biochem b - molecular biology

נון-שוש בר' פרופ, לילי ורדימון' פרופ, דני כנעני' פרופ, גבי קאופמן' פרופ–' ביוכימיה ב

1 2008' סמסטר ב

(גבי קאופמן - 1 )–מבוא לחומצות גרעין וביולוגיה מולקולרית

DNAשכפול ותיקון , מבנה חומצות גרעין

ספר לימוד מומלץ

Watson et Al – Molecular biology of the gene 2008

הדוגמה המרכזית–נקודת המוצא

פענוח הצפון הגנטי , סליל- התגבשה תפיסה שמבודדת על מודל הדו60-בשנות ה

. בתרגוםRNAוזיהוי תפקידי

DNAהוא משתכפל במהימנות אך לעתים . נושא את המידע התורשתי

.חלים בו שינויים המזינים את האבולוציה

RNAמשועתק מ -DNAומתורגם לחלבון .

בין יתר פעולותיהם התאיות, שעתוק ותרגום, חלבונים מזרזים שכפול.

:שתי תגליות חשובות לדוגמה המרכזית

RNA-התגלית רמזה ש. RNA- חזרה לDNAשיודע להפוך , Reverse Transcriptase, התגלה אנזים מהפך .1

.DNA-יכול לשמש תבנית ל

אנזימים שעשויים על טהרת , קטליטיRNA –ריבוזימים .2

. לשתי התגליות תפקיד חשוב במוצא החיים. RNA-ה

RNAמכיוון שרק , DNA- קדם לחלבונים ולRNA-ההנחה היא ש

נ "ככה. יכול לשמש גם כגנום בנגיפים וגם יש לו יכולת קטליטית

(. ”RNA world“) שימש גם כגנום RNA-קדמו לנו צורות חיים פרימיטיבות בהם ה

של החיים' ב-'הא- חומצות הגרעין

DNA –גדיל ותפקידו לשמש כמולקולה גנטית- מופיע כדו.

RNA –תבנית לתרגום, (בנגיפים בלבד) גנום –יש לו תפקידים מגוונים . אוהב להתקפל על עצמו, נוצר כחד גדיל ,

.(בריבוזם החלק הרגולטורי הוא הריבוזום ולא החלבון)וקטליזה , בקרה

רכיבי הנוקלאוטיד

. ושייר פוספט, סוכר, בסיס

α- : נוקלאוטידבשש זוויות פיתול על כל שייר

: זווית הפיתול סביב הקשר הN- גליקוזידי

הבסיס מחובר לסוכר בקשרN-glycosidic בזווית ,אפשרות לסיבוב, ויש גמישות .

זוויות הפיתול(α-) מאפשרות גמישות

גם הקשרים הבודדים בין שיירי הפוספטים מאפשרים גמישות .



הבסיס

והטבעות הן שטוחות , פירמידנים ופורינים: לבסיסים קיימות שתי משפחות

.ואינן גמישות

. Nלפורינים ממספרים את אטומי הטבעת מאטום החנקן

. 9החיבור לסוכר הוא בעמודה

.1החיבור לסוכר בפירימידינים הוא בעמדה

יש DNA- הוא שבRNA- לDNA-ההבדל בין נוקלאוטידים ב

Thymineוב -RNA יש Uracil . 5השניים נבדלים זה מזה רק בהיעדר מתיל על פחמן מספר (ב-Uracil)

יכולות Keto-חומצות ה. במצבים טאוטומריים שוניםהבסיסים יכולים להימצא

. imino יכולות להיות במצב amino-וקבוצות ה, enolלהיות במצב

.DNAלמצבים הטאומטריים תפקיד בשכפול . הן השכיחותamino- וketoצורות

: שתי צורות היקשרות, יש שני אספקטים. הבסיסים מגיבים זה עם זה - זיווגי בסיסים

של הטבעות πדיפול באמצעות ענני אלקטרוני -הידבקות דיפול- דרך המישורים .א

ענני האלקטורנים יוצרים סביבה הידרופובית פנימית שמאפשרת את . הארומטיות

(יש תחרות עם המים)קשרי המימן בין הבסיסים

, aminoהמתאפשרים הודות לקבוצות , באמצעות יצירת קשרי מימן–דרך הצלעות .ב

ketoמעצבים את מבנה חומצת הגרעין ומקנים לה את אלו הקשרים ש. וחנקני הטבעת

. יכולת הקידוד

לעומת זאת הפוספטים תמיד ). כ"ולכן אינם טעונים בד, הפיזיולוגיpH- הרחוקים מהpH בערכי הבסיסים מתייננים

ריבוזימים מסוימים יכולים להפוך קטליזטורים ומתחילים להתיונן גם . (טעונים שלילית

. פיזיולוגי כשיש סביבה פנימית מתאימהpHבתנאי

להתמרות תפקידים . DNA- ומצויים גם בRNA-שכיחים ב- (נדירים)בסיסים מותמרים

. חשובים אך רק חלקם ידוע

היא יכולה לשמש להשתקה או . חשובה לבקרת שעתוקCytosineמתילציה של - DNA-ב

- חדש לDNAבחיידקים מתילציה כזו משמשת לאבחנה בין . הפעלה של גן זה או אחר

DNAישן .

RNAיש תפקידים בייצוב ועיצוב , (U- לCלמשל הפיכת ) שינוי קידוד חלבון – RNA-ב

כ התמרה מתרחשת לאחר היווצרות "בד. ועמידות לאנטיביוטיקה, המסייעים בתרגום

זה –אך במידה וההתמרה התרחשה קודם , (DNA-לאחר ההכללה ב)הפולינוקלאוטיד

. של נגיף התוקף את התאDNA-ל, עצמי של התאDNAמאפשר להבחין בין



:דוגמאות

1. hydroxy-methyl של 5 בעמדה cytosine .בנגיף , כ יש שם רק מימן"בדPhage T4 –וכך התא יכול , יש התמרה

כ ההתמרות נוצרות לאחר "כי בד, הדוגמא הזו היא מקרה נדיר. שלוDNA- של הנגיף לDNA-להבדיל בין ה

.ולא לפניו, השכפול

2. Pseudo-Uridine –איזומר שכיח ב -RNA , החיבור לסוכר

ומייצב , המאפשר עוד קשר מימן, 1N ולא דרך 5Cמתבצע דרך

. RNA-את ה

3. Inosine –אמינציית - תוצר דהAdenosyne (ריבוז+אדנין) המתנהג בתרגום כ-

Guanosyne (ריבוז+גואנין) . לאחר מכן בתרגום יתקבל חלבון אחר מזה שקודד אליו

.במקור

הסוכר

או 5והחיבור לפוספט הוא דרך חמצן שעל פחמן , 1 דרך פחמן –החיבור לבסיס

-de יש קבוצה 2 על פחמן מספר DNA-ב. 3דרך הידרוקסילשעל פחמן מספר

Oxy .בראקציה אנזימתית חלבונית נוצר ה-de-Oxy , זה לא סוכר שקיים

. בטבע

נוכחות ) בעיקר יציבות – מקנה לו כמה תכונות de-Oxy Ribose-נוכחות ה

. (הידרוקסיל היא גורם לחוסר יציבות

פחמן )משתמשים בשלושה אטומים כדי לקבוע את המישור . puckered- הסוכר הוא מקופל , שלא כמו הבסיס השטוח

(. Oוחמצן , 4פחמן , 1

C2’ endo - 2אם פחמןC מדובר בקונפורמוציית – נמצא מעל המישור C2’endo .

(משמאל למטה) C2’ endoבסביבה מימית הקונפורמציה המועדפת היא

C3’ endo אם פחמן C3 הקונפורמציה היא – נמצא מעל המישור C3’endo ( מימין

.(למטה

exoו -endo5'ריחוק או קירבה לפחמן מציינים בהתאמה .

לצורות הקיפול השונות השפעה מכרעת על המבנה המרחבי

! והאופן בו חלבונים מזהים אותםRNA- וDNAשל

זוויות הפיתול סביב הקשר הגליקוזידי

: יש שני מצבים שוים של תנוחת הבסיס ביחס לסוכר

Anti – (זוהי הצורה השכיחה) הבסיס רחוק מהסוכר.

Syn – (נדיר יותר) הבסיס סמוך לסוכר.



מנוקלאוזיד לנוקלאוטיד

.בסיס+ סוכר –נולקאוזיד

.פוספט+ בסיס סוכר –נוקלאוטיד

פולינוקלאוטיד

של שייר אחד לפחמן ’3אסטרי בין פחמן -די-פוספובפולינוקלאוטיד חוברים נוקלאוטידים בגשר

. של שכנו’5

גלויה 3'ובקצה השני קבוצת (בדרך כלל פוספט) גלויה 5'בקצה אחד של השרשרת מצויה קבוצת

. (בדרך כלל הידרוקסיל)

( כאל תחילת השרשרת5'מקובל להתייחס לקצה ה )3- ל’5- מ–לשרשרת יש כיוון כימי מוגבר

. ומתורגם החלבוןRNA-משועתק ה, DNA-ובכיוון זה גם מתפלמר ה

-אינטרקציות בין הבסיסים לפוספו, י אינטרקציות בין הבסיסים"החופש של השרשרת מוגבל ע

. ('חלבונים וכו, יוני מתכת)ובאינטרקציות לחומרים חיצוניים , סוכר

אסטרי-די-הגשר הפוספו

. סוכרית- מקנות חופש תנועה ניכר לשדרה הפוספו(a-)שש זוויות פיתול

, יונים, מים, סוכרית-י זיקות בין הבסיסים ובינם לבין רכיבי השדרה הפוספו"חופש זה מוגבל ע

. חלבונים וחומצות גרעין אחרות

למרות מגבלות אלה נותרת גמישות מספיקה כדי לאפשר לחומצות הגרעין לפשוט וללבוש צורה

. במהלך פעילויותיהן

צורת הכתיבה

.מתוארת משמאל

זיקות בין בסיסים

. בסיסים מתקשרים זה לזה באמצעות מישוריהם וצלעותיהם

. ערכיים-ודו- למים וליונים חד, פוספט-הבסיסים מתקשרים גם לשדרת הסוכר

בעיקר זיקות שלישוניות )ומיעוטם ארוכי טווח (זיקות שניוניות)מרבית הקשרים נוצרים בין שיירים קרובים זה לזה ברצף

(. RNA-ב



Stacking –בין מישורי הבסיסים .

ואלס -דר-קשרי וון, דיפול-בזכות קשרי דיפול" נדבקים זה לזה"מישורי בסיסים שכנים

כל בסיס ) ספציפות כי יש חלוקת מטענים לא שווה באטומי הטבעת וזיקות אלקטרוסטטיות

. (מסתדר אחרת כתלות בשכן שלו

המערום (stack)כמו בחלבון וממלא תפקיד קריטי , מייצב סביבה פנימית הידרופובית

.בייצוב מבנה חומצת הגרעין

בזיקותstackingאך הן חזקות במיוחד בין פורינים ובין זוגות , משתתפים כל סוגי הבסיסיםGC.

מה שמשפיע על נטייתם למסור ולקבל , נובעים מפיזור מטען לא שווה באטומי הטבעת–קשרי מימן בין צלעות

. פרוטון

Base Pairing - בין צלעות הבסיסים .

3 יש CG-ל. Watson & Crickגשרי מימן ייעודיים נוצרים במתכונת

להיות GCמה שגורם לקשר , יש רק שני קשרי מימן AT-ול, קשרי מימן

. חזק יותר

יש להם מבנה , לכל ארבעת הזוגות אפשר להניח אחד לשני

של בני הזוג דומה 1המרחק בין פחמני , איזוסטרי חופף

. GC ובין ATבין

זיווגי בסיסים אחרים

אן הקשר הזה . אנטי קודון- זיווג נפוץ בקודון– GUנסתכל על

, wobble-זיווג זה מכונה זוג ה. שייך למשפחה איזוסטרית שונה

זיווג כזה גם מאפשר הכרת כמה . RNA-גדיל ב-שכיח באיזורי דו

רק . למרות שאין חפיפה אמיתית, קודון יחיד-י אנטי"קודונים ע

ולהם חשיבות , בשנים האחרונות שמו לב לזיווג בסיסים יוצא דופן

.DNAבמבנה המרחבי של

סוגי זיווגי בסיסים

. ושת צלעות פנויות לאינטרקציות אחרות, קריק-אחת לזיווג ווטסון, צלעות3לכל פורין יש

, Hoogsteen edge –גדיל אחת הצלעות פונה לתעלה הגדולה -במבנה הדו

. Sugar edgeוהצלע השנייה שפנה לתעלה הקטנה מכונה

. C-H edgeמכונה Hoogsteen edge בפירימידין



.נוגדת/לשני הגדילים כיווניות וקוטביות הפוכה, DNAגדיל - כך נראה דו– ציס

. קוטביות הגדילים מקבילה– טרנס

.יש גם זיווגי בסיסים לא שגרתיים

זיווגים לא שגרתיים

הזיווגים הלא שגרתיים מהווים RNA-ב

. תפקיד חשוב

Watson & Crickמודל הדו סליל של

שני גדיליDNAבעלי רצף משלים מקיפים זה את זה בפיתול ימני .

מחזוריות(periodicity - )10 ~ זוגות בסיסים למחזור פיתול(pitch). Pitch = המרחק

. ( בין בסיסים שכנים3.4המרחק הוא ) אנגסטרם 36. מנקודה אחת לנקודה שמעליה

(החלק ההידרופילי) פוספט בחוץ-שדרת הסוכר, (החלק ההידרופובי) הבסיסים בתווך .

הגדילים משלימים כיA חובר ל Tו -Gל -C .

רכסי השדרה וצלעות בסיסים פנויות מגדירים תעלה גדולה וקטנהgrooves) Minor

Major & ) .אך השמות נשארים, בקונפורמציות אחרות מימדי התעלות משתנים קצת .

של השני3' של אחד חובר לבסיס מצד 5'הבסיס בקצה : לגדילים קוטביות מנוגדת .

דבר ; סדיר-לא, א מהגדילים רצף אסימטרי"גדיל לכ-בצד המבנה המונוטוני של הדו

.המקנה לה יכולת קידוד

משמאל ניתן לראות את הקוטביות ההפכה של הגדילים

. (אטומי החמצן פונים לכיוונים שונים)

סליל-שיקולים שהובילו למודל הדו

(Chargaffחוקי ) G:C ו A:Tשוויון .1

מבנה חופף של הזוגות המשלימים .2

DNAנתוני דיפרקצית סיבי .3

השלמה עצמית תנאי לשכפול מדויק .4



Aלמרות זאת קיים שוויון בן , DNA-יצורים שונים נבדלים בהרכב בסיסי ה - (Chargaffחוקי ) G:C ו A:Tשוויון .1

C- לG והיחס של T- לAאם משווים את היחס בין . דבר המצביע על זיקה בין הבסיסים התואמים. C- לG ובין T-ל

ווטסון וקריק קפצו על . 0.8- שואף לATאחד יוצא דופן בו היחס בין ' יש בקטריופאג. 1- מקבלים יחס קרוב ל–

.הממצא והניחו שהוא נובע מהשלמה של הבסיסים זה עם זה

קשרי מימן נכונים נוצרים בין הצורות - מבנה חופף של הזוגות המשלימים .2

אם במהלך . והינם תנאי לשכפול מהימן, DNA-הטאוטומריות השכיחות בין בסיסי ה

. יתקבל זיוג שגוי ונראה מוטציות–שכפול הבסיס יהפוך לצורה הטאוטומרית הנדירה

(. C ויוצר קשר עם G מחקה את Aבדוגמא משמאל )

החיפה . חפיפת הזוגות מאפשרת אריזה כמעט הומוגנית בלתי תלויה ברצף

.ובמרחק זהה ביניהם בארבעת הזוגות' 1מתבטאת בסימטרה הכפולה שהזכרנו של פחמני

חוקי כתיבת רצפים: הערת סוגריים

ומוצגים בכיוונים מנוגדים , (קומפלמנטריים)הרצפים תמיד משלימים זה לזה

(dsDNA = double strand DNA ,ssDNA = single strand DNA .)

