukan secara empiris. Studi kimia ----.

dan farmakologis terhadap tanaman

tersebut masih terbatas, sehingga

aktivitas biologis senyawaan yang ada

dalam tanaman tersebut perlu

diketahui. Daun sirih merah (Piper

crocatum Ruiz & Pav) diduga memiliki

WARTA AKAB, No 21, JULl 2009

aktivitas farmakologis sebagai

antikanker (Feri Manoi, 2007).

Pengujian pendahuluan aktivitas

antikanker ini dapat dilakukan dengan

menentukan toksisitas metabolit

sekunder yang terkandung dalam daun

sirih merah. Metode yang dapat

digunakan dalam penentuan toksisitas

ini adalah Brine Shrimp Lethality Test

(BSL T) dengan larva udang Artemia

salina Leach.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini diarahkan untuk

mengetahui toksisitas metabolit

sekunder dari daun sirih merah (Piper

crocatum Ruiz & Pav) sebagai

pengujian pendahuluan antikanker

menggunakan metode Brine Shrimp

23

Lethality Test (BSL T) dengan larva

udang Artemia salina Leach.

BAHAN DAN METODE

PENELITIAN

Bahan

Bahan yang digunakan dalam

penelitian ini meliputi bahan uji dan

bahan kimia. Bahan uji yang digunakan

dalam penelitian ini adalah daun sirih

merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)

kering yang dikumpulkan dari tanaman

hasil budidaya di daerah Ciapus Bogor.

Bahan kimia yang digunakan adalah

metanol, etil asetat, n-heksana, asam

sulfat pekat, asam klorida 2 %, asam

klorida pekat, larutan feriklorida,

anhidrida asam asetat, asam asetat

glasial, kloroform, pereaksi

Dragendorff, pereaksi Mayer, telur

udang Artemia salina Leach, DMSO,

air laut, dan akuades.

Peralatan

Peralatan yang digunakan dalam

penelitian ini adalah neraca analitik,

rotary shaker, rotary evaporator, oven,

peralatan gelas, incubator, lampu UV,

dan kotak dengan sekat berlubang.

Metode

Penelitian ini dilakukan dalam

beberapa tahap. Tahap awal dilakukan

24

UJl determinasi tanaman bertujuan

untuk mendapatkan spesies dari

tanaman yang digunakan dalam

penelitian. Tahap kedua dilakukan

pembuatan oleoresin dengan metode

maserasi menggunakan pelarut

n-hekasan, etil asetat, dan metanol.

Tahap ketiga dilakukan uji fitokimia

dan pengujian toksisitas dari ekstrak

daun sirih merah menggunakan metode

Brine Shrimp LethaZity Test (BSL T)

dengan larva udang Artemia salina

Leach.

Uii Determinasi

Uji determinasi tumbuhan sirih

merah dilakukan di Herbarium

Bogoriense, bidang Botani Pusat

Penelitian Biologi-LIPI.

Ekstraksi

Ekstraksi dilakukan dengan

teknik maserasi (perendaman)

menggunakan beberapa pelarut

organik. Sejumlah 300 gram daun sirih

merah kering yang telah halus

.direndam dalam pelarut organik

(n-heksana) sampai terendam selama

tiga hari, kemudian disaring. Filtrat

yang diperoleh diuapkan kembali

hingga kering. Hasil yang diperoleh

merupakan ekstrak kasar dari

n-heksana. Residu dari perendaman

pertama seluruhnya direndam kembali

WART A AKAB, No 21, JULI 2009

dalam etil asetat selama tiga hari, dan

disaring. Filtrat diuapkan dan diperoleh

ekstrak kasar etil asetat. Residu

perendaman etil asetat direndam

kembali dalam metanol selama tiga

hari untuk memperoleh ekstrak kasar

metanol. Maserasi dilakukan berulang

sampai hasil ekstrak berwama bening

dan diharapkan semua senyawa dapat

terlarut di dalam pelarutnya.

