biomedicÍnskÝ vÝzkum na prahu dalŠÍho tisÍciletÍ … 2008-10.pdf · 2014. 7. 24. · 2...

BIOMEDIC ÍNSKÝ VÝZKUM NA PRAHU DALŠ ÍHO T IS ÍC ILET Í

NOVINKY PRO STANOVENÍ ANEMI Í

INDIKACE A INTERPRETACE ONKOGENNÍCH MARKERŮ

MEMBRÁNOVÉ MOLEKULY NA BUŇKÁCH (MINULOST-PŘ ÍTOMNOST-BUDOUCNOST)

informační magazín číslo 10 - 2008

i n f o r m a č n í m a g a z í n č í s l o 1 0 - 2 0 0 82

Biomedicínský výzkum na prahu dalšího tisíciletí

(vědecké ústavy, nemocnice, vysoké školy)

oučasné intelektuální úsilí lidského rodu vyúsťuje v relativně dokonalé poznání procesů a pochodů na naší planetě. Mimořádně

se posouvá naše znalost o elementární povaze a struktuře jed-notlivých molekul nezbytných pro životní pochody. Je až neu-věřitelné, že kombinace několika málo chemických prvků je zdrojem bezpočtu organických molekul nejrůznějších vlastností

a funkcí.Vznikly nové obory jako genomika a proteomika, které souvisejí s rozvi-

nutím dvou celosvětových projektů – HUGO („Human Genome Organiza-tion“) a HUPO („Human Proteome Organization“). Mezi tyto obory lze zařadit i transkriptomiku, čímž jsou na molekulární úrovni dokonale uza-vřeny pochody ve vztahu fenotyp – genotyp, a to nejen u lidského orga-nismu.

V tomto úvodníku se omezíme pouze na pár poznámek týkajících se postavení biomedicínského výzkumu a jeho organizace v naší zemi. Zamyslíme se tedy nad schopnostmi našich výzkumných pracovníků pohybujících se v experimentální a klinické medicíně a nad jejich příno-sem v této oblasti. Už při detailnějším pohledu je zřejmé, že biomedicín-ský výzkum představuje zcela zásadní trend, ve kterém se musí velmi rozumně sladit jednotlivé složky nejen z hlediska strukturovatelnosti, ale především z hlediska vhodného využití finančních prostředků při řešení daných úkolů.

Každý vědecký pracovník je ve své výzkumné činnosti postaven před základní otázku obhajoby náplně své činnosti náplně své činnosti i její

V současné době dochází k obrovskému nárůstu vědeckých poznatků prakticky ve všech směrech lidského

bádání. Tato exploze přináší tolik informací, že není v silách jednoho člověka ji obsáhnout, a to ani v jednotlivých oborech.

úspěšnosti. Záleží tedy na něm, jak dalece je schopen formulovat tuto činnost, aby svým dílem obohatil lidské poznání a posunul dosa-vadní stav znalostí. Tím, že je vědecký pracovník odkázán na různé ústavy, instituce či vysoké školy, se jeho úsilí promítá do existence ústavů či škol, v nichž badatel pracuje, a také se spolu-podílí na jejich renomé. V podstatě se jedná o velmi aktuální otázky: kde, kdo, co a jak by se mělo řešit a navíc v tom pro řešení nalézt ta nej-lepší propojení. Jsou to v podstatě otázky spolu-práce mezi vědeckými ústavy České akademie věd, fakultními nemocnicemi a i vysokými ško-lami. Stručně řečeno, každá instituce má své výhody, ale je možné poukázat i na některé jejich problémy. Není třeba zdůrazňovat přínos vysokých škol jako líhně pro budoucí odborné pracovníky, kteří časem převezmou otěže v pokračování již stávajících institucí a ústavů. Není také třeba poukazovat na činnost fakult-ních nemocnic s jejich snahou zavádět nejmo-dernější metody pro nemocné a také s jejich možností záchytu souborů nemocných různých diagnóz. V neposlední řadě vědecké akademické ústavy se svojí tradicí a vybavením či potenciá-lem jsou přímo stvořené k řešení těch nej-složitějších otázek.

POKRAČOVÁNÍ NA STRANĚ 4

RNDr. Kristián Koubek, DrSc.

se narodil v Sušici. V roce 1969 absolvoval Přírodovědeckou fakultu UK v Praze (specializace obecná biologie a genetika) a úspěšně obhájil diplomovou práci na téma „Izoenzymy lidské sérové alkalické fosfomonoesterázy a krevní skupiny“, kterou vypracoval na oddělení klinické genetiky Biologického ústavu Fakulty všeobecného lékařství UK a v Ústavu hematologie a krevní transfúze v Praze. Vědeckou aspiranturu v Ústavu experimentální biologie a genetiky ČSAV završil kandidátskou dizertační prací na téma „Transplantační antige-ny“. V roce 1973 nastoupil na klinické oddělení Ústavu hematologie a krevní transfúze, kde v roce 1993 obhájil v oboru genetika doktor-skou práci na téma „Leukocytární antigeny v diagnostice a patoge-nézi krevních chorob“. V roce 1979 nastoupil na základě mezinárod-ního konkurzu na jednoroční studijní pobyt na Royal Free Hospital v Londýně, zaměřený na výzkum leukémií. Jako první v Českosloven-sku rozpracoval imunodiagnostiku krevních chorob (leukémií a lym-fomů) pomocí monoklonálních protilátek a zavedl detekci hemato-poetických kmenových buněk (CD34+) průtokovou cytometrií.

i n f o r m a č n í m a g a z í n č í s l o 1 0 - 2 0 0 8 3

ObsahBiomedicínský výzkum na prahu dalšího tisíciletí (vědecké ústavy, nemocnice, vysoké školy) 2

Obsah 3

Elektronická externí kontrola kvality eIQAPv hematologických laboratořích 5

Solubilní transferinový receptor (sTfR) – nová souprava pro analyzátory řady Access a DxI 6

Protilátky proti vnitřnímu faktoru (IFAb) 8

Nabídka pro stanovení anemií 8

Laboratorní proces do posledního šroubku 9

Onkogenní markery Indikace a interpretace 13

Manuální soupravy Immunotech na podzimní vlně dobrých zpráv 18

Membránové molekuly na buňkáchMinulost - přítomnost – budoucnost 19

Nové Eia Soupravy pro diagnostiku Celiakie 30

ParadigmTM 31

Časopis Cellular Research 31

Průtokový cytometr CellLab Quanta SC MPL 31

Validace a verifi kace IVD 32

EDMA už má svoje zastúpenie aj na Slovensku 34

Kongres ISAC v Budapešti 34

Vision Centrum v Paříži 35

Integrovaný systém UniCel DxC 880i – Panochova nemocnice Turnov 35

XV. Slovensko-Česká konferencia o hemostáze a trombóze s medzinárodnou Účasťou 38

Uživatelské setkání FreeliteTM 39

Laboratórna diagnostika v medicíne 2008 40

Výrobní útvar 41

Útvar zabezpečování jakosti a regulatory affairs (ÚZJ) 42

Křížovka o ceny 43

Kde se můžeme setkat (září – prosinec 2008) 44

Konference/seminář s účastí společnosti Immunotech a.s. formou stánku

Časopis vydává a distribuujeIMMUNOTECH a.s., Radiová 1, 102 27 Praha 10www.beckman.cz

Časopis připravujíMgr. Pavel KružíkMgr. Patrik ŠafRNDr. Helena Kurzweilová, CSc.RNDr. Běla Říčařová, CSc.Ing. Petr SuchanMgr. Markéta KrupařováIng. Kateřina KožanáIng. Eva KrálováRNDr. Jozef Smolka

Do časopisu přispěliRNDr. Kristián Koubek, DrSc. - Ústav hematologie a krevní transfúze RNDr. Běla Říčařová, CSc. Ing. Petr Boudal Ing. Mgr. Tereza Tietze Ing. Kateřina Lapišová RNDr. Štěpán Tintěra Prof. MUDr. Ondřej Topolčan, CSc. - FN Plzeň RNDr. Helena Kurzweilová, CSc. Mgr. Patrik Šaf Ing. Eva Králová Mgr. Pavel Kružík Ing. Petr Šmídl, CSc. Ing. Jitka Černá Mgr. Martina SalátováIng. Lukáš Palivec, PhD. Mgr. Helena Bazovská RNDr. Iva Ouhrabková - Krajská nemocnice Liberec RNDr. Mária Gavelová, CSc. RNDr. Miroslav KušiakRNDr. Jozef Smolka Mgr. Markéta Krupařová Monika Lahodová - titulní fotoIvan Šarkan - autor křížovky

Grafi cká podoba Nina Nováková

Tiskárna REPRO servis s. r. o.Starochuchelská 15/195, 159 00 Praha 5

Náklad čísla 1600 výtisků


Propojením našich univerzit se špičkovými vědeckými ústavy by se určitě dala zvýšit úroveň výzkumu.

POKRAČOVÁNÍ ZE STRANY 2

Takže by se dalo na první pohled říci, že naše země má velmi dobrou strukturu k řešení těch nejzávažnějších problémů, které v medicíně vyvstá-vají. Navíc naše země není sužována nemocemi jako malárie a některá virová onemocnění ohrožující její populaci, jak je tomu v jiných zemích, a tak není zdánlivě takový tlak je v naší zemi studovat. O to víc je potěšu-jící přínos českých vědců v otázkách léčby nemoci AIDS a některých krev-ních chorob (např. chronické lymfoidní leukémie). Měnící se potřeby naší společnosti, do kterých pronikají i názory široké veřejnosti, mohou upravit organizační a institucionální struktury, aby podpora výzkumu z veřejných prostředků byla co nejracionálnější. To sice může vyznít jako zažitá záležitost, protože již bylo mnoho řečeno o výkonnosti a efektivnosti výzkumu a o odstranění některých jeho nedostatků. O případných změ-nách v politice výzkumu a vývoje se dozvídáme z oficiálních dokumentů vlády nebo parlamentu. Zde se uvádí, že v porovnání se zahraničím lze nalézt nižší výkonnost českého výzkumu, vyjádřenou nižšími počty publi-kací a citací v renomovaných časopisech.

Jednou ze snah o zlepšení některých nedo-statků je vytvoření center špičkového výzkumu. Není ani tak problém v tom, co by se mělo oče-kávat od výzkumných center, jako v otázce jejich praktického naplnění. Z veřejné diskuse o pro-gramu národně výzkumných center zaznívaly názory, že se jedná hlavně o dosažení špičko-vých výsledků, o konkrétní, věcný i časový pro-gram práce za spolehlivého systému řízení a kontroly. Je chvályhodné, že se v těchto cent-rech mohou soustřeďovat pracovníci stávajících výzkumných organizací, kteří na řešení kom-plexních úkolů mají zajištěnou finanční podpo-ru ze státního rozpočtu.

O špičkové výzkumné činnosti na vysokých školách se dá velmi těžko hovořit, protože k tomu mnohde nejsou vytvořeny adekvátní podmínky. Např. Univerzita Karlova, jako jedna z nejstarších univerzit v Evropě, vyznívá ve srovnání s ostatními univerzitami velmi špatně, takže se nachází až na chvostu tří set hodnoti-telných univerzit. Tato univerzita nemá vhodné zázemí pro provozování biomedicínského výzkumu ve srovnání se špičkovými zahraniční-mi univerzitami. Propojením našich univerzit se špičkovými vědeckými ústavy by se určitě dala zvýšit úroveň výzkumu, aby jeho výsledky byly adekvátní vynaloženým finančním pro-středkům. Může vyvstat problém, který lze cha-rakterizovat jako kvalita vědeckých pracovníků. Kvalita vědeckých pracovníků se posuzuje počtem publikací a citací v renomovaných časopisech, a tak je výkonnost českého výzku-mu daleko nižší, než je tomu v anglicky mluví-cích zemích. Z toho vyplývá, že dobrou práci s dopadem do renomovaných časopisů lze nej-snáze provádět na zahraničních pracovištích, a to nejlépe v zemi, kde je angličtina národním jazykem.