(.antisense ,template)והתחתון גדיל התבנית , (sense strand)הגדיל העליון תמיד יהיה גדיל התוכן המקודד

. וניתן למתוח אותה, היא סיביתDNA-מולקולת ה. מתאיםDNA בודדו מולקולות של – DNAנתוני דיפרקצית סיבי

על סמך התמונה . וקיבלו את תמונת הדיפרקציהXהקרינו את הסליל המתוח בקרני

:הסיקו מספר מסקנות

בסיסים 10מצביעים שלסליל עם מחזוריות של (layer lines)קווי השכבות .א

.במחזור פיתול

התאבכות בין עמדות . מעידה על כל שיש שני סלילים (4)השכבה החסרה .ב

.(בהמשך' ר)מקבילות של שני הגדילים מסבירה את התופעה

. אנגסטרם3.4הכתמים החזקים בשוליים עידים על חוזרניות של .ג

סלילי-הצלב מסגיר מבנה דו .ד

–בשני סלילים . נותנת לנו תמונה הפוכה למציאותהתאבכות תמונת הדיפרקציה

כפי שבמקומות אחרים הקרינה של , הקרינה של אחד מבטלת את הקרינה של השני

. אחד מחזקת את הקרינה של השני

השלמה עצמית .3

כל אחד מהגדילים משמש תבנית לגדיל . DNA-המודל של ווטסון קריק סיפק תשובה לאופן שכפול ה

. וכל אחד משתי המולקולות החדשות תהיה זהה למולקולה המקורית, משלים



תלוי ברצף בסיסיוDNA-מבנה ה

. ההנחה של ווטסון וקריק שהרצפים רחוקים זה מזה במרחק קבוע התבררה כשגויה

, מעלות42- ל28 הוא מצא שזוויות הפיתול נעו בין –גדיל שמשלים את עצמו -דו, סינטטיDNA-כשדיקרסון השתמש ב

(שהתברר כערך הממוצע) DNA מעלות שנחזה במודל המקורי שהתבסס על דיפרקצית סיבי 36לעומת הערך של

הפיתול וההגבהה הממשיים חורגים מממוצעי ערכיWatson-Crickהסטיות המקומיות . ותלויים ברצף

, מהממוצע משקפות תנוחות אופטימליות של מישורי הבסיסים השכנים זה כלפי זה

. וזיקות אלקטרוסטטיות ספצפיות בין אטומים שחלוקת המטעים שלהם אינה זהה

שינויים מקומיים כאלה הם הסיבה לכך שרצפים מסוימים מעוותים את המבנה המונוטוני

כיפופים תלויי רצף המופיעים ברווחים . למשל מכופפים צירו בכיוון מסוים, גדיל-של הדו

יש רצפים עם נטייה . ביחידת המבנה של הכרומטיןDNA-סדירים מאפיינים את אריזת ה

.גדיל-גדיל ולרצפים אחרים נטייה לכופף את ציר הדו-להקשיח את ציר הדו

רצפים מסוימים מקנים ל-DNAאף נטייה ליצור פיתול שמאלי .

החשיבות של נתון זה היא בהבנת הקיפול . והמרחקים תלויים בזהות השכנים, כלומר לכל סליל אישיות משלו

. במרחבDNA-המרחבי של ה

DNA-תעלות ה

אחרת התעלות היו ) מעלות 180הזווית שנוצרת בין הסוכר לבסיס היא לא זווית של

הזוויות מגדירות את התעלה הקטנה . 240- מעלות ו120אלא של , (זהות בגודלן

השוויון בין שתי התעלות נובע אי. לעומת התעלה הגדולה

מהעמדה האסימטרית של שדרת הסוכר פוספאט ביחס למישור

. זוג הבסיסים

זיהוי רצף מצד התעלה הגדולה

MADA)נראה שבצד התעלה הגדולה מוצגת חזות אסימטרית

(. AHA)סימטרית היא החזות הקטנה בתעלה אך, (ADAMלעומת

(רפרסור או אקטיבטור שמזהה פרומוטור) גדיל-חלבון שמזהה רצף דו

. בוחר בתעלה הגדולה

כ ייקשרו "שאינם קוראים רצף בדליגאזות , פולימראזות, חלבונים אורזים

. מצד התעלה הקטנה

להגיב עם בסיסים " אוהבות"חומצות אמינו מסוימות המהוות חלק מהחלבון

.מסוימים מצדדים מסוימים



הליקס-התעלה הגדולה נגישה לסליל אלפא

וקיימות שתי צורות לחלבון להיקשר , כ פועלים דימרים"חלבונים בד. החלבון מחדיר את ההליקס שלו בתעלה הגדולה

: לתעלה הגדולה

מאותו צד של התעלה הגדולה בשני , כל אחת מתת היחידות מחדירה סליל אלפא אחד .א

המבנה . DNA-בין שני אתרי המגע מפריד מחזור פיתול אחד של סלילי ה. מחזורי פיתול

הדימרי מגדיל את ספציפיות הקישור כיוון שאתר המטרה שהוא מזהה כפול באורכו מזה

למשל )מאפשר גם מודולציה של הבקרה ו, י מונומר"שהיה מוכר ע

. (הפעלה לעומת השתקה

– קישור משני עברי מחזור פיתול אחד של התעלה הגדולה .ב

. שני החלקים הצהובים משמשים כדבק לדימרים של החלבון

צד אחד של – עמדות 7 נמצאת כל Leucinאם החומצה האמינית , 3.4מכיוון שמחזור פיתול של הליקס הוא

ויתקבל רוכסן לאוצין , ויפגוש את צד הידרופובי זהה לו, (leucine-מלא ב)הסליל החלבוני יהיה הידרופובי

(leucine zipper .)

Base Flipping- י היפוכו " עDNAזיהוי בסיס

Base Flipping מתאפשר הודות לגמישות של הקשרים הבודדים של הקשר

מאפשר שינוי קונפורמציה שיכול להקפיץ בסיס Base Flipping. אסטרי-די-הפוספו

(. ”breathing “DNA)סליל -החוצה ולהחזיר אותו חזרה מבלי לפגוע בדו

גדיל משלים -י חד"גדילי ע-על בסיס תופעה זו מסבירים גם איך מזוהה רצף דו

.ברקומבינציה הומולוגית

מערכת . מותמר/ ולחפש בסיס פגוםDNA-חלבון שתפקידו לסרוק את ה: דוגמא

. בסיסים" לעקור"כך שאין צורך , הבסיסים כל הזמן מציצים החוצה. התיקון יודעת לזהות את הבסיס הפגום ולשלוף אותו

. ויש צורך בהתמרת בסיסים, לבקר שעתוק/לחילופין צריך לדכא

גדיל יכול לזהות את –כיצד חד. גדיל רק אם הרצף הומולוגי- פולש לתוך דו DNA חד גדיל של –ברקומבינציה הומולוגית

מסתבר שעקב היציאות ? גדיל סגור-גדיל אם הדו-הרצף של הדו

היציאות יכולות לשמשש –הזמניות של הבדידים הבודדים

-גדיל לדו-לפלישה של חד, כנקודת אינייאציה להחלפת הגדילים

. גדיל


10 2008' סמסטר ב

( גבי קאופמן– 2 )–מבוא לחומצות גרעין וביולוגיה מולקולארית

DNA-מבנה ה

. כל אחד מהגדילים משמש תבנית לסינטזת גדיל קומפלמנטרי–כשפותחים את הדו גדיל

, מסנטזים את הגדילים החדשים, DNA-י אנזימים ייחודיים שפורמים את ה" מתבצע עDNAשכפול

.מאחים את השרשראות ומבקרים את התהליך

.הוא זקוק לפריימר ולתבנית. הוא אחד מיני אנזימים רביםDNA polymerase-ה

.נושא ווריאציות: גדיל-קונפורמציות דו

קונפורמצייתB - ווטסון וקריק " הצורה השכיחה שתוארה ע–

והיא שכיחה בסביבה , בסיסים למחזור פיתול10.5-יש בה כ

וזוג הבסיסים מוסט רק במעט , מחזור הפיתול ימני. מימית

.מנקודת הכובד במרכז המולקולה

קונפורמציהA -לעתים הכינו את גדילי ה-DNA בסביבה עם

– Aשבה התקבלה קונפורמציה , (סביבה ענייה במים)אלכוהול

במקום שזוגות הבסיסים יהיו אנכיים לציר , גדיל גדל-קוטר הדו

.מחזור הפיתול ימני. הזוגות מוטים- האורך

קונפורמציהZ –והיחידה , הגדילים מפותלים בפיתול שמאלי

. האסימטרית מכילה שני זוגות בסיסים

הבסיסים משנים את –אם מטיילים לאורך הגדיל : הסיבה לכך

. נדירsyn-ב (Gהפורין ) ופעם הבסיס antiבמצב (Cהפירמידין )פעם אחת הבסיס : מצבם כלפי הסוכר לסירוגין

. חוזרניים ובייחוד כאשר מעלים את ריכוז המלחGCGCGCהקונפורמציה מתקבלת מתקבלת ברצפי

עדיין לא ידועה המשמעות הביולוגית של הקונפורמציה כי לא רואים אותה ב -DNA . קיים אנזים שגורם

ובו (אמינציה של אדנוזין-גורם לדה)למודיפיקציה של בסיסים

. Z שמצוי בקונפורמצית RNA- או לDNA-דומיין שיודע להיקשר ל

עדיין לא )י היקשרות למבנים כאלה "יש סברה שהאנזים מווסת ע

.(בטוח שזה אכן נכון

. היא מולקולוה דינאמיתDNA-הקונפורמציות השונות מדגישות שה

התעלה הגדולה של . משמעות ביולוגית ברורהB- וAלקונפורמציות

-A רחבה לעומת המבנה המקביל של קונפורמציה B-DNAקונפורמציה

RNA (שם התעלה צרה ועמוקה) . ולכןB-RNAוזו , נגישה לחלבונים

.RNA לא יכולים להיקשר לרצפי DNAהסיבה שחלבונים מזהי רצף


11 2008' סמסטר ב

:B- וAהבדלים חשובים בין

A – זוגות בסיסים למחזור 11-12. וזווית הפיתול קטנה והמרחקים בין זוגות הבסיסים קוטר הדו גדיל גדול

הזוגות . (OH-2עקב הימצאות ) A יכול להימצא רק בצורת RNAסליל -דו. הידרופוביתנפוץ בסביבה . פיתול

התעלה הקטנה נגישה . ומנועת חדירת חלבונים לתוכהעמוקה וצרההתעלה הגדולה הופכת . להיקףמוסטים

.החלבונים שמנצלים אותה לזיהוי רצף- אך בשל מיעוט תווי היכר מובהקים מעטים , יותר

B – מאפיין DNAבסביבה מימית .

Z- לB- וAנשווה בין

במבנהAו -B - מהפיתול הוא הפוך -Z , היחידה האסימטרית הבסיסית הקטנה

כל צעד . שכן הבסיסים תופסים עמדות דומות והמרחקים דומים, זוג אחדהיא

.מורכב מזוג בסיסים אחד

במבנהZ – בגלל הסירוגין של synו -anti – הם היחידה שני זוגות בסיסים

פעמים 6כלומר יש , זוגות בסיסים למחזור פיתול12יש . האסימטרית

.כל צעד מורכז משני זוגות בסיסים. זוגותיים

גדילי-שלשות בסיסים ומבנה תלת

hoogsteenקריק אליו חובר בסיס שמנצל את צלע -שלשות בסיסים נוצרות מזוג ווטסון

רק G- חובר לC-מקרה בו ה: לדוגמא, יש סוגים של שלשות שונות. מצד התעלה הגדולה

.'כאשר הוא מיונן וכיוב

גדיל ומאפשרים לאחד הגדילים להתלכד - כאשר פורמים חלק מהדוגדיל-ניתן ליצור תלת

שפונה hoogseenי ניצול צלע " כל שבכל מקום נוצר תלת גדיל ע–גדיל פרום נוסף -עם דו

. לתעלה הגדולה

. גדיל מופיעים בפוליזום ואפשר ליצור אותם מלאכותית-רצפים שמתאימים ליצירת תלת

. גדילי מסוים-גדיל מרצף דו-נוקלאוטיד יתאים ליצירת תלת-אפשר לחשב איזה אוליגו

הגדיל השלישי יכול לשבש ביטוי גנים או אם הוא נושא עליו קבוצה –אם הרצף מתאים

. הגדיל השלישי יכול להרוס גן מסוים–כימית

לא ידוע על שימוש תרופתי שפועל )ניסו ליישם זאת למטרות מחקר ולמטרות קליניות

.(במנגנון זה


12 2008' סמסטר ב

G-quartet –גדילי -מבנה ארבע

זנב - יחברו במתכונת ראשG בסיסי 4- יש אפשרות ש– G-כאשר יש רצפים עשירים ב

המבנה . קריק- ומצד שני את צלע ווטסוןHoogsteenכאשר הם מנצלים מצד אחד את צלע

. למרכז המולקולה (אשלגן או נתרן)ודרוש יון חד ערכי , Gניתן ליצירה רק עם נוקלאוטידי

יש אנזימים שיודעים לפרום את המבנה , מבנים אלה מצויים בטלומרים ובחלקים פנימיים

קשורה במחלה גנטית (קרי פגיעה בפרימת המבנים האלה)הזה ופגיעה באנזימים אלה

.קשה

:גדילי יכול להיווצר בכמה אופנים-מבנה הארבע

4מקבילים, גדילים שונים

(בשתי צורות)שני גדילים שכופפים על עצמם

פעמים4גדיל אחד שכופף על עצמו

–טכנולוגית - המבנים מעניינים מנקודת מבט ננו–מלבד הפוטנציאל הביולוגי

מעין , באמצעותם אפשר ליצור גדילים ארוכים שבתוכם מקננים יונים חד ערכיים

.מטען

פלינדרום וראשי סיכה

י חלבונים קטנים יחסית "לפלינדרומים חשיבות כאתרי הכרה ייחודיים שכן ניתן לזהותם ע

הם מצויים באזורי בקרה או באזורים עם נטייה .המתארגנים כדימרים או טטרמרים סימטריים

. (עליהם נדבר בהמשך)להיות אתרי כניסה לטרנספוזונים

. וליצור צלב, להקפל על עצמם, רצפים שמכילים פלינדרם יכולים ליצור ראש סיכה

DNA מבנה מרחבי של –סיכום ביניים

. בין מישורי בסיסים משלימים וקשרי מימן בין צלעותיהםstackingזיקות י " מעוצב עDNAמבנה •

סליל וזה את -מקיפים שני גדילים את ציר הדויפים לאריזה הומוגנית בה , מבנים חופפים לזוגות הבסיסים •

לגדילים קוטביות . זרחן פונות לממס-הבסיסים בתווך ההידרופובי ושדרת הסוכר. בפיתול ימני כ"בד, זה

. מנוגדת

דגם צלעות התעלה הגדולה מנוצל על ידי . שתי תעלות הקפיות לא שוותמיקום הבסיסים ביחס לשדרה מגדיר •

. הדגם היותר סימטרי שבתעלה הקטנה מתאים להתקשרויות שאינן תלויות רצף. חלבוני בקרה מזהי רצף

המאפיינת סביבה יותר הידרופובית ורצפים A להמצא בקונפורמציה DNA השכיחה יכול Bלבד מקונפורמצית •

וארבע - מסוימים מאורגנים במבנים תלתDNAרצפי . בעלת הפיתול שמאליZמסוימים אף בקונפורמצית

. גדיליים

• RNA גדילי נמצא רק בקונפורמציה -דוAבה התעלה הגדולה אינה זמינה כל כך לחלבונים .