Uii Fitokimia

Pada tahap nu dilakukan

identifikasi alkaloid, sterol dan

terpenoid, alkaloid basa, flavonoid,

poliuranida (pectin, mucilage, gum),

glikosida steroid, glukosida, dan tanin.

Brine Shrimp Lethalitv Test (BSL T)

Larutan uji ekstrak kasar n-

heksana, etil asetat, dan metanol dari

daun sirih merah yang dilarutkan dalam

air laut. Konsentrasi larutan uji pada uji

pertama adalah: 2000, 200, dan 20

ug/ml., sedangkan konsentrasi larutan

uji setelah pengenceran adalah 20, 10,

dan 2 ug/ml.. Sampel nonpolar yang

bersifat kurang larut ditambahkan

DMSO kurang lebih 10 uL. Pada

pengujian dengan konsentrasi yang

telah diencerkan, setelah 48 jam 100

ul. air laut yang berisi 10-15 ekor larva

udang dimasuk.kan ke lubang vial uji,

kemudian dimasukkan pula larutan

WARTA AKAB, No 21, JULl2009

ekstrak sebanyak 100 ul. sehingga

konsentrasi ekstrak dalam tiap lubang

vial berturut-turut menjadi: 10; 5; dan 1

ug/ml.. Untuk setiap konsentrasi

dilakukan tiga kali pengulangan.

Sebagai kontrol dipakai 100 ul, air laut

yang berisi 10-15 ekor larva udang

ditambah dengan 100 ul. air laut.

Setelah dibiarkan selama 24 jam, udang

yang masih hidup dan yang sudah mati

dihitung jumlahnya.

Data hasil pengujian BSLT

dianalisis menggunakan metode Sam

(Colegate, 1993) berdasarkan

perhitungan jumlah larva yang mati

dan yang masih hidup. Tingkat

kematian atau mortalitas (%) diperoleh

dengan membandingkan antara jumlah

yang mati dibagi dengan jumlah total

larva. Nilai LC50 diperoleh melalui

penentuan nilai probit, yaitu

mengkonversi nilai prosen kematian

dengan tabel probit. Plotting data

antara nilai probit dengan log

konsentrasi akan diperoleh persamaan

garis regresi:

y = a + bxKeterangan

y = 50 (menyatakan larva udang yang mengalamikematian sejumlah 50% setelah masa inkubasi24jam).

a = slopeb = interscpx == mcnyatakan konsentrasi larutan yang

menyebabkan kematian terhadap 50% larva

25

HASIL DAN PEMBAHASAN

Uji Determinasi

Hasil determinasi tanaman yang

digunakan dalam penelitian ini yang

dilakukan di Herbarium Bogoriense,

bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-

LIPI adalah jenis sirih merah (Piper

crocatum Ruiz & Pav).

Uji Fitokima

Proses ekstraksi dilakukan secara

maserasi terhadap daun sirih merah

menggunakan pelarut heksana, etil

asetat, dan metanol yang kemudian

diuapkan dengan evaporator

menghasilkan ekstrak pekat. Uji

fitokimia terhadap ekstrak heksana, etil

asetat, dan metanol daun sirih merah

tersaji pada Tabel 1.

Tabel 1 Hasil Uji Fitokimia EkstrakHeksana, Etil Asetat, danMetanol dari Daun Sirih Merah(Piper crocatum Ruiz & Pav)

Pengamatan

No Parameter Ekstrak Ekstrak Etil EkstrakHek.sana Asetat Metanol

I Alkaloid ++ +2 Tanin +3 Saponin +.~

4 Gula + tHPereduksi, Flavonoid

6 Glukosida + ++7 Fenclik8 Glikosida +

Steroid9 Sterol -

Triteruenoid

Tabel 1 menunjukan bahwa pada

ekstrak heksana kesembilan parameter

26

uji tidak teridentifikasi; pada ekstrak

etil asetat teridentifikasi adanya

alkaloid, gula pereduksi, dan adanya

ikatan glikosida; sedangkan pada

ekstrak metanol teridentifikasi adanya

alkaloid, tanin, saponin, gula pereduksi,

dan diduga suatu glikosida steroid.

