UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLAREAL

FACULTAD DE OCEANOGRAFÍA, PESQUERÍA Y CIENCIAS ALIMENTARIAS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA ALIMENTARIA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGÍA

TEMA: BIOQUÍMICA DE LOS MICROORGANISMOS

ALUMNOS: Alarcón Abad, Jorge Rolando. Panez Robles, Roxana Isabel Ramos Rodas, Eva. Yon Yong, Alicia Sugen.

DOCENTE: Nilda Quispe.

AÑO DE ESTUDIO: 3ro Año

Miraflores, 03 de Agosto del 2009

Bioquímica de los Microorganismos - Microbiología

I. Objetivos: Aprender a identificar a las bacterias de acuerdo a las reacciones

metabólicas que tienen frente a los diferentes reactivos y medios de cultivo (uso de las pruebas bioquímicas para la identificación de microorganismos).

Entender los principios bioquímicos de las pruebas.

II. Fundamento: Metabolismo de los hidratos de carbono : Producción de ácido y/o gas

durante el crecimiento fermentativo con azúcares o alcoholes azucarados. La utilización de determinados azúcares son la base para la diferenciación bioquímica de los microorganismos quienes utilizan en mayor facilidad los carbohidratos de menor peso molecular siendo los más utilizados los monosacáridos.

Reacción en el Agar Triple Azúcar Hierro (Producción de Sulfuro de Hidrógeno – H2S): El H2S por rotura de los aminoácidos azufrados o reducción del Tiosulfato. El H2S se detecta en un medio rico en hierro a partir de la formación del sulfito ferroso negro. Es utilizado en Enterobacterias y ayuda a la identificación de la Salmonella, Arizona, Edwarsiella y Proteus.

Prueba de la Oxidasa : Hay bacterias que contiene las enzimas Citocromo C Oxidasas que reaccionan con el reactivo tetrametil-p-fenilendiamina oxidándolo (aceptor de electrones artificial).

Prueba de la Catalasa : Las ensimas de muchas bacterias son capaces de descomponer el peróxido de hidrógeno (H2O2 - agente tóxico) desdoblándolo en H2O y O2.

Reducción de Nitratos : El nitrato como aceptor de electrones alternativo, reducido a NO2

- o N2. Hidrólisis de la Urea : Determinar si la bacteria degrada la Urea a partir

de las enzimas hidrolíticas ureasas. La urea (H2N – CO – NH2) se escinde en 2 NH3 + CO2. Las sustancia producto de la hidrólisis va alcalinizar el medio haciendo virar el reactivo indicador Rojo de Fenol a un Rojo Grosella.

Prueba del Indol : Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol (molécula heterocíclica) en un cultivo bacteriano. Dicha liberación se debe a la degradación del aminoácido triptófano.

Prueba del Rojo de Metilo : Las bacterias fermentadoras mixtas de ácidos producen suficiente ácido para disminuir el pH por debajo de 4.3

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Prueba de Voges-Proskauer : Determinar la capacidad de algunos microorganismos de producir acetoína a partir de la fermentación de azúcares. Prueba química para acetoína utilizando α-naftol.

Prueba del Citrato de Simmons : Utilizada para determinar que microorganismos son capaces de utilizar el citrato como única fuente de carbono produciendo una alcalinización del medio. La fuente de nitrógeno la constituye el fosfato de amonio.

Prueba del ácido Fenil Pirúvico-APP (Prueba de la Fenilalaníndesaminasa): La desaminación producida por la actividad metabólica de ciertos microorganismos produce ácido fenílpirúvico que se detecta en una prueba colorimétrica.

Prueba de la Tolerancia al Cianuro de Potasio: Determinar la capacidad que tiene algunos microorganismos de desarrollarse en un medio que se ha agregado un veneno enzimático KCN, la que impide el proceso de respiración.

Descarboxilación de la Lisina : La descarboxilación de la libera una amina y CO2. Medio enriquecido de aminoácidos. El púrpura de bromocresol como indicador de pH vira a púrpura (si actúa una enzima).

Hidrólisis del Almidón: El almidón es un carbohidrato complejo que es degradado por microorganismos que contienen amilasas.

Hidrólisis de la Gelatina: Muchas enzimas hidrolasas hidrolizan la gelatina y destruyen el gel .