O přínosu vědy nemá smysl vůbec pochybo-vat, protože dosažené poznatky pronikají do činnosti lidí na každém kroku. Prozatím není v naší zemi mnoho vědců, kteří na biomedicín-ském poli vynikli a jsou i mezinárodně uznáváni. Lze si tedy jenom přát, aby se lepší podmínky v našem biomedicínském výzkumu odrazily také v kvalitních výsledcích práce a ocenění osob-ností vědeckého života, na které bude naše země právem hrdá.

RNDR. KRISTIÁN KOUBEK, DRSC.

KLINICKÝ ÚSEK, ÚSTAV HEMATOLOGIE

A KREVNÍ TRANSFÚZE,

U NEMOCNICE 2, 128 20 PRAHA 2

E-MAIL: [email protected]

BĚLA ŘÍČAŘOVÁ



Elektronická externí kontrola

kvality eIQAP v hematologických

laboratoříchoncern Beckman Coulter nabízí uživa-

telům všech typů hematologických ana-lyzátorů Coulter rychlý, jednoduchý a poho-dlný cyklus elektronické externí kontroly

kvality eIQAP (electronic Interlaboratory Quality Assurance Program), který je postaven na vámi již používaných kont-

rolních materiálech Coulter 4C® a Coulter 5C®. Pouhým stisknutím několika kláves pošlete vybrané výsledky svých kontrol na zabezpečenou webovou stránku a dostanete zpět komplexní analýzu včetně úplné statistiky; srovnání vašich dat s daty velké skupiny účastníků tohoto cyklu na celém světě. Navíc je tato služba pro uživatele analyzátorů, rea-gencií a kontrol Beckman Coulter bezplatná.

Výhody tohoto kontrolního cyklu jsou zřejmé:� úspora času a materiálu využitím výsledků, zís-

kaných při rutinních denních kontrolách, � jednoduchý přístup na zabezpečené webové

stránky pomocí hesla a přiděleného kódu,� aktuální výsledky vždy po expiraci příslušné šarže

kontrol (nejméně 12 cyklů ročně pro každého účastníka!),� trvalá možnost prohlížení historie minulých cyk-

lů (zálohování 1 rok),� elektronická forma umožňuje redukci obtížného

„papírování“,� kontrolní cyklus eIQAP je mezinárodně uznávaný

při akreditacích.

Jak postupovat při registraci do kontrolního cyklu eIQAP?Prvním krokem je přihlášení uživatele na stránkách www.beckmancoulter.com. Po otevření stránky zadáte do lišty s adresou novou adresu www.beckmancoulter.com/eiqap.Otevře se stránka kontrolního cyklu a na ní zvolíte „Registrace“.

Obdržené dva kódy spolu s vaším přihlašovacím jmé-nem a heslem vám umožní vstup do programu eIQAP tlačítkem „Login“ na stejné stránce jako v prvním kroku registrace www.beckmancoulter.com/eiqap.

Uvnitř programu eIQAP již budete postupovat krok za krokem přesně podle pokynů nápovědy a průvodce pro nové uživatele. Podrobný návod

Vlastní registrace má tři kroky:

Zadání uživatelského jména a hesla pro pozdější přístup na stránky kontrolního cyklu.

Potvrzení zadaných informací nebo jejich případná oprava a odeslání k registraci.

Po úspěšné registraci vám bude během několika dnů přidělen pětimístný IQAP Participant Number a Passcode identifi kační kód (písemně e-mailem i poštou).

(Help) a veškerou dokumentaci k programu eIQAP také najdete na webových stránkách koncernu Beckman Coulter www.beckmancoulter.com, pokud do malého okénka vyhledávače (Search) zadáte heslo eIQAP.

Bezplatný cyklus externích kontrol je dalším z mnoha kroků koncernu Beckman Coulter ke zkvalitnění služeb našim zákazníkům a jistě také vítaným příspěvkem k vyšší spolehlivosti výsledků a ekonomičtějšímu provozu vašich laboratoří.

PETR BOUDAL



Solubilní transferinový receptor (sTfR) – nová souprava pro

analyzátory řady Access a DxIPanel fi rmy Beckman Coulter pro stanovení anemií se v tomto roce opět rozrostl, tentokrát o soupravu pro stanovení solubilního transferinového

receptoru. V následujících řádcích vás stručně seznámíme s možností využití tohoto stanovení v klinické praxi.

udeme se věnovat anemii z nedostatku železa (Iron Defi ciency Ane-mia – IDA), která je nejčastějším typem anemie, a také druhému

nejběžňějšímu typu - anemii způsobené chronickým onemocněním (Anemia of Chronic Disease - ACD), např. zánětem, nádorem, autoi-munitním onemocněním nebo chronickým onemocněním ledvin.

Metabolismus železaPo absorpci enterocyty se železo váže na transferin, protein přítomný v cirkulaci. Ten zajišťuje transport železa mezi místem absorpce, skladování a využití železa. Hlavním místem využívání železa je kostní dřeň.

Laboratorní diagnostika nedostatku železa je založena na vyhodnocení stavu železa v organismu a hematologických parametrech. Běžné diagnostické testy jsou založeny na stanovení železa v séru, transferinu, ferritinu a saturace transferinu. Ferritin v séru je markerem zásoby železa v organismu.

Transferinový receptor a solubilní transferinový receptor

Transferin předává železo do buněk pomocí interakce se specifi ckým membránovým recep-torem nazývaným transferinový receptor (TfR). TfR je homodimer složený ze dvou 95 kDa jed-notek svázaných disulfi dickými můstky. Každá část má 61 aminokyselin, N-terminální cyto-plasmatickou doménu, krátký transmembrá-nový úsek a velkou extracelulární doménu (viz. obr. 1). Každý TfR může vázat jednu, pří-padně dvě molekuly kompexu Fe-transferin.

Solubilní transferinový receptor (sTfR) vzniká proteolýzou extracelulární domény na specifi c-kém místě TfR a může být měřen v séru nebo v plasmě. Vztah mezi koncentrací TfR a sTfR

v séru a plasmě je konstatní, proto koncentrace sTfR v séru nebo plasmě slouží k nepřímému měření celkového množství TfR.

Klinické využití stanovení sTfR1. Diferenciální diagnostika IDA a ACDHlavní oblastí využití stanovení sTfR je diferenciální diagnostika IDA a ACD. Diagnos-tikovat ACD může být složité z důvodu možné interference dalších vlivů jako nedo-statku železa, krevních ztrát, užívání léků nebo přítomnosti jiných forem hemoglobi-nu (např. thalasemie). Stanovení distribuce železa v organismu se používá při diagnostice ACD k vyloučení přítomnosti IDA. Standardní měření stavu železa v orga-nismu jako ferritin, celková vazebná kapacita železa a železo v séru ovšem může být přímo ovlivňováno chronickou nemocí, způsobující nejisté výsledky. Například ferritin je protein akutní fáze, proto jeho cut off hodnoty neplatí pro pacienty s infekcí nebo zánětem. Naproti tomu sTfR není protein akutní fáze a nekoreluje s markery zánětu, jako je CRP nebo sedimentace erytrocytů. Použití poměru sTfR/log ferritinu může

zvýšit specifi citu stanovení anemie u pacientů s chro-nickým onemocněním (viz. tab. 1, obr. 2).

2. Monitorování erytropoézy a odezva na léčbu erytropoetinemDalší studie ukazují použití sTfR k monitorování eryt-ropoézy. Po poklesu sTfR před transplantací kostní dřeně nebo kmenových buněk se po obnovení erytro-poézy vrací hladina sTfR na původní hodnoty.

Při léčbě lidským rekombinantním erytropoetinem se změny v hladině sTfR projevují dříve, než mohou být detekovány změny v hodnotách hematokritu. Z tohoto důvodu může být při sledování sTfR dříve provedena korekce podávání erytropoetinu a železa.

ShrnutíPoužití stanovení sTfR v kombinaci s ferritinem v séru a ostatními markery stavu železa může zlepšit diagnó-zu a léčbu pacientů s anemií. Poměr sTfR/log ferritin pomáhá rozlišit IDA a ACD. Stanovení sTfR lze rovněž využít k monitorování erytropoézy po transplantaci kostní dřeně.

Pro objednání:

PN NázevA32493 Access sTfR 2x50 testsA32494 Access sTfR CalibratorsA32495 Access sTfR QC

Literatura1. WHO/UNICEF/UNU, Iron defi ciency anaemia:

assessment, prevention, and control. Geneva, World Health Organization, 2001 (WHO/NHD/01.3).

2. Weiss G, Goodnough LT. Anemia of chronic disease. N Engl J of Medicine 2005;352(10): 1011-1023.

3. Andrews N. Disorders of iron metabolism. N Engl J of Medicine 1999;341:1986-95.

4. Goodnough LT, Skikne B, Brugnara C. Erythropoietin, iron, and erythropoiesis. Blood 2000;96(3):823-833.

5. K/DOQI, National Kidney Foundation. Clinical practice recommendations for anemia in chronic kidney disease. Am. J. Kidney Dis. 2006; 47(5 Suppl 13):S86-S108.

6. Beguin Y. The soluble transferrin receptor: biological aspects and clinical usefulness as

Obr. 1: Lidský transferinový receptor


quantitative measure of erythropoiesis. Hematologica 1992;(77):1-10.

7. Feelders R. Structure, function and clinical signifi cance of transferrin receptors. Clin Chem Lab Med 1999;37:1-10.

8. Worwood M. Serum transferrin receptor assays and their application. Ann Clin Biochem 2002;(39):221-230

9. Mast AE et al. Clinical utility of the soluble trans-ferrin receptor and comparison with serum ferritin in several populations. Clinical Chemistry 1998;44(1):45-51.

10. Sawhney MS, et al. Should patients with anemia and low normal or normal serum ferritin undergo colonoscopy? Am. J. Gastroenterol. 2007, 102(1):82-88.

11. Punnonen K, Irjala K, Rajamaki A. Serum transferrin receptor and its ratio to serum ferritin in the diagnosis of iron defi ciency. Blood 1997;89(3):1052-1057.

12. O’Brion S. Evaluation of serum transferrin receptor assay in a centralized iron screening service. Clin Lab Haem 2005;(27):190-194.

13. Suominen P, Punnonen K, Rajamaki A, Irjala K. Serum transferrin receptor and transferrin receptor-ferritin index identify healthy subjects with sub clinical iron defi cits. Blood 1998;92(8):2934-2939.

14. Shih, Y.J. et al. Serum transferrin receptor is a truncated form of tissue receptor. J. Biol. Chem. 1990;(265):19077.

15. Baynes, R.D. et al. Production of soluble transferrin receptor by K562 erythroleukemia cells. Proc. Soc. Exp. Med. 1993;(204):65.

16. Beguin, Y. et al. Transferrin receptors in rat plasma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 1988;(85):637.

17. Cook, J.D. et al. Serum transferrin receptor. Annu. Rev. Med. 1993;(44):63.

18. Ferguson, B.J. et al. Serum transferrin receptor distinguishes the anemia of chronic disease from iron defi ciency anemia. J. Lab. Clin. Med. 1992;(119):385.

19. Baer, A.N. et al. The pathogenesis of anemia in rheumatoid arthritis: a clinical and laboratory analysis. Sem. Arth. Rheum. 1990;(19):209.