13 2008' סמסטר ב

זיהוי אך גם מוטגנזה/ כימות– UVבליעת

. לכמת ולעקוב אחרי שינויי מבנה אחרי חומצות גרעין/ שמאפשרת לזהותUV בליעה חזקה בתחומי RNA- וDNAלבסיסי

זוגות בסיסים ובסיסים שנמצאים באינטרקציות בולעים פחות מבסיסים –אחת הסיבות לשינויים האלה בבליעה

. גדיל פרוש-שנמצאים בחד

אפשר , קרינה גם מחוללת שינויים כימיים מוטגניים

ואז חומצת הגרעין הופכת , לקבל רדיקלים חופשיים

חומצות גרעין אחרות /ריאקטיבית מאוד עם חלבונים

מה –ונוצרים קשרים קוולנטיים בין הפרטנרים

שמאפשר זיהוי אינטרקציות בין חומצת הגרעין

.לחומרים אחרים

. זה עלול לגרום למוטציות ולסרטן– שנמצא בתאים בגוף DNA-מתרחשים ב (שנובעים מקרינה)אם השינויים

DNAהכלאה והתכת

– pHי שינוי " כך מבטלים את קשר המימן או ע–י חימום "ניתן להפריד את הגדילים ע

. הבסיסים יתיוננו ולא יוכלו ליצור את הזיווגים

.או נטרול התמיסה ' י הורדת הטמפ"גדיל ניתן ע-שחזור הדו

ארוכות DNAמכיוון שלמולקולות , עלינו לעשות זאת באיטיות–כשמכליאים מחדש

אם התהליך יתרחש במהירות . לוקח זמן עד שהרצפים המשלימים ימצאו זה את זה

כלומר יש לקרר באיטיות ) נראה פלונטרים שימנעו את ההכלאה הנכונה –רבה מדי

.(ולחכות מספיק זמן

ולכן אפשר לעקוב אחרי , וזיווגי בסיסים מקטינים את הבליעהstackingזיקות

.השינויים במידת הזיווג באמצות שינויי הבליעה

. ' כפונקציה של הטמפDNA- מידת הדנטורציה של ה–משמאל

מתחילה היפרדות של – (נקודת ההתכה)מסוימת ' מעבר לטמפ

. ונראה גם עליה תלולה בבליעה, הגדילים

, והיא משתנה בין הגדילים, נקודת ההתכה היא הנקודה המרכזית

.(נמוכות יותר משרשראות ארוכות' יותכו בטמפ–שרשראות קצרות ) DNAובוארכים שונים של מולקולות

כי יש יותר ) נקודת ההתכה עולה – עולה GCככל שתכולת ה. GC-כפונקציה של אחוז ה (Tm)ההתכה ' טמפ–מימין

.(קשרי מימן ולגדילים קשה יותר להיפרד זה מזה

, כי פוספטים גורמים לדחייה הדדית, מחזקים את הקשרים–אם בתמיסה יש חוזק יוני ומנטרלים את מטעני הפוספטים

. מייצבים את המולקולה–אם מקטינים את הדחיה ההדדית


14 2008' סמסטר ב

' לפנינו גנום של בקטריופאג. אפילו באותה מולקולוה יש נקודות התכה שונות

ATוהרצפים שנפרמו מכילים יותר , ידוע' הרצף של הבקטריופאג. שחלקו נפרם

. (הלא פרום)בהשוואה לשאר הרצף

שחזור המולקולה לאחר התכה

בתנאי שהם )ואפשר ליצור הכאלה מלאכותית בין גדילים זרים , אפשר לשחזר אותו מחדשDNAגדיל -כשמפרידים דו

ומעבר לנקודה , תיחלש הזיקה בין הגדילים–את חוסר הקומפלמנטציה , ככל שנגדיל את השוני. (קומפלמנטריים מספיק

.גדיל-מסוית לא נוכל יותר ליצור דו

:ניתן להכליא

DNAל -DNA

RNAל RNA

DNAל -RNA

RNA/DNA למולקולות דמויות DNA/RNA ,סוכר שונה-שיש להן שדרת פוספט או שדרת פוספט ,

-למשל יכולת החדרה לתאים חיים או יצירת קשרי ווטסון)מולקולות שיש להן תכונות שונות מאלו הטבעיות

.היכולות האלו חשובות מאוד ומשמשות בסיס לטכניקות של הנדסה גנטית. ('קריק חזקים במיוחד וכו

.בידוד ועיצוב מחודש של גנים, טכניקות ההכלאה מאפשרות זיהוי

דוגמאות ליישומים של שיטות הכלאה

בתאים בריאים ובתאים : זמני של דגם הביטוי של גנים בשני מצבי התפתחות-תיאור בו: RNA- לDNAהכלאת .1

.השיטה מאפשרת זיהוי של השלב הסרטני ואיזה טיפול מתאים לאותו שלב. סרטניים של אותה רקמה

לפנינו תאי שמר מתחלקים ותאי שמר שנמצאים במצב של .2

בכל אחד מהמצבים מבוטאים גנים שונים ברמות . ספורלוציה

. שונות

DNAיוצרים עותקי , מכל אחד מהתאיםmRNAמפיקים

לנוקלאוטידים . Reverse Transcriptaseמשלימים באמצעות

המכילים אנלוג (C ,T) נוסיף פירימידינים –בהם משתמשים

2שיאפשר להבדיל בין , 5בעמדה (אדום או ירוק)צבעוני

. אך לא יפריע להתנהגות הנוקלאוטיד בשכפול, האוכלוסיות

נוקלאוטידים -אוליגו)על שבב מוצגים בכל נקודה ונקודה גנים רלוונטיים של השמר באמצעות גלאים מקובעים

שילוב של , ייצבעו בצבע נייטרלי)רוב הנקודות לא נצבעו . אדוםDNA- ירוק וDNAעל כל גלאי נשפוך . (סינטתיים

י שמר במצב "י שמר שמתחלק ייצבעו באדום וגים שמבוטאים יותר ע"אך הגנים שמבוטאים יותר ע, (אדום והירוק

. של ספורולוציה ייצבעו בירוק


15 2008' סמסטר ב

DNAטופולוגיית

אך לא כאשר שוברים , מתיחה או כיווץ, י כיפוף" עמעוותים אותובתכונות שעצם כלשהו משמר כאשר טופולוגיה דנה

. או קורעים אותו

תוך שינוי מספר לנוע בחופשיות זה כלפי זה לינאריDNAבמבחנה יכולים גדילי . כרוכים זה בזהDNA-שני גדילי ה

. ( קיצוני ניתן אף להפרידם לגמריpHבחום או כאמור ) הפעמים שאחד מקיף את השני

.(topological constraint)זהו אילוץ טופולוגי מעגלי סגור קוולנטיתDNAלא ניתן להפריד גדילי , לעומת זאת

.הקשרים בין הגדילים יישארו גם אם ננסה למשוך את הגדילים לכיוונים מנוגדים

. לנוע בחופשיותהגדיליםחלבונים צמודים מונעים מ כי לינאריים DNAלא ניתן להפריד גם בין גדילי האנימלי בתא

. ולהפרדת גדיליו בשכפול ובשעתוק(בגרעין) רלבנטיים לאופן אריזתו בתאDNA-האילוצים הטופולוגיים להם כפוף ה

:DNA-התכונות הטופולוגיות של ה

. אותו לממדי תא או חלקיק הנגיףלדחוסמסבירות כיצד ניתן .א

גדילי בהפרדתבמינון נכון מסייעים פיתולי על .Supercoil) , על-פיתול)סליל עצמו -אחראיות לפיתול ציר הדו .ב

לתא אמצעים לסלק את ) הצטברותם עלולה לעכב תהליכים אלהאולם, בתחילת השכפול או השעתוקDNAה

תכונה חשובה במיוחד עבור , DNA- את היודעים לייצבפיתולי על בכיוון ההפוך דווקא .(פיתולי העל המיותרים

. שלהם ייפרם ללא צורךDNA-יצורים תרמופיליים שלא מעוניינים שה

גדילי - מעגלי דוDNAמקובל להמחיש בעיות אלה בעזרת - הלינארי כפוף לאילוצים טופולוגיים DNA-למרות שגם ה

. Covalently Closed Circular DNA cccDNA :וסגור קוולנטית

cccDNA

נשבר )וקשה לבודדו מהתא , אך הוא גדול מאוד, cccDNA הוא E.coliהגנום של , מופיעות בטבע cccDNAמולקולות

. (בקלות

cccDNAנגיפים, זעירים נמצאים במיטוכונדריות ,

.נוחים לבידוד ולחקירההם . ואברוני תא, פלסמידים

מיקרוסקופ אלקטרוני הם נראים כמעגלים רפויים חתת

. (super-coil) על עצמם או מפותלים

הסיבה , נקודת ההתחלה היא תמיד הצורה המפותלת

. והגדיל חופשי לנוע– שהתרחש במהלך הבידוד של המולקולה DNA-למעבר לצורה הרפויה היא נתק ב


16 2008' סמסטר ב

המשתנים הרלוונטיים

Liknage – Lk- הוא מסמל את מספר הפעמים שגדיל אחד צריך לעבור דרך השני . טופולוגי נתון

אם נקרע את ) גם אם תעוות המולקולהנים משתםאינ ומספרים שלמים הם Lkערכי . כדי שיופרדו

(Lkהמולקולה לא יהיה עוד

Twist – Tw - דרגת פיתול גדיל הוא מייצג את . גיאומטרינתוןDNAבקונפורמצית , למשל. סליל- בדוB

-Bהפיתולים הימניים של . בין זוגות שכניםº34.5- זוגות בסיסים ופיתול של כ10.5במחזור פיתול אחד

DNA ו-A-DNA נחשבים לחיוביים והשמאליים שלZ-DNA לשליליים .

זוגות בסיסים וזווית 10.5- גדיל אחד חולף על פני השני בפיתול ימני אחת לBבקונפורמציה , למשל

. 400 זוגות בסיסים הוא 4,200 בת DNA של מולקולות Twערך . 34.3º~הפיתול הממוצעת בין זוגות שכנים

Writhe – Wr - אפשר . גדיל עצמו-דרגה עיוותנו את ציר הדו/ באיזו מידה.העל-דרגת פיתולי מייצג את .גיאומטרינתון

.(המספר לא חייב להיות שלם)גדיל בחצי סיבוב או בסיבוב וחצי -להטות ולפתל את ציר הדו

העל -סכום פיתולי(Wr) והפיתולים הראשוניים (Tw)שווה ל -Lk . Lk=Wr+Tw

. ולהפךקטן Twגדל Wrכאשר - קבוע Lk-ב

(מספר הקשרים הוא שלם)קשר אחד בין שתי המולקולות , Lk=1מולקולוה עם - למעלה

(מספר הקשרים הוא שלם) קשרים בין שתי המולקולות 6יש , Lk=6 ולקולוה שבה –למטה

גדילי המולקולה הקווית מימין חופשיים לשנות את מספר הפעמים שהם חולפים זה •

נוחה הגדילים ' בטמפ.Tw קרוב ל Lkשיווי המשקל מושג כאשר . מעבר לזה

(. 10.5)יתלכדו וייצרו בדיוק את מספר הקשרים המתאים למחזור פיתול

יהיה Tw- ולכן אם הוא שונה מLk לא ניתן לשנות את ערך cccDNA- ב •

:ניתן לתקן בשתי צורותהפרש את ה. גרעון או עודף קשריםבמולקולה

על -סליל עצמו ליצירת פיתולי-עיוות מתקן של ציר הדו .א

DNAפרימה חלקית של גדילי ה .ב

תכונה )ויש רצפים מסוימים עם נטייה גדולה יותר לפרימה , עם גרעון קשרים יש נטייה לפרימהלמולקולוה

.(חשובה במיוחד בפרומוטורים

להפר את האילוץ הטופולוגי ולאפשר לגדילים לחלוף האחד מעבר לשני על מנת cccDNA מגדילי די נתק באחד •

. Tw- מקורב לLkכלומר ערך , עד להשגת שווי המשקל

במולקולה אחת יש . חלבונים שמקיפים אתו הלינארי כפוך לאילוצים עקב אותם DNA-גם ה

. עם חוסר קשרים או באיזון, איזור עם עודף קשרים–איזורים שלכל אחד מאפיינים אחרים -איזורים


17 2008' סמסטר ב

. מחולק לדומיינים שבכל אחד מהם התנהגות טופולוגית עצמאיתDNA-ה

מחזורי 25 כלומר אמורים להיות בה בערך – זוגות בסיסים 262לפנינו מולקולה מעגלית שיש בה

. פיתול

מולקולה רפויה(Relaxed )Lk=25, Tw=25, Wr=0.

הגדיל מקיף את הגדיל השני ) קשרים 23יש רק - במולקולה משמאל

.( פעמים23

כדי לפצות על . גדיל רציף שהציר שלו לא מפותל- חסרים שני קשרים כי שנוכל ליצור דו–מכאן שיש גירעון

. מפלים בין בסיסים מזווגים לבודדים. גדיל-פורמים אותם לשני חדי, מוציאים חלק מזוגות הבסיסים- הגרעון

שמרנו על . כי הוצאנו חלק מהבסיסים מהמשחק, קטןTwאך , (cccDNA-הוא לא משתנה ב) 23 נשאר Lk-כך ה

אך מעט פרומה, המולקולוה רפויה, 0 הוא Wrוה, Lk- לTwהשוויון בין ה

הפעם אנו מעוניינים לשמור . קשרים23 שוב רק –במולקולוה משמאל

אפשר להביא לפיתול הרצוי של , ולא לפרום אותה, על המולקולה

- כדי לאזן . גדיל עצמו-י יצירת עיוות מונוטוני בציר הדו"הגדילים ע

אם . (שקל לפרק אותם)יוצרים קשרים מדומים . ניצור שני פיתולי על

יש . נשנה את צורת המולקולה אפשר ליצור גאומטריה חדשה

Tw=25 ,Wr=-2 –כ " כלומר מפתלים את המולקולה בכיוון השלילי וסהLk=23 .