III. Marco teórico:

Prueba de reducción de nitratos a nitritos: La prueba se basa en basa en la reducción del nitrato a nitrito o gas nitrógeno por medio de la enzima nitrato reductasa, es un proceso de oxidación por el cual el nitrato proporciona oxígeno para ser usado como aceptor de electrones. El nitrito presente en el medio puede detectarse con el reactivo de Griess A y Griess B Britania, dando un compuesto diazoico coloreado.Si se observan burbujas en el medio, éstas son de gas nitrógeno, ya que el nitrito intermediario inhibe las decarboxilaciones. Esta prueba ayuda en la determinación de Enterobacterias gran positivas.

Prueba de la Catalasa: La base de esta prueba es demostrar la presencia de la enzima catalasa. La catalasa es una enzima que descompone al peróxido de hidrógeno (forma tóxica del oxigeno) en oxígeno y agua. Esta enzima es similar a la estructura de la hemoglobina. Debido a que el oxígeno es un oxidante poderoso y un excelente aceptor de electrones para la respiración, siendo su forma normal conocida como triplete de oxígeno, sin embargo una forma habitual del oxígeno tóxico se denomina singlete de oxígeno, esta es una forma de mayor energía en el que la capa más externa de electrones que rodean al núcleo se hacen altamente reactivos y son capaces de

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llevar a cabo una serie de oxidaciones indeseables, dentro de la célula. El singlete de oxígeno se produce tanto fotoquímicamente como bioquímicamente; esta última forma es por la reacción de las peroxidasas. Otras formas altamente tóxicas de oxígeno incluyen el anión superóxido (O2-), peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidroxilo (HO2). Con tantas formas tóxicas del oxígeno no es de extrañar que los microorganismos hayan desarrollado formas enzimáticas capaces de destruirlos. Entre estas formas enzimáticas está la catalasa, la peroxidasa y la superóxido dismutasa. Excluyendo al género Streptococcus y algunos otros la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas tienen catalasa.

Prueba del Indol: Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol (molécula heterocíclica, con estructura bicíclica que consiste en un anillo de seis miembros -benceno unido a otro de cinco miembros -pirrol) en un cultivo bacteriano. Dicha liberación se debe a la degradación del aminoácido triptófano mediante el enzima triptofanasa (desaminación reductiva). Las triptofanasas catalizan la reacción de desaminación, durante el cual se remueve el grupo amino (NH2) de la molécula de triptófano. Los productos finales de la reacción son el indol, ácido pirúvico, amoníaco (NH3) y energía. Como coenzima de la reacción se requiere al fosfato de piridoxal.

Para la detección del indol se usa el reactivo de Kovacs que se puede preparar con los siguientes ingredientes:

Ingredientes CantidadAlcohol amílico o isoamílico (puede sustituirse por ácido butílico).

150 ml.

p-dimetilamino-benzaldehído 10 g.HCl (concentrado) 50 ml.

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Constitución del Reactivo de Kovacs (fuente: Brock “Biología de los Microorganismos, 1998)

Resultados positivos y negativos de la prueba del Indol (fuente: www.microbology.com)

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Prueba de la Oxidasa: El objetivo de la prueba Oxidasa es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa. Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la cadena transportadora de e−. Los citocromos contienen ferroporfirina (grupo hemo), se encuentran en células aeróbicas, algunos en la membrana interna mitocondrial donde secuencialmente transportan electrones a partir de diferentes deshidrogenasas hasta el O2. Otros se ubican en el retículo endoplásmico. El Citocromo C oxidasa se detecta utilizando el tetra-p-fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida vira a púrpura.

Hidrólisis de la Urea: Para esta prueba es necesario el Caldo Urea. El Caldo de urea es un medio muy pobre y bastante tamponado que permite determinar la presencia de la

actividad de la enzima hidrolítica ureasa, cuya actividad provoca la degradación de la

urea presente en el medio (un 2% p/v) a CO2 y Amonio, con la consiguiente

alcalinización. Este cambio de pH es detectado por cambio de color del indicador azul

de bromotimol desde el verde original al azul intenso. También es válido usar el

reactivo indicador Rojo de Fenol el cual vira por la alcalinización del medio a un rojo

grosella.