20. Allen J, Backstrom KR, Cooper JA, Cooper MC, Detwiler TC, Essex DW, Fritz RP, Means, Jr. RT, Meier PB, Pearlman SR, Roitman-Johnson BR, Seligman PA. Measurement of soluble transferrin receptor in serum of healthy adults. Clinical Chemistry 44:135–39 (1998)

21. Baillie FJ, Morrison AE, Fergus I. Soluble transfer-rin receptor: a discriminating assay for iron defi -ciency. Clin. Lab. Haem. 2003, 25, 353–357.

TEREZA TIETZE


KATEŘINA LAPIŠOVÁ


Marker ACD IDA ACD + IDA

Železo snížené snížené snížené

Transferin snížený až normální zvýšený sníženýTransferinová saturace snížená snížená snížená

Ferritin normální až zvýšený snížený snížený až normální

sTfR normální zvýšený normální až zvýšenýPoměr sTfR/log ferritinu nízký (< 1) vysoký (>2) vysoký (>2)

Cytokiny zvýšené normální zvýšené

Tab. 1: Markery sloužící k rozlišení anemie z chronické nemoci a anemie z nedostatku železa

Copyright © 2005 Massachusetts Medical Society

Obr. 2: Navrhovaný algoritmus použití poměru sTfR/log ferritin k diferenciální diagnostice IDA, ACD a ACD s nedostatkem železa

Copyright © 2005 Massachusetts Medical Society

Biochemické nebo klinické projevy zánětu

Saturace transferrinu< 16 %

Anemie

Vyloučení ostatních příčin

anemie

Stanovení solubilního transferrinového

receptoru

sTfR / log ferritin > 2

sTfR / log ferritin < 1

Ferritin30 – 100 ng/mL

Ferritin< 30 ng/mL

Ferritin> 100 ng/mL

IDA ACD s nedostatkem

železa

ACD


Protilátky proti vnitřnímu faktoru (IFAb)

irma Beckman Coulter nabízí na imunochemických analyzátorech řady Access/DxI jako jediná soupravu na stanovení protilátek proti vnitřnímu faktoru (IFAb)

Vnitřní faktor (Intristic Factor) hraje důležitou roli při vstřebávání vitaminu B12. Vitamin B12 je z potravy uvolňován trávicími proteiny v žalud-ku, kde je poté vázán B12-vazebnými proteiny. V tenkém střevu se z nich opět vitamin B12 uvolní a váže se na vnitřní faktor. Komplex vitamin B12 – vnitřní faktor je vázán sliznicí ilea a vitamin B12 je uvolněn do krve.

Perniciózní anemie, nejčastější příčina nedostatku vitaminu B12, je chronické autoimunitní onemocnění charakterizované destrukcí žaludeční sliznice. Pří-tomnost protilátek proti buňkám žaludeční sekrece a přímo proti vnitřnímu faktoru svědčí o perniciozní anemii (viz. obr. 1).

Pro objednání:

TEREZA TIETZE


KATEŘINA LAPIŠOVÁ


Obr. 1: Navrhované schéma laboratorní diagnózy pernicióní anemie za použití protilátek proti vnitřnímu faktoru (IFAb)

Makrocytární anemie

Folát Vitamin B12

IFAb Jiné příčiny

Perniciózní anemie

PN Název

387992 Access IFAb 2x50 tests

387993 Access IFAb Calibrators

387999 Access IFAb QC

Nabídka pro stanovení anemií

e stále pokračujícím procesem kon-solidace laboratoří do velkých labora-

torních komplexů přestala být diagnóza anémií výsadou hematologických laboratoří. Stále více je kladen důraz na kompletní hodnocení stavu paci-

enta v širších souvislostech. Doplněním výsledků z hematologických analyzátorů o další testy lze jednoduše a v krátkém čase zjistit i drobné odchyl-ky od fyziologických hodnot. To ve výsledku vede k přesnějšímu určení diagnózy a současně šetří čas, který by pacient a lékař musel strávit podrobnějším vyšetřením v hematologické ambulanci. Zároveň vět-šina laboratoří směřuje k minimalizaci počtu analyzá-torů na pracovišti v rámci omezení nákladů a snížení nároků na obsluhující personál. Firma Beckman Coul-ter proto nabízí na svých analyzátorech kompletní spektrum markerů pro stanovení anemií. Pro toto široké spektrum vyšetření postačí mít v laboratoři pouze 2 přístroje – kombinovaný systém řady UniCel a hematologický analyzátor HmX/LH. Tyto přístroje navíc zvládnou kompletní rutinní provoz.

Hematologické analyzátory řady AcT/HmX/LH� RBC� HGB – hemoglobin� MCV – střední objem erytrocytů� MCH – barvivo� MCHC – koncentrace hemoblobinu� RDW – míra anizocytózy� Retikulocyty� MRV – střední objem retikulocytů� IRF – maturační index retikulocytů� NRBC – normoblasty (erytroblasty)� MAF – microcytic anemia factor

Analyzátory řady UniCel (DxC/DxI/DxC880i)/Access� Haptoglobin� IBCT� Železo� Transferin� Ferritin� Vitamin B12� Folát� EPO - erytropoetin� Solubilní transferinový receptor (sTfR)� Protilátky proti vnitřnímu faktoru (IFAb)

TEREZA TIETZE



Laboratorní proces...…do posledního šroubku

a začátek malá rekapitulace. V minulých článcích jsem hovořil o výhodách znalosti laboratorního

procesu pro jeho efektivní řízení. Dále jsem se v minulém čísle snažil popsat metodiku, jak přistoupit

k popisu laboratorního procesu for-mou kladení otázek a zaznamenávání odpovědí a jejich kombinaci zaznamenat formou vývojového diagramu, jako základní kostru laboratorního pro-cesu v laboratoři. Na konci minulého článku jsem upozornil i na skutečnost, že k popisu procesu je potřeba se po čase vrátit. To právě teď učiním.

Předpokládejme, že na základě vaší analýzy formou otázek máte nyní schéma vašeho labora-torního procesu. Pokud se k vašemu schématu vracíte po delší době, může se stát, že vám něk-teré kroky procesu, tak jak jste je zaznamenali posledně, nejsou srozumitelné nebo že byste je dnes zaznamenali jinak. V tom případě se na tu část procesu zaměřte a pokuste se jej popsat znovu. Zvolte k tomu stejný přístup jako minule, tj. hledejte odpovědi na to, jaký je váš proces formou otázek. Původní variantu nezavrhujte a archivujte ji.

V další části článku bych se rád zaměřil na cha-rakteristiku jednotlivých kroků procesu z hlediska jejich vlivu na zpracovávaný materiál a data, z pohledu vlivu na rychlost procesu, jeho kapacitu, vlivu na kvalitu výsledku, z pohledu možného vzni-ku chyb, vlivu lidského faktoru a také vlivu procesu na personál laboratoře. Účelem je vyhledat v pro-cesu klíčová místa, která zásadně ovlivňují kapacitu procesu a kvalitu výstupu. I zde můžeme použít metodu otázek a odpovědí, v tomto případě tzv. uzavřených otázek, tj. otázek, kde odpověď zní buď „ano“ nebo „ne“. Pokud máte všechny kroky ve vašem schématu z hlediska vykonávané činnosti popsané srozumitelně, nemělo by se stát, že nebu-dete schopni odpovědět.

Příklad uzavřených otázek:Hromadí se v tomto konkrétním kroku vzorky?Čekají v tomto kroku vzorky na další zpracování?Je tento krok úzkým hrdlem procesu z pohledu jeho výkonu (kapacity)?Ohrožuje tento krok kvalitu vzorku?Ohrožuje tento krok kvalitu výsledku?

Hrozí destrukce vzorků?Ohrožuje v tomto kroku zpracovávaný vzorek personál?Hrozí v tomto kroku chyba způsobená lidským faktorem?Liší se v tomto kroku způsob zpracování rutinních a STAT vzorků?…atd.

Na základě odpovědí (ANO/NE) jste nyní schopni do vašeho schématu popisu laboratorního procesu zaznamenat vliv daného kroku na kvalitu vzorku, a tedy i na kvalitu výstupu procesu, na vliv personálu, vliv na personál, vliv na kapaci-tu a výkon procesu atd. Vlivy jednotlivých kroků můžete do schématu zazna-menat formou „ikon“ charakteristických pro jednotlivé vlivy. Já osobně použí-vám symboly dopravních značek. Například pro nárazové nahromadění vzorků používám dopravní značku „kolona“, pro krok, kdy vzorek ohrožuje své okolí, dopravní značku „odletující štěrk“. Pro úzké hrdlo procesu značku „zúžené komunikace“, pro krok, kde vzorky čekají na další zpracování, symbol „parkoviš-tě“ atd. (viz. tabulka č. 1 a příklad schématu). Na tomto místě doporučuji vytvo-řit si vlastní legendu k vámi použitým symbolům.

Volba sady symbolů je čistě na každém z vás. Tady se může projevit vaše nápaditost a tvořivost, vaše představivost, dokonce i vaše mimopracovní zájmy a záliby. Například symboly používané v říční dopravě, symboly námořní komu-nikace, symboly bezpečnosti práce apod. mohou posloužit stejně, ne-li lépe pro charakteristiku jednotlivých kroků v procesu.

Vážený čtenáři, možná oceníš moji neodbytnost a přečteš si další článek, pokračování popisu laboratorního procesu, nebo naopak

otráveně otočíš list. Přesto pro ty, které toto téma v minulých číslech našeho časopisu zaujalo, přinášíme další pokračování.

Hromadění vzorků (např. na příjmu při zadávání informací do LISu). Hromadění vzorků je způsobeno nedostatečnou kapaci-tou personálu, způsobem práce.

Vzorky čekají (například pro vložení vzorků do centrifugy), čekání je způsobena kapacitou technologie.

Okolí, zpracování vzorku ohrožuje jeho kvalitu.

Vzorek dává přednost jinému typu vzorku, zpracování jiného typu.

Čekání vzorku ohrožuje kvalitu výstupu, vzorek nesmí čekat například STAT.

Úzké hrdlo procesu (například centrifugace, alikvotace vzorku).

Nutná visuelní kontrola vzorku.

Vzorek ohrožuje okolí (kontaminace technologie, kontaminace ostatních vzorků, kontaminace obsluhy).

