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R. RolandiUniversità di Genova, CNISM
Biofisica
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Che cosa è la biofisica?
La biofisica è il campo della scienza che usa i principi della fisica e della chimica, i metodi dell’analisi matematica e della modellistica computazionale per studiare come funzionano i sistemi biologici.
Essa cerca di spiegare le funzioni biologiche in termini della struttura e delle proprietà di molecole specifiche.
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Universo biologico e universo fisico
Il mondo biologico è stato creato dall’evoluzione: caso e necessità. Probabilmente il mondo biologico di cui facciamo parte non èl’unico possibile.
Le leggi biologiche non hanno la generalità delle leggi fisiche
I sistemi biologici sono sistemi “fisici” complessi. Un sistema complesso è un sistema le cui proprietà non sono direttamente deducibili dalle proprietà dei singoli costituenti
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Che cosa studia la Biofisica?• Come catene di aminoacidi si ripiegano a formare precise
strutture tridimensionali aventi funzioni specifiche.• Come una singola enorme molecola di DNA si svolge per
replicare se stessa o indurre la sintesi di proteine.• Come il suono, la luce, gli odori, I sapori e la pressione
meccanica sono trasformati in impulsi nervosi che informano il cervello del mondo circostante.
• Come fanno le cellule muscolari a trasformare l’energia chimica dell’idrolisi dell’ATP in energia meccanica e movimento
• Come fa la membrana cellulare, che è impermeabile alle molecole solubili in acqua a trasportare tali molecole attraverso il suo interno idrofobico?
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Lunghezza d’onda e risoluzione
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Come si può ricostruire la struttura di una molecola?
Si può ricostruire la struttura atomica o molecolare dall’analisi della distribuzione spaziale di particelle diffuse per diffrazione dal
campione.
Le tecniche di diffrazione utilizzano:
Raggi X Elettroni Atomi Neutroni
Utilizzo delle grandi macchine:
Sincrotroni (Trieste, Grenoble),
Sorgenti di Neutroni (Grenoble, Oxford, Berlino)
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Cosa è un sincrotrone ?
APS, USA
ESRF, Europe-France
Spring-8, Japan
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Struttura molecolare di una proteina
Cristallo di mioglobina
Difrattogramma di mioglobina
Struttura della molecola di mioglobina Max Perutz and Sir John Cowdery
Kendrew, Nobel prize in Chemistry, 1962
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Microscopio elettronicoA trasmissione (TEM) A scansione (SEM)
E. Ruska, premio Nobel per la fisica 1986
Isole di atomi di oro su un substrato di carbonio amorfo
(risoluzione spaziale di 0.11 nm)
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Cellule in coltura foraminiferoVirus dell’erpes
pulce
Globuli rossi diatomea
Membrana cellulare
formica
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Microscopio a forza atomica
(AFM)Muovendo la punta sopra il campione, si misura il piegamento della piccola leva dovuto alle forze di interazione atomiche e molecolari.Si ottiene una immagine topografica della superficie.
Segmento
di DNA
G. Binnig, C.F. Quate, Ch. Geber, Atomic ForceMicroscope, Phys. Rev. Letters, 56 (1986), 930
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DNA scan size 500 nm
HPI layer battericoscan size 220 nm
Filamenti di actinascan size 2.5 μm
Fibre di collagene scan size 3.0 μm
Polisaccaridiscan size 0.8 μm
Cellule di neuroblastomacon dendriti; scan size
100 μmDa http://www.veeco.com
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Caratteristiche della tecnicaAFM
• ambiente di operazione: aria, liquido o vuoto• non è necessario colorare o fissare il campione• il campione deve essere ancorato ad un substrato
e non deve avere rugosità maggiore di 10 μm• risoluzione XY: 2-10 nm, da confrontare con:
• risoluzione Z: 0.05 nm, da confrontare con: • STM <0.01 nm
•SNOM 20 nm
• SEM 3 nm
• TEM 0.4 nm
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Viene generata un’immagine in falsi colori…
0 2 4 6 8 10 12
0
20
40
60
80
100
Z (n
m)
X (μm)
Faccia (001) di un cristallo di streptavidinaProfilo topografico ottenuto
sezionando l’immagine
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Studio di processo in situ: fibrillogenesi della proteina HypF-N