Rojo de Metilo/Voges-Proskauer: Estas dos pruebas permiten la diferenciación dentro de las enterobacterias del grupo coli y aerógenes. Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarán la glucosa en dos fases: primero la metabolizarán aerobiamente (respiración oxibióntica-oxidativa) consumiendo rápidamente el oxígeno del medio, para, en segundo lugar, continuar metabolizándola por vía anaerobia (fermentación). Ésta puede ser de dos tipos:

Fermentación ácido mixta: La realizan las bacterias del grupo de E.coli y los productos finales son ácidos orgánicos (ácidos fórmico, acético, láctico y succínico) que provocan un fuerte descenso del pH inicial del medio. Puede detectarse por el viraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillo por encima de pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4.

Fermentación butilén glicólica: La realizan las bacterias del grupo Klebsiella-Enterobacter (antiguo aerógenes). Los productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, produciéndose acetoína como intermediario que podrá ser detectada añadiendo al medio KOH (reactivo A de Voges-Proskauer) y alfa-naftol (reactivo B de Voges-Proskauer) que reaccionarán con este compuesto produciendo un color rojo característico.

Para la realización de estas dos pruebas se cultiva el microorganismo en caldo RMVP (Red Metil Voges-Proskauer) conocido también como medio de Clark y Lubs.

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Medio MR-VP: El Medio MR-VP es utilizado para la diferenciación de organismos coliformes en base a las pruebas de Rojo de metilo y Voges-.Proskauer. En 1915 Clark y Lubs demostraron que las bacterias del colon de la familia aerogenes podían dividirse en dos grupos en base a su acción en un medio con dextrosa y peptona. Cuando se probaron con el Rojo de Metilo como indicador de pH, el grupo de coliformes producía una gran cantidad de ácido mientras que el grupo de los aerógenos producía una reacción menos ácida. La prueba para detectar a los altos productores de ácido es conocida como Rojo de Metilo (MR). La prueba para detectar a los menos productores de ácido está basada en el procedimiento que describieron Voges y Proskauer en 1898 donde se presenta una reacción colorida cuando los cultivos se incuban en un medio conteniendo dextrosa y peptona y se les adiciona hidróxido de potasio exponiéndolos al aire. Esta reacción pone de manifiesto la formación de acetilmetilcarbinol y es conocida como la prueba de Voges-Proskauer (VP).

En este medio las peptonas proporcionan la fuente de carbono y nitrógeno. La dextrosa es el carbohidrato fermentable y el fosfato actúa como buffer.

Prueba del Agar Citrato de Simmons : La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de enterobacterias. La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento del pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.

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Mezcla de Peptonas

7.0

Dextrosa 5.0Fosfato de potasio

5.0

pH 6.9 ± 0.2

Resultados positivos y negativos de la Prueba Agar Citrato de Simmons (fuente:www.microbiology.org)

Constitución del Caldo MRVP – Metil Red Voges Proskauer (fuente: Brock “Biología de los Microorganismos, 1998)

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Prueba del Ácido Fenil Pirúvico. La desaminación produce ácido fenilpirúvico que se detcta a través de una prueba colorimétrica. La fenilalanina es un aminoácido que en detrminados microorganismos puede transformarse por desaminación oxidativa en APP (ácido fenil pirúvico), el cual con una reacción de cloruro férrico produce una coloración verde.

Prueba de la Descarboxilación de la Lisina (Prueba LIA -Lysine Iron Agar ó Agar Lisina Hierro): Esta prueba se da cuando la descarboxilación de la lisina (aminoácido) da la formación de la cadaverina que hace virar o cambiar el pH del medio hacia el lado alcalino, en donde genera CO2. La descarboxilación de los aminoácidos libera CO2 y una amina. Esta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen descarboxilación o desaminación de la lisina. Se pude detectar además la producción de SH2 y es más sensible que el TSI (Triple Sugar Iron) para la detección de SH2. Es muy utilizado para descartar Salmonella de aislamientos primaros.

Prueba de la Gelatina: La gelatina tiene la propiedad de precipitar cuando se añaden metales pesados, los microorganismos que degradan la gelatina es porque segregan enzimas hidrolíticas transformando esta proteína en peptonas haciendo perder la capacidad de precipitar los metales pesados.