Tab. 1: Příklad legendy


Názorné schéma


Tab. 2: Popis činností, vlivy a rizika

Pracoviště Prováděné činnosti Popis činnosti Vliv/Riziko

Příjem Příjem vzorku Fyzické převzetí vzorků personálem příjmu Možná ztráta vzorku, poškození

Fyzické převzetí dokumentace vzorků (žádanky) Možná ztráta žádanky/nemožnost provedení vyšetření

Kontrola integrity vzorků, kontrola identifi kace vzorku Nekvalitní vzorek, vliv na kvalitu výsledku, zmatečná identifi kace vzorku

Kontrola kompletnosti žádanky Nekompletní žádanka, chybějí údaje pro identifi kaci vzorku, nečitelnost žádanky

Třídění vzorků Dle typu vzorku (materiál vzorku) Časově náročná operace, rutinní operace

Dle naléhavosti (rutina/STAT) Časově náročná operace, riziko záměny, větvení procesu dalšího zpracování

Další/jiná (možná) kritéria třídění vzorků

Zpracování žádanky Zadaní pacienta/vzorku do LISu Urgentní činnost pro zaznamenání vzorku v systému, možný zdroj chyb

Označení žádanky Možná záměna

Označení primární zkumavky

Přiřazení jednotlivých požadovaných vyšetření ke vzorku

Možná záměna

Tisk čárových kódů pro označení primárních zkumavek Určující činnost pro další zpracování vzorku v procesu

Označení primární zkumavky štítkem s čárovým kódem

Možná záměna, znehodnocení vzorku špatným nalepením štítku na zkumavku

Centrifugace Příprava centrifugace Obsluha přebírá roztříděné (rutina/STAT) vzorky z příjmu na zpracování centrifugací

Čekání na vzorek, různé zpracování různých typů vzorku dle naléhavosti

Obsluha se rozhoduje o vytíženosti jednotlivých centrifug, množství vložených vzorků (workload) na základě momentálního počtu vzorků čekajících na zpracování

Významný vliv na výkon a kapacitu procesu, riziko prostojů, vliv na TAT vzorku

Vyvažování rotoru centrifugy (množství vzorků) Časově náročná operace, vliv na kvalitu centrifugace

Vkládání centrifugačních kyvet do rotoru centrifugy Nehrozí významné riziko

Vlastní centrifugace Obsluha dohlíží na vlastní průběh centrifugace Prostoj

Ukončení centrifugace

Obsluha po ukončení vlastní centrifugace rozhoduje o prostojích vzorku (stání vzorků v centrifuze po ukončení separace)Vyjmutí kyvet z centrifugy

Vyjmutí zkumavek z centrifugačních kyvet

Kontrola kvality vzorku po centrifugaci

Třídění vzorků pro další zpracování (alikvotace, transport k analýze), vkládání vzorků do patřičných stojánků

Alikvotace Příprava alikvotace Příprava sekundárních zkumavek/capů, eppendorfek atd.Tisk štítků pro označení sekundárních zkumavek

Příprava pipet, špiček a jiného materiálu pro alikvotaci

Odvíčkování primární zkumavky

Vlastní alikvotace Přenesení požadovaného objemu vzorku do sekundární zkumavky

Ukončení alikvotace Uzavření/Neuzavření sekundární zkumavky s alikvotemUzavření/Neuzavření primární zkumavky se vzorkem

Označení sekundárrní zkumavky identifi kačním štítkem s čárovým kódemUmístění sekundární a primární zkumavky do stojánku/TříděníTransport stojánku se vzorkem k dalšímu zpracování


Legendu můžete vytvářet postupně tak, jak přicházíte u jednotlivých kroků procesu k jejich možným vlivům, případně charakteristickým znakům pro daný krok. Pokud ale nebudete okamžitě po zavedení symbolu zaznamenávat jeho význam do legendy, může se stát, že později budete mít problém s defi nicí významu nebo pro daný rys, vliv nebo riziko kroku budete mít více symbolů. Je rovněž dobré význam symbolu popsat konkrétním příkladem.

A nyní přistupme k praktickému procvičení na konkrétním příkladě. Jako pří-klad jsem zvolil zjednodušený proces příjmu a preanalytického zpracování vzorku v laboratoři.

Volba sady symbolů je čistě na každém z vás. Tady se může projevit vaše nápaditost a tvořivost, vaše představivost, dokonce i vaše mimopracovní zájmy a záliby. Například symboly používané v říční dopravě, symboly námořní komu-nikace, symboly bezpečnosti práce apod. mohou posloužit stejně, ne-li lépe pro charakteristiku jednotlivých kroků v procesu.

Legendu můžete vytvářet postupně tak, jak přicházíte u jednotlivých kroků procesu k jejich možným vlivům, případně charakteristickým znakům pro daný krok. Pokud ale nebudete okamžitě po zavedení symbolu zaznamenávat jeho význam do legendy, může se stát, že později budete mít problém s defi nicí významu nebo pro daný rys, vliv nebo riziko kroku budete mít více symbolů. Je rovněž dobré význam symbolu popsat konkrétním příkladem.

A nyní přistupme k praktickému procvičení na konkrétním příkladě. Jako pří-klad jsem zvolil zjednodušený proces příjmu a preanalytického zpracování vzorku v laboratoři.

Uvedené schéma je za účelem přehlednosti záměrně zjednodušené. Jednot-livé kroky lze popsat podrobněji a doplnit celou řadu dalších symbolů k jejich popisu.

Pro popis procesu je vhodné si na základě již vytvořeného vývojového diagra-mu vytvořit tabulku jednotlivých činností na jednotlivých úsecích zpracování vzorku a dat s konkrétním popisem činnosti a s uvedením možného vlivu či rizika prováděného kroku (viz. tabulka č. 2) na konečný výsledek stanovení, poškození materiálu, ohrožení personálu, technologie, možnost vzniku chyby atd.

Při tvorbě takové tabulky se může stát, že proces popsaný formou vývojové-ho diagramu je potřeba upravit. V tom případě tak učiňte a nezapomeňte si opět zálohovat (archivovat) původní verzi. Konfrontace vývojového diagramu a tabulky je další návodem, jak lépe, podrobněji a přesněji popsat laboratorní proces do posledního šroubku.

Označení, kategorizace a roztřídění jednotlivých kroků v laboratorním procesu je důležité z pohledu vlivu na konečnou kvalitu, možné eliminace rizika, které daný krok s sebou nese. Po kategorizaci kroků je potřeba provést jejich sumarizaci, tedy součet vlivů jednotlivých kategorií v celém procesu (viz. tabulka č. 3).

V příštím čísle si obdobný proces zopakujeme na analytické, popř. postana-lytické fázi laboratorního provozu. V dalších pokračováních tématu „Labora-torní proces“ bych se rád věnoval i možnostem, jak tento proces na základě jeho popisu, poznání a analýzy zjednodušovat, inovovat a automatizovat. Dal-ším ze zajímavých témat je i metrika procesu, která objektivně charakterizuje

kvalitu, výkon a ekonomičnost procesu. Zajímavý-mi tématy je situační lokalizace procesu v prostoru laboratoře, uplatnění tzv. midleware a fi rmware prostředků a bezpochyby i laboratorního infor-mačního systému.

Co je na laboratorním procesu to zajímavé z pohledu chápání světa? Pro mě je to poznání, že tady funguje to, co i v jiných lidských činnostech, jako je teorie relativity, teorie neurčitosti, metafyzi-ka, dialektika a celá řada dalších teorií. Například pokud budeme popisovat zpracování jednoho vzorku, pravděpodobně nám to nebude dělat pro-blém. Jakmile daný popis aplikujeme na větší množství vzorků, zjistíme, že vše je relativní, a dokonce, že naší laboratoří procházejí vzorky, u kterých ani netušíme, jak jsou zpracovávány. Pokud nebudeme schopni přesně říci, kde se v dané chvíli vzorek v laboratoři nachází, nebudeme schopni určit, jakou fází zpracování prochází. Stej-ně tak pokud nebudeme vědět, jaká vyšetření již byla provedena, budeme mít pravděpodobně pro-blém vzorek v laboratoři dohledat. Jistá fi losofi cká teorie říká, že je možné stoprocentně popsat coko-liv, tedy i laboratorní proces. Jiná nás od toho bude odrazovat, protože než dosáhneme přesného popi-su laboratorního procesu, budeme vlastně popiso-vat něco, co již neexistuje. Život je plný překvapení a laboratorní proces je život sám, někdy možná i světem sám pro sebe. Pevně věřím, že téma „Labo-ratorní proces“ je pro vás zajímavé, a proto se těším na vaše ohlasy, připomínky, případně dotazy, které zasílejte do naší redakce.

ŠTĚPÁN TINTĚRA


5 1 1 2

5 2 0

3 2 6

4 1 1

Tab. 3: Sumarizace vlivů a rizik


Onkogenní markeryIndikace a interpretace

Vyšetření nádorových markerů je bráno mnohdy nejenom laickou veřejností jako základ úspěšné diagnostiky a následného

sledování nemocných se zhoubnými nádory.

yšetření nádorových markerů je brá-no mnohdy nejenom laickou veřej-

ností jako základ úspěšné diagnostiky a následného sledování nemocných se

zhoubnými nádory. Je jejich význam sku-tečně tak veliký nebo je to jen sugestivní

název těchto analytů či touha po jednoduché kvantitativně vyjádřené veličině? Pokud něco změ-řím a je-li to vyšší než minule, je vše špatně? Tento článek se pokusí odpovědět na otázku, kdy a proč indikovat nádorové markery, a současně s tím, jak je interpretovat.

Nelze začít jinak než otřepanými a neustále opa-kovanými frázemi - nádorové markery lze charakte-rizovat jako látky produkované maligními buňkami či organizmem jako odpověď na nádorové bujení. Může se jednat o antigeny lokalizované na povrchu buněčných membrán, enzymy metabolických drah či fragmenty cytoplazmatických struktur uvolňované do okolí při zániku buněk. Nádorové markery lze detekovat imunoanalytickými metodami v séru či jiných biologických tekutinách, popřípadě v buněč-ném cytozolu a extraktech z tkáňových kultur. Imu-nohistochemicky je můžeme detekovat přímo v tká-ních. Metody molekulární biologie nám umožňují detekovat genovou expresi nádorových buněk. Šlág-rem současnosti je stanovení nádorových markerů v cirkulujících buňkách v periferní krvi. Jejich pro-dukce je závislá na diferenciaci buněk. Málo diferen-cované buňky produkují pouze chemicky jednodu-ché sloučeniny, které jsou nezbytné pro buněčné dělení – proliferační markery, jako je thymidinkináza (TK) nebo markery vznikající přeměnou buněčného skeletu (růst, nekróza, apoptóza) – a my je detekuje-me jako solubilní fragmenty cytokeratinů. Teprve diferencované buňky jsou schopny tvořit složité polypeptidické či mucínové struktury. Dalším před-pokladem stanovení nádorových markerů je vasku-larizace nádoru a vyplavení nádorového markeru do tělních tekutin. Kromě vaskularizace souvisí hladina nádorových markerů samozřejmě i s velikostí nádo-ru. Nádorové markery umožňují v příznivých přípa-dech odhalit nádor o hmotnosti 1 mg (cca 106 nádo-rových buněk), zatímco klinická diagnóza pomocí zobrazovacích technik bývá stanovena až u nádoru, který obsahuje 109 nádorových buněk. Při indikaci a interpretaci nádorových markerů musíme vzít v úvahu ještě následující dva faktory, a to: biologický poločas a biologickou variabilitu. Respektování bio-logického poločasu je důležité především tehdy,

pokud využíváme nádorové markery pro kontrolu efektu terapie – kdy volba doby po operaci nebo po skončení chemoterapie musí být minimálně dvoj- až trojná-sobkem biologického poločasu. Znalost biologické variability markeru je důležitá při dynamickém sledování nádorových markerů pro posouzení významnosti změny hladiny nádorového markeru.

Název „Nádorové markery“ je značně nepřesný, protože do této skupiny patří látky, které ve velké většině případů nejsou ani nádorově ani orgánově specifi cké (tabulka č. 1). Neexistuje zatím univerzální nádorový marker, který by vyhovoval statistickým parametrům používaným k jejich hodnocení, tj. senzitivita (správný záchyt nemocných) při dostatečné specifi citě (správná negativita u lidí bez nádo-rového onemocnění), a tím nemá ani optimální spolehlivost.

Při indikaci vyšetření nádorových markerů je vhodné se řídit :1) Klinickou otázkou – proč nádorový marker určujeme a co od výsledku očeká-

váme. To by měl být základ uvažování lékaře, protože s tím i úzce souvisí inter-pretace. V praxi se velice často s setkáváme s tím, že tato základní podmínka není dodržena a důsledkem pak je, že lékař obdrží výsledek, který pouze založí, a význam vyšetření pro pacienta je nulový. Věřím, že takováto situace se vysky-tuje vzácně. Možné klinické situace, kdy a jak vyšetřovat nádorové markery, jsou rozebrány v další části článku.