Brine Shrimp Lethality Test (BSL T)dengan Larva Udang Artemia salinaLeach

Uji BSLT dengan larva udang

Artemia salina Leach dilakukan

terhadap ekstrak kasar heksana, etil

asetat, dan metanol dari daun sirih

merah (Piper crocatum Ruiz & Pav).

Larva udang yang digunakan sebanyak

10 ekor pada setiap ekstrak uji dan

percobaan dilakukan secara triplo.

Rata-rata hasil pengujian tersaji pada

Tabe12.

Tabel 2 Rata-rata Hasil Uji BSLT EkstrakHeksana, Etil Asetat, dan Metanoldari Daun Sirih Merah (Pipercrocatum Ruiz & Pav)

Kosentrasi JumlahJumlah

%Sampel

Ekstrak (ppm) Larva MatiLarva KematianHidup--. 10 0 30 0

Ekstrak100 9 21 30,00

Heksana1000 30 0 100,00

Ekstrak IQ 8 22 26,67

Etil lOO 1\ 19 36,67

Asetat 1000 30 0 100,00_.

10 15 15 50,00Ekstrak

100 23 7 76,67Metanol

1000 )0 0 100,00

Blanko Air Laut 0 )0 0--

WARTA AKAB, No 21, JULI 2009

Tabel 2 menunjukan bahwa

ketiga ekstrak mempunyai efek toksik

terhadap larva udang Artemia salina

Leach. Untuk mengetahui besarnya

nilai LCso dari ketiga ekstrak kasar

daun sirih merah tersebut, maka

dilakukan analisis probit. Data hasil

perhitungan probit tersebut disajikan

pada Tabel 3.

Tabel 3 Data Hasil Perhitungan ProbitEfek Toksik Ekstrak Heksana,Etil Asetat, clan Metanol dariDaun Sirih Merah (Pipercrocatum Ruiz & Pav)

Sampel Kosentrasi % Log Nilai(ppm) Kematian Konsentrasi Probit

10 0 1 0,00Ekstrak

100 30,00 2 4,40Heksana

1000 100,00 3 8,93

10 26,6i-f--

4,391Ekstrak Etil

100 36,67 2 4,67Asetat

1000 100,00 3 8,93

10 50,00 1 5,00Ekstrak

100 76,67 2 5,74Metanol

1000 100,00 3 8,93--

Berdasarkan data yang

diperoleh dari Tabel 3, maka akan

dihasilkan persamaan gans untuk

ekstrak heksana: Y = 4,465 X - 4,486,

ekstrak etil asetat: Y = 2,27 X-I ,456,

dan ekstrak metanol:

Y = 1,965 X - 2,626 dalam hal ini Y

adalah nilai probit dan X adalah nilai

log konsentrasi. Dengan menggunakan

masing-masing persamaan tersebut

akan dihasilkan nilai LCso ketiga

WART A AKAB, No 21, lULl 2009

ekstrak tersebut. Nilai LCso dari ketiga

ekstrak daun sirih merah tersaji pada

Tabel 4. Tingkat toksisitas tertinggi

dari ekstrak kasar tanaman ditunjukkan

oleh ekstrak kasar metanol dengan nilai

LCso 16,15 ppm, dan terendah oleh

ekstrak kasar heksana dengan nilai

LCso 133,20 ppm. Toksisitas metabolit

sekunder tanaman berkaitan dengan

kemampuan pertahanan diri tanaman

terhadap predator. Mekanisme

pertahanan diri terse but kemungkinan

dengan cara melindungi organ target

maupun dengan menghambat

pembelahan sel yang terkena kuman

patogen. Semakin rendah nilai senyawa

bioaktif (metabolit sekunder), maka

semakin potensial senyawa kimia

terse but untuk digunakan dalam

pengobatan karena memiliki

mekanisme pertahanan diri atau

kemampuan melindungi yang Juga

tinggi (Culter and Culter, 2000).