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Resultado positivo de la Prueba de la Descarboxilación de la Lisina – Prueba Lia- Lysine Iron Agar (fuente:www.microbiology.org)

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Pruebas importantes para el diagnóstico clínico de bacterias y su utilización más frecuente (fuente: Brock “Biología de los Microorganismos, 1998)

Prueba Principio Método Utilización más frecuenteFermentación de hidratos de carbono

Producción de ácido y/o gas durante el crecimiento fermentativo con azúcares o alcoholes azucarados

Un caldo de cultivo con hidratos de carbono y rojo de fenol como indicador de pH, tubo invertido para el gas

Diferenciación de enterobacterias (también para la separación de otros géneros o especies distintos con algunos azúcares determinados).

Catalasa La enzima descompone el peróxido de hidrógeno, H2O2.

Añadir una gota de H2O2.a un cultivo denso y buscar burbujas (O2).

Bacillus (+) de Clostridium (-); Streptococcus (-) de Micrococcus-Staphylococcus (+).

Utilización del citrato. La utilización del citrato como fuente única de carbono produce la alcalinización del medio.

Un medio de citrato con azul de bromotimol como indicador de pH. Buscar un color azul intenso (pH alcalino).

Klebsiella-Enterobacter (+) de Escherichia (-), Edwarsiella (-) de Salmonella (+)

Coagulasa La enzima provoca la aglutinación del plasma sanguíneo.

Mezclar una suspensión líquida densa de bacterias con plasma, incubar y buscar un coágulo de fibrina.

Staphylococcus aureus (+) de S. epidermis (-)

Descarboxilasas (lisina, ornitina, arginina).

La descarboxilación de los aminoácidos libera CO2 y amina.

Medio enriquecido con aminoácidos. El púrpura de bromocresol como indicador de pH vira a púrpura (pH alcalino) si actúa la enzima.

Ayuda a la determinación del grupo bacteriano entre las enterobacterias.

Prueba de la β-Galactosidasa (ONPG)

El ortonitrofenil-β-galactósido (ONPG) es un sustrato artificial para la enzima. Cuando se hidroliza, se forma el nitrofenol (amarillo)

Incubar una suspensión pesada de un cultivo lisado con ONPG. Buscar un color amarillo.

Citrobacter y Arizona (+) de Salmonella (-). Identificación de algunas especies de Shigellla y Pseudomonas.

Licuefacción de la gelatina

Muchas hidrolasas hidrolizan la gelatina y destruyen el gel.

Incubar un caldo con 12% de gelatina. Enfriar para comprobar la formación del gel. Si se hidroliza la gelatina, el tubo permanece líquido cuando se refrigera.

Ayudar a la identificación de Serratia, Pseudomonas, Flavobacterium, Clostridium.

Producción de sulfuro de hidrógeno (H2S)

La producción de H2S por rotura de los aminoácidos azufrados o reducción del tiosulfato.

El H2S se detecta en un medio rico en hierro a partir de la formación del sulfit ferrosos negro (muchas variantes: agar hierro de Kligler y agar hierro triple azúcar, también detectan la fermentación de los hidratos de carbono).

En enterobacterias, ayudar a la identificación de Salmonella, Arizona, Edwarsiella y Proteus.

Prueba del Indol Conversión del triptófano de las proteínas en indol (molécula cíclica).

Detección de indol en medio de cultivo con dimetil-aminobenzaldehido (color rojo).

Distinguir Escherichia (+) de Klebsiella (-) y Enterobacter (-); Edwarsiella (+) de Salmonella (-)

Prueba del rojo de metilo

Los fermentadores mixtos de ácidos producen suficiente ácido para disminuir el pH por debajo de 4.3

Caldo de glucosa. Después de la incubación, añadir indicador rojo de metilo a la muestra.

Diferenciar Escherichia (+, cultivo rojo) de Enterobacter y Klebsiella (generalmente-, cultivo amarillo).

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Reducción del nitrato El nitrato como aceptor de electrones alternativo, reducido a NO2

- o N2.

Caldo con nitrato. Tras la incubación, detectar nitrito con ácido α-naftilamina sulfanílico (color rojo). Si es negativo, confirmar que el NO3

- está aún presente añadiendo polvo de zinc para reducir el NO3- a NO2-. Si tras la adición del zinc no hay color, entonces NO3

-→NO2- .

Ayudar a la identificación de enterobacterias (generalmente +).

Prueba de la oxidasa El citocromo C oxida al aceptor de electrones artificial: tetrametail (o dimetil)-p-fenilendiamina.