2) Jaký je přínos vyšetření – největším přínosem by bylo, kdyby markery umožnily diagnostiku časných stadií nádorového onemocnění, ale to je stále sen budouc-nosti. Při monitoraci onemocnění existují zcela extremní názory – nedělat sledo-vání vůbec, protože tím, že zjistíme recidivu, progresi, event. generalizaci one-mocnění dříve – v asymtomatickém období – se nic nezmění na perspektivě nemocného. Druhý názor předpokládá intenzivně sledovat nádorové markery a již pouze při změně hladin nádorových markerů léčbu zahájit nebo změnit. Oba přístupy jsou extrémní. V současné době nové chirurgické přístupy umožňují reoperace, operaci metastáz apod. Obdobně i onkologická léčba má zcela jiné možnosti než dříve. Proto čím dříve určíme progresi onemocnění, tím lépe. Na druhé straně tam, kde je možná již pouze paliativní léčba, je otázkou, zda má sledování nádorových markerů význam. Jedná se například o pokročilá sta-dia nádorů jícnu, pankreatu apod.

3) Pro výběr konkrétního nádorového markeru musíme vycházet z lokalizace nádo-ru a předpokládané TNM klasifi kace, stádia onemocnění, histologické struktury a s tím i úzce související buněčné diferenciace nádorových buněk, jak již bylo výše zmíněno. Obecně platí, že čím je nádorové bujení pokročilejšího stadia, tím je větší pravděpodobnost zvýšené hodnoty nádorových markerů. Co se týká histo-logického typu, je nutné si na prvním místě uvědomit, že nádorové markery ne-jsou tkáňově ani orgánově specifi cké. Jen velice obecně lze říci, že nádory vychá-zející z dlaždicového epitelu produkují SCC, CEA, event. CYFRU. U karcinomů mucinosního charakteru vyšetřujeme nádorové markery CA typu. U nádorů vycházejících ze zárodečného listu jsou pozitivní AFP a hCG. Proliferaci nejlépe vystihují změny hladiny thymidinkinázy. Někdy jsou mezi proliferační markery řazeny i cytokeratiny, což však řada autorů odmítá s tím, že jejich zvýšení je důsledkem poškození buňky (nekrózy nebo apoptózy), nikoliv proliferace.

4) Klinickým stavem nemocného a fází onemocnění – před operací, po radikální operaci, po paliativním výkonu, před onkologickou a po onkologické terapii, v částečné či úplné remisi, pokud existuje podezření na progresi, či je-li progre-se nebo generalizace onemocnění zcela zřejmá .


5) Frekvence vyšetření nádorových markerů je nejčastěji 1x za 3 – 4 měsíce v prv-ních třech letech po vzniku nádorového onemocnění. Později stačí 2 x do roka. Frekvence však závisí i na vývoji onemocnění. Při progresi nádoru je samozřej-mě nutné frekvenci vyšetření zvýšit na 1 x za měsíc nebo 1x za dva měsíce.

K čemu slouží vyšetření nádorových markerů? SkríningObecnou podmínkou skríningu je, aby při 95 % specifi citě byla senzitivita 97 %. Této senzitivity musí být dosaženo nejlépe v časném stadiu nádorového onemoc-nění. Pro skríning byla snaha použít CEA u nádorů kolorecta, CA 125 pro nádory ovarií a PSA pro karcinom prostaty. Žádný z markerů této podmínce nevyhověl. U karcinomu prostaty by se proto mělo hovořit nikoliv o skríningu, ale o časné diagnostice ve vybrané populační skupině.

Primární diagnostikaPodobně jako pro skríning nejsou nádorové markery vhodné ani pro primární diagnostiku, a to ze stejných důvodů; navíc i proto, že jejich orgánová specifi cita je většinou malá.

Diferenciální diagnostikaPodobně jako při primární diagnostice se zde obecně nádorové markery nedopo-ručují. U vybraných následujících diagnóz je však naopak použití velice účelné. Jedná se o nádory testes, chorioepiteliom, neuroendokrinní nádory a v současné době stále více i diferenciální diagnostika nádorů plic.

Monitorování průběhu chorobyV praxi je nejvýznamnější indikací pro sledování nádorového markeru monitoro-vání průběhu onemocnění a s tím úzce související diagnostika recidivy nebo pro-grese (1, 2, 3). Dodržuje se určité schéma, které je odvozeno ze senzitivit získa-ných z předoperačních vyšetření nebo dlouhodobých monitorovacích studií. Hovoří se o hlavních a doplňkových nádorových markerech. Tento empirický pří-stup má své výhody, ale, jak si dále ukážeme, i své nevýhody. V průběhu nádoro-vého onemocnění se mění řada markerů. Některé změny umíme vysvětlit – sou-visí s biologickou aktivitou nádorového procesu. Další změny sice neumíme vysvětlit, ale jsou natolik signifi kantní, že marker zařadíme buď do skupiny hlav-ních, nebo doplňkových nádorových markerů. Někdy změny nádorových markerů existují, jejich diagnostická cena je omezená nebo vůbec žádná. Označujeme je v odborné terminologii jako falešnou pozitivitu. Klasifi kace na hlavní a doplňkové markery není v ČR jednotná, nejobvyklejší klasifi kaci ukazuje tabulka č. 2. Doplnil jsem tabulku pouze o sloupec nádorové markery „se mění“, bez diagnostického významu. Diskutovanou otázkou je, kdy se sledováním nádorových markerů začít a jaká má být frekvence. Zde se již mísí úvahy o současném víceúčelovém využití stanovení nádorového markeru – tedy nejen pro monitoraci nádorového one-mocnění, ale současně pro sledování efektu léčby, prognózy s ohledem na všech-ny aspekty průběhu onemocnění. Dle naší zkušenosti je nejvhodnější provést první vyšetření před léčbou, tj. nejčastěji před operací,14 dní po operaci a pak vyšetřovat v prvních třech měsících 1 x za měsíc a na to navázat vyšetřením 1x za 3 – 4 měsíce až do konce třetího roku od zahájení sledování. Později je dosta-čující frekvence 2 x ročně. Samozřejmě dojde-li k progresi onemocnění, je nutné frekvenci sledování zvýšit. Vyšetření předoperační hodnoty má dvojí význam. Jak naše dlouhodobé zkušenosti ukazují, pokud je nádorový marker zvýšen předope-račně, bude zvýšen i při progresi, a to v 88 – 95 % , naproti tomu tam, kde pře-doperační hodnoty byly v normě, dojde při progresi k vzestupu jen v 30 %. Pře-doperační vyšetření vhodně voleného nádorového markeru umožňuje do jisté míry individualizovat dispenzární péči. Při předoperační pozitivitě markeru se na něj můžeme spolehnout i při follow up, při negativitě by měl být dán důraz pře-devším na klinické sledování nemocného, event. na zobrazovací techniky. Kromě toho absolutní výše sérové hladiny nádorového markeru souvisí s prognózou nemocného.

Sledování efektu terapieSledování efektu terapie pomocí nádorových mar-kerů je, pokud se systematicky a indikovaně prová-dí, neocenitelným pomocníkem lékaře. Vzhledem k různým biologickým poločasům jednotlivých markerů je nutno správně volit intervaly odběrů krve k vyšetření tak, aby se skutečně postihl efekt terapie a ne „lysis fenomen“, tj. krátkodobý prudký nárůst hladiny markeru jako odpověď na terapii. Vyšetřujeme nádorové markery pro posouzení úspěšnosti terapie nejdříve koncem třetího týdne, lépe ve 4. týdnu od aplikace terapie. Tato oblast se v poslední době dostává do centra zájmu onkologů. Nezanedbatelnou výhodou pro markery, oproti zobrazovacím metodám, je fakt, že jejich elevace může upozornit na progresi i v jiném orgánu, než který je sledován zobrazovacími metodami. Existu-je tedy potřeba lepšího systému pro sledování tera-pie, než je současně dostupný. Toto je oblast, ve které v budoucnu markery najdou své ocenění a snad nedůležitější roli v praxi. Důležitou výhodou vyšetřování sérových nádorových markerů je, že jejich měření odráží dynamiku stavu nemocného a vyšetření může být opakováno, jak je třeba. Pozi-tivní korelace mezi změnami některých sérových nádorových markerů a odpovědí k systémové tera-pii u onkologických pacientů byla popisována nej-častěji u karcinomu prsu. Další práce potvrzují zvý-šení přežívání u nemocných léčených na základě zvýšených hodnot sérových nádorových markerů při negativním nálezu zobrazovacích metod u nemalobuněčného plicního karcinomu. Při terapii ovariálních karcinomů byl prokázán význam stano-vení CA 125 pro optimalizaci léčby. U nehodgkin-ských lymfomů a leukémií vyšetřování sérové TK i B-2-M umožňuje sledovat efekt chemoterapie i predikci vývoje choroby.

Obecná pravidla při interpretaci nádorových marketůPředpokladem správné interpretace výsledku v laboratoři je respektování podmínek preanalytiky, analytiky a samozřejmě existující interní a externí kontroly kvality.

Na rozdíl od enzymů, hormonů a dalších analytů jsou nádorové markery relativně odolné zevním vlivům. Hemolýza zvyšuje významnou měrou pou-ze sérovou hladinu NSE – což je způsobeno jeho vysokou hladinou v erytrocytech. Nevyžadují odběr nalačno a pro standardizaci výsledků je doporučeno provádět odběr vždy v ranních hodi-nách. Nádorové markery podléhají relativně mini-mální denní variabilitě, výjimkou jsou cytokeratiny a TK, kde se denní variabilita podle našich zkuše-ností pohybuje mezi 10 – 25 %. Biologická variabi-lita je různá a pohybuje se od 5 – 70 %, extrémně vysokou biologickou variabilitu má podle někte-rých autorů CA72 - 4 – až 300 %. Při monitoraci

Marker Zkratka Charakteristika M. h. kDa Biologický poločasOnkofetální antigenyKarcinoembryonální antigen CEA glykoprotein 180 14 dnůAlfa -1 - fetoprotein AFP glykoprotein 70 3 - 6 dnůLidský choriový gonadotropin hCG glykoprotein 1,5 - 2,5 dnůCancer antigen 15 -3 CA 15 -3 glykoprotein 400 7 dnůCancer antigen 19-9 CA 19-9 glykolipid , mucin 100 5 dnůCancer antigen 125 CA 125 glykoprotein 200 4 dnyCancer antigen 72-4 CA 72-4 glykoprotein >10³ 3 - 7 dnůEnzymyNeuronspecifi cká enolasa NSE polypeptid 100 24 hodProstatický specifi cký antigen celkový TPSA glykoprotein 34 2 - 3 dnyProstatický specifi cký antigen volný FPSA glykoprotein 10 7 hodinThymidinkinasa TK polypeptid 2 dnyHormonyAdrenokortikotropin ACTH polypeptid 4,5 Calcitonin CT polypeptid 3,5 12 min.Parathormon PTH hormon 9,4 do 5 min.Prolaktin PRL polypeptid 23 15 - 20 min.Solubilní cytokeratinové fragmentyMonototal MT polypeptid, fragmenty 8, 18, 19Tkáňový polypeptidický antigen TPA polypeptid fragmenty 8, 18, 19 40 7 dnů

Tkáňový polypeptidický specifi cký antigen TPSpolypeptid fragment 18

(M3 epitop) 40 7 dnů

Cytokeratinový fragment 21 -1 CYFRA 21-1 polypeptid, fragment 19 40 dosud neznámOstatníAntigen skvamosních buněk SCC glykoprotein 48 20 min.Thyroglobulin hTg protein 660 15 - 96 hod.Chromogranin A CHgA kyselý glykoprotein 49Ferritin protein železné jádro až 440 Beta -2 mikroglobulin B2- M protein 11,8 40 min.

