Mikroskopická technika

Úkol 1:

Pojmenujte

jednotlivé

části

mikroskopu

1

2

4

5

6

7

3

okulár

objektiv

stolek

kondenzor

stativ

šroub hrubého zaostření

šroub jemného zaostření

Měření velikosti mikroskopických objektů v optickém mikroskopu

okulárové měřítko (okulárový mikrometr)

Kalibrace okulárového měřítka

Měření velikosti mikroskopických objektů

Barvení chromozomů pro účely světelné mikroskopie

• Giemsa-Romanowski

• Hematoxylin

• Acetokarmín

• Acetoorcein

• Fuchsin – Feulgenova reakce

Barvení Giemsou

leukocyty chromozomy

Úkol 2: Pozorování chromozomů

• Preparáty byly získány z dělících se lymfocytů lidské periferní krve.

• Krev jsme po odběru kultivovali v médiu, kde byly buňky přinuceny k mitotickému dělení.

• Vzniklou suspenzi jsme fixovali, nakapali na skla a po zaschnutí obarvili roztokem Giemsa-Romanowski

Úkol 2: Prohlídka skel pod mikroskopem

• Sklo položíme (buňkami nahoru!) na stolek mikroskopu a prohlížíme objektivem 6x nebo 10x.

• Po zaostření na plochu obsahující větší počet buněk (výrazně modrofialově zbarvená jádra nebo skupinky chromozomů) použijeme objektiv s vyšším zvětšením (nejlépe 45x). Při zaostřování s vyšším zvětšením pozor na nebezpečí poškození preparátu a znehodnocení objektivu!

• Vyhledáme chromozomy a zkusíme je spočítat. Obraz v mikroskopu srovnáme s přiloženou fotografií.

Stereomikroskop

Fluorescenční mikroskop

Princip fluorescence:

Schéma fluorescenčního mikroskopu

Fluorescenční barviva v genetice

• DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)

• PI (propidium iodide)

• Chinakrin

• Ethidium bromid

Nejnovější trend – spojení mikroskopu a počítače

Kultivace buněk in vitro

Kultury

• Orgánové

• Tkáňové

• Buněčné

– Buňky opouštějí původní tkáň a v médiu se

samostatně dělí – tak vzniká buněčná

kultura .

Oba termíny se často zaměňují.

Alexis Carrel (1873 – 1944)

Složení média• základní anorganické živiny• stopové prvky

• stabilizátory pH (CO32-/HCO3

-, HPO42-/H2PO4

-)– pH = 7,2 – 7,4

• glukóza• aminokyseliny• vitaminy a jiné složky různých enzymů• mastné kyseliny a lipidy• specifické proteiny a peptidy podporující buněčné dělení • sérum (zpravidla fetální bovinní sérum)• antibiotika (pro snížení rizika kontaminace bakteriemi)

Kultivační podmínky

• Používáme skleněné nebo umělohmotné nádobky, které plníme médiem s rozptýlenými buňkami.

• Přechováváme v termostatu při 37 ºC. Buňky brzy ulpí na stěnách nádobky a začnou se dělit.

• V některých případech přidáváme do kultivační atmosféry oxid uhličitý.

Práce ve sterilním boxu

Pasážování buněk

• Po určité době se živiny z média vyčerpají a početnost buněk stoupne na neúnosnou míru.

• Proto je nutné část buněk odebrat, smísit s novým médiem a tuto suspenzi přenést do další kultivační nádobky

Buněčné kultury

• živočišných buněk

– savčích buněk (včetně

lidských)

• rostlinných buněk

– explantátové kultury

– význam ve šlechtitelství a

genetickém inženýrství –

produkce transgenních

plodin

kultura makrofágů

explantátová kultura – tzv. kalus

Podle typu a morfologie buněk rozlišujeme:

• kultury epiteliálních buněk

• k. fibroblastoidních buněk

• k. lymfoblastoidních buněk

• k. neuroblastoidních buněk

Z hlediska životnosti dělíme buněčné kultury do 3 skupin:

• Primokultury (též primární kultury)– obsahují buňky čerstvě izolované z organismu– Po převedení do kultivačního média přežívají pouze ty buňky, které jsou lépe

přizpůsobeny daným podmínkám. – existují zpravidla jen několik dní, pak je nutné buňky, které se rozmnožily,

převést do nového média.

• Buněčné kmeny– vycházejí z primárních kultur– kultury normálních diploidních buněk, které byly již alespoň jednou pasážovány – vznikají z buněk, které se v podmínkách in vitro začaly rozmnožovat– zhruba po 40-50 děleních zanikají.

