biokémia enzimológia makromolekulák témakör

Enzimológia IEnzimológia I

Biokémia 3, Vértessy Beáta, vertessy@mail bme [email protected]

1

Makromolekulák témakör befejezése

Biokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]

2

A nukleinsavak biológiai funkciójaA nukleinsavak biológiai funkciója

‐A genetikai információ tárolása (genom)R liká ió (DNS→ DNS)‐ Replikáció (DNS → DNS)

‐ Transzkripció (DNS → RNS)Reverz (RNS → DNS)

T lá ió (RNS → f hé j )‐Transzláció (RNS → fehérje)


3

DNS-fehérje komplex –egy jellemző példa

Fehérje : helix-turn-helix szuper-másodlagosszerkezeti egységgel kapcsolódikszerkezeti egységgel kapcsolódik

Az egyik hélix pont jól beilleszkedik aDNS spirál nagyárkábaDNS spirál nagyárkába

Példa: transzkripciós faktorok, fontos szerep a génkifejeződésszabályozásában


szabályozásában

4

Néhá f t bb li idNéhány fontosabb lipid


5

A zsírsavak főbb típusaiA zsírsavak főbb típusai

K b ilKarboxilcsoport

Szénhidrogénlánclánc

Telítettzsírsavak

Telített és telítetlenzsírsavak keveréke


6

GlicerinKevert triglicerid:

A három OH-t háromkülönböző zsírsav észteresítizsírsav észteresíti(sztearinsavlinolsavpalmitilsav)


7

Tároló funkció:Neutrális zsírok

Membrán lipidek:Polárosak: foszfátcsoport vagy cukrok

Neutrális zsírok vegyületei


8

Fontosabb foszfolipidekFontosabb foszfolipidek


9

AZ ENZIMMŰKÖDÉS ALAPJAI Katalitikus hatékonyság

– sebesség fokozás: 106-1016x (Keq nem változik!!!)

Enzim

Reakcióféléletideje(katalízis

kun kcat kcat/kun(1/s)(katalízis nélkül)

OMP dekarboxiláz 78 millió év 2,8x10-16 39 1,4x1017

(Katalízis nélkül) (1/s)

OMP dekarboxiláz 78 millió év 2,8x10 39 1,4x10

Staphylococcus proteáz 130 ezer év 1,7x10-13 95 5,6x1014p

karboxipeptidáz A 7,3 év 3,0x10-9 578 1,9x1011

trióz foszfáttrióz-foszfát izomeráz 1,9 nap 4,3x10-6 4300 1,0x109

szénsav-anhidráz 5 sec 1 3x10-1 1x106 7 7x106

10

szénsav anhidráz 5 sec 1,3x10 1x10 7,7x10


• Specifitás abszolút v részleges– abszolút v. részleges

• pl. proteázok: szubtilizin (minden peptidkötés), tripszin, trombin• pl. proteázok: peptidkötés, egyéb amid- és észterkötés

– geometria és elektrosztatikus komplementaritás– sztereospecifitás

• prokirális szubsztrátokra is (pl etanol és alkohol-dehidrogenáz)• prokirális szubsztrátokra is (pl. etanol és alkohol-dehidrogenáz)– molekuláris felismerés

11tripszin trombin


• Reguláció– enzim mennyiség és izoenzimek (genetikai)– modulátor fehérjék (pl. Ca2+ és kalmodulin)j (p )– kovalens módosítás:

• reverzibilis– Ser, Thr, Tyr foszforiláció: protein-kinázok (~600 emberben),

protein foszfatázok• irreverzibilis• irreverzibilis

– zimogének: pl. Ser-proteázok– enzimkaszkádok: pl. véralvadás, komplement rendszerp p– ubikvitinálódás (72 a.s.; degradációs szignál)– membrán-kötődés: pl. farneziláció (Src, kalcineurin)

ll té ik bál á– allosztérikus szabályozás– enzim inhibitorok

12• irreverzibilis, reverzibilis (kompetitív, nem-kompetitív)