ופיותלי על שמפצים על עודף פיתולים הם חיוביים, פיתולי על שמפצים על גירעון הם שליליים.

משמעויות ביולוגיות של פיתולי על

כשהם נתקלים בזמן הנכוןמקל על פרימת רצפים מצב זה .בפיתולי על שליליים DNA מפותל הברוב האורגניזמים

. (מהם נפתח השכפול או השעתוק)בחלבון בקרה

היה להצטבר עודף הנמשכת במהלך השכפול עשוי DNA-בשל פרימת ה, מאידך

DNA-כאשר פורמים חלק מה. אלמלא היו לתא אמצעים לסלקו, על חיוביים-פיתולי

יוצרים , מגדילים את צפיפות הקשרים בחלק שאינו נפרם–ומשחררים את הקשרים

בתא קיימים . שיתקע את מזלג השכפולועלול להיווצר פלונטרפיתולי על חיוביים

. אנזימים שמווסתים את פיתולי העל

ע את פרימתו בחום נ ומולגדי-הדק את הדושממה , על חיוביים-חיידקים תרמופיליים מסוימים פיתולי של DNA-ל

ויש , הוא יוצר פיתולי על חיוביים לפניו ושליליים מאחוריו– DNA- מפלס את דרכוו בRNA polymeraseכאשר .הגבוה

. לנטרל אותם

:אפשר ליצור את פיתולי העל בשתי דרכים

אפשר לגלול על חלבון - Toroidal/Spiral .א

עצמוDNA-אפשר לגלגל על ה - Plectonemic .ב


18 2008' סמסטר ב

EtBr –דרך ניסויית המאפשרת להתרשם מהיחס של הגאומטריה והטופולוגיה

EtBr( Ethidium Bromide) משמש לזיהוי וכימותDNA .

הוא יכול להיכנס בין זוגות –כמו תרכובות רב טבעתיות אחרות

10-ואז הזוית בין הבסיסים קטנה ל DNA( intercolation)בסיסי

(. Twשינינו את ) DNA-כי שינינו את הגאומטריה של ה, מעלות

– Tw-יקטן ה (EtBrככל שנוסיף ) לרוויהDNA-ככל שנטטר את ה

DNAכלומר אם יש . יהיו לנו יותר זוגות בסיסים למחזור פיתול

אנו מקטינים את הגרעון – Tw אם נקטין את –עם גירעון בקשרים

אנו רק , Lk-אנו לא נוגעים ב) וייתכן שאף נעבור לעודף קשרים –

(. Tw-משנים את ה

יש נקודת מינימוםEtBr-ל

אפשר . מספר פיתולי העל יקטן– EtBr עם פיתולי על שליליים ונטטר עם cccDNAניקח

כי המסה )המולקולות תשקענה כפונקציה של הצורה , לסרכז, לקחת את המולקולות האלה

. (כי החיכוך גדול יותר) הן ישקעו לאט יותר –ככל שהן יותר רפויות , (אחידה

המולקולה הייתה ) מקדם השקיעה ההתחלתי הוא גבוה –אם נסתכל על מקדם השקיעה

לאחר מכן המולקולה . המקדם יקטן ויגיע למינימום–וככל שהיא יותר רפויה , (קומפקטית

. תתחיל לצבור פיתולי על שליליים ומקדם השקיעה ישוב ויעלה


19 2008' סמסטר ב

( גבי קאופמן– 3 )–הפרדת טופואיזומרזים באלקטרופורזה

טופואיזומרים וטופואיזמרזות

DNA-אתידיום משנה את גאומטריית ה

.בעזרת מולקולות האתידיום ביטלנו פיתולי על שלילים ואף הוספנו פיתולי על חיוביים

(.UVהופך זוהר בהקרנה של ) DNA-אתידיום משמש גם כחומר צביעה של ה

– שני הגדילים/נתק באחדבזמן הבידוד מהתא בחלק מהמולקולות נוצר , בפלסמיד עם פיתולי על שלילייםלדוגמא

. (ל'נודדות לאט בג) שלהם והפכו רפויות את כל פיתולי העל (בבת אחת)איבדו והם

טופואיזומרים

להביא למספר הולך , אפשר להגיע בהדרגה לפריסה של המולקולה

. וקטן של פיתולי על עד שמגיעים לרפיון מלא

את השינוי המדורג במספר פיתולי העל נייצר בעזרת טופואיזומרזות

בכל (בשניים במספר אחד או ) אנזימים שמשנים את מספר פיתולי העל –

. מחזור

מכונים – שנבדלות זו מזו רק במפסר הפיתולים DNAמולקולות .טופואיזומרים

. ל'טופואיזומרים רצים באופן שונה בג

במהירות רואים הבדל משמעותי –כאשר הגדיל עובר ביקוע - משמאל

.הריצה

במספר י טופואיזומרזות יש שינוי הדרגתי "כאשר הגדילים מטופלים ע- מימין

.ל'הפיתולים ומכאן הפסים השונים בריצה בג

סיווג טופואיזומרזות

בוקעות גדיל אחד– גורמות לשינוי של פיתול על אחד בכל מחזור 1מסוג - פ מספר הפיתולים"ע .

.מבקעות שני גדילים- גורמות לשינוי של שני פיתולים פר מחזור 2מסוג

יש שיודעות להרפות פסיבית פיתולי על - ייצור פיתולים/פ יכולת שחרור"ע.

(.ATPואז נדרשת השקעת אנרגיה שבאה על חשבון פירוק )יש שיודעות לייצר אקטיבית פיתולי על

באאוקריוטים יש . (בחיידקים) יש כאלה שמרפות פיתולי על שליליים בלבד –פ כיוון שחרור הפיתולים "ע

.טופואיזומרזות שיכולות להרפות פיתולים משני הסגים

בחיידקים . (בחיידקים)רוב האיזומרזות הפעילות יוצרות פיתולי על שליליים - פ כיוון יצירת הפיתולים"ע

, מצוי באפן טבעי עם פיתולי על חיובייםDNA-ה. תרמופיליים מוצאים טופואיזמרות שיוצרות פיתולי על חיוביים

.הגבוהות' שנועד למנוע את ההרפיה שלו בטמפ DNA-ולכן כנראה ששם נדרש הידוק של ה


20 2008' סמסטר ב

1טפואיזומראז

. ונשאר קשור לשני הקצוות שביקעDNA-בוקע את אחד מגדילי ה - המנגנון

וכך משתנה מספר הקשרים –דרך הנתק שנוצר הוא מעביר את הגדיל השני

- ל5-בדוגמא משמאל עוברים מ)הוא מגדיל את מספר הקשרים . ביחידה אחת

.את מספר פיתולי העל השליליים, צמצמנו את הגרעון בקשרים ( פיתולים4

אסטרי -יש טירוזין באתר הפעיל שיכול לתקוף את הזרחן של הקשר הפוספו

הקצה השני של הגדיל שנותק נוצר קשר אסטרי זמני בין האנזים לחלבון

ממתין כדי לתקוף שוב את הקשר האסטרי לאחר שהגדיל השני יעבור דרך

מרפה פיתולי על שליליים. הנתק שנוצר

DNA gyrase – 2טופואיזומרז

. זמנית את שני הגדילים-אבל האנזים בוקע בו, פועל באופן דומה - המנגנון

בוקע , DNA- האנזים נכרך סביב היש פיתול על חיובי - בדוגמא משמאל

נוצר שער דרכו יעבור חלק אחר של המולקולה את שני הגדילים

מכיוון שהפכנו . ונוצר פיתול על שלילי (ATP-תוך שימוש ב)השער ייסגר

פיתול על חיובי לפיתול על שלילי שינינו את מצב פיתולי העל בשתי יחידות

.(זמנית את שני הגדילים-בקענו בו)

ומנטרל יוצר פיתולי על שליליים, האנזים הזה נמצא כמעט בכל החיידקים

יודע - Reverse gyrase)פיתולי על חיוביים המצטברים בזמן השכפול

(ליצור פיתולי על חיוביים באורגניזמים תרמופילים

בקרה על הטופואיזמרזות

כאשר יש גירעון בפיתולי על , מופעל כאשר הוא רפויgyrase-הפרומוטור של ה. דינאמיות, יש מאזן בין שני האנזימים

הפרומוטור מופעל – היא הפוכה1והבקרה על הפרומוטור של טופואיזומרז , השליליים ויש צורך ביצירת פיתולי על

. (ויש צורך ליצור קשרים, הגירעון בקשרים גדול) ויש צורך להרפות אתם כאשר הוא חש בעודף פיתולי על שליליים

ויש מצבים פיזיולוגיים שונים בהם מספר פיתולי העל משתנה באופן , פועלים באופן עצמאי DNA-חלקים שונים של ה

.מקומי

מעכבי טופואיזומראז נוגדי סרטן

נוצר נתק בגדיל –( DNA-לחבר מחדש את ה/להשלים)מעכבי טופואיזומרזות מונעים מהאנזים להשלים את פעילותו

קשה עוד יותר לשחזר DNA-אנזים קשור ל/כן אם נשאר חלבון-כמו. גדילי- או שבר דו– (שעלול לגרום לעוד שבר)אחד

.את הגדיל, את הקשר

שכן בתאים אלה פעילות , יש להם פעילות סלקטיבית לתאים סרטניים. ולמות התאDNAהמעכבים גורמים לשבירת

.(לכן נפוץ השימוש במעכבים אלה כתרופות כימותרפיות)גבוהה של טופואיזומרזות


21 2008' סמסטר ב

סיכום ביניים

פיתולי על(Wr ) נובעים מפער בין מספר הקשרים הממשי בין הגדילים(Lk) למספר המתבקש מגיאומטרית

DNA נתונה (Tw .)

פער זה(Wr)על אך מעודד גם פרימה-כלומר גורם לפיתולי, גדיל עצמו- מעוות את ציר הדו.

פיתולי על מאפשרים לדחוס את הגנום ולפרוםDNA במוצאי שכפול או באתרי פרומוטר אך הצטברות יתר

. שלהם מצריכה פעולה מתקנת

גדילי דרך -דו/העברת קטע חד, י בקיעת אחד או שני הגדילים"טופואיזומראזות משנות את מספר פיתולי העל ע

. ואיחוי הנתק הזמני" שער"ה

טופואיזומראזות מרפות פיתולי על ב-DNAהורי שטרם שוכפל או ב -DNA דרכו חולף RNAהן . פולימראז

מעכבי . מפרידות את גדילים ההוריים זה מזה כמו גם כרומטידות שנותרות סבוכות בתום השכפול

.ים כתרופותשטופואיזומראזות משמ

טופואיזומרזת –מרחיקות את הגדילים אך לא משנות את מספר הקשרים ביניהן / מפרידות– הליקאזות

אחרת הם לא , ולגרום להפרדה מוחלטת של הגדילים ההורייםDNA-צריכות לפעול באופן רציף לאורך ה

. יוכלו לנדוד כל אחד לתא הבת שלו

RNA-מבנה ה

1. RNAמכיל את הבסיס U ( ולא את הבסיסTשקיים ב -DNA)

2. RNA מכיל Ribose ולא deoxyRibose

3. RNA משועתק כחד גדיל שמתקפל באופנים שונים בעזרת אינטרקציות stackingכך . וזיווגי בסיסים פנימיים

עושר של מבנים מרחביים כמו לחלבונים RNA-גם ל)נוצרים מבנים גלובולריים שמזכירים מבנים של חלבונים

: אחד ההישגים הגדולים) ספציפיות RNAכיום מכירים מבנים מרחביים של מספר מולקולות . (DNA-ובניגוד ל

.( של הריבוזוםRNAפענוח

C –אמינציה -חשיפה לראגנטים שגורמים לדה. יציבותDNA-מקנה ל - U במקום Tנוכחות . 1

הוא T-מכיוון ש. אז השינוי לא היה מוכר כנזק– DNA- היה בסיס תקני ב Uלו. U-יכול להפוך ל

.C-ויש אנזימים שדואגים לסלק אותו ולהחליף אותו ב, מוכר כנזקDNA- בUאזי , DNA-בסיס תקני ב

. זהו סימן היכר לחלבונים שמזהים רצף מצד התעלה הגדולה– T-יתרון נוסף למתיל של ה

מאוד OH- קבוצת ה– 2תכונות ההידרוקסיל בעמדה - Riboseנוכחות . 2

לערער אסטרי ויכולה -נמצאת סמוך לזרחן של הגשר הפוספו, ראקטיבית

נעלם נוצר מצב ביניים לא יציב OH-אם הפרוטון של ה, את יציבות הקשר

. הגדיל נשברוכך, אסטרי-שעלול לגרום לשבירת הקשר הפוספו

יותר גדולים מאלה הקיימים RNAזו הסיבה שבגללה לא נוצרו גנומי

.RNA- אפשרה התפתחות גנומים גדולים יותר ומפותחים יותר שדחקו את גנומי ה DNA-הופעת ה. בנגיפים

מאידך נוכחות OH קישור לליגנדים ויכולת קטליטית מאפשרת ( בריבוזימים מסוימיםOHמשמש קבוצה קטליטית ).


22 2008' סמסטר ב

RNA-היררכיה ארגונית ב

רצץ נוקלאוטידים– מבנה ראשוני

יכולים להיות . (wobble U:G) זוגות ווטסון קריק וזוגות בסיסים נוספים – אינטרקציות קרובות טווח – מבנה שנינוני

יש צורך לנטרל את מטעני הפוספטים שעלולים לגרום לדחיה הדדית של הגדילים . י עננת יונים חד ערכיים"מיוצבים ע

.השותפים לקשר

יש מעורבות של , גם כאן יש צורך לנטרל מטענים. זיקות ארוכות טווח שיש בין המבנים השניוניים– מבנה שלישוני

.בעיקר מגנזיום, מתכות דו ערכיות

RNA-סוגי מבנים שניוניים ב

.RNA- פירוט המבנים השניוניים ב–משמאל

RNA זיווגי בסיסים פנימיים ביעילות רבהיוצר ,

סליל - באזורי דוU:Gבין היתר בשל שכיחות זוגות

. קריק התקניים-בנוסף על זוגות ווטסון

סליל -דוRNAנבדל גם מ -DNA ית ייכול להימצא רק בקונפורמצ גם בכך שהואA .נה זה התעלה הגדולה בבמ

. פועלים על פי עקרונות אחריםRNAחלבונים מזהי רצף . צרה ועמוקה ואינה זמינה לחלבונים

כל מולקולה אקראית שניצור תיתן אפשרויות קיפול אינטנסיביות מאוד .