• Buněčné linie (též permanentní buněčné linie)– mají charakter nádorových buněk– jsou plně adaptovány na podmínky in vitro– neomezeně se dělí a lze je přechovávat libovolně dlouho– vznikají transformací buněčných kmenů anebo jde o buňky původně izolované z

nádorů

Růstová křivka buněčné kultury• vyjadřuje změny početnosti buněk v závislosti na čase• Růst buněčné kultury prochází několika fázemi:

– Lag-fáze – počáteční fáze, počet buněk nejprve mírně klesne a pak poměrně rychle vzrůstá. Buňky se adaptují na kultivační prostředí a připravují se k buněčnému dělení.

– Log-fáze (též logaritmická nebo exponenciální fáze) – počet buněk exponenciálně roste. V této fázi zachytíme nejvíce buněk v mitóze, což lze využít pro chromozomové vyšetření.

– Stacionární fáze – rychlost růstu buněčné populace postupně klesá, projevují se inhibiční mechanismy (např. kontaktní inhibice, produkce růstových inhibitorů) a postupné vyčerpávání živin z média.

– Fáze úbytku buněk – dochází k postupnému odumírání buněk způsobenému nedostatkem živin, snížením pH (následkem zvýšení koncentrace CO2 a dalších kyselinotvorných látek v médiu) a hromaděním toxických produktů buněčného metabolismu.

log N

čas

lag

log

stacionární fáze

úbytek

Růstová křivka buněčné kultury

Praktické úkoly

viz návody na stolech

Úkol 3: Pozorování buněčné kultury inverzním mikroskopem

• Seznamte se s použitím inverzního mikroskopu.

• Prohlédněte pod inverzním mikroskopem kultivační nádobku s buněčnou kulturou.

• Povšimněte si tvarů buněk a posuďte jejich denzitu.

Práce s inverzním mikroskopem

Úkol 4: Pozorování buněk HeLa

• Epiteliální buňky HeLa jsou

stabilizovanou buněčnou linií.

• Primární kultura byla získána z buněk

karcinomu děložního krčku pacientky

Henrietty Lacksové v počátku 50.let

20.století.

• Dosud se v laboratořích používají jako

typický model zachovávající všechny

vlastnosti nádorových buněk.

Henrietta

Lacks

Úkol 4: Pozorování buněk HeLa

• Buňky v předložených Petriho miskách byly po krátkodobé kultivaci fixovány methanolem a obarveny trypanovou modří. V některých miskách lze již vizuálně pozorovat jejich kolonie.

• Prohlédněte pod inverzním mikroskopem kolonie buněk HeLa. K vyhledání a pozorování využijte objektivů 10x-20x.

• Povšimněte si utváření jednotlivých buněk a kolonií. Vysvětlete, proč mají některé buňky kulovitý tvar.

Úkol 5: Počítání buněk v suspenzi

• Bürkerovu počítací komůrku přikryjte krycím sklíčkem, jehož okraje musí pevně přilnout k podkladu (provede vedoucí praktika). Pipetou odeberte cca 10 – 20 mikrolitrů vzorku (suspenze buněk) a kápněte ji ke hranám krycího sklíčka po obou stranách (tedy 2 x 10 µl).

• Vzorek nejprve prohlédněte pod malým zvětšením (objektiv 6x nebo 10x), s nímž vyhledejte mřížku s buňkami. Pak spočtěte buňky pod 20x, popř. 45x zvětšujícím objektivem.

• Ze zjištěného údaje vypočtěte buněčnou denzitu. Její hodnotu (d) v počtu buněk na mililitr suspenze udává vzorec:

d = p . 104 / n• kde p - celkový počet vyhodnocených buněk a n - počet

malých čtverečků mřížky, na nichž byly buňky počítány.

Úkol 5: Počítání buněk v suspenzi

Úkol 6: Chromozomy v buňkách stabilizované linie CHO

• Na fotografiích jsou zobrazeny chromozomy stabilizované buněčné linie CHO.

• Jde o fibroblasty izolované z ovarií čínského křečka (Chinese Hamster Ovary Cells).

Chromozomy byly izolovány z dělících se buněk, fixovány směsí methanol-kyselina octová a po zaschnutí suspenze na podložním skle obarveny roztokem Giemsa-Romanowski.

Úkol 6: zadání• Spočtěte jednotlivé chromozomy a

povšimněte si jejich utváření.