• Kofaktorok– apoenzim + kofaktor = holoenzim– Me-ionMe ion

• Zn2+ : karboxipeptidáz A, szénsav-anhidráz• Mg2+: restrikciós endonukleázok, hexokináz• Ni2+ : ureáz• Mn2+: szuperoxid-diszmutáz

K+ i át ki á• K+ : piruvát-kináz• Se : glutation-peroxidáz• Mo : nitrát-reduktázMo : nitrát reduktáz

– koenzim (sokszor vitamin származék)– prosztetikus csoport (erősen kötött) vagyprosztetikus csoport (erősen kötött) vagy– ko-szubstrát

13Biokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]

Koenzim vitamin csoport transzfer példatranszfer

tiamin-pirofoszfát (TPP) B1 (tiamin) aldehid piruvát-dehidrogenáz

flavin-adenin-dinuklotid (FAD) B2 (riboflavin) H atom szukcinát-

dehidrogenázik ti id d i lk h lnikotinamid-adenin-

dinukleotid (NAD) niacin hidrid-ion alkohol-dehidrogenáz

k i A (C A) t té il acetil-CoA-koenzim-A (CoA) pantoténsav acil acetil CoAkarboxiláz

biocitin biotin karboxil piruvát-k b ilábiocitin biotin karboxil karboxiláz

piridoxál-foszfát (PLP) B6 (piridoxin) amino glikogén-foszforilázfoszforiláz

5’-dezoxiadenozil-kobalamin B12 H és alkil metilmalonil-

CoA-mutáz

14tetrahidrofolát (THF) folsav 1-szén timidilát-szintáz

• Enzimek osztályozása E C i i 1964– Enzyme Commission, 1964

– pl. hexokináz: EC 2.7.1.1 (ATP:D-hexóz-6-foszfotranszferáz)

osztály reakciótípus példa1 oxidoreduktázok redox laktát-dehidrogenáz1. oxidoreduktázok redox laktát-dehidrogenáz

2. transzferázok csoport transzfer NMP-kináz

3. hidrolázok hidrolízis kimotripszin

4 liázok kettőskötéshez fumaráz4. liázok kettőskötéshez ± csoport

fumaráz

5 izomerázok intramolekuláris trióz foszfát izomeráz5. izomerázok intramolekuláris csoport transzfer

trióz-foszfát-izomeráz

6 ligázok kovalens kapcsolás aminoacil tRNS15

6. ligázok kovalens kapcsolás (+ATP)

aminoacil-tRNS-szintetáz


• Szubsztrát kötés: ES-komplexSzubsztrát kötés: ES komplexszubsztrát telítési görbe

maximális sebesség

geb

essé

gea

kció

sre

16[S]


Hogyan tud betalálni a szubstrát az enzim aktív helyére??Három különböző modell: kulcs zár indukált fit fluktuációs fitHárom különböző modell: kulcs-zár, indukált fit, fluktuációs fit

L

LKulcs-zár

L

LL Induced fit

L

L

Fluktuációs fitStraub, 1960(más néven„conformationalselection”


– kulcs-zár hipotézis (E. Fischer, 1894)p ( , )


– indukált-illeszkedés (“induced-fit”)indukált illeszkedés ( induced fit )(D. Koshland, 1958)


• Mi is az az aktív hely” (aktív centrum)?Mi is az az „aktív hely (aktív centrum)?– kötőhely + katalitikus hely (katalitikus csoportok)

3 D hasíték árok zseb (ált apoláros)– 3-D hasíték, árok, zseb (ált. apoláros)

Lizozim(Glu35, Asp52)

20

• Átmeneti állapot teóriaaktivációs szabadenergia (G‡)– aktivációs szabadenergia (G‡)

– az enzim csökkenti a G‡-t

Átmeneti állapot, S‡

G‡ ( k t )

G‡ (katalizált)

G‡ (nem-kat.)