Caldo o agar. Las colonias oxidasa positivas en agar pueden detectarse sumergiendo la placa en un reactivo y buscando colonias azuladas o marrones.

Separar Neisseria y Moraxella (+) de Acinetobacter (-). Separar enterobacterias (todas-). De pseudomonas (+). Ayudar a la identificación de Aeromonas (+).

Prueba de la oxidación-fermentación (O/F).

Algunos organismos producen ácido solamente cuando crecen en aerobiosis.

Producción de ácido en la parte alta del tubo de cultivo que contiene azúcar; el agar blando se utiliza para disminuir la mezcla durante la incubación

Diferenciar Micrococcus (producción de ácido solamente en aerobiosis) de Staphylococcus (producción anaeróbica de ácido). Caracterizar Pseudomonas (producción aeróbica de ácido) de enterobacterias (producción anaeróbica de ácido).

Prueba de la fenilalaníndesaminasa

La desaminación produce ácido fenilpirúvico que se detecta en una prueba colorimétrica.

Medio enriquecido en fenilalanina. Después del crecimiento, añadir cloruro férrico y buscar el color verde

Caracterizar el género Proteus y el grupo Providencia.

Hidrólisis del almidón El yodo-ioduro da un color azul con el almidón.

Crecimiento de un organismo en una placa que contiene almidón. Sumergir la placa en ioduro de Gram y buscar las zonas claras alrededor de las colonias.

Identificar los hidrolizadores típicos de almidón como Bacillus spp.

Prueba de la ureasa La urea (H2N – CO – NH2) se escinde en 2 NH3 + CO2

Medio con un 2% de urea y rojo de fenol como indicador. La liberación de amonio eleva el pH, intenso de color rojo rosado

Dsitinguir Klebsiella (+) de Escherichia (-). Distinguir Proteus (+) de Providencia (-)

Prueba del Voges-Proskauer

La acetoína es producida a partir de la fermentación de azúcares.

Prueba química para acetoína utilizando α-naftol.

Separar Klebsiella y Enterobacter (+) de Escherichia (-). Caracterizar los miembros del género Bacillus.

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Pruebas importantes para el diagnóstico clínico de bacterias y su utilización más frecuente (fuente: Brock “Biología de los Microorganismos, 1998)

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Zona de viraje pH Cambio de colorAzul de timol 1,2 – 2,8 rojo amarilloPúrpura de m-cresol 1,2 – 2,8 rojo a amarillo4- Dimetilaminoazobenzol 2,9 – 4,0 rojo a anaranjado amarillentoAzul de bromofenol 3,0 – 4,6 amarillo a violado rojizoRojo de Congo 3,0 – 5,2 violeta azulado a naranja rojizoNaranja de metilo 3,1 – 4,4 rojo a anaranjado amarillentoVerde de bromocresol 3,8 – 5,4 amarillo a azulIndicador mixto 4,4 – 5,8 violado rojizo a verdeRojo de metilo 4,4 – 6,2 rojo a anaranjado amarillentoTornasol 5,0 – 8,0 rojo a azulPúrpura de bromocresol 5,2 – 6,8 amarillo a púrpuraRojo de bromofenol 5,2 - 6,8 amarillo anaranjado a púrpuraAzul de bromotimol 6,0 – 7,6 amarillo a azulRojo de fenol 6,4 – 8,2 amarillo a rojoRojo neutro 6,8 – 8,0 rojo azulado a amarillo anaranjadoRojo de cresol 7,0 – 8,8 amarillo a púrpuraPúrpura de m-cresol 7,4 – 9,0 amarillo a púrpuraAzul de timol 8,0 – 9,6 amarillo a azulFenolftaleína 8,2 – 9,8 incoloro a violado rojizoTimolftaleína 9,3 – 10,5 incoloro a azulAmarillo de alizarina GG 10,0 – 12,1 amarillo claro a amarillo parduscoAzul de épsilón 11,6 – 13,0 anaranjado a violeta

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Indicadores de ácidos y bases más utilizados en las pruebas de Diagnóstico Clínco (fuente: Brock “Biología de los Microorganismos, 1998)

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IV. PARTE EXPERIMENTAL:

Materiales, Equipos y Reactivos:

