BIODEGRADACION DE PLASTICO POR Rhyzopussp Mara Teresa GONZALEZ CRUZ ; Gabriel CAMARENA GUTIERREZ Metodologa Cientfica III; Unidad de Morfologa y Funcin. FES Iztacala, UNAM. Av. De los Barrios No. 1 Los Reyes Iztacala, Tlalnepantla, 54090 Mxico RESUMEN Los plsticos son polmeros extremadamente estables y no entran fcilmente en los ciclos de degradacin de la biosfera. El polietileno de alta densidad junto al polietileno de baja densidad son los plsticos sintticos ms utilizados. Son lentos de degradar en ambientes naturales, provocando graves problemas ambientales. Recuperamos bolsas de plstico de un basurero, en el laboratorio separamos una comunidad de hongos adherida a las bolsas, despus se aisl un hongo del gnero Rhyzopus. Se sembr Rhyzopussp. sobre tiras de plstico de baja densidad en agar. Bajo el microscopio se observ que el hongo crece sobre el plstico generando cambios en el color, corrosin de la superficie, formacin de agujeros o grietas en el plstico. Nuestros resultados sugieren que los hongos del gnero Rhyzopussp. forman parte de una comunidad multicelular que puede ser ms eficiente en la degradacin de plstico de baja densidad. Palabras clave: biodregradacin de plsticos, Rhyzopus, plstico

POLYETHILENE BIODEGRADATION BY Rhyzopussp ABSTRACTS Plastics are polymers extremely stable and not easily fit into the cycles of degradation of the biosphere. Both, the high density polyethylene and low density polyethylene are the most widely used synthetic plastics. They are slow to degrade in natural environments, causing severe environmental problems.

Plastic bags was recovered from a garbage dump then we separate a fungi community attached to the bags, then isolated a Rhyzopus fungi. Rhyzopus were seeded over plastic of low density strips on agar. Under the microscope it was observed that the fungus grows on the plastic creating changes in color, etching, formation of holes or cracks in the plastic. Our results suggest that fungi of the genus Rhyzopus sp. form a mutlcellular community that can be more efficient in the degradation of low density plastics. Key words: plastics biodegradation, Rhyzopus, plastic

INTRODUCCION Se ha reconocido como un problema grave la presencia de plsticos y polmeros sintticos en las aguas residuales y en el suelo. Algunos tipos de plstico son biodegradables, y sus mecanismos de degradacin ahora empiezan a ser claros. La biodegradacin es el proceso mediante el cual las sustancias orgnicas se eliminan o transforman por la accin de organismos vivos. El trmino biodegradacin se utiliza a menudo en relacin con la ecologa, la gestin de residuos, la remediacin (bioremediacin) de los materiales de plstico (Gpferich, 1997). Los microorganismos son responsables de la mayora de la degradacin de plsticos (Atagana, et al., 2004), y los factores abiticos, como la fotodegradacin o hidrlisis desempean un papel muy secundario (Dietrich, 1990, Sasek, et al., 2003). Durante la degradacin, las exoenzimas de microorganismos descomponen polmeros complejos a molculas ms pequeas de cadenas cortas, por ejemplo, oligmeros, dmeros y monmeros, que son lo suficientemente pequeos para pasar las membranas semi-permeables de los hongos, y luego para ser utilizados como fuentes de carbono y energa. Cuando los productos finales son el CO2, H2O, o CH4, la degradacin se llama mineralizacin (Frazer, 1994; Hamilton et al., 1995). Se ha encontrado que el desarrollo de comunidades microbianas multicelulares conocidas como biopelculas (biofilms), adheridas a las superficies de residuos sintticos, han resultado ser poderosos agentes degradantes en la naturaleza, mostrando una mayor resistencia a los agentes antimicrobianos. Tambin en la

mayora de los ambientes naturales y artificiales, la mayora de las poblaciones microbianas forman biopelculas sobre superficies slidas (Atkinson, 1974) y su actividad metablica es superior a la de los organismos individuales (Kirchman, 1982). Por lo tanto, hay grandes posibilidades de desarrollo de una tecnologa de biopelcula para una mayor biodegradacin de polmeros. En este estudio, nuestro objetivo fue aislar e identificar hongos que degradan plstico, asociados con las bolsas de polietileno que se utilizan en los supermercados y que son depositadas en los basureros. Material y Mtodo