Tab. 1: Základní charakteristika nádorových markerů

Lokalizace maligního nádoru a typ Hladiny markerů, které se mění

Diagnostický význam Doplňkový marker Mění se, ale změna nemá dg. význam

Nádory hlavy a krku TPS, CYFRA 21-1 TPA, Monototal, TK, CEA,

Nádory jícnuHorní dvě třetiny SCC CEA, TPA, TK CYFRA, TPS Dolní třetina CA 72 -4 CEA, TPA, TK CYFRA, TPS, CA 19-9

Nádory plic nemalobuněčné NSCLC

Squmosní CYFRA, TPA, MT SCC PSA, TPS, NSE, CA 125Adenokarcinom TPA, MT, CYFRA CA 125 PSA, TPS, SCC, NSEVelkobuněčný TPA, MT, CYFRA TK PSA, CA 125, TPS

Nádory plic malobuněčné - SCLC NSE, PrGNp MTl, CYFRA TPA, SCC Nádory žaludku CA 72 - 4 CEA CA 19-9, Nádory colorecta CEA CA 19-9, TPS, TK hCG, CA 72-4, CA 125, AFP, TPA, MTNádory jater a žlučových cest CA 19-9, CEA, Chg A CA 15-3, SCC, CYFRA TK, TPS, TPA, MT Nádory pankreatu CA 19-9, AFP TK CA 72-4, TPS, CA15-3, CA125Neuroendokrinní nádory ChgA, NSE TK TPS, TPA, CEANádory ledvin NSE, TPS, Chg A CYFRA řada markerůNádory močových cest TPA, CYFRA TPS, TK CEA, MT, SCCNádory prostaty PSA, fPSA Chg A CA 19-9 Nádory prsu CA 15-3, CEA TK, TPA, ChgA, CYFRA TPS, MT, CA 19-9Nádory varlat AFP, beta hCG, TK, NSE cytokeratiny, CA 72-4

Nádory ovarií CA 125, CA 72 -4, HE -4TPA, CA 19-9, CYFRA AFP Monototal, CEA

CA 15-3, ChgA, PSA

Nádory dělohy SCC, CYFRA TK, TPA CEA, CA 19-9, CA 125, TPS, MTHemoblastozy TK, beta 2 M, ferritin cytokeratiny

Tab. 2: Změny nádorových markerů u nádorových onemocnění


Tab. 3: Pozitivita nádorových markerů u benigních onemocnění

Klinický stav Hladiny markerů, které se mění

Často (více než v 30 %) Může se měnit (10 – 30 %) Ne (u méně než 10 %)

Kouření CEA

Vyšetření per rectum CEA, PSA CA 72-4, 125, SCCCA 15 -3, CA 19-9, cytokeratiny

Těhotenství hCG, AFP, CA 125, 19-9 CA 15-3, TK, cytokeratiny CEA, SCC

Perniciozní anemie TK, feritin ostatní markery

Regenerační procesy spojené rychlým buněčným růstem

TK, TPS MT CEA, CA typu, AFP

Infekce

Bakteriální celková TK, TPS TPA, MT většina NM

Bakteriální lokální TK, TPS většina NM souvisí lokalizací

Virová TK TPS, MTvětšina nádorových markerů

Imunoalteračí onemocnění

Akutní fáze TK, TPSMT, TPA, AFP, CA 125, CA 19-9

Stabilizovaný stav TK Většina NM

Srdeční selhání Bez výpotku a ascitu CA 125, AFP, B-2-M CA 19-9, TPS, TPA, MT TK, CEA, CA 72-4

S výpotkem a ascitemCA 125, TPS, TPA, B-2-M, MT, CYFRA21.1

CA 19-9, CEA, CA 72-4 TK

Výpotek benigní etiologie

V pohrudniční dutiněCA 125, TPS, TPA, MT, CYFRA

CEA, TK, CA 15-3

V břišní dutině (ascites)

CA 125, TPS, TPA CA 19-9, CA 72-4 MT, CYFRACEA, TK, SCC, CA 15-3

Ateroskleróza TPS MT, CYFRA TPA a většina NM

Ledvinné selháníCEA, Chg A, B-2-M, ferritin, AFP,

CA 15-3, SCC, CA19-9, CYFRA TK, TPS, TPA, MT

Jaterní selhání CEA, AFP, CA 125 mucinové NM TK, cytokeratiny

Onemocnění jater a žlučových cest

Akutní CA 19-9, CA 125, AFP CA 15-3, CEA, TK, TPS, TPA, SCC

Chronické CA 19 -9, AFP, CA 125 CA 15-3, CEA, ChgA

Selhání jater Chg A, AFP, CA 19-9 CEA, markery CA typu TK, cytokeratiny

Onemocnění plicZánětlivé CEA, CA - 19-9

Benigní nádorCEA, CA - 19-9, CYFRA21.1

Onemocnění prsu Benigní nádor CEA, CA 15-3 TPA, MT, CA 19-9, CA 125 TK, TPS, AFP

Onemocnění střev

ZánětlivéCA 19 - 9, CA 72-4, AFP, CEA

TK, TPS, MT, TPA, CYFRA

Autoimunní TK, TPS, CA 19 - 9, CA 72-4, AFP, CEA, CYFRA

Benigní nádor CEA, CA 19 -9, CA 72 - 4 CYFRA TK, TPS

Onemocnění močového ústrojí

Zánětlivé TPA, TPS, CYFRA TK, CEA mucinové NM

Benigní nádory TPA, TPS, CYFRA většina NM

onemocnění je důležité nádorové markery stanovovat jednou metodikou v jedné laboratoři.

Negativní výsledek ještě neznamená, že nádorové onemocnění není přítomno. Pro kvalitní klinické zhodnocení je nutná úzká spolupráce laboratoře a klinického pracoviště. Pro klinické zhodnocení nádorových markerů se používá Cut off (refe-renční hladina) – při primární diagnostice je defi nována jako hladina markeru, pod kterou je 95 % zdravých lidí, event. pacientů s benigním onemocněním, při follow up nádoru nebo monitoraci lečby je defi nována jako hladina markeru, pod kterou leží 95 % hodnot pacientů v kompletní remisi. V současné době je dopo-

ručeno stanovovat senzitivitu při 95% specifi citě. Je nutné respektovat i skutečnost, že se nádorové mar-kery mohou zvyšovat i u benigních onemocnění (tabulka č.3).

Na otázku položenou v úvodu článku můžeme odpovědět: Správně indikované vyšetření nádorových marke-rů může přispět především k časnému záchytu


Literatura:1. Duffy MJ. The urokinase plasminogen activator system: role in malignancy.

Curr Pharm Des. 2004;10(1):39-49. Review.2. Duffy MJ. Evidence for the clinical use of tumour markers Ann Clin Biochem.

2004 Sep;41(Pt 5):370-7.3. Duffy MJ, Duggan C. The urokinase plasminogen activator system: a rich sour-

ce of tumour markers for the individualised management of patients with cancer Clin Biochem. 2004 Jul;37(7):541.

4. Fateh Moghadam, A., Stieber, P. Descritption of individual tumor markers. In: Sensible Use of Tumor Markers. Roche, Basel 1993, 33-49.

5. Holubec, L., Jr., Topolčan, O., Pikner, R.: Biologická aktivita u kolorektálního kar-cinomu. Čas. Lék. Čes. 2002, 141(16), s. 508-512.

6. Kaušitz, J. et al.: Radioimunoanylýza nádorových markerů. Onkológia. Veda, 2003.7. Votava T, Topolcan O, Holubec L Jr, Cerna Z, Sasek L, Finek J, Kormunda S. Chan-

ges of serum thymidine kinase in children with acute leukemia. Anticancer Res. 2007 Jul-Aug;27 (4A):1925-8.

8. Finek J, Holubec L Jr, Topolcan O, Salvet J, Pikner R, Holdenrieder S, Stieber P, Lamerz R, Holubec Sen L, Svobodova S, Visokai V, Helmichova E. Clinical rele-vance of tumor markers for the control of chemotherapy. Anticancer Res. 2005 May-Jun;25(3A): 1655-8.

PROF. MUDR. ONDŘEJ TOPOLČAN, CSC.

ODDĚLENÍ NUKLEÁRNÍ MEDICÍNY, ÚSEK IMUNOANALÝZY, FAKULTNÍ

NEMOCNICE PLZEŇ, DR. E. BENEŠE 13, 305 99 PLZEŇ


recidivy onemocnění a tím i k rychlejšímu terape-utickému zákroku, který může prodloužit život nemocného. Orgánová specifi cita při vyšetřování jednoho izolovaného markeru je relativně nízká, proto je nutné vyšetřovat nádorové markery v pravidelných intervalech a v optimální kombi-naci. Nejdůležitějším faktorem, který nás může upozornit na časnou recidivu onemocnění, je dynamika vzestupu markerů. Praxe je však přesně opačná, vyšetření jsou indikována naprosto náhodně. To znamená spíše ekonomickou ztrátu, protože výtěžnost těchto nahodilých vyšetření je naprosto nulová. Mnohdy je opomíjeno předope-rační stanovení nádorových markerů, které je nezbytným předpokladem využití markerů v úspěšné kontrole terapie.

Položíme-li si ještě otázku perspektiv, pak je nepo-chybně ve vyhledávání nových markerů pomocí nej-modernějších analytických metod (proteomiky, genomiky a dalších) a při volbě terapie využívání znalostí personalizované medicíny. Pro kontrolu léč-by používat cílený marker pro cílenou léčbu (VEGF pro antiangiogenní léčbu), dále stanovení cirkulují-cích nádorových buněk v periferní krvi pro diagnos-tiku mikrometastáz.

Manuální soupravy Immunotech na podzimní

vlně dobrých zpráv letošním roce se již stačilo odehrát nemálo významných událostí, namát-

kou odmítnutí Lisabonské smlouvy v Irsku, nárůst cen ropy do rekordní výše, konání kontroverzních olympijských her v Číně. Zároveň je rok 2008,

zejména v České republice, spojen s významnými výročími, při vzpomínce na něž je těžké vyhnout se lehkému mrazení - 1938, 1948, 1868 nebo i 1993 (pro

ty, kdo zapomněli - jednalo se o defi nitivní rozpad Československa).Paralelně s významnými světovými událostmi se samozřejmě dějí i věci, které do

běhu světového řádu nijak výrazně nezasahují, byť to nijak nesnižuje jejich význam pro zainteresované jedince. Z ryze subjektivního pohledu pak například narození potomka často naruší „řád věcí“ podstatně více než přírodní či společenská kata-strofa odehrávající se někde ve druhé části světa.

Na výše zmíněné události lze pohlédnout i z jiného úhlu pohledu, a to z hlediska jejich dopadu. I zde bývá hodnocení velmi subjektivní – můžeme se téměř doneko-nečna přít o tom, jestli je ten který jev jevem pozitivním nebo negativním, a stejně se názory nepřestanou lišit. V dnešním světě se zdá být tedy prakticky nemožné přijít s informací, která by byla přijímána bezvýhradně kladně.

Přesto se domníváme, že pro vás (nebo alespoň pro ty z vás, kteří jste uživateli manuálních imunoanalytických souprav Immunotech) takovou zprávu máme. Ostatně, posuďte sami:

Firma Immunotech uvádí na trh tři nové manuální soupravy - vylepšenou RIA soupravu na stanovení protilátek proti tyroidální peroxidáze (Anti-TPO RIA kit, kat.

č. A56719) a zcela nové soupravy Cytokeratin 19 frag-ment IRMA kit (kat. č. A56888) a Neo IRT ILMA kit (kat. č. A45781).