Tubos de prueba Placa petri Mechero Papel de filtro whatman Caldo nutritivo Ácido sulfanílico Caldo úrea Caldo rojo de metilo Cloruro férrico Agar LIA Caldo lactosa Agar gelatina Solución clorhídrica Col. De dihidrocloruro de tetrametil parafenilendiamina Aguja y asa de kolle Gradilla Algodón Estufa a 35ºC Solución de peróxido de hidrógeno Agar nutritivo Ácido tartárico Reactivo de Kovac`s Agar citrato de Simmons Agar TSI Caldo glucosado Agar almidón Lugol

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Procedimiento:

Reducción de Nitratos a Nitrititos:

Se realiza la siembra en caldo de nitrato, luego de la incubación a 37ºC por un tiempo de 24 a 48h, se adiciona el reactivo de Griebs al cultivo.

Reactivo de Griebs

Caldo de nitrato

Prueba de Indol:

Se realiza la siembra en caldo de triptona, luego de la incubación a 37ºC por 24h se adiciona el reactivo de KOVAC´S de 2 a 3 gotas.

Reactivo de Kovac`s

Caldo de triptona

Asimilación de Citrato:

Se realiza la siembra en Agar de Citrato de Simmons, luego se incuba a 37ºC por 24h

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Tolerancia al Cianuro de Potasio:

Se realiza la siembra en un caldo nutritivo de 2ml que contiene 0.1ml de KCN, luego se realiza la siembra y se procede ala incubación a 37ºC por 24h.

Descarboxilación de la lisina:

Se realiza la siembra por picadura profunda en Agar Lía, se procede a la incubación a 37ºC por 24h

Formación de ácido fenil pirúvico:

Se realiza la siembra en agar nutritivo, luego se procede a incubar a 37ºC por 24-48h, para realizar la lectura se agrega Cl3Fe de 2 a 3 gotas Cl3Fe

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Oxidación fermentativa de la glucosa:

Se realiza la siembra por picadura profunda en dos tubos, luego uno de ellos se agrega cera líquida, incubación de 37ºC por 24-48h.

Hidrólisis de la Urea:

Se realiza la siembra en el caldo de la urea, incubación de 37ºC por 24h.

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Prueba de la Oxidasa:

Se obtiene papel de filtro watman impregnado con solución de Dihidrocloruro de tetrametil parafenilendiamina, luego con una asa de koller, se realiza una estria sobre el papel y se observa la reacción.

Prueba de la catalasa:

En un porta objeto se coloca la cepa, luego se agrega 2 a 3 gotas de peroxido de hidrogeno y se observa el desprendimiento de oxigeno.

Hidrólisis de la gelatina:

Se realiza la siembra por estrías del microorganismo en la placa petri que contiene agar, incubar a 37ºC por 24horas luego de esto se agrega gotas de solución clorhídrica y se expone por un minuto, luego enjuagar con agua corriente.

Cl3Mg

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Hidrólisis del almidón:

Se realiza la siembra por estrías por un agar de almidón al 1% en placa petri, incubar a 37ºC por 24horas, se adiciona gotas de lugol sobre la placa.

lugol

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V. RESULTADOS:

Salmonella typhi

PRUEBA RESULTADO COLORACIÓN

Reducción de nitritos a nitratos Positivo con formación de nitritos

Rojo ladrillo

Prueba de Indol Negativo Amarillo

Prueba de citrato de Simmons (P. de asimilación de citrato)

Positivo, se produce una alcalinización por el

amoniaco

Azul

Descarboxilación de la lisina Positivo , se produce una alcalinización en el pH

Amarillo en la superficie y morado en la parte de abajo

siendo este más intenso

Formación de APP (acido fenil piruvico)

Negativo,no hay cambios Coloración amarilla, no concuerda con el coloración

verde propia de las desaminación oxidativa

Reducción de nitritos a nitratos (Rojo ladrillo)

Prueba de Indol (Amarillo)

Prueba de citrato de Simmons (P. de asimilación de citrato) (Azul)

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Bioquímica de los Microorganismos - Microbiología

Formación de APP (acido fenil piruvico)

VI. DISCUSIONES:

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Bioquímica de los Microorganismos - Microbiología

Según BROCK MICHAEL T. MADIGAN, JOHN M. MARTINKS & JACK PARKER (1998) los microorganismos que al reducir los nitratos a través de la enzima nitrato reductasa, liberan gas nitrógeno, producen un resultado falso negativo con la metodología detallada previamente. Por eso, ante un resultado negativo, agregar unas granallas de Zinc y observar el color desarrollado. Esto permitirá dar el resultado definitivo de la prueba de reducción de los nitratos. Este enunciado fue comprobado en la experiencia de laboratorio.