Tabel 4 Nilai LCso Ekstrak Heksana, EtilAsetat, dan Metanol dari DaunSirih Merah (Piper crocatumRuiz & Pav)Sampel LC•• (ppm)

Ekstrak Heksana 133.20

Ekstrak Etil Asetat 36,41

Ekstrak Metanol 16,15

27

SIMPULAN

Hasil pengujian yang telah

dilakukan memberi petunjuk. bahwa

ekstrak metanol dari daun sirih merah

mempunyai sifat toksisitas yang terkuat

dengan nilai LCso 16,15 ppm.

DAFT AR PUST AKA

Ayo, R.G., Audu, O.T., and Amupitan,J.O., 2007, Physico-ChemicalCharacterization and CytotoxicityStidies of Seed Extracts of Khayasenegalensis (Desr.) A.Juss.,African Journal of BiotechnologyVol. 6 (7), pp 894-896

Bambang Sudewo, 2005, BasmiPenyakit dengan Sirih Merah, PT.Agro Media Pustaka, Jakarta

Cassady, John M., and Dourus, JhonD., 1980, Anticancer Agents Basedon Natural Product Models.Academic Press, New York: xiii +484 pp

Ciulei, 1., 1984, Methodology forAnalysis of Vegetable Drugs,Chemical Industries BranchDivision - Industrial OperationUNINDO, Bucharest - Romania :11 - 23.

Colegate, Steven M., and Russel. J.,Melyneux, 1993, Bioactive NaturalProducts, Detection, Isolation, and

28

Structural Determination. CRCPress. Boca Raton: 442, 444-448.

Cutler, Stephen J, and Horace Cutler,2000, Biologically Active NaturalProducts: Pharmaceuticals, CRCPress LLC, Boca Raton, USA: I-n, 17-22, 73-92

Feri Manoi, Agustus 2007, WartaPuslitbangbun Vo!.I3 No. 2, Bogor

Fujimoto, Y. and M. Satoh, 1986,Studies var aureum II. Synthesisand Cytotoxic Activity ofTrihydrocytetralones, Chem.Pharm, Bull, 34: 4540-4544

Fujimoto, Y., S. Usui, M. Makino andM. Sumatra, 1996, Phluroglucinolsfrom Baeckea Frutescens,Phytochemistry, 41 : 923-925

Heyne, K. 1987. Tumbuhan BergunaIndonesia. Jilid III YayasanSarana Wana Jaya, Jakarta :1470.

Lisdawati, V. 2002, Bioasai Antikankerin Vitro dengan Sel Leukemiadan Isolasi serta PenentuanStruktur Molekul Senyawa Kimiadari Buah Mahkota Dewa(Phaleria macrocarpa [Scheff.]Boerl.) , Tesis ProgramPascasarjana, FMIP A,Universitas Indonesia, Depok.

Me, Laughlin, J. Loren, Ching J. Changand David L. Smith, 1991,Studies in Natural Prod,Chemistry: Atta-ur-Rahman, (Ed)vol. IX, Elsevier SciencePUB.B.V., USA: 384-386

WARTA AKAB, No 21, lUll 2009

Meyer, H.N. et aI, 1982, Brine ShrimpLethality Test : Med. PlantResearch, Vol. 45, HipokratesVerlag Gmbrl, Amsterdam: 31-34

Rapisarda A., Ragusa S., and DePasquale A., 1993, Brine ShrimpBio-Assay of the Leaves of SomeCordia Species, Pharmaco-Biological DepartementUniversity of Messina, Italy.

Sirojudin, TB., 2005, AnalisisKomposisi dan FitokimiaTanaman Mahkota Dewa(Phaleria macrocarpa [Scheff.]Boerl), Laporan PKL D3,Akademi Kimia Analisis Bogor.

Soediro, 1., 1995, Organisme Baharisebagai Sumber Bahan Bioaktif,Proceeding Unesco Seminar onChemistry of Natural Product ofIndonesian Plants, Depok, 1-25

WART A AKAB, No 21, JULI 2009 29