G‡ = Gs‡ -Gs = H‡ – TS‡

ergi

aG

szubstrátab

aden

eS

za

termék

21Reakció koordinátaBiokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]

Több intermedier is van!!


• Enzimkatalízis lényege: – átmeneti állapot specifikus, preferált kötődése

(L. Pauling, 1947)( g )


• Az ATP kémiai energiáját felhasználó enzimek– motorfehérjék– ATP-szintáz– membrán pumpák

Ca2+-ATPázCa ATPáz

24Biokémia 3, Vértessy Beáta,

[email protected]

ENZIMKINETIKAENZIMKINETIKA• Szaturációs kinetika (sebesség/szubsztrát koncentráció)( g )

(V0)

bess

ég (

zdet

i seb

kez

25szubsztrát koncentráció [S] Biokémia 3, Vértessy Beáta,

[email protected]

MICHAELIS-MENTEN EGYENLET• Feltételek:

– egy szubsztrát (ha több, egy változó, a többi állandó)ES E + P i ibili k d ti b é é é– ES E + P irreverzibilis v. kezdeti sebesség mérése([P] ~ 0)

– [S] >> [ET] és [ET][ ] [ T] [ T]– T, pH, (ionerő) állandó

k1 k2

E + S ES E + P (1)

k–1

V = d[P]/dt = k2[ES] (2)

26d[ES]/dt = k1[E][S] – (k–1+ k2)[ES] (3)


• Egyensúlyi közelítés (L. Michaelis, M. Menten, 1913)• k–1 >> k2 (gyakran nem áll fenn)

• Steady-state közelítés (G. Briggs, J.B.S. Haldane, 1925)

d[ES]/dt = 0d[ES]/dt 0

(4)


k kk1 k2

E + S ES E + Pk

(1)

k–1

k1[E][S] = (k–1+ k2)[ES] (5)

[E][S]/[ES] = (k–1+ k2)/k1(6)

KM = (k–1+ k2)/k1(7)

KM : Michaelis-konstans (dimenzió: M (azaz mol/liter)


– kezdeti sebesség feltétel

Vo = (d[P]/dt)t→o = k2[ES]

k1 k2

E + S ES E + Pk–1

Vmax = k2 [E]T29

max 2 [ ]TBiokémia 3, Vértessy Beáta,

[email protected]

KM = Kd(ES)– ha k2<<k 1 KM Kd(ES)ha k2 k–1


V = k [E]

• k : átviteli szám (katalitikus konstans)

Vmax = kcat [E]T

• kcat: átviteli szám (katalitikus konstans)– dimenzió: s–1

Vo = (kcat/KM) [E][S]

– ha [S]<< KM V = (k /K ) [E] [S][ ] M[E] ~ [ET]

– fiziológiásan: 0,01 < [S]/KM < 1

Vo = (kcat/KM) [E]T[S]

fiziológiásan: 0,01 [S]/KM 1

• kcat/KM : enzim hatékonyság mértéke

31– dimenzió: M–1s–1 (másodrendű sebességi áll.)


enzim szubstrát KM(M)ki t i i til L t i t fá id 5000kimotripszin acetil-L-triptofánamid 5000lizozim hexa-N-acetilglükózamin 6szénsav-anhidráz CO2 8000dUTPáz dUTP 0,2piruvát-karboxiláz piruvát 400

Specificitás és katalitikus képességenzim kcat (s–1)

Specificitás és katalitikus képesség

szénsav-anhidráz 600.000 laktát-dehidrogenáz 1.000kimotripszin 100DNS polimeráz-I 15