Según LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA (2003) en la prueba del indol “ciertos microorganismos forman Indol por descomposición del aminoácido triptófano (indol-alanina) presente en la triptona. Después del periodo de incubación, la presencia del Indol se reconoce con el reactivo de Kovacs, integrado por p-dimetil-amino-benzaldehido, alcohol amílico y HCl concentrado, con el cual forma un estrato superficial de color rojo en el tubo de reacción”; en la práctica al realizar esta prueba con la salmonella tiphy nos dio una coloración roja al adicionar el reactivo de Kovacs lo que nos indica que la salmonella puede degradar al triptófano.

Según LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA (2003) en la prueba de Voges-Proskauser el periodo de incubación es de 24-48 horas utilizando el medio M.R.-V.P. (caldo glucosado-sal peptona), esta reacción consiste en establecer la formación de acetilmetil- carbinol o acetoína, producida por ciertos microorganismos a partir de la glucosa, con el reactivo de Barrit, constituido por alfa-naftol y KOH ; sin embargo en la guía de práctica se especifica que el periodo de incubación es de 3 días y los reactivos a usar son la creatina y el KOH .

La UNIVERSIDAD DEL ZULIA (2003) nos menciona que para la prueba del rojo de metilo se debe incubar el medio M.R.-V.P. (caldo glucosado-sal peptona) por 5 días (a 35ºC) para luego adicionar las gotas del indicador para observar la reacción del medio; no obstante en la guía de práctica se nos indica que el periodo de incubación debe ser 24 horas.

En la Prueba de asimilación del citrato se debe sembrar en el agar citrato de simmons con una aguja de Kohl poco cargada e incubar a 35ºC durante 72-96 horas y luego observar si ha habido desarrollo del cultivo o cambio del color verde al azul ,UNIVERSIDAD DEL ZULIA (2003) ; en la práctica el periodo de incubación del agar citrato de Simons fue 48 horas

VII. Conclusiones

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Bioquímica de los Microorganismos - Microbiología

Los microorganismos mueren con la presencia de los nitratos al ser esta una sustancia toxica.

La salmonella typhi descompone al nitrato en nitrito aprovechando el oxigeno que es liberado para su proceso de respiración

Las granallas de zinc sirven para confirmar que la reacción es negativa y que hay presencia de nitratos en la muestra además de descartar la posibilidad que el microorganismo haiga degradado o reducido el nitrato a nitrógeno

Si en la prueba de reducción de nitrato a nitrito al confirmar con las granallas de zinc no hay cambio de color es porque el microorganismo ha degradado hasta el final el nitrato y es muy ávido de oxigeno por lo que se podría decir que el microorganismo es un aerobio estricto.

La reducción total del nitrato es nitrógeno o nitrógeno celular. La salmonella tiphy nos dio negativo en la prueba del indol debido a que no

puede degradar el triptófano del caldo triptona. El reactivo de griess reacciona con los nitritos y debido a esto para saber si el

nitrato fue degradado por el microorganismo se le debe agregar este reactivo dándonos un color rojo ladrillo como prueba positiva.

La alfanaftilamina es la que detecta el nitrito pero en las condiciones que le da el acido sulfanílico y el acido tartárico.

En la prueba de la catalasa la enzima descompone el peróxido de hidrogeno en agua y O2 ,debido a esto se producen las burbujas formadas.

VII.- BIBLIOGRAFÍA:

BROCK MICHAEL T. MADIGAN, JOHN M. MARTINKS & JACK PARKER (1998), “Biología de los Microorganismos” 8va Edición, Editorial Grafilles (Group Fuproin) Impreso en España.

PDF: S. ROUSSOS & I. PERRAUD-GAIME (1986) “Fisiologia y Bioquimica de microorganismos utilizados en procesos de fermentación en medio sólido” Laboratorie de Biotechnologie PMC, Centre ORSTOM.

LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA (2003) “Microbiología De La Leche II” Maracaibo-Venezuela

QUEVEDO, F (1967) “Microbiología General: Prácticas De Laboratorio” UNFV Lima-Perú

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