Autoprotilátky proti tyroidální peroxidázeSouprava na stanovení anti-TPO prošla již v minulosti některými změnami. Nejdůležitější okamžiky jejího života jsou dva. První nastal v roce 2002, kdy byla nativní TPO

používaná v traceru nahrazena rekombinantní peroxi-dázou, která má výrazně nižší variabilitu mezi jednotli-vými šaržemi. Další krok k vyšší kvalitě soupravy právě probíhá. Jeho podstatou je nahrazení polyklonálních protilátek používaných k potažení zkumavek dobře kontrolovanou a pečlivě zvolenou směsí monoklonál-ních protilátek proti TPO. Vyšší kvalita soupravy se pro-jevuje i ve zřetelnější klinické výpovědní hodnotě. Kli-nické ověření soupravy bylo provedeno na několika pracovištích v České republice a v zahraničí. Na obráz-ku č. 1 je uvedeno, u jakého procenta pacientů s růz-ným onemocněním byla nalezena zvýšená hladina autoprotilátek proti štítné žláze.

Cytokeratin 19 fragmentKarcinom plic je nejrozšířenějším karcinomem v celosvětovém měřít-ku, zodpovědným za více než 1,1 milionu úmrtí ročně. V České repub-lice na jeho vrub připadá více než 20 % ze všech úmrtí na rakovinu.

Při diagnostice se uplatňuje celá řada tumorových markerů v závislosti na histologickém typu nádoru. K nejčastěji používaným patří, vedle CEA a NSE, sta-novení fragmentu cytokeratinu 19 (známého též jako stanovení CYFRA 21-1™) .

Nově vyvinutá izotopová souprava společnosti Immunotech již byla úspěšně testována na několika klinických pracovištích a byla též validována pro kli-nické použití. Na obrázku č. 2 je zobrazeno srovnání s jiným komerčně dostupným stanovením.

Obrázek č. 3 znázorňuje způsobilost soupravy roz-lišit mezi zdravými jedinci, jedinci s benigním one-mocněním a pacienty s nemalobuněčným karcino-mem plic v remisi na jedné straně a pacienty s nemalobuněčným karcinomem plic v progresi na straně druhé.

Z obrázku č. 3 je tedy zřejmé, že souprava vykazuje vynikající klinickou senzitivitu a specifi citu pro nema-lobuněčný karcinom plic.

Obr. 1: Klinické ověření soupravy Anti-TPO RIA kit (kat. č. A56719)

Obr. 2: Porovnání hodnot získaných soupravou Cytokeratin 19 Fragment IRMA kit (kat. č. A56888) s komerčně dostupnou soupravou CYFRA 21-1 IRMA1


Imunoreaktivní trypsinOd nového roku bude rozšířena nabídka manuálních luminis-cenčních souprav pro neonatální

screening o stanovení tzv. imunoreaktivního trypsinu. Toto stanovení pomáhá diagnostikovat dědičné one-mocnění, které ovlivňuje funkci chloridového kanálu buněk epitelu. Jedná se o cystickou fi brózu, která pod-le literárních údajů postihuje 1 z 2 500 – 3 500 novo-rozenců. Nejvíce je ovlivněna funkce dýchacího a trá-vicího ústrojí. Souprava Neo IRT ILMA prošla klinickou validací v Centru pro screening novorozenců v Bánské Bystrici, během níž bylo testováno 27 974 vzorků od novorozenců. Incidence cystické fi brózy nalezená při této stuidii byla 1:5 595. Výsledek je vzhledem k frek-veci výskytu onemocnění ve velmi dobré shodě s pub-likovanými údaji.

O přesném datu, kdy budou soupravy uvedeny na trh, budete včas informováni.

Těšíme se na další spolupráci!

HELENA KURZWEILOVÁ


PATRIK ŠAF


Obr. 3: Porovnání hodnot Fragmentu cytokeratinu 19 u zdravých lidí a u pacientů s benigními onemocněními a u pacientů s nemalobuněčným karcinomem plic (stadium III a IV) v remisi a progresi. Hodnota 3,3 ng/mL odpovídá doporučenému cut-off

Membránové molekuly na buňkách

Minulost - přítomnost – budoucnoste zjištění biologických příčin neslučivosti

tkání při transplantacích výrazně pomohly inbrední kmeny některých laboratorních zví-řat, které poskytly vhodné nástroje genetické,

biochemické a imunologické analýzy histo-kompatibilitních systémů determinujících molekuly normálních tkáňových buněk.

V historii výzkumu těchto problémů se laboratorní myš stala druhem, jehož H – systémy byly nejlépe prozkoumány zásluhou průkopnických studií P. A. Gorera a později G. D. Snella. Tito vědci položili zákla-dy pro pochopení imunologické manifestace genetic-ké podstaty neslučivosti tkání a orgánů, na něž další badatelé svými pokusy navazovali. Pro osud tkáňo-vých transplantátů se ukázal H-2 lokus jako nejvý-znamnější, protože alogenní kožní štěpy transplanto-vané mezi H-2 rozdílnými jedinci se zpravidla odhojují do deseti dnů. Místo na chromozomu bylo nejdříve nazváno hlavním histokompatibilitním loku-sem a později se ukázalo, že se jedná o extrémně komplexní systém determinující relativně silné H-antigeny, v jehož rámci byla popsána řada různých haplotypů determinujících rozdílnou mozaiku anti-genních specifi cit.

I když se předpokládalo, že poznatky získané výzkumem histokompatibilitních systémů u myší by se mohly využít i u ostatních živočišných druhů, trvalo víc než 10 let, než byl identifi kován Daussetem a jeho spolupracovníky hlavní H-systém u člověka. Tento systém byl označen jako HL-A systém a určuje HL-A antigeny, které tvoří pravděpodobně nejheterogennější skupinu antigenů u člověka zná-mých. HL-A systém je nejsilnější H-systém u lidí, kožní štěpy přežívají na HL-A geneticky odlišném příjemci výjimečně 15 dní, většinou se do 12 dnů odhojí. Mno-ho poznatků pro transplantační imunologii přinesli i naši odborníci pracující v Ústavu experimentální biologie a genetiky ČSAV, který tehdy řídil prof. MUDr. Milan Hašek. Z tohoto ústavu vyšli skvělí odborníci, kteří významným způsobem posunuli tehdejší stav poznání a zapsali se nesmrtelným písmen do dějin imuno-genetiky. Jen namátkově jsou uvedena některá jména, jako J. Klein, P. Skamene, P. a J. Ivanyiové, A. Lengerová, P. Démant, I. Hilgert a mnoho dalších. I autor článku měl možnost vypracovat v tomto ústavu kandidátskou disertační práci na téma Transplantační antigeny (1). Později u dalších živočišných druhů (potkan, opice, prase, pes, králík) byly odkryty hlavní histokompatibilitní systémy (H-1, Rh1-A, P1-A, D1-A, R1-A), které rozšířily dosavadní stav poznání.

MinulostV minulém století se v nejrůznějších oborech (imunologii, hematologii, onko-logii, endokrinologii, experimentální medicíně) nahromadilo množství poznat-ků, jejichž společným jmenovatelem je kritická účast buněčné membrány v různých fyziologických procesech. Pro transplantační strategii bylo objevení individuálně specifi ckých antigenů, které jsou příčinou neslučivosti tkání


a orgánů, natolik zásadní, že byly označeny jako histokompatibilitní trans-plantační antigeny. Byly rozpracovávány jednotlivé metody jejich detekce a zjišťována jejich chemická povaha. Původní představa Billinghama, Brenta a Medawara, že H-antigeny jsou lokalizovány v buněčném jádře (konkrétně v DNA), byla zpochybněna Haškovou a Hrubešovou, které prokázaly, že anti-genní aktivita tkáňových homogenátů není citlivá na deoxyribonukleázu. Poz-ději se ukázalo, že H-antigeny se nacházejí na buněčné membráně. Tyto poznatky podnítily intenzívní výzkum zaměřený na detekci, a to nejen H-anti-genů, ale mnoha dalších membránových molekul. Buněčná membrána se najednou stala středem zájmu a byly vyvíjeny různé metody, které tyto anti-geny uvolňovaly z buněčných membrán. Byl přijat model membrány jako tekuté mozaiky, kde je základní nosnou strukturou viskózní dvojvrstva lipidů,

v níž jsou lokalizovány různé glykoproteiny mající určitou pohyblivost. Tento model pomohl vysvětlit nejrůznější dynamické jevy včetně indukované redistribuce různých membránových molekul a stabilizace některých membránových kompo-nent jejich uspořádáním v komplexní membránové agregáty. Doslova byla spuštěna lavina objevování a charakterizování nejrůznějších typů molekul u různých druhů. HL-A systém brzy dohnal zpo-ždění oproti H-2 systému, a tak HLA-A, B, C anti-geny byly zařazeny do MHC I. třídy a HLA-DR, DP, DQ do MHC II. třídy. Také byla vyjasněna jejich chemická povaha a funkce. Obrovský rozvoj v ana-lýze antigenních systémů byl v podstatě podmíněn dvěma směry: 1) rozvojem nových detekčních technik a 2) hybridomovou technologií.

Pro charakterizaci membránových molekul se z detekčních technik ukázaly jako zásadní dvě hlav-ní metody, imunofl uorescence a průtoková cyto-metrie. Imunofl uorescence dává různé možnosti, a to za využití jednak přímé, jednak nepřímé fl uo-rescence, přičemž se dají ještě použít různé fl uoro-chromy. Průtoková cytometrie se ukázala jako nesmírně užitečná metoda, a to pro celou řadu kvalitativních a kvantitativních stanovení mnoha proteinů. Díky tomu došlo k neuvěřitelnému rozvo-ji poznatků, které jsou tak rozsáhlé, že již jenom málo lidí je schopno je absorbovat.

V druhé polovině minulého století se postupně odkrývaly membránové znaky (antigeny), přítomné na morfologických profi lech normálních a patolo-gických buněk převážně leukocytární povahy. Tyto antigeny byly objasňovány z hlediska chemické struktury, genetické determinace, exprese a funkce.