RNA-זיקות שלישוניות ב/סוגי מבנים

:RNA- פירוט המבנים השלישוניים ב–משמאל . אינטרקציות בין אלמנטי מבנה שניוניים ממרחקים גדולים

pseudo-knots - גדיל מרוחק -לולאה שיכול להגיב עם חד

kissing hairpins - לולאות 2זיווג בין

hairpin bulge - בליטה אסימטרית שמגביה עם ראש סיכה מרוחק

RNAדוגמאות של מבני

Group 1 intron (משמאל) – דוגמא של שני דומיינים שמגיבים ביניהם

.באיזורים נבחרים בריבוזום

tRNA (מימין) - עד אז תוארה המולקולה כולה כתלתן שטוח .

גדילים -או שני דו)גדילים שמשותף להם גדיל אחד -אפשר לקחת שני דו

בין זוגות הבסיסים stackingי אינטרקציות "וליצור להם ציר משותף ע (נפרדים

שמערב coaxial stacking - stacking –הקשר הנוצר ביניהם מאוד חזק . הקיצוניים

צירים והלולאות 2מארבעה גבעולים נוצרו . גדילי במרחב-נוצר רצף דו. גדילים-שני דו

. שהיו בתווך התכווצו

. כל שני גבעולים מצומדים ונוצר ביניהם ציר חדש. הגבעולים4מבנה התלתן עם - מימין


23 2008' סמסטר ב

. stackingבין שני הגבעולים נוצרת צומת בעזרת אינטרקציות

מהבסיסים במולקולת המקור נמצאים באינטרקציות 50%-כש

stacking - מהבסיסים יהיו באינטרקציות 90%במבנה החדש

stackingקודון נשאר -איזור האנטי. ולא יהיו זמינים לנוקלאזות

. mRNAעם הקודון של (kissing)זמין ליצור זיווג בסיסים

מגנזיום וקשרי קורדינציה

ולעתים יש לו תרומה קטליטית בגלל היכולת שלו ליצור RNAמרחבי של /המגנזיום ממלא תפקיד חשוב בארגון המבני

בקשר ). קשר קוולנטי שבו אחד האטומים מוסר שני אלקטרונים והאטום השני מקבל אותם- קשרי קורדינציה

.(קוולנטי רגיל כל אטום מוסר רק אלקטרון אחד לקשר

.חמצנים של הבסיסים או עם ריבוז/עם חמצנים של פוספטים או עם חנקנים, ליגנדים6מגנזיום יכול ליצור קשרים עם

:הקשרים יכולים להיות משני סוגים

ישיר .א

י מים"מתווך ע .ב

המטען הכפול של המגנזיום ויכולתו ליצור קשים רבים הופכים

. RNA-מצוין של חלקים שונים מולקולת האותו למגשר

.RNA- דוגמא נוספת לקשרים ארוכי טוח ב– סוכר-בסיס-זיקות סוכר- רוכסן ריבוז

. ובינן לבין צלעות בסיס של התעלה הקטנהOH-’2י גשרי מימן עוקבים בין קבוצות "רוכסן ריבוז נוצר ע

השוואות פילוגנטיות תורמות לניבוי מבנה

אלמנטי המבנה –הסיבה לכך . מתוך הרצף שלו בהשוואה למבנה החלבוןRNA-את מבנה ה (יחסית) קל לנבא

דינמיים של כל הקשרים - יציבים מאוד בזכות עצמם וקל לחשב את הפרמטרים התרמוRNA-השניוניים הבודדים של ה

בעזרת חישובים אלה נדע . stackingבמולקולה וכך להסיק על חוזק הקשרים שנוצרים עקב זיגווי בסיסים ואינטרקציות

אלא באמצעות – stacking-פ מקסימום זיווגי בסיסים ו"החישובים הם לא רק ע. מה המתכונת האופטימלית של הקיפול

.השוואה פילוגנטית

ריבוזומלי של יצורים שונים זה מעל זה ובדקו עד כמה הרצפים שונים זה מזה ומה החלקים RNAהניחו רצפי גנים של

בנקודה A- לGשינוי של נוקלאוטיד אחד . שינויים מתואמים ברצף, וריאציות-קוהתגלתה תפעה מעיינת של . השמורים

חילופי הרצפים האלה שימרו את היכולת ליצור זיווגי בסיסים בין . בנקודה אחרתU- לCמסוימת יביא לשינוי של

. נקודות רחוקות ברצף

. ריבוזומליRNAדינמיים ופילגונטיים הגיעו בהדרגה לניבוי מבנים כגון מבנה שניוני של -י שיקולים תרמו"ע

פ רצף הפך קל עוד יותר כשהצליחו "ניבוי ע. (מבנים שלישוניים)בהמשך אפשר היה לעמוד על אינטרקציות ארוכות טווח

.לגבש את הריבוזום ולהבין את המבנה המרחבי שלו


24 2008' סמסטר ב

הבנת מבנה שניוני בעזת שילוב רצפים ומוטגנזה

: משני אורגזנימים(RNAse) אנזימתיות RNAנלקחו שתי מוקלולות

E. coliו -subtilis שחותכות את קצה ה tRNA ( מבשילותtRNA

מבנה , קיים מכנה משותף בין שתי המולקולות. (מהפפרקורסור שלו

ונמצא שאכן יצרו במעבדה את המבנה השמור. מרחבי שנשמר

כמו למולקולות יש את אותה יכולת אנזימתית למבנה המסונטז

היכולת לשחרר את –הם השורש של היכולת האנזימתית , האיזורים השמורים ברצף הם החשובים ביותר. המקור

. מהפרקורסור שלוtRNAקצה ה

חלבון-RNAקשרי

RNAמתקפל על עצמו ברגע שהוא מתחיל להשתלשל מה, לובש את המבנה המרחבי-RNA polymerase , ומיד גם

כמעט תמיד מצוי בקומפלקס עם אחד tRNA ) לבד בתאRNAלעולם לא נמצא . חוברים אליו חלבונים ספציפיים

-מעצבים את קצות ההם , תפקידים חשוביםRNA-לחלבונים העוטפים את ה. ('הפקטורים שמביא אותו לריבוזום וכיוב

RNA ,ממקמים מיקומו ,(למשל לאורך אקסון) אותו לאורך התא משנעים, מתמירים את בסיסיו, מסייעים בשחבורו

.בזירת הפעולה וממשיכים לסייע לתפקודיו השונים

. הכרחית להבנת פעילויותיו הביולוגיותם עם חלבוניRNAהבנת קשרי

שבה התעלה הגדולה B היא קונפורמציית DNAנזכור כי הצורה השכיחה של

של חלבון וייקשר β-strand או α-helixהיא רחבה ויש בה די מקום כדי שייכנס

. של המולקולהhoogsteenלצלע

דו גדילי עושים RNA חלבונים שמכירים– התעלה הגדולה אינה נגישה RNA-ב

.DNAזאת בצורה שונה מאלו שמגיבים עם

RNA-דוגמאות לקשרי חלבון

. המגוונים משתקפים בעושר מבניוRNAתפקידי

. מספר סוגי מוטיבי הקישור החלבוניים מצומצםלעומת זאת

צריכים להתאים את עצמם RNAחלבונים שצריכים להכיר צורות שונות של

RNAכלומר היינו מצפים לראות מספר עצום של חלבונים שקושרים . אליהם

. (כמה עשרות בלבד) הדומיינים המוכר הוא די מצומצם, מספר המוטיביםאך

.שימוש מודולורי באותם מוטיביםהגיוון של אופני הההיכרות מושג באמצעות

מוטיבים שונים או כמה , כמה דומיינים מאותו סוגהחלבונים השונים מכילים

. בסדר משתנה


25 2008' סמסטר ב

DNA-ב, RNA- סוגי אינטרקציות ב- משמאל

.ובחלבונים

מוטיבים מוכרים

1. Pab - Poly-A Binding Protein –גדיל - חלבון הנקשר לחגדRNA

2. Pumilio –גדיל - חלבון המשתמש באותו מוטיב לקישור לחדRNA

3. dsRBM –גדיל - מודל קישור לדוRNA

1 .Poly-A Binding Protein – Pab – RRM( RNA Recognition Motif) מצויים בחלבונים

אך , דומיינים4-החלבון משמאל מורכב מ. אאוקריוטיmRNAשחבור ותרגום , שמעורבים בעיבוד

דומיינים משמשים לאינטרקציה עם חלבונים 2-ו, RNA מהם משמשים לאינטרקציה עם קטע 2רק

לשיירים . αכנגד שני סלילי βמקופלות במשטח חומצות אמינו 80-90-כל דומיין מורכב מ. נוספים

בקשרי מימין או ושיירים בסיסיים מגיבים RNA- עם בסיס ה stackingארומטיים מהמשטח זיקות

. סוכר-עם שדרת הפוספוקשרי מלח

הוא מבחין באופן – poly-deoxyAהחלבון הזה לא יכול לקשור . RRM-קרוב לאחוז אחד מהגנים האנושיים מקודד ל

.RNAולכן רלוונטי רק עבור , 2 בעמדה OHמדוייק בנוכחות

ונקשרים לרצפים שנמצאים בקצה mRNA מווסתים תרגום של – Pumilioחלבונים משפחת . 2

הרצפים חשובים לויסות הייצוב של . (polyA-אבל לפני זנב ה, מעבר לחלק המקודד) mRNA-ה

mRNA .בכל אחד , אבל מעט שונים ברצף, החלבונים מורכבים משורה של דומיינים זהים במבנה

אך , הזיקה לנולקאוטיד חלשה. חומצות אמינו הקובעות איזה נוקלאוטיד ייקשר3מהדומיינים יש

. מביא לאינטרקציה משולבת חזקה יותר, צירוף כמה דומיינים

שאנו RNAכיום ניתן לבנות חלבונים כאלה באופן מלאכותי כדי ליצור חלבונים שייקשרו לרצף

. טבעיRNAמחליטים עליו ולאו דווקא רצף

3 .dsRBM - חלבון שקושרRNAחלבונים לא יכולים לפלוש לתעלה הגדולה של - גדיל- דו

2משמאל רואים . RNA-עיקר הקישור הוא לאיזורי התעלה הקטנה של ה, RNA-ה

בתווך אמנם יש אינטרקציה עם התעלה . (מחזור פיתול שלם)תעלת קטנות

. הגדולה שמתאפשרת רק כי התעלה הגדולה באיזור זה נפרמה חלקית

:הממשקים כוללים זיקות

. ותעלה קטנה אחתα1בין סליל .א

. ותעלה קטנה שנייהβ2-β3לולאה .ב

. ותעלה גדולה פרומה חלקיתα2סליל .ג


26 2008' סמסטר ב

י " לולאה פנימית או מופרעים עגדיל לא רציף עם-יכולים לזהות דוגדילי - דוRNAהמוטיבים שנפוצים בחלבונים קושרי

. זוג בסיסים לא תואם

. שלה כי היא יחסית יותר חופשית מהתעלות במרכזלקשור את התעלה הגדולה בזוג הבסיסים האחרוןחלבון יכול


ב-RNAגדיל בקונפורמצית -גדיל וקטעי דו- אזורי חדA .בליטות ואי, באחרונים מקננות תדיר לולאות פנימיות-

. טווח בין מבנים שניוניים אלה מעצבות את צורתה המרחבית של המולקולה-זיקות ארוכות. תאימות

חלבונים מזהיםRNAאחרת מ -DNA .גדיל -הם אינם מזהים רצף דוRNA מצד התעלה הגדולה אלא פועלים

.מושלמים-גדיל לא-לכן בעיקר על התעלה הקטנה או על אזורי דו

הם מנצלים שיירים ארומטיים לקשריstacking עם מישורי הבסיסים ושיירים טעונים והידרופיליים לקשרי מלח

.וקשרי מימן עם שדרת הסוכר פוספט

ספציפיות וחוזק קישור צנועים של מוטיב קישור בודד מפוצים על ידי שימוש מודולרי במספר מוטיבים של אותה

.מולקולת חלבון

ריבוזימים

RNAאנזים עשוי , קטליטיRNA.

. וחלבוניםRNAלריבוזימים תפקידים חשובים בסינתזות

עד אז כל מה שהיה .RNAחקירתם תרמה להבנת מקורות הקטליזה הביולוגית וסיפקה דוגמאות של ארגון מרחבי של

. tRNA-ידוע על קיפול הגיע מ

היה RNA-אך כדי לקיים את כלל התא ל, RNAחיתוך וחיבור : כ התכונות הקטליטיות של ריבוזימים הן פשוטות"בד

.(אך הן לא שרדו, עם יכולות מורכבות יותרRNAמעריכים שהיו מולקולות )צורך בתכונות מורכבות נוספות

.לאחרונה פיתחו שיטות ליצירת ריבוזומים מלאכותיים עם יכולות קטליטיות לפי הזמנה

הריבוזים משחבר את עצמו

. שעתוק ראשוני ארוך יותרךמתו הריבוזומלי נוצר RNA-ה

בתהליך אינטרון בין שני אקסוניםבמהלך הבשלתו נחלץ מ

splicing (שחבור).