32

plizozim 0.5


• Kinetikai állandók meghatározásaö b ill té– görbeillesztés

– kettős-reciprok (Lineweaver-Burk) ábrázolás

33

ENZIMGÁTLÁSOKkompetitív i hibitszubsztrát

• reverzibilisinhibitor

– kompetitív• ES v. EI

– nem kompetitív• ESI szubsztrátESI

– kevert (“is-is”) nem-kompetitívinhibitor

szubsztrát

34Biokémia 3, Vértessy Beáta,

[email protected]

• Kompetitív gátlásK ö k ik V ál l– KM

app növekszik, Vmax változatlan

KI = [E][I]/[EI]KI [E][I]/[EI]

K app = K (1+[I]/K )KMpp = KM(1+[I]/KI)

35

• Nem-kompetitív gátlás– Vmax csökken, KM nem változik

36

• Irreverzibilis gátlószerek (ált. kovalens kötés)– oldallánc specifikus reagensek

• Ser + organofoszfátok: diizopropil-fluorofoszfát (DFP), szarinés tabun (ideggázok) parathion (inszekticid)és tabun (ideggázok), parathion (inszekticid)

Szíria

DFP

acetilkolin észteráz;37

acetilkolin-észteráz; Ser-proteázok inaktív enzim

– affinitás jelölés (szubsztrát analógok)• pl kimotripszin + TPCK (His módosítás)• pl. kimotripszin + TPCK (His módosítás)

kimotripszin

kimotripszin természetes szubsztrátkimotripszin természetes szubsztrát

38tozil-L-fenilalanin-klórmetil-keton (TPCK)

ALLOSZTÉRIKUS ENZIMEKALLOSZTÉRIKUS ENZIMEK

• Szigmoidális szubsztrát telítési görbeSzigmoidális szubsztrát telítési görbe– általában negyedleges szerkezetű (és/v. több domén)

fehérjefehérjebe

sség

kció

seb

Rea

k

39Szubsztrát koncentráció

• Együttműködő és/vagy szekvenciális modellgy gy

szekvenciális modell effektor: + vagy – kooperáció(Koshland)

együttműködő modell (MWC) effektor: csak + kooperációegyüttműködő modell (MWC) effektor: csak kooperáció

40MWC: Monod, Wyman, Changeux

MIOGLOBIN ÉS HEMOGLOBIN„tiszteletbeli enzimek”- kiváló példa

Gl bi lád O tá lá (Mb) é állítá (Hb)• Globin család: O2 tárolás (Mb) és szállítás (Hb)• Hem (Fe2+-protoporfirin IX) prosztetikus csoport

Fe2+

Fe hat 2+

41porfirin gyűrű hemkoordinációs hely,

ebből 4-et a hem leköt

• Mb, Hb() és Hb() szekvencia illesztés (18% azonosság)

Disztális His(kö li Hi )(közeli His)

Proximális His(távoli His):

Ezek fontosakEzek fontosaklesznek!

42

hemhem

43mioglobin (153 a.s.) hemoglobin -lánc (146 a.s.)

• O2 kötődés; proximális és disztális His szerepe 2 ; p p(HisF8, HisE7)

oldalnézet

proximális His porfirin síkproximális His(HisF8)

porfirin sík

2+

44Fe hat koordinációs hely: 4 hem porfirin, 1 His (prox), 1 O2

2+

– O2 kötés hidrofób zsebbe– oxigenáció → színváltozás (vénás és artériás vér)– oxigenáció → színváltozás (vénás és artériás vér)– szabad Fe2+ oxidáció → metMb, metHb (Fe3+; alvadt vér)– CO, NO mérgezésCO, NO mérgezés

Disztális(távoli) His

CO kötés(kémény)

Proximális(közeli) His

( y)

45

Mioglobinszövet tüdő

Tapasztalat:

Tüdő: Oxigén felvétel

ráci

ó) Szövetek: Oxigén leadás

(sza

tur Oxigén leadás

Y (

13,3 kPa4 kPa

Mit segít a kooperativitás?