Pro toto odkrývání měl přímo zásadní význam objev nositelů Nobelovy ceny G. Köhlera a C. Mils-teina, kteří vyvinuli hybridomovou technologii pro přípravu monoklonálních protilátek. Jejich metoda vyústila do biotechnologické přípravy monoklo-nálních protilátek, používaných pro výrobu výzkumných, diagnostických a farmaceutických prostředků. Před objevem Köhlera a Milsteina bylo známo jen několik málo membránových znaků, které se daly využít k defi nování membránových odlišností buněk. Tyto znaky byly převážně proka-zované rozetovými a cytotoxickými testy. V roce 1980 měl autor možnost pracovat na Royal Free Hospital v Londýně v rámci stipendijního pobytu. Podařilo se mu ve spolupráci s ostatními pracovní-ky poukázat na to, že stanovení lymfocytů T, které se dříve běžně prokazovaly tzv. E rozetovým tes-tem, lze provést průkazem antigenu monoklonální protilátkou OKT-11 (2). Pro stanovení lymfocytů T to znamenalo, že nepřesné stanovení lze nahradit elegantním průkazem pomocí monoklonální pro-tilátky, což významným způsobem přispělo k defi -nování krevních chorob odvozených z T lymfocy-tární řady. Toto stanovení bylo ještě umocněno

Tab. 1: Základní informace o mezinárodních setkáních z hlediska vytvoření CD nomenklatury

Pracovní setkání

Místo konání Rok

Počet MP prokazujících

CD znaky

Defi nované CD znaky *

1 Paříž 1982 102 CD1 – CDw15

2 Boston 1984 126 CD16 – CD26

3 Oxford 1986 236 CD27 – CD45

4 Vídeň 1989 425 CD46 – CDw78

5 Boston 1993 662 CD79 – CD130

6 Kobe 1996 444 CD131 - CD166

7 Harrogate 2000 273 CD167 - CD247

8 Adelaide 2004 CD247 – CD350

zavedením průtokové cytometrie. Samotní prů-kopníci a zakladatelé cytometrie ani nečekali, jaký dopad bude mít průtoková cytometrie pro klinic-kou a diagnostickou medicínu. Autor vzpomíná na profesora Herzenberga, který před více než 35 lety představil principy průtokové cytometrie na mezi-národním sympoziu. První informaci o průtokové cytometrii autor poskytl pro československou odbornou veřejnost právě z mezinárodního sym-pozia, kde prof. Herzenberg předvedl cytometr a nastínil jeho praktické využití (3). Tehdy byla cytometrie na začátku své éry, během několika dalších desetiletí prodělala převážně po technické stránce a za využití počítačových programů obrov-ské zdokonalení. Autor měl možnost pracovat v roce 1980 na průtokovém cytometru v Londýně, takže si je plně vědom, jaký od té doby cytometry prodělaly neuvěřitelný technický vývoj. K tomu přispěly dvě hlavní oblasti: 1) oblast vhodně zna-čených monoklonálních protilátek, dávající mož-nost sledovat sedm i více parametrů současně na jedné buňce, 2) rozvoj vhodných počítačových programů, umožňujících záznam a grafi cké vyhod-nocování naměřených parametrů. Cytometrie si tak defi nitivně získala své místo, protože vedle praktického ovládání průtokového cytometru je nezbytná znalost specifi city jednotlivých protilá-tek, které dávají poměrně širokou volbu pro sledo-vání daného problému. Prvou práci z českosloven-ských pracovníků na průtokovém cytometru udělal autor na anglickém pracovišti v roce 1980. Jeho práce ve spolupráci se zahraničními autory měla více než 350 citačních ohlasů. Cílem této práce byl průkaz lymfocytů T pomocí monoklonální protilát-ky detegující membránový antigen (dnes CD2) (2). Průkazem tohoto znaku se podařilo stanovit T lymfocyty a nahradit jejich ne příliš přesné stano-vení pomocí E roset. Prvý cytometr v Českosloven-sku byl na poliklinice na Karlově náměstí v Praze, kde měl autor možnost měřit. Na tento cytometr dohlížel Dr. Petr Hausner, který vycházel vstříc růz-ným spolupracím. Potom přišla vlna, která přinesla velké množství cytometrů různých parametrů, jež byly na různých pracovištích. Jednotliví pracovníci měli i možnost si vzájemně vyměňovat své zkuše-nosti a poznatky, a to i v rámci cytometrické spo-lečnosti. Dnes je již poměrně dobré zastoupení cytometrů na našich klinických i experimentálních pracovištích, což se odráží v lepší kvalitě práce i v počtu původních prací. Díky tomu se rozběhlo také stanovení kmenových hematopoetických buněk a bylo publikováno prvé sdělení o detekci hematopoetických kmenových buněk českými autory (5).

Pro transplantační strategii a pro diagnostiku různých chorob vyvstaly nové možnosti, a to pře-devším zavedením průtokové cytometrie za použití monoklonálních protilátek. Dřívější metody neu-možňovaly odkrývat buněčné subpopulace zastou-

Obr. 1: Některé membránové antigeny jednotlivých typů v architektuře buněk

Obr. 2a: Představa proliferace a diferenciace lymfoidních buněk a jejich možné patologické formy

Legenda k obrázkům 2a a 2b (Jednotlivá čísla nad buňkami v obrázcích vystihují stádium, ze kterého vznikají konkrétní krevní choroby)1. leukémie z kmenových buněk; 2. nediferencovaná leukémie progenitorová nezralá; 3. prekurzo-rová lymfoidní leukémie nezralá (“null“ ALL); 4. pro B akutní lymfatická leukémie (pro B-ALL); 5. pre-pre B akutní lymfatická leukémie (pre-pre B-ALL); 6. pre B akutní lymfatická leukémie (pre B-ALL); 7. B akutní lymfoblastická leukémie (B-ALL); 8. chronická lymfatická leukémie B typu (B-CLL); 9. B lymfoblastický lymfom, Burkitův lymfom (BL); 10. prolymfocytární leukémie B typu (B-PLL); 11. vlasatobuněčná leukémie B typu (B-HCL); 12. prothymocytární leukémie T typu nezra-lá (pro T-ALL); 13. thymocytární leukémie T typu (T-ALL); 14. obecná thymocytární leukémie T typu (“common“ T-ALL); 15. lymfoblastický lymfom T typu CD4+, lymfom ze svinutých buněk T; 16. zralá akutní lymfoblastická leukémie T typu CD4+; 17. zralá akutní lymfoblastická leukémie T typu CD8+; 18. lymfoblastický lymfom T typu CD8+, “convoluted“ T buněčný lymfom; 19. lymfom-prolymfocytární leukémie T typu CD4+ (T-PLL); 20. Sezary syndrom, Mycosis fungoides, CD4+ (SS, MF); 21. prolymfocytární leukémie T typu CD8+ (T-PLL); 22. prolymfocytární leukémie T typu CD8+ (T-PLL); 23. centroblastický – centrocytární lymfom; 24. centrocytární lymfom B typu; 25. imuno-cytom, makroglobulinémie, Waldenströmova nemoc; 26. plazmocytom, mnohočetný myelom, (MM), Kahlerova choroba; 27. imunoblastický lymfom T typu CD4+; 28. imunoblastický lymfom T typu CD4+, fenotypová varianta; 29. imunoblastický lymfom T typu CD8+; 30. imunoblastický lymfom T typu CD8+, fenotypová varianta; 31. akutní myeloidní leukémie nezralá (AML-MO); 32. akutní myeloidní leukémie myelomonocytární (AML-M4, AMMoL); 33. akutní myeloidní leuké-mie, erytroleukémie nezralá (AML-M6, AEL); 34. akutní myeloidní leukémie, erytroleukémie zralá (AML-M6); 35. akutní myeloidní leukémie bazofi lní nezralá; 36. akutní myeloidní leukémie bazo-fi lní zralá; 37. akutní myeloidní leukémie megakaryoblastická (AML-M7, AMegL); 38. akutní mye-loidní leukémie megakaryocytární (AML-M7); 39. akutní myelomonocytární leukémie (AML-M5, AMoL); 40. akutní monocytární leukémie zralá (AML-M7); 41. histiocytární lymfom; 42. akutní myeloblastická leukémie nezralá, bez maturace (AML-M1); 43. akutní myeloblastická leukémie zralá, s maturací (AML-M2); 44. akutní myeloidní leukémie promyelocytární (AML-M3, APL); 45. chronická myeloidní leukémie (CML); 46. eozinofi lní leukémie nezralá; 47. eozinofi lní leukémie zralá; 48. leukémie z NK buněk, lymfoproliferativní onemocnění z granulárních lymfocytů

Obr. 2b: Schéma vzniku něktrých malignit v myeloidních řadách


pené méně než jedním procentem ve výchozí buněčné suspenzi.

Odkrývání membránových molekul přineslo i některé problémy. V literatuře byly popisovány tytéž membránové molekuly pod různými názvy. Snahy o sjednocení názvů vedly k zavedení tzv. CD klasifi kačního systému. Tento systém, nebo-li nomenklatura, se tak postupně vytvářela na základě pracovních zasedání (workshopů) a kon-ferencí nazývaných Leukocyte typing, kterých se již uskutečnilo celkem osm. Tabulka 1 podává základní informace o těchto zasedáních z hledis-ka defi nice CD znaků. Prvé setkání bylo v roce 1982 v Paříži, kde byl založen CD klasifi kační sys-tém, potom následovalo setkání v Bostonu (1984), Oxfordu (1986), Vídni (1989), znovu v Bostonu (1884), Kobe (1996), Harrogate (2000) a naposle-dy v Adelaide (2004). V Paříži dostaly antigeny defi nované monoklonálními protilátkami označe-ní CD (Cluster of Differentiation) s přiřazeným pořadovým číslem.

Rozpracovávání inventarizace leukocytárních antigenů naráží i na řadu otázek. Jednou z nich je, jaké spektrum molekul má být do této nomenkla-tury zahrnuto. Má se jednat hlavně o buněčné znaky čistě leukocytární, popř. rozšířené o moleku-ly exprimované na krevních elementech (destič-kách, erytrocytech) hematopoetického původu, nebo se má systém rozšířit třeba o skupinu úzce příbuzných molekul, vyskytujících se na různých somatických buňkách (hepatocyty, keratinocyty, mozkové buňky apod.). Do jednotlivých worksho-pů byly zahrnuty sekce týkající se karbohydráto-vých (lektinových) struktur, erytrocytárních buněk, dendritických buněk, kmenových/progenitoro-vých buněk a také sekce zaměřené na zavedení určitých korelací s buňkami některých živočišných druhů. To je dáno tím, že některé epitopy nejsou specifi cké pouze pro lidský systém, ale jsou pří-tomny i na buňkách jiných živočišných druhů. Dal-ší otázky se týkají toho, zda karbohydrátové epito-py či antigeny třeba krevních skupin, nebo některé „intracelulární“ diferenciační molekuly, mají být také zahrnuty do této nomenklatury.

Po konferenci v Adelaide (Austrálie) končí CD systém číslem CD350, ale CD membránových mole-kul je o něco více, protože v tabulce znaků jsou zahrnuty jednak skupiny příbuzných molekul (inte-grinů, selektinů), jednak jejich glykosylované formy. V nomenklatuře CD „leukocytárních“ znaků jsou šířeji zahrnuty i některé molekuly, které se nachá-zejí na dendritických a endoteliálních buňkách, erytrocytech a krevních destičkách, takže jejich zařazení mezi „čistě“ leukocytární antigeny není zcela přesné. U skupiny antigenů velmi blízce pří-buzných molekul je jejich rozlišení ještě vystiženo písmeny (např. CD85a, CD85b, CD85c atd.). U něk-terých znaků jsou jejich glykosylované (sialyzova-né) formy vyjádřené písmenem -s (např. CD15s,

Tab. 2: Přehled hlavních interleukinů, jejich synonym, molekulové hmotnosti a genové lokalizace

Interleukiny Synonymum Molek. hmotn. D Lokalizace

IL1A interleukin 1α TRF, LAF, BAF, MP, EP, LAF, LEM

15-17 2q12-q21

IL1B interleukin1β IL1F2 15-17 2q13-q21

IL2 interleukin 2TCGF, TSF, TMF, TDF, KHF, EDF

23 4q26-q27

IL3 interleukin 3CFU-SA, PSF, BPA, E-CSF, HP2, m-CSF

25 5q23-q31

IL4 interleukin 4BCGF-1, TCGF-2, MCGF 2, BSF-1

20 5q23-q31

IL5 interleukin 5BCGF-2 (též BCDF), TRF, Eos-CSF

23 5q23q31

IL6 interleukin 6BSF-2, IFN-γ 2, PCT-GF, HSF, HPGF

26 7p21-p15

IL7 interleukin 7LP-1, Lpo, PBGF, THCGF

25 8q12-q13

IL8 interleukin 8LIP, NAF, MONAP, MDNCF, LAI, TCF

8 4q13-q21

IL9 interleukin 9 P40, MEA, TCGF-3 14 5q31-q35

IL10 interleukin 10CSIF, BTCGF, IL1

biomedicÍnskÝ vÝzkum na prahu dalŠÍho tisÍciletÍ … 2008-10.pdf · 2014. 7. 24. · 2...

Documents