• Zkuste vysvětlit své výsledky.

karyotyp

Úkol 7: Využití buněčných kultur při mapování genomu• Při mapování genomu byly využity hybridní

buněčné linie vzniklé fúzí normálních lidských buněk s nádorovými buňkami myši. Vznikla tak stabilní linie, jejíž další proliferací došlo ke vzniku několika klonů o různé chromozomové konstituci.

• Při vývoji těchto klonů buňky ztrácejí některé lidské chromozomy, zatímco počet myších chromozomů se příliš nemění.

• V extrémním případě může v buňkách zůstat pouze jediný lidský chromozom, zatímco zbytek karyotypu tvoří myší chromozomy.

• Jednotlivé klony lze poměrně snadno izolovat do samostatných buněčných kultur a pak přímo v buňkách nebo v jejich médiu zjistit přítomnost konkrétních lidských proteinů.

• Pokud se sledované proteiny v buňkách vytvářejí, lze srovnáním těchto výsledků s karyotypem buněk zjistit, na kterém chromozomu se gen pro příslušný protein nachází.

fúze buněk

Úkol 7: Využití buněčných kultur při mapování genomu

• V laboratoři byla připravena série hybridních klonů normálních lidských a myších nádorových buněk. Analýzou chromozomů se zjistilo, že uvedené klony obsahují následující lidské chromozomy:– Klon I: 4, 7, 8, 10, 20, X– Klon II: 1, 3, 7, 21, X– Klon III: 9, 13, 19, 21, X– Klon IV: 1, 4, 10, 19, X– Klon V: 2, 3, 13, 20, X.

• Ve všech klonech byla biochemickou analýzou stanovována přítomnost 4 různých lidských enzymů. Přitom bylo zjištěno, že:– a) Enzym A je přítomný v klonu V, ale v ostatních klonech chybí.– b) Enzym B se naopak vyskytuje ve všech pěti klonech.– c) Enzym C je přítomen pouze v klonech III a IV.– d) Enzym D není obsažen ani v jednom z hodnocených klonů.

• Lze pomocí uvedených dat upřesnit chromozomovou lokalizaci genů pro příslušné enzymy? Pokud ano, zjistěte na kterých chromozomech se tyto geny nachází.

Řešení úkolů

Úkol 4: Pozorování buněk HeLa

Kulovitý tvar mají buňky v mitóze.

Úkol 6

21 chromozomů

7

6

4

4

5

6

3

7

Aneuploidní počet chromozomů je výsledkem transformace buněk dlouhodobě přechovávaných v kultuře.

Karyotyp buněk CHO

21 chromozomů

Buňky CHO mají charakter nádorových buněk.

Karyotyp normální a nádorové buňky

normální buňka muže

nádorová buňka

Při vývoji nádoru dochází rychlou a nekontrolovanou proliferací ke změnám počtu a struktury chromozomů.

Úkol 7: Využití buněčných kultur při mapování genomu

• Klon I: 4, 7, 8, 10, 20, X• Klon II: 1, 3, 7, 21, X• Klon III: 9, 13, 19, 21, X• Klon IV: 1, 4, 10, 19, X• Klon V: 2, 3, 13, 20, X.

– a) Enzym A je přítomný v klonu V, ale v ostatních klonech chybí.– b) Enzym B se naopak vyskytuje ve všech pěti klonech.– c) Enzym C je přítomen pouze v klonech III a IV.– d) Enzym D není obsažen ani v jednom z hodnocených klonů.

Gen pro enzym A leží na chromozomu 2.

Gen pro enzym B leží na chromozomu X.

Gen pro enzym C leží na chromozomu 19.

Gen pro enzym D neleží ani na jednom z uvedených

chromozomů.

Význam buněčných kultur• studium regulace buněčného cyklu a diferenciace buněk• studium procesů vedoucích ke vzniku a progresi

nádorových chorob. • produkce monoklonálních protilátek, které jsou nezbytné

při diagnostice mnoha onemocnění. • testování účinků léčiv a jiných chemických látek, které by

mohly ohrozit zdraví člověka, stanovení genotoxicity – nahrazení pokusů s laboratorními zvířaty?

• klinická genetika– prenatální vyšetření (amniocyty z plodové vody, buňky choriových

klků)– postnatální vyšetření (kultury lymfocytů periferní krve) – chromozomové vyšetření nádorových buněk

• mapování lidského genomu• klonování savců• virologie – kultivace a izolace virů

Na shledanou!