,

46

• A kooperativitás molekuláris alapja– Kötőhelyek közötti kommunikáció– O2-kötés → konformációváltozás (negyedleges szerk.)

az Fe(II) ion a hem csoport síkjába rendeződikaz Fe(II) ion a hem csoport síkjába rendeződik

47

T → R konformációs átmenet (“tense”, “relaxed”)– T: alacsony O2 affinitás; R: magas O2 affinitásy 2 ; g 2

– T-állapot: extra sóhidak stabilizálnakAmikor az alfa alegység oxigént köt, akkor a bétaAmikor az alfa alegység oxigént köt, akkor a béta

alegységgel alkotott kölcsönhatásai megváltoznak

48

Al éAlegységkölcsön-h tá khatásokhelye

49

• Hemoglobin alloszterikus fehérje (reguláció)h ó ff k O (k i i á )– homotróp effektor: O2 (kooperativitás)

– heterotróp effektorok: H+, CO2, BFG– O2 affinitás csökkentése szövetekben (R – allosztéria modellek:

a) Együttműködőa) Együttműködő (“concerted”)

MWC, Monod, Wyman,yChangeux (1965)

b) SzekvenciálisKoshland (1966)

Mi a különbséga két modell között?

50

a két modell között?

• Bohr-effektus (Ch. Bohr, 1904)

– H+ és CO2 fokozza az O2 leadást a szövetekben

HHb+ + O2 HbO2 + H+2 2

Izomaktivitás szén-dioxidot (és tejsavat) produkálíti h l bi i é l dá át

51– ez segíti a hemoglobin oxigén leadását.

Bohr effektusBohr effektus

52Magas metabolikus ráta: pH csökkenés

Hemoglobin szabályozásHemoglobin szabályozás

• Allosztéria• Parciális oxigén nyomásParciális oxigén nyomás• pH• CO2 tartalom (két úton is: CO2 bekötés ill

szénsavanhidrázzal való együttműködés)s é sa a d á a a ó együtt ű ödés)• 2,3-biszfoszfoglicerát (BFG)• Magzati hemoglobin

53

• Hb CO2 szállítása (~20 % totál CO2)

• 2,3-biszfoszfoglicerát (BFG) szerepe: O2-mentes hemoglobinhoz köt! T-t stabilizál O leadásra késztetköt! T-t stabilizál, O2 leadásra késztet

– [BFG] ≈ 5 mM (nagy magasságban: ≈ 8 mM)([Hb] ≈ 2-5 mM)([Hb] ≈ 2-5 mM)

HbBFG + O2 HbO2 + BPG

54Honnan lesz a 2,3-BPG? 1,3-BPG-ből, ami a glikolízis intermedierje

• Magzati Hb (22)Hi 143S– : His143Ser

– 2 + töltéssel kevesebb a BPG kötőhelyen T → RO anyai vérből magzatba– O2 anyai vérből magzatba

55

• Sarlósejtes vérszegénységHb A Hb S ( Glu6Val mutáció) – Hb A → Hb S ( Glu6Val mutáció)

– Dezoxi-Hb hidrofób felszíni folt → polimerizáció → tubuláris rost (sejtalak változás)tubuláris rost (sejtalak változás)

– Heterozigóta előny: malária rezisztencia(2011 Science cikk: heterozigóta aktin citoszkeleton(2011 Science cikk: heterozigóta aktin citoszkeleton

megváltozik)

56

ENZIMEK MOLEKULÁRIS MECHANIZMUSA

• Katalitikus mechanizmusok– átmeneti állapot komplex preferált kötődéseátmeneti állapot komplex preferált kötődése– sav-bázis katalízis

k l k t lí i– kovalens katalízis– fémion katalízis– proximitás és orientáció– ES destabilizáció: (kötési energia kompenzálása)ES destabilizáció: (kötési energia kompenzálása)


biokémia enzimológia makromolekulák témakör

Documents