16.1.2009

1

Fizikalna biokemija

ENZIMSKA KINETIKA

P f d J k D iProf. dr. sc. Jerka Dumi

Zavod za biokemiju i molekularnu biologijuFarmaceutsko-biokemijski fakultet

Sveuilita u Zagrebu

Promjena Gibbsove energije kod jednostavnih reakcija

16.1.2009

2

Energetika enzimske reakcije

Reakcija tee u najmanje dva koraka:1. vezanje substrata2. prevoenje substrata u produkt

Usporedba katalizirane i nekatalizirane brzine

Enzimska reakcijanekataliziranareakcija, ku, s-1

kataliziranareakcija, ke, s-1

ke / ku

alkalna fosfataza 1x10-15 14 1,4x1016

3x10-10 3x104 1x1014

1x10-10 1x102 1x1012

3,2x1011

1 10 15 1 3 10 3 1 3 1010

ureaza

glikogen(n) + Pi glikogen(n-1) + glukoza-1-Pglikogen-fosforilaza

hekzokinaza

kimotripsin-Phe-Asn-Arg- + H2O -Phe + Asn-Arg-

1,3x1010

4,5x108

1x10-2 1x105 1x107

3x10-9 4x10-5 >1,33x104

glukoza + ATP glukoza-6-P + ADPhekzokinaza

alkohol-dehidrogenaza

karboanhidraza

kreatin-kinaza

CH3CH2OH + NAD + CH 3COH + NADH + H+

kreatin + ATP kreatin-P + ADP

16.1.2009

3

[P][ ]

Brzina enzimske reakcije ovisi o koncentraciji supstrata

E + S ES E + Pk1k-1k2

k-2

podruje [S]1

[S]2

[S]3[S]4

v0(4)v0

tvo = tg

v0(1)v0(2)v0(3)

v0(4)

UVJETI ZA USPOSTAVU

USTALJENOG STANJA

koncentracija supstrata mnogo vea od koncentracije i

[ES] = konstantna

enzima

koncentracija produkta zanemarljivo mala u odnosu na koncentraciju supstrata ([P] = 0)

16.1.2009

4

Kinetika enzimskih reakcija u ustaljenom stanjumodel Michaelis-Menten

E + S ES E + Pk1k -1

k2

[E]ukupni = [ES] + [E]slobodni

poetak reakcije: k-2 [P] = 0

uvjeti ustaljenog stanja[ES] = konst.

[S] konst. >> [E][P] 0

3 faze enzimske reakcije:

1. predustaljeno stanje:1. predustaljeno stanje:raste koncentracija ES

2. ustaljeno stanje:konstatna koncentracija ES

3. post-ustaljeno stanje:opada koncentracija ES

16.1.2009

5

Vremenski tijek enzimske reakcije

E + S ES E + Pk 1

k -1

k2

k-2

Reakcija tee u tri faze do uspostavljanja ravnotee: (1) predustaljeno, (2) ustaljeno stanje i (3) postustaljeno stanje

once

ntra

cija

ustaljeno stanje

d[P]/dt = konst.

vrijeme

ko

predustaljeno stanje

Poetna brzina enzimske reakcije

v0, poetna brzina enzimske reakcije je brzina nastajanja 0, p j j j jprodukta u ustaljenom stanju.

v0 je konstantna

v0 = d[P]/d[t] = k2[ES] uz stalnu koncentraciju enzima v0 ovisi o poetnoj

koncentraciji substrata dok se sav enzim ne zasitikoncentraciji substrata dok se sav enzim ne zasiti supstratom

Vm je najvea poetna brzina za odreenu koncentraciju enzima [E]t = [ES]

16.1.2009

6

Ovisnost poetne brzine o koncentraciji supstrata

E + S ES E + Pk1k-1

k2

k-2

Vm [S]v =jednadba Michaelis Mentenv0

Vm

v0 = K m + [S]jednadba Michaelis-Menten

[S]KM

Vm/2

Km

[ ]ESkvo 2=

Vm = k2 [ET]

E + S ES E + Pk 1

k -1

k 2

k-2

V m [S]v0 =

+1

21

kkkK m =

-

m 2 [ T]

za k2 k-11

1

kkKK sm

-=

v0 = Km + [S]

za [S] Km ( 100Km)

mo Vv Vm = k2 [ET][P] = Vm x t

16.1.2009

7

za [S] Km ( 1/100Km)[ ] [ ][ ]SEkS

KVv

m

mo =

k - mjera za uinkovitost i specifinost

[ ][ ][ ]SKSEkv

m

to +

= 2

j pk je ograniena difuzijom (108- 109)

kc, s-1, konstanta brzine I. reda = broj molova nastalog produkta po molu enzima u sekundi

1 / kc = vrijeme potrebno za nastanak 1 mola produkta

k2 = kc = obrtni broj

ENZIM SUPSTRAT KMkarboanhidraza CO2 12

kimotripsin acietiltriptofanamidN formiltirozinamid

512

Vrijednosti Km

N-formiltirozinamidglikoziltirozinamid

12122

heksokinaza glukozafruktoza

0.151.5

-galaktozidaza laktoza 4

glutamat-dehidrogenaza glutamata-ketoglutaratNAD+

0.122

0.025

aspartat-aminotransferaza aspartat 0.9aspartat aminotransferaza pa-ketoglutarat oksaloacetat glutamat

0.10.04

4

treonin-deaminaza treonin 5

piruvat-karboksilaza HCO3-piruvatATP

1.00.4

0.06

lisozim heksa-N-acetilglukozamin 0.006

16.1.2009

8

Dijagram Lineweaver-Burk

1 Km 1 1v0

= Vm [S]+ Vm

1v 0

1[S]

1Vm

1K m

v0

E + S ES E + Pk 1

k -1

k 2

k-2

Vm = k2 [ET]

[ET]

Brzina enzimske reakcije linearno ovisi o koncentraciji enzima

16.1.2009

9

Kvantitativno odreivanjeenzimske aktivnosti

katalitika aktivnost se mjeri u jedinicamaj j(International Commission on Enzymes pri International Union of Biochemistry):

1 katal = koliina enzima koja katalizira konverziju 1 mola substrataprodukt u 1 sekundi

1 U = koliina enzima koja katalizira konverziju 1 mola substrata u produkt u 1 minutiprodukt u 1 minuti

1U = 16.67x10-9 kat= 16.67 nkat

1 kat = 6x107 U

katalitika koncentracija enzima = broj katala u litri otopine

Aktivnost enzima ovisi o brojnim imbenicima

vrsta i koncentracija substrata vrsta i koncentracija substrata

prisutnost efektorskih molekula

pH

ionska jakost

temperatura

kofaktori

16.1.2009

10

Temperatura i brzina enzimske reakcije

Termika stabilnost enzimskih sustava i utjecaj temperature na kinetike parametre

Temperaturni uinak ovisi o trajanju izlaganja odreenoj temperaturi

16.1.2009

11

Enzimska aktivnost ovisi o kiselosti medija

REVERZIBILNA INHIBICIJA

K titi Kompetitivna

Nekompetitivna

Akompetitivna

Mijeana

16.1.2009

12

Konkurentna inhibicija

Konkurentna inhibicija (2)

Vm [S]v0 KmI+[S][I]

=

=KmI Km (1 + )[I]KI

VmaxI =Vmax

KmI >Km

16.1.2009

13

VmaxI