אך דרוש , מצליח להשתחבר בעצמו ללא נוכחות חלבוןRNA-ה

. שיתחיל את הרקאציהGNPלו נוקלאוטיד

G נקשר לאינטרון Gאסטרי - תוקף את הקשר הפוספו

מנתק Gשנמצא בגבול שבין האקסון הראשון לבין האינטרון

חל שינוי קונפורמטיבי והקצה החופשי של את האקסון

האינטרון די אסטר - תוקף את הפוספוGהאינטרון שנושא את

. (חיבור של שני האקסונים) ריבוזומלי בשל RNAכולו נפלט ומשתחחר


27 2008' סמסטר ב

חיבור / כיום יודעים שעבור חיתוךRNA שניצבים בעמדות יוני מגנזיום2נדרשים

שני יוני המגנזיום מצויים גם בחלבונים רבים שעוסקים בראקציות הקשורות . מסוימות

?האם הדמיון מקרי. בפוספטים

RNAse P

מתוך tRNA-זהו האנזים שגורם להבשלה של ה, RNAsa P: הריבויזם השני שהתגלה

. מקופל ומחובר לחלק העודף שיש להשילpre-tRNA –משמאל . הפרקורסור שלו

. 5 מסיר את החלק המיותר בקצה RNAse Pהאנזים

RNAse P כולל תת יחידת RNA תלוי , אחת או יותר) ותת יחידות חלבוניות

במבחנה אפשר להפעיל את היחידה הקטליטית ללא חברת . (באורגניזם

חלבונים בתנאי שנספק ריכוז גבוה מהפיזיולוגי של יוני מגנזיום שמייצבים

.את המבנה של המולקולה


28 2008' סמסטר ב

( גבי קאופמן4 )– המשך –ריבוזימים

. לחבר את עצמה/ יכולה לחתוךRNA אחראי לכך שמוקלולת – ריבוזים ראש הפטיש

. גדליים וליבה קטליטית- גדילים דו3 –ריבוזים ראש הפטיש מכונה כך עקב הצורה שלו

צמחיים RNAהוא מצוי בנגיפי . שבה הוא מקנןRNAאיחוי עצמי של /הוא מזרז ביקוע

הריבוזים . ח"הריבוזים זוהה לאחרונה גם בבע. מסויימים ומתפקד בהבשלת גנוהימיהם

. בו הוא נמצאRNA-הטבעי פועל על רק על ה

מעגלי rolling circle .RNA משוכפל במנגנון RNA גנום – מעגל סובב

והמערכת ממשיכה להקיף במעגל את , נגיפי משמש תבנית בפלמור

ארוך שיכול RNAכך שכל הזמן משתלשל קטע , התבנית פעמים רבות

מהקטע המשתלשל . (מספר עותקים)להכיל מספר רב של יחידות גנומיות

אך כדי שהן עצמן תשמשנה לתבנית של , נחתכות יחידות גנומיות מעגליות

ליצירת ) יש לחבר את הקצוות שלהן זה לזה – משלים RNAסינטזת גדיל

. (מעגל

. ובאיחוי הקצוות ליצירת מעגלRNA-לריבוזים יש תפקיד בחיתוך ה

אך , הוא משתנה תוך כדי הראקציה, הוא לא קטליזטור קלאסי

במבחנה אפשר להפוך את הריבוזימים לקטליזטורים רב מחזוריים

. שיעבדו על סובסטרט חיצוני שיחתוך מולקולות אחת אחרי השניה

ניתוק החלק של הסובסטרט –י ניתוק חלקי הריבוזים "עושים זאת ע

. פעמי-לאחר שנסנטז מולקולות מלאכותיות עם רצף מתאים לחלק האנזימתי יתאפשר חיתוך רב. מהחלק של האנזים

. אחרים ואפשר אפילו לכוון אותו לבקע רצפים מסוימיםRNAהפכנו את הריבוזמים שבוקע את עצמו לאנזים שבוקע

הזכרנו ש -RNA לא יציב בגלל קבוצת OH הריבוזים . שכן עלולה להתרחש תגובה שתביא לנתק בגדיל, 2 בעמדה

.הוא המקטלז את הראקציה הזו

מנגנון מולקולורי

דרושה קבוצה בסיסית שתקלוט את הפרוטון וקבוצה חומצית שתתרום - חיתוך

בתגבוה זו מספר הקשרים האסטריים אינו . את הפרוטון לקבוצה העוזבת

נוקלאוטידי -נולאוטידי לקשר אסטרי תוך-אנו מחליפים קשר אסטרי בין, מתשנה

בריבוזים ראש הפטיש הקבוצה הבסיסית היא . (נוצר נולקאוטיד ציקלי)

Guanine והקבוצה החומצית הוא אותו OH (י השרשרת הנחתכת"שניהם נתרמים ע) 2 בעמדה

, הריבוזים הזה יכול להחמיר את המחלה. ויון מגנזיום כחומצהC75 המשתתיפם בקטליזה הם בסיס HBV-בריבוזים ב

.HBVמקודד לחלבון רגולטורי ומסתמך על נגיף העזר , RNA נולקאוטידי 1600-הוא מורכב מ

. בדיוק הראקציה ההפוכה לעיל–איחוי


29 2008' סמסטר ב

RNA-ריבוזימים ועולם ה

סבורים ש-RNA מילא תפקידי מפתח בשלבים מוקדמים של התהוות החיים על פני כדור הארץ כמולקולה גנטית

.DNA-אפשרו את הופעת מערכת תרגום החלבונים ובהמשך את הופעת גנומי הש תכונות ,וכקטליזטור אנזימתי

בכלל זה פיתוח הריבוזימים , רעיון זה אושש בעקבות הישגים נוספים שנרשמו מאז גילוי הריבוזימים הראשונים

.המלאכותיים ופענוח המבנה הגבישי של הריבוזום

כאלה שיכלו לסנטז ) RNA-לאחר גילוי הריבוזמים הראשונים נשאלה השאלה האם היו ריבוזימים נוספים בעולם ה

.SELEX –נעשו מאמצים ליצור ריבוזומים כאלה בצורה מלאכותית . ('נוקלאוטידים וכו

SELEX - שיטת אבולוציה מזורזת במבחנה שנועדה במקור ליצור מולקולותRNA ו

DNAחלבונים /אנטיביוטיקות/למשל יוני זהב, שיקשור ליגנדים שאנו מעוניינים בהם

. ספציפיים

עם רצף אקראיRNA של מולקולת מאוסף אינסופימתחילים .1

שרשראות 1014-1015 של העתקים רבים מייצרים RNA polymeraseי "ע .2

כדי שנוכל ) נוקלאוטידים עם שוליים מוגדרים 100-200בנות שונות

(.PCR-להגביר ב/לשעתק

מתוך הנחה שביניהן תימצא המולקולה שלה היכולת בה אנו מפעילים סלקציה .3

שתקושר מולקולות מסוימת RNAאם רוצים מולקולות : לדוגמא. מעוניינים ולנו נותר רק לבודד אותה מתוך הכלל

כך נבודד ) נוכל להעביר את השרשראות הרבות דרך קולונה שלדפנותיה קשורה המולקולה הרצויה לקישור –

. ( הרצויהRNA-את שרשרת ה

:הפתרון. עם יכולות מרשימות במחזור הראשוןRNA אנו לא מקבלים מולקולת –הבעיה

Reverse transcriptaseי " עDNA- חזרה לRNA-הופכים את שרשראות ה .4

בתנאי מוטגנזה שמעשירים את אוכלוסיית המולקולות שבחרנו בוריאנטים ) DNA- נשכפל את ה PCRבאמצעות .5

(וחלקם יהיו טובים יותר מהמולקולות המקוריות

(שוב בתנאי מוטגנזה) RNA-נשעתק חזרה ל .6

מקבלים מולקולות בעלות יכולות קטליטיות או קישור ליגנד לאחר מספר מחזורים –חוזרים על הסלקציה .7

.מיטביים

RNAמזרז סינטזת חלבון

במהלך הגיבוש של . הענקי ולא החלק החלבוניRNA- הוא דווקא ה–המרכיב הקטליטי בריבוזום

החלבונים הקרובים . המולקולה הצליחו לזהות את האתר שבו מתבצע הקשר הפפטידי בחלבון

חלבונים הם לא קבוצה קטליטית כלומר , ( אנגסטרם18)לאתר הפעילות הם רחוקים למדי

, לשדך בין שני המשתתפים בתהליך– הריבוזומלי RNA-תפקיד ה. שמזרזת את יצירת הקשר

. RNA-יכולת זו מתיישבת עם קדמוניות ה. tRNA-והקבוצה הקטליטית הנדרת מגיעה מאחד ה


30 2008' סמסטר ב


וצר מבנים שניוניים כמו יקיפול עצמי שלו . גדיל-ריבוז והוא נוצר כחד-ריבוז במקום דאוקסי, T במקום RNA U-ל •

מבנים אלה מגיבים זה עם זה בזיקות ארוכות טווח . לולאת בליטה ולולאה פנימית, בליטה, ראש סיכה, סליל-דו

הוא . ר מגנזיום"עפי, ערכית-בזיקות אלה יש תפקיד ליון מתכת דו. שכיחים-בהן פוגשים גם בזיווגי בסיסים לא

.הסוכר ובסיסי הנוקלאוטידים, מים עם חמצני הפוספט-יוצר קשרי קואורדינציה ישירים או מתווכי

כמו רוכסן ) אך מאפשרת זיקות תוך ובין מולקולריות RNA- הידרוקסיל מערערת את יציבות ה2'נוכחות קבוצת •

.ומעניקה לעתים יכולת קטליטית (ריבוז

שיקולים , מנתוני רצף על סמך זיווגי בסיסים אפשרייםRNA-קל יחסית לנבא את מבנה ה, בניגוד לחלבונים •

מסתבר שמבנה יכול להשתמר למרות שינויי רצף כאשר . אנרגטיים והשוואות פילוגנטיות של רצפים הומולוגיים

שניוניים מבודדים יציבים יחסית בשונה יציבות מהמצב RNAמבני . שינויים אלה משמרים זיווג בסיסים רלבנטי

. בחלבון בו מותנית יציבותם במבנה השלישוני

ובסינתזת הקשר הפפטידי RNAבמסלולי עיבוד , נגיפיRNA מסוימות המתפקדות בשכפול RNAלמולקולות •

הידרוקסיל או בסיס 2'על , הקטליזה יכולה להיות מבוססת על יון מגנזיום ספוח. בחלבון יש יכולת קטליטית

RNA . ייתכן שהריבוזימים הקיימים שרדו מעולם קדום בו הושתתו גם הגנומים וגם הפנוטיפ הקטליטי עלRNA .

רעיון זה נבחן בין היתר בעזרת אבולוציה מזורזת במבחנה שהניבה ריבוזימים מלאכותיים חלקם מזרזים

.RNA-ריאקציות משוערות של עולם ה

אריזת הגנום

במבנה הקרוי , בעיקר חלבונים, בחברת מולקולות נוספותDNA-אולם בתא מצוי ה. במבודדDNA-עד כה דנו ב

.משמש כמה מטרותה, כרומוזום

. למימדי התאDNA-כיווץ ה •

. כשהמולקולה חשופה היא מאוד פגיעה– DNAמניעת נזקי •

.העברה מסודרת של הגנום לתאי הבת בעת חלוקת התא •

.מידור המידע באופן המאפשר לשלוף או לגנוז חלקים ממנו לפי הצורך •

. כרומוזום מעגלי יחיד בתאכ "בדחיידקים וארכאה מכילים

. (מצב דיפלואידי)א בשני עותקים "מיוצגים בדרך כלל כה (עד כמה עשרותכ "בד) כרומוזומים קוויים מרובים אוקריוטיםלא

.ויקריוטי עטוף בממברנהא רק הגנום האהגנום ממוקם באזור תאי מוגדר אך

עולה וצפיפות הגנים שבו פוחתת עם הגידול במורכבות DNA-תכולת ה

. האורגניזם

אך באורגניזמים . קיים מתאם גס בין גודל הגנום למורכבות האורגניזם

. מה שנחוץ עבור מספר הגנים שלהםDNA יש הרבה יותר –המורכבים ביותר


31 2008' סמסטר ב

בטבלה משמאל

ל-E.coli –גנום באורך של כ - mB5 1000- כ– ומספר הגנים שלו .

. כלומר גן אחד לאלף בסיסים

ב-S. cerevisiaeגודל הגנום כ -mB 12 , אך צפיפות הגנים ירדה פי

...וכן הלאה (mB- גנים ל500-פחות מ) 2

גנים ל9 רק – צפיפות הגנים נמוכה עוד יותר –באדם -mB.

(בחיידקים יש רק עשרות בודדות של נוקלאוטידים באיזורים מסוימים המשמשים לבקרה) הגנום החיידקי כולו גנים.

(קריאה בצורה אלטרנטיבית)אותו גן יכול לפעמים לקודד לכמה תוצרים - שיטת חיסכון ויראלית.

הגורמים לירידה בצפיפות הגנים באאוקריוטים

פרומוטור , חלבוני בקרה4י עד "פרומוטור חיידקי נשלט ע - בשוליהםנרחבים י אזורי בקרה "התארכות גנים ע .א

. ע עשרות חלבונים"אנושי יכול להיות מבוקר ע

. מספרם עולה ככל שעולה מורכבות האורגניזם–הוספת אינטרונים בתוך הגנים .ב

ממשיכים , רצפים אלה כוללים אלמנטים ניידים המתאזרחים בגנום .גניים-מקודדים בין-גידול ברצפים לא .ג

. להתרבות בו וגם להרבות עותקי גנים פגומים

על פני " מחליק"הפולימראז ) הפולימראז" גמגום"גנום רצפים חוזרניים פשוטים שמקורם כנראה בבעים ימופ .ד

. (הגדיל ומשכפל מספר פעמים את אותו מקטע

חלק גדול מהגנום מגיע . מהגנום מקודד לחלבונים1%רק - באדם

אלמנטים גנטיים ניידים שיכולים להשתבץ )מנגיפים או מטרנספזונים

יש איזורים שלא עוזבים את הגנום . (וירוסים-כמו רטרו, בכרומוזום תאי

.של התא המאחסן וממשיכים להפיץ את עצמם הלאה

. יש לנו למעלה ממיליון עותקים של גנים שריבה את עצמו במנגנון זה והוא מפוזר ברחבי הגנום

. שכן מרצף שלא מקודד דבר הוא יכול להפוך לאקסון, יש לזכור שאותו מקטע זר יכול לתרום לאבולוציה של האדם

רצפים לא מקודדים מקטינים את צפיפיות הגנום

במספר אורגניזמים 60kbנשווה את צפיפות הגנים במקטע באורך

. RNA polymerase הגן של –ובכתום , גנים–ירוק כאשר ב

ב-E.coliגנים57- יש קידוד ל

ואורך הדן של , גנים31- אותו איזור בדיוק מקודד רק ל–בשמרRNA polymeraseגדל .

ובצד הרצפים המקודדים רואים אינטרונים, גנים בלבד8- האיזור מקודד ל–בדרוזופילה.