En un basurero al aire libre sobre el Ro de los Remedios, Naucalapan, Estado de Mxico, se extrajeron 15 muestras de bolsas de plstico con biopelculas visibles, enterradas a un metro de profundidad. Las muestras se guardaron en bolsas de papel y fueron llevadas al laboratorio. Se lavaron las bolsas de plstico con agua destilada estril, quitando todos los residuos posibles, despus las bolsas se sumergieron una solucin de cloramfenicol a 0.5mg/ml en agua destilada estril, sin agitacin por 60 minutos, para eliminar las bacterias presentes en la biopelcula. Posteriormente se sumergieron las bolsas en agua destilada estril por 30 minutos (Mndez R., 2007). Se cortaron tiras de las bolsas de plstico alrededor de una biopelcula visible y se sembraron en cajas de Petri con agar Czapeck- Dox a pH 5,0 al que se le adicion extracto de levadura al 3% y se incubaron a 30C por 48 horas (Mndez R., 2007) . Despus se tom una muestra del consorcio de hongos en la caja de Petri y se realizaron diluciones seriadas y se sembraron en papa dextrosa pH 5 y se incubaron a 37 C por 48 horas (Koneman W. et al., 1985). Para la obtencin de colonias puras de hongos, se realiz la tcnica de microcultiv en porta objetos (Koneman W. et al., 1985). Se extrajeron crculos de medio agar glucosa Sabouraud, y se colocaron en el centro de un porta objetos estril; con una asa de siembra se tom una muestra de la

caja con la mayor dilucin y se deposit en la orilla del crculo de agar y se coloc un cubreobjetos Posteriormente el porta objetos se coloc dentro de una caja de Petri que contena papel filtro estril y encima una varilla de vidrio, esto con la finalidad de mantener el portaobjetos elevado sobre la superficie de la caja, se cerr la caja y se incubo a temperatura ambiente por 5 das. Al da cinco se observ el crecimiento de hongos en los portaobjetos y en los casos donde se observaron dos o ms tipos de hongos, se tom una muestra de cada uno y se sembraron en portaobjetos como se indic antes. Este proceso se repiti hasta observar el crecimiento de una colonia homognea de hongo en el portaobjetos. Generalmente los hongos se adhieren al cubreobjetos, el cual se retir y se coloc sobre un portaobjetos que tena una gota de azul de anilina en lactofenol, y los montajes se preservaron sellando los bordes del cubreobjetos con esmalte de uas transparente. Con estas laminillas se observaron las caractersticas morfolgicas en un microscpioNikon. La identificacin de los hongos encontrados se realiz siguiendo a Koneman et al., (1985) y Frutis, et al., (2009). Actividad del hongo sobre el plstico. Seleccionamos a Rhyzopussp para observar su actividad sobre el polietileno de baja densidad, seguimos a Kavelman y Kendrick (1978) con las siguientes modificaciones: se cortaron cuadros de 1.0 por 1.0 cm y se eliminaron los que mostraron grietas o perforaciones bajo el microscpio. Los cuadros se lavaron con HClO al 0.5% y se lavaron tres veces con agua destilada estril y despus se sumergieron en cloramfenicol a 5 mg/ml durante 30 minutos, despus se lavaron 3 veces con agua destilada estril durante 20 minutos.