I giorno - Scan size 670 nm, Z range 20 nm
IV giorno - Scan size5.3 μm, Z range 45 nm
IV giorno - Scan size4.8 μm, Z range 40 nm
IX giorno - Scan size3.6 μm, Z range 80 nm
XII giorno - Scan size3.9 μm, Z range 100 nm
A. Relini et al. (2004), J. Mol. Biol. 338, 943-957.
STM I giorno – Scan size 42 nm, Z range 15 nm
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Manipolazione di singole biomolecolemediante AFM
dove intervengono:
• Legami covalenti (F∼1 nN)
• Legami non covalenti (interazioni idrofobiche, legami idrogeno o di Van derWaals cooperativi) (F∼100 pN)
• Forze entropiche (configurazioni del sistema) (F∼10 pN)
Misura di curva forza-distanza
Informazioni su:
• Rottura di legami molecolari (interazione ligando/recettore)
• Unfolding di proteine
• Meccanica del DNA
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Rottura di legami molecolari
Esempi:interazioni ligando-recettore(avidina-biotina, antigene-anticorpo);interazione tra le basi del DNA;estrazione di lipidi da membrana;rottura di legami covalenti
da http://www.biophysik.physik.uni-muenchen.de/
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Unfolding di una proteina di membrana: la batteriorodopsina
Oesterhelt et al. (2000), Science 288, 143-146
I picchi a 10, 30, 50, 70 nm riflettono l’estrazione e l’unfolding delle eliche che compongono la proteina
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Manipolazione di molecole non ancorate: cristallo proteico
Ferritina (∅ ∼10 nm; 24 subunità proteiche)
monomero
Immagine AFM del cristallo a risoluzione molecolare
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,50
10
20
30
40
Cou
nts
Δz (nm)
4 m
ol. [
B]
1 m
ol. [
A]
3 m
ol. [
C]
2 m
ol. [
B]
100 120 140 160 180
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
F (n
N)
z (nm)
Esperimento
V. Mollica et al. (2000), Eur. PhysJ. E 3, 315-321.
Simulazione
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Indentation on a fcc site
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On top indentation
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Simulazione
Δz
Δz (nm)• l’avanzamento della punta ha una distribuzione multimodale• la forza di estrazione di una singola molecola dàinformazioni sulle forze di coesione nel cristallo
R. Ferrando et al. Physical Review B. 72 (2005) 045412
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Ferritin single molecule conductivityDegao Xu,Gerald D. Watt, John N. Harb, and Robert C. Davis, Nano Letters, 5 (2005), 571-577
Tapping mode AFM image of apoferritin molecules (a) and holoferritin molecules (b) deposited on a flat gold surface.
The AFM I-V measurements of single holoferritin and apoferritin. The contact force between the AFM tip and the chosenferritin was 6 nN.
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Un interruttore molecolare
Porfirina
F. Moresco, G. Meyer, K.H. Rieder, H. Tang, A. Gourdon, C. Joachim, Physical Review Letters 86, 672 (2001)).
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Hao Yan, Sung Ha Park, GlebFinkelstein, John H. Reif,Thomas H. La Bean, Science, 301, 2003
Fili e reti di DNA
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Conduzione nervosa: potenziale d’azione
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Sir John Carew Eccles, Alan Lloyd Hodgkin, AndrewFielding Huxley , Nobel Prize in Physiology or Medicine, 1963
Potenziale di azione e voltage-clamp
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Misure di correnti attraverso la membranacellulare: patch clamp
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1991: Erwin Neherand Bert Sakmann
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Correnti di singolo canale
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Basi molecolari della conduzione ionica
Modelli di funzionamento dei canali al sodio e al potassio
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Considerazioni finali
La struttura e le funzioni dei sistemi biologici sono descrivibili sulla base dei principi fondamentali della fisica.
L’approccio “fisico” al problema biologico è una strategia che ha portato a importanti scoperte in campo biologico e ha rivoluzionato il modo di fare biologia.
La biologia è la nuova frontiera della fisica