האיזור של , אותו איזור מקודד לשני גנים בלבד–באדםRNA polymeraseוהרצפים , תופס שטח נרחב

.מחוץ לגנים יכולים להיכנס רצפים חוזרניים/בגנים. המקודדים הם במיעוט בין האינטרונים


32 2008' סמסטר ב

הזרוע השמאלית עשירה ) 22דוגמא לסידור גנים בזרוע הימנית של כרומוזום

ברצפים חוזרניים דחוסים במבנה הטרוכרומטיני הדוק שמשוכפל רק בשלב

כ עד שאינו מאפשר חדירה לגורמי "כי הוא צפוף כ, Sמאוחר יחסית של פאזת

.(שעתוק

ניתן לראות כי האקסונים מהווים עוט מבין האינטרונים הארוכים וכי בתחילת

. הגן יש איזור בקרה נרחב

שלושה רכיבים חיוניים לשכפול ותחזוקת כרומוזם

נחוץ כדי לאפשר לתא לנוע לקטבים בזמן – צנטרומר .א

מחבר את הכרומטידה כישור המיטוטי. החלוקה

חשוב לשכפול – Origin of replicationמוצאי שכפול .ב

.כיווני של הגדילים-דו

מתחזקים את הקצוות ומבדילים – שני טלומרים בקצוות .ג

נזק ) DNA-גדילי ב-בין קצה נורמלי של כרומוזום לשבר דו

אחרת מערכת התיקון הייתה מחברת , חמור שיש לתקן

.(כרומוזומים זה לזה ויוצרת שגיאה גדולה

קריוטיפ אנושי

מכיוון שאנו יודעים את תכולת –כל זוג כרומוזומים נצבע בצבע משלו

שכל אחד (נוקלאוטידים-אוליגו) נכין גלאים –הגנים בכל הכרומוזמים

. מהם יצבע את הכרמוזום בצבע אחר

תוכן שמרני לעומת גמישות צורנית

(, synteny- סינטניות )באדם ובעכבר מספר הגנים כמעט זהה וסידור הגנים דומה

גנים שנמצאים על )אך איזורים שונים מפוזרים בין הכרומוזמים באופן שונה

.(כרומוזום עכברי אחד יכולים להיות מפוזרים על כמה כרומוזמים באדם

במרכז /באדם הוא נמצא בתוך- גם מיקום הצנטרומר משתנה בין האורגניזמים

. ובעכבר הוא צמוד לקצוות–הכרומוזום

, יש להם תכולת גנים וסדר גנים כמעט זהה, שני סוגי איילים–משמאל

, ובכל זאת הגנום מפוזר במספר גדול של כרומוזמים באייל הסיני משמאל

.ובארבעה כרומוזומים בלבד באייל ההודי מימין


33 2008' סמסטר ב

מארז הגנום

, הגנומי עולה על קוטר התא או גרעין התא בסדרי גודלDNA-אורך ה

ועלינו , (מ"ואורכך כרומוזום מספר ס) מטר 2 באדם הוא DNA-אורך ה

קטנה DNA-בתאי חיידק או נגיף כמות ה. לכווץ אותו למיקרונים ספורים

. יחסית ועדין יש להגיע לכיווץ ניכר

ניתן לראות את השטח העצום . נגיף/ מתפרץ מתוך חיידקDNA- משמאל

. תופס כשהוא יוצא החוצהDNA-שה

(לעומת אאוקריוטים) DNA-יש דרכים שונות לכווץ את ה- חיידקים וארכיאה

שמתיר את type1טופואיזומרז שומרים על מאזן פיתולי על אופטימלי בעזרת . פיתולי על שלילייים –בחיידקים

. שיוצר פיתולי על DNA gyrase-הקשרים ו

.(ומגבירים את הנטיה הזו)הם נקשרים לרצפים שיש להם נטיה להתכופף , DNAבנוסף ישנם חלבונים שיודעים לכופף

יוצרים , הם מגשרים בין רצפים רחוקים, נפוצים בחיידקיםSMCחלבוני

החלבונים יכולים לחלק . מסולסל בפיתולי עלDNA-בכל לולאה ה. לולאות

כך הגנום . לדומיינים שלכל אחד טופולוגיה עצמאית משלוDNA-את ה

כלומר יש איזור המיועד , מסודר במבנה של ליבה חלבונית וסביבה לולאות

.אך אינו עטוף בממברנה, לגנום

באאוקריוטיםDNAדרכי כיווץ

ממדר את המידע הגנטי דחיסה וכן מאפשר הבמארז כרומטיניהגנום מכווץ

.באופן שיאפשר לחשוף או לגנוז חלקים ממנו בעיתוי מתאים

נכרך DNA-שה (היסטונים) תצמיד חלבונים –לכרומטין יחידת מבנה בסיסית

- למעט איזורי מרווחים בין חלקיק לחלקיק. פיתולי על שליליים1.65-מסביבו ב

. כל הגנום ארוז כך

הקשר ההדוק שבין צורת הכרומטין מהווה מוקד התעניינות גוברת בגלל

.בתאי אאוקריוטים בכלל ובאדם בפרטהאריזה של כרומטין ובקרת ביטוי גנים

: יש היררכיות שונות של קיפול

DNA עירום ( קוטרוnm 2) עוטף תצמידי חלבונים ויוצר סיב דק–

nm11) ,הם יחידת (הנוקלאוזומים)החרוזים . מעין שרשרת חרוזים

. (הארגון הבסיסית של הכרומטין

מתקפל על עצמו בלולאות ליצירת סיב עבה , הסיב הדק מתארגן בנוקלאוזומים(nm 30)

הלולאות של הנוקלאוזומים מתארגנות באופן גלי ליצירת מקטע עבה עוד יותר(300 nm )

המקטעים נדחסים ונוצר הקיפול שרואים במיטוזה(700 nm .)

ובדרגות הגבוהות החלבונים החשובים הם , בדרגות הקיפול הנמוכות היסטונים ממלאים תפקיד חשובSMC .


34 2008' סמסטר ב

יש איזורים שנמצאים במצב נגיש יותר או נגיש פחות לגורמי שעתוק– בכל תא מתבטא רק חלק מהמידע הגנטי ,

. והכל תלוי בדרגת האריזה של הכרומטין

מחרוזת הנוקלאוזומים

נעביר את - (nm 10בקוטר של )כדי לראות הסיב הצר - הסתכלות

החלבונים יעזבו את , לתמיסה עם חוזק יוני נמוךnm 30הסיב בקוטר

מחרוזת , הכרומטין ייפרס ונקבל שרשרת חרוזים צרה, DNA-ה

. ננומטר10נוקלאוזומים בקוטר

בעזרת אנזים . וכמה עשרות בסיסים במרווח שבין החרוזים, "חרוז" זוגות בסיסים פר 150- יש כ– מניפולציות כימיות

.היסטון נפרק את השרשרת למקטעים קצרים/ חופשי ולא כזה שצמוד לחלבוןDNAשיודע לפרק רק

קטעים ומתקבלים מ(linker) פוגע אקראית במרווח micrococcal nucleaseי "יכול חלקי של מחרוזת נוקלאוזומים עע

. 200bp~כפולות של ברוכים שונים ב

אותם ניתן לגבש ולקבוע . והיסטוני ליבה147bp DNA בה ליבת נוקלאוזוםעיכול מלא מותיר

. את המבנה המדויק

שלושת . marker –משמאל . ל של הגדילים שעוברים פירוק הדרגתי'ניתן לראות את הריצה בג

200חלק מהמקטעים הם באורך )הטורים במרכז מסמלים שלבים שונים בעיכול החלקי

כל המקטעים , עיכול מלא של הגדילים- מימין . (' ביסים וכיוב400אחרים באורך , בסיסים

. זוגות בסיסים147שהתקבלו באורך

התצמיד/ההיסטונים

.4H ,3H ,B2H ,A2H: סוגים4-היסטון מ/ מולקולות חלבון8התצמיד מכיל

α-helix, לולאה, קטןα-helixיש להם : (מוטיב ההיסטון)להיסטונים מבנה מיוחד

. המבנה סימטרי– קטן α-helixלולאה ושוב , גדול

מתילציה וסרין /עתיר ליזינים המיועדים לאצטליציהלכל היסטון יש זנב אמיני

. שכנים זה לזה הזנב חשוב לבקרת ביטוי וקישור נוקלאוזומים. מיועד לזירחוןה

קובע את מידת הכיווץ של (זרחן/אם יש עליהן מתיל)מצב ההתמרה של הזנבות

הזנבות חשובים לבקרת . נגיש לפקטורי שעתוק או לאDNA-הכרומטין ואם ה

. השעתוק

בעוד . לזנבות תפקידים רגולטוריים חשובים. זנב קרבוקסיליA2H- וB2H-ל

מוטיב ההיסטון אחראי לארגון ליבת ש

.הנוקלאוזום


35 2008' סמסטר ב

היסטונים נקשרים זה לזה – histone foldלכל ההיסטונים יש

. במתכונת של לחיצת יד כדי לבנות את ליבת הנולאוקזום

3H4- וHוגם , מתקשרים ויוצרים דימרA2Hו -B2H נקשרים

, מר- נקשרים ויוצרים טטרה4H- ו3Hשני דימרים של . לדימר

האוקטמר הוא הלב של . B2H- וA2Hמר נקשר לשני דימרים של -והטטרה

. הנוקלאוזאום

עלינו הרי לשכפל גם ) DNA-זהו גם הסדר של יצירת המבנה בזמן שכפול ה

(.DNAהיסטונים בזמן שכפול

יש להם מבנה של כרומטין . מר-במחלקה אחת של הארכיאה מכילה כבר היסטונים פרימיטייבים שיוצרים טטרה

אבל שאר היררכיות הקיפול שיש – (חסר הזנבות) מקיפים את הקומפלקס DNA בסיסי 120פרימיטיבי שבו

.באאוקריוטים חסרות

רצף- אינו תלוי–היסטונים -DNAהקישור

. פיתולי על שליליים1.65- מקיף את שמונת ההיסטונים בDNAכאמור

. (איפה שאין סיבוב כפול של הגדיל) DNA-מר קושר את הקצוות ואת המרכז של ה-הטטרה

. (איפה שיש סיבוב כפול) DNA- קושרים את יתר הB2H- וA2Hשני הדימרים של

זוגות בסיסים כאשר זוג אחד נמצא ממש 147 יש –הנוקלאוזום סימטרי מאוד

. במרכז ציר הסימטריה

בלי תלות DNA-כי הם מארגנים את ה, ההיסטונים נקשרים מצד התעלה הקטנה

והקישור נעשה דרך חמצני , להיסטוניםDNA נקודות מגע בין 7יש . ברצף

היסטונים מאוד בסיסיים ולכן נקשרים כמו כן . הפוספטים ומעט קשרי מימן

. פוספט שנמצאת בתעלה הקטנה-לשדרת הסוכר

Nucleosome positioning - כיפוףDNAרצף- תלוי

.DNAכאן באה לידי ביטוי השפעת הרצף על קונפורמציית

-ב לעומת עושר GC-עושר ב, קונפורמציה באה לידי ביטוי כי יש סירוגיות-התלות רצף

AT .בסיסי ,שה זוגותי במרווחים סדירים בני כחמ,מופיעים לסירוגין T-A שנוטים

. הנוטים להרחיבהG-Cלכווץ את התעלה הקטנה וזוגות

. לעשות כיפוף מודרג מסביב לליבת החלבוניםDNA-הסירוגיות הזו מאפשרת ל

מאפשר חשיפת רצפים נבחרים לגורמי בקרה כמו nucleosome positioningהתופעה אינה חלה על כל הגנום אך

. י גורמי שעתוק"איזורי המרווחים בין נוקלאוזומים מכילים רצפים מסוימים שמוכרים ע .פקטורי שעתוק


36 2008' סמסטר ב

1Hהיסטון

, לזנבות ההיסטונים תפקיד רגולטורי והם מאפשרים אינטרקציה בין נוקלאוזומים שכנים

. (חשוב לביטוי הגנים)ומסייעים בקיפול

מכיל פעמיים את , כפול בגודלו שהוא 1H יש היסטון –נוסף לזנבות היסטוני הליבה

:ולו מספר תפקידים, מוטיב ההיסטון

שיוצאים מהנוקלאוזוםDNA-לקרב את חלקי ה .א

המרווחי מאחד העברים ומסייע לדחיסת נוקלאוזומים שכנים DNA-מהדק את ה .ב

על-למבנה

. ננומטר30 נומטר לסיב של 10תורם להפיכת הסיב של .ג

(ולא סולנואיד)זי - זיג–מבנה על

.(על-פיתול על)על -מחרוזת הנוקלאוזומים הבסיסית בעצמה יוצרת מבנה

הכרוך מסביב DNA-וה, נוקלאוזומים בכל מחזור פיתול6 - סולנאויד

DNA-לא רק ה)לנוקלאוזום ממשיך כל הדרך את פיתול העל השלילי

מודל זה . ( המרווחי ממשיך באותו כיווןDNA-שמקיף את ההיסטונים גם ה

. התגלה כלא נכון

הופך ( המרווחיDNA-ה) שיוצא מהנוקלאוזום DNA-ה, זגי-הנוקלאוזומים מסודרים בארגון זיג- המודל הנכון – זג-זיג

. פיתול על חיובי2/3-את הפיתול שלו ל

1.65 עושה DNA-מכיוון שה. נוקלאוזומים25ובו , מעגלי DNAלנגיף זה . SV40-י מחקר על נגיף ה"המודל התגלה ע

25אך התקבלו רק , פיתולי על שליליים41.25 ציפו לקבל –כשסילקו את הנוקלאוזומים , על לכל נוקלאוזום-פיתולי

פיתולי על חיובי שמקזזים 2/3, המרווחים עושים תפנית חיובית: זג הסביר את הממצאים-מודל הזיג. פיתולי על שליליים

. נטו מתקבל רק פיתול על שלילי אחד פר נוקלאוזום, את מספר פיתולי העל השליליים

לביטוי גנים ייחודיים מבלי לפרק את ננומטר יכולות להיפתח סלקטיבית30-של סיב ה לולאות

.מבנה הכרומטין הכללי

חלבוני כרומטין שאינם היסטונים אחראים לחוסר אחידות במבנה הכרומטין.

תצמידי chromatin remodeling משנעים

מנגיש את מה שנוקלאוזומים ומסלקים , נוקלאוזומים

.לגורמי שעתוק ושכפול DNA-ה


37 2008' סמסטר ב

DNAשכפול

התחזית של ווטסון - Semi-conservaitve replication –שכפול משמר למחצה

. חדשDNA משמש תבנית לסינזת גדיל DNA-כל אחד מגדילי ה: וקריק

.(סליל חדש-סליל הא תבנית לדו- דו–אפשרות לא נכונה אחרת )

: הרעיון נבחן בניסוי

. צפיפות גדולה יותרDNA- שהקנה לN15גודלו תאי חיידקים עם איזוטופ חנקן כבד

DNA-כך של, 14Nשטפו את המצע מהחיידקים והעביר ואת החידקים לחנקן רגיל

. תהיה צפיפות הולכת וקטנה

. י סרכוז בתמיסת מלח" בעלות צפיפות שונה עDNAאפשר להבדיל בין מולקולות

. צפיפות גבוהה של מלח ולמעלה צפיפות נמוכה–בתחתית המבחנה . יצרנו מפל ריכוזים של המלח עצמו במבחנה

. כבד ינדוד וייעצר נמוך DNA. מסתדר בתוך המבחנה לפי הצפיפות שלוDNA-ה

DNA-כיוון שכל מולקולות ה (התייצב במרכז המבחנה)ם י צפיפות ביניDNA-לאחר מחזור שכפול אחד הייתה לכל ה

. החדשות הכילו גדיל חדש וגדיל ישן

. קל בשיעור הולך וגדלDNAבהמשך הופיע

.אך העלה שאלות נוספות, גדיל הורי משמש תבנית לגדיל חדש–התצאות מתיישבות עם המודל

מוצא שונה– DNAעקרונות משותפים בשכפול

. המשמשים מודלים לחקר שכפול הגנום התא הפונדקאיDNAי נגיפי "אותם עקרונות מיושמים ע

. לעומת ארכיאה ואאוקריוטים, במנגנוני השכפול של חיידקים–אך יש הבדלים מהותיים

מדובר במיקרוארוגזנימים פרוקריוטים שרובם , בעבר חשבו שאלו חיידקים– ארכיאה

, גבוהה במיוחד' טמפ, גדלים בתנאים קיצוניים כגון מליחות גבוהה במיוחד)אקסטרימופילים

. (גופרית/מפרקים מתאן, אנאירוביים

הסתבר שהרצף יותר דומה לזה של האאוקריוטים מאשר לזה – הריבוזומלי שלהם RNA-כאשר ריצפו את רצף ה

. ארכיאה ואאוקריוטים, לחיידקים: ובעקבות זאת נעשתה חלוקה מחודשת של העולם הביולוגי–של חיידקים

. הארכיאה- המודל הפשוט המשמש אותנו DNAבשכפול

כללי שכפול משותפים לכל הגנומים התאיים

כיווני -מוצא שכפול דו

סינטזה כל שרשרות ה-DNA קטע - נפתחת בפריימרRNA קצר

יודע רק להאריך DNA polymerase) נוקלאוטידים 10של

י " שנוצר עRNAוהם מתחילים את השכפול ממקטע , שרשרות

Primase) .יוחלף ב, הפריימר יסולק לאחר מכן-DNA ,ושרשרות יחוברו זו לזו.