Los cuadros de plstico se colocaron en agar Czapeck sin sacarosa, el cual fue preparado como sigue: 3.0 gr de nitrato de sodio, 1.0 gr de fosfato de potasio, 0.5 gr de cloruro de potasio, 0.5gr de sulfato de magnesio, 0.01 gr de sulfato ferroso, 15.0 gr de agar-agar, se ajust el pH a 5.0 y otro a pH 7.0 y se diluyeron en 1000mL de agua . Se esteriliz y vaci a cjas de Petri (Koneman W. et al., 1985). Despus de tres das se colocaron los cuadros de plstico de baja densidad sobre el agar; se mantuvieron a 37 C por dos das, con la finalidad de asegurar que no haba contaminacin. De los cultivos puros de hongos se tom una muestra para diluirlos y alcanzar una turbidez de 5 en la escala de MacFarland, con la finalidad de tener una concentracin conocida. De sta dilucin, con una asa de siembra se deposit a Rhyzopus en las puntas del cuadro de plstico; las cajas se mantuvieron a 28 y 30 C durante 4 semanas. Las cajas se abrieron para observacin en el microscopio. Se tomaron fotografas a 20 X de las cajas control y en las que se sembr Rhyzopussp. Finalmente se separaron del agar los plsticos sobre los que creci Rhyzopussp y con cuidado se lavaron 5 veces con agua destilada, se montaron sobre portaobjetos y se fotografiaron al microscopio.

RESULTADOS La tcnica de microcultivo permiti separar los hongos que formaban la biopelcula. Rhyzopussp. creci sobre el plstico de baja densidad (Fig. 2); se puede observar la actividad de biodegradacin como cambios de color y perforaciones. El crecimiento del hongo en la interfase plstico-agar se observa en la figura 2. El plstico sobre agar, sin hongos, durante el periodo del experimento se observa en la figura 2a. El crecimiento de Rhyzopus en la interfase agar-plstico se observa en la figura 2b ; el crecimiento invasvo del hongo sobre el plstico se observa en la figura 2c y 2d. Los efectos de la actividad de biodegradacin de Rhyzopussp. sobre el plstico se observan en la figura 3. El cambio de color en las orillas del plstico de baja densidad, por efecto del crecimiento de Rhyzopussp se observan en la figura 3a y 3b; se observa

la erosin del plstico provocado por el crecimiento de Rhyzopussp. en la figura 3c y 3d; se observan perforaciones sobre el plstico en las zonas donde creci el hongo. DISCUSIN La evaluacin de los cambios visibles en los plsticos es un mtodo semicuantitativo que se puede realizar en casi todas las pruebas. Los efectos utilizados para describir la degradacin incluyen corrosin de la superficie, la formacin de agujeros o grietas, la fragmentacin, los cambios en el color o la formacin de bio-pelculas en la superficie como se ve en las figuras. Estos cambios no demuestran un proceso metablico de biodegradacin, pero el parmetro de cambios en la observacin puede ser utilizado como un primer indicador de cualquier ataque microbiano. Este mtodo se aplica generalmente con microorganismos que pueden degradar un polmero determinado (Nishida y Tokiwa, 1993; Abou-Zeid, 2001), pero tambin puede ser utilizado para obtener resultados semi-cuantitativos (Ishigaki2004). El empleo de plsticos est aumentando en la vida del hombre y est aumentando la presin sobre la capacidad para disponer de los plsticos de desecho; de manera que la fabricacin de plsticos biodegradables y la biodegradacin de los plsticos de desecho han incrementado su importancia (Ying y Yanful 2005). El papel de los hongos en la biorremediacin de suelos contaminados est siendo investigado (DAnnibale, et al., 2006); mientras que poco se sabe de la ecologa de las comunidades que forman biopelculas y su actividad en la degradacin de plsticos en los basureros.

Agradecimientos El trabajo se realiz gracias al apoyo del programa Universidad Nacional Autnoma de Mxico PAPIME PE203609 de la

Referencias

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D'Annibale A, F. Rosetto, V. Leonardi, F. Federici, y M. Petruccioli 2006. Role of Autochthonous Filamentous Fungi in Bioremediation of a Soil Historically Contaminated with Aromatic Hydrocarbons. Applied and Environmental Microbiology, 72:28-36

Abou-Zeid, 2001

Ishigaki T, Sugano W, Nakanishi A,Tateda M, Ike M, Masanori Fujita M. 2004.The degradability of biodegradable plastics in aerobicand anaerobic waste landll model reactorsChemosphere 54: 225233 Atagana, H. J. 2004. Biodegradation of phenol, o-cresol, m-cresol and p-cresol by indigenous soil fungi in soil contaminated with cresolate. World J. Microbiol.Biotechnol. 20:851-858. Atkinson, B. y Fowler, H. W., 1974. Adv. Biochem. Eng., 1974, 3, 224277. Dietrich, D. M., and R. T. Lamar. 1990. Selective medium for isolating

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Frazer, 1994; Hamilton et al., 1995). Frutis, et al., (2009). Gpferich, 1997 Kirchman, D. y Mitchell, R., 1982. Appl. Environ. Microbiol., ,42, 200209. Koneman W. et al., 1985 Mndez R., 2007 Nishida y Tokiwa, 1993 Sasek, V., J. A. Glaser, and P. Baveye. 2003. The utilization of bioremediation to reduce soil contamination: problems and solution. Kluwer Academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands.

Ying Zheng y Ernest K. Yanful 2005 A Review of Plastic Waste Biodegradation. CriticalReviews in Biotechnology, 25:243250, 2005

Figura 3. muestra los efectos de la actividad de biodegradacin de Rhyzopussp. sobre el plstico de baja densidad. 3a y 3b Cambio de color en las orillas del plstico de baja densidad donde se sembr a Rhyzopus. 3c y 3d se observa la erosin del plstico provocado por el crecimiento de Rhyzopussp., se observan perforaciones sobre el plstico en las zonas donde creci el hongo.

Fig. 1. Fotografa al microscopio de la superficie de plstico control en medio Czapek sin sacarosa despus de 5 semanas pH 5/28C. Donde no se observa crecimiento de hongos.Plsticocortados en cuadros de 1 X 1 cm y colocado en el centro de la caja petri.

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Fig. 2. Fotografa de la superficie de plstico inoculado con Rhyzopusspen medio Czapek sin sacarosa despus de 5 semanas pH 5/28C. Fig. 2A. Se inocul el hongo en una arista del cuadro de plstico. 2B se observael crecimiento de Rhyzopussp.sobre el plstico y sobre el agar. 2C y 2Dse observa el hongo creciendo sobre el plstico de baja densidad cortado en cuadros de 1 X 1 cm y colocado en el centro de la caja petri.

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Fig. 3. Fotografa de la superficie de plstico inoculado con Rhyzopusspen medio Czapek sin sacarosa despus de 5 semanas pH 5/28C.Los cuadros de plstico se lavaron con agua bidestilada eliminando los hongos que estaban creciendo sobre la superficie y se fotografiaron las zonas de erosin, decoloracin o perforacin. 3A. Se observa la superficie donde creci el hongo mostrando decoloracin y erosin del plstico. 3B muestra la superficie del plstico donde probablemente creci el micelio del hongo. 2C muestra los cambios de coloracin y degradacin de la esquina del plstico donde creci el hongo.

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Fig. 4. Fotografa con campo obscuro de la superficie de plstico inoculado con Rhyzopusspen medio Czapek sin sacarosa despus de 5 semanas pH 5/28C. Los cuadros de plstico se lavaron con agua bidestilada eliminando los hongos que estaban creciendo sobre la superficie y se fotografiaron las zonas de erosin, decoloracin o perforacin. 4A. Se observa la superficie del plstico donde fue inoculado el hongo mostrando decoloracin y erosin. 4B muestra una perforacin y zonas de erosin sobre la superficie del plstico donde probablemente creci el micelio del hongo. 2C muestra una perforacin sobre la superficie del plstico y cambio de coloracin donde estaba creciendo el micelio.