גדיל אחד שלDNA שכפול שהוא בחציו בלתי המשכי– גדל ברציפות והגדיל השני נוצר קטעים קטעים .


38 2008' סמסטר ב

עקרונות השכפול

עד היום אי אפשר להגדיר את הרצף –( Origin of replication - OriC)מוצא השכפול , נפתח באתר מוגדר .1

שהוא מוצא לשלכפול בתאים הומניים אופן האריזה הוא שקובע את נקודת התחלת השכפול בתאים

.הומניים/אנימליים

. DNA-לרצף המוצא נקשרים חלבוני בקרה שפורמים חלק מה .2

הוא . DNA-פרונים שמעינים אותו על ה' יחד עם צHelicaseלמוצא השכפול נקשר .3

כדי (רק מפריד זוגות בסיסים)גדיל אך לא מנתק את הקשרים -מפריד את הדו

. דרושה פעולה נוספת–להפריד את הקשרים

. חדשDNAהגדילים פנויים לפלמור

DNA- למרות שהוא וחלבוני שכפול אחרים נטועים במקום והDNA-מקובל להראות את ההליקאז נע כלפי ה

.דרכם" זורם"המשתכפל

הם מושתתים על גבעול –ממוצא השכפול מסתעפים שני מזגות שכפול .4

DNA-הורי שבחלקו עוד לא פרם וזרועות בהם מתבצעת הינטזה של ה

.החדש

ההליקאז ממשיך .ההליקאז מושך את אחד מגדילי התבנית ובכך פורם את הגבעול ההורי .5

ההליקאז וחלבוני שכפול אחרים נטועים –י משיכת אחד הגדילים דרכו " עDNAלפרום

. הוא שזורם דרכםDNA- וה–במקומם

ולכן טופואיזומרזות - בגלל הפרימה נוצרים פיתולי על בחלק ההורי וזרועות הבת מסתכות .6

יתערבו ויתירו את עודף פיתולי העל חיוביים בחלק שאינו פרום עדיין

.ומתירים את הסבך שבזרועות הבנות


39 2008' סמסטר ב

(גבי קאופמן - 5)המשך עקרונות שכפול

- יכול לפלמר רק מDNA polymeraseאך , DNAיש קוטביות מנוגדת של גדילי .7

יש גדיל מוביל שנוצר בצורה מקוטעת וכך שני התהליכים –הפתרון . 3- ל5

הגדיל יתקדם בצורה רציפה –כל פעם שנחשף קטע חדש . מתרחשים בו זמנית

מקטעי הגדיל הבלתי המשכי נקראים. ויווצר עוד קטע קטן שיתחברו זה לזה

. פיסות אוקזאקי

8. polymerase DNA מאפריימר שרשרת בסיועPrimase (primase) ,RNA

polymerase ייחודי לשכפול DNA .הPrimase יוצר קטע RNA קצר

.DNA polymeraseאותו מאריך (תחל, יזם)המשמש כפרימר

מונע , מגן על התבנית החשופהSSB) )גדילי- חדDNAחלבון קושר .9

השתזרות מחודשת או קיפול עצמי של גדילי הבת ומרתק לזירה חלבוני

.שכפול נוספים

הפער מתמלא . DNA-הבשלת ה עם RNA- מסלקות את פריימר הנוקלאזות .01

.DNA Lygaseי " והנתק מאוחה עDNA-ב

.לעתים כפוף שלב זה לבקרה, השכפול מסתיים עם מפגש המזלגות .11

, בחיידקים יש משני עברי נקודת הסיום רצפים מסוימים אליהם נקשר חלבון ייחודי

בחיידק כיוון השעתוק . סימטרית ומונעים גלישה מעבר לנקודת הסיום-הם בנויים א

מה שנועד למנוע התנגשות בין – חופף להתקדמות מזלג השכפול –של גנים פעילים

DNA polymeraseל -RNA polymeraseשמתקדמים בכיוונים מנוגדים .

הם אקריוטים בא, למשל. קצוות כרומוזומים קוויים משתכפלים במנגנונים ייחודיים .21

. י טלומראז"מתוחזקים ע

.היא מקודדת לרצף החוזרני של הטלומר. RNAאנזים זה תבנית שכפול פשוטה עשויה ב

:יש פתרונות שונים לתחזוקת קצוות של כרומוזומים

.שכפול בשיטת המעגל הסובב .א

:ולו שתי מטרות, אינו מקודד לגנים, GC-רצף חוזרני עשיר ב- טלומר .ב

a. לאפשר מנגנון שכפול ייחודי שעוקף את אי יכולת החלפת הפריימר

b. גדילי ב-להבדיל את קצה הכרומוזום משבר דו-DNAשיש לאחות .

חלק ממנה הוא רצף . שמשמשת כתבנית, RNAלאנזים טלומראז תת יחידת - מבנה טלומראז

תת יחידה חלבונית אחרת מהווה איזור קטליטי והיא יכולה . קומפלמנטרי לרצף החוזרני בטלומר

לאחר שעתוק של . (Reverse Transcriptaseמעין ) DNA כדי לשעתק RNA-להשתמש בתבנית ה

. הטלומר מאורך- מספר חזרות של הרצף


40 2008' סמסטר ב

, זה מעין קוצב זמן, והטלומרים הולכים ומתקצרים, עם כל מחזור חלוקה הטולמראז מפסיק לפעול

בתאי סרטן בהם החלוקה . הוא מהות ההזדקנות התאית-מספר הפעמים שתא יכול להתחלק הוא

אחת המחשבות איך . פעילות הטלומראז התחדשה ולכן הם יכולים להתחלק ללא הרף–היא נצחית

. מעכבים שיפגעו בפעילות הטלומראז–לפגוע בתא סרטן

(גרעיני/קשורים למרכיבי שלד תאי)במקומם אלא הם נטועים , הנייחDNA-ג ה" חלבוני השכפול לא נעים ע .31

. זורמת דרכםDNA-ותבנית ה

: העיקרון מומחש בניסוי הבא

DNA polymerase בשיטות של הנדסה ) סומן בצבע פלורסנטי אדום

הוא ממקם עבורנו את מערכת . (גנטית הוסף לו קטע חלבון צבעוני

מסוים באמצעות חלבון DNAהחוקרים סימנו רצף - בנוסף . השכפול

–כאשר מרעיבים חיידקים . שישמש כרצף בקרהDNA-כחול שנקשר ל

. תימשך עד לנקודה מסוימת ואז תיפסקDNA-סינטזת ה

שני –כאשר עצרנו את השכפול בדיוק כאשר רצף הבקרה עובר שכפול - נסתכל על אוכולוסיית חיידקים

הרצף יכול להמשיך - (מפסיקים את ההרעבה)אם מוסיפים חומצות אמינו . מתלכדים (האדום והכחול)הסימונים

. חולף דרך החלבון המקובעDNA-ה: המסקנה. להשתכפל והוא מתרחק מחלבון השכפול

41. Checkpoints - שכפול ה-DNA ובכל מהלך השכפול יש , סיום השכפול כפוף לבקרה, כפוך לבקרה קפדנית

חלבוני שכפול מאותתים לחיישני נזק שמעבירים סיגנל למתווכים –כאשר מזוהה נזק . בקרת שכפול מתמדת

. התהליך יתחדש–כאשר הנזק מתוקן . ומגייסות מערכות תיקון מצד שני, שבולמים את השכפול מצד אחד

ATM – אחד החלבונים המרכזיים במערכת הולכת האותות בתגובה לנזקי DNA .


השכפול נפתח מאתר זה כאשר נקשרים אליו חלבוני . DNA-מוצא השכפול הוא אתר מוגדר לפי רצף או מארז ה •

. בקרבת מקוםDNA-בקרה וגורמים לפרימה מוגבלת של ה

.הליקאז מגויס לאתר הפרום וממשיך להפריד את הגדילים הישנים מנקודת המוצא ועד נקודת הסיום •

. כך נוצרים שני מזלגות שכפול. החדש מתקדמים מהמוצא בשני כיוונים מנוגדיםDNA- ופלמור הDNA-פרימת ה •

. החדשDNA-א מהם גבעול הורי שטרם השתכפל וזרועות בת בהן נוצר ה"אלה מבנים דינמיים שבכ

סינתזה . למרות הקוטביות המנוגדת, זמנית בכיוון כימי אחיד- החדשות צומחות בוDNA-שתי שרשרות ה •

. מקוטעת של אחת מהן מאפשרת זאת

• Primase מאפריימר את הגדיל ההמשכי ואת פיסות האוקאזאקי בעזרת קטע RNAקצר ש -DNA polymerase

. DNA-פריימר זה מסולק בהמשך ומוחלף ב. מאריך

. DNA Lygase הסמוכים מאוחים זה לזה באמצעות DNA-קטעי ה •

• SSB - חלבון קושרDNAמונע את קיפולם או הכלאתם זה לזה , מגן על גדילי התבנית החשופים- גדילי - חד

. ומרתק חלבוני שכפול נוספים לזירה


41 2008' סמסטר ב

פרימת הגדילים ההוריים ללא הפרדתם עלולה לסבך את הזרועות הבנות וליצור פיתולי על חיוביים בגבעול •

.טופואיזומראזות מונעות זאת. ההורי

. פסיבית או באורח מבוקר, בתום השכפול מתמזגים מזלגות שכפול הנעים זה לקראת זה •

השלמת השכפול בקצוות כרומוזומים קוויים דורשת פתרונות ייחודיים כמו אופן תחזוקת קצוות הכרומוזומים •

של RNAאנזים הכולל תבנית – י טלומראז "הם בנויים מרצפים פשוטים חוזרניים המסונתזים ע. האויקריוטיים

. הרצף החוזרני

מוצאי שכפול ולפריקונים

שיש בה יחידת ציס , יחידת שכפול אוטונומית- רפליקון

(replicator) שהוא מוצא השכפול וגורם טראנס המפעיל אותו

(. Initiatior)ומבקר את מוצא השכפול

השכפול היה תלוי בשני –ים שהשתכפלו בחיידק באופן אוטונומי 'נמצא כי בבקטריופאג

:אלמנטים

(שנמצא על כרומוזום החיידק)אלמנט שפועל בציס .א

.(אלמנט שפועל בטרנס אפשר לספק אותו ממקום אחר .ב

פלסמידים ונגיפים להם מוצא שכפול , ארכאה, מודל זה מתאים לשכפול גנומי חיידקים

.יחיד

. אך באאוקריוטים כרומוזמים רבים ובכל כרומוזום מוצאי שכפול רבים

(טרם השתכפלה)ניתן לראות שבגדיל אחד חלק מהזמן השרשרת בודדה - משמאל

יש כמה בועות שכפול בכל . אלו איזורים שהשתכפלו–וחלק מהאיזורים נראים כבועות

. משוכפלDNA-הבועות הולכות ומתקרבות זו לזו עד שכל ה. גדיל

.ולא כל מוצאי השכפול יחד, replicator-מן הסתם רק איזור אחד מקודד ל

. נ לא ניתן לדבר על שכפול אוטונומי"ככה- בין מקטעים שונים שהשכפול הוא מסונכרןמכיוון

.י מוצאי שכפול משלהם מכונים רפליקונים"גם מקטעי כרומוזמים שנשלטים כל אחד ע- באאוקריוטים

, למשל בשלב העוברי יש הרבה מוצאי שכפול פעילים. אלא מותנים, מוצאי השכפול באאוקריוטים הם לא תמיד פעילים

באלל הפעיל מוצא שכפול פעיל והאלל הלא פעיל משוכפל באופן פיסיבי בעזרת –או כאשר יש אלל פעיל ואלל לא פעיל

.גורם שמגיע מאיזור מרוחק


42 2008' סמסטר ב

ניסוי המדגים ריבוי מוצאי שכפול ושפכול דו כיווני

DNA בתאי אוגר סומן בתימידין רדיואקטיבי (3H) ב-pulseקצר .

לאחר מכן מסלקים את התימידין . DNA-התימידין החם מסמן את ה

החם ומוסיפים תימידין קר בעודף שהולך ומחליש בהדרגה את הסימון

. ומתחו את הסיביםDNA-לאחר מכן בודדו את ה. החם

. והוא מאפשר מעקב אחרי פרקורסור מסויםpulse-chaseהניסוי מכונה

שני מוצאי שכפול עם מזלגות שכפול שמתקדמים לכיוונים מנוגדים ועומדים להיפגש , משמאל אנו רואים שני רפליקונים

. באמצע

בקטע הלא מסומן . DNA-וכייון הדעיה הסגיר את כיוון צמיחת ה, בעקבות הסופת התימידין הקר דעך הסימון בהדרגה

.כיווני- ששוכפל לפני שסימנו בתימידין חם ובמרכזו מוצא השכפול הדו DNAבתווך מצוי

? תופעה מאוחרת–ריבוי מוצאי שכפול באוקריוטים

. תחילה חשבו שארכיאה וחיידקים קרובים אבולוציונית כי להם יש מוצא שכפול יחיד

שונה ואוקריוטים מוצא אבולוציוני משותף אה והאיערכות השכפול של הארכלמ, מאידך

. החיידקימהמקור

ייתכן . מהארכיאהאויקריוטים סביר לכן שריבוי מוצאי השכפול החל לאחר היפרדות האו

עם התפתחות המארז הכרומטיני שאפשר מצדו גידול משמעותי של ושריבויים החל

. הגנומים האויקריוטיים

נוכחות כרומטין וגידול הגנום יכלו להאט את קצב השכפול אך ריבוי המוצאים פתר בעיה

. (אחרת התאים לא היו מצליחים להתרבות בקצב מספיק מהיר) זו

הפעלת מוצאי שכפול

שכפולDNAאו אופן אריזת ה/ נפתח מאתר המוגדר על פי רצף ו-DNA .

הם מזהים את אתר המוצא וגורמים לפרימת . אחראים לכך חלבון או חלבוני בקרה ייחודיםDNA (unwinding)

. ראשונית בקרבת מקום

יש בקרה . פעילויות אלה מלוות בשינויים מיידיים המונעים שכפול נוסף מאותו אתר באותו מחזור חלוקת תא

.קפדנית על מוצא השכפול ואנו מנטרלים את מוצא השכפול עד לסיום מחזור השכפול

עד היום לא ידועים הרצפים שמגדירים מוצאי שכפול


43 2008' סמסטר ב

E.coliשל (OriC)הפעלת והשתקת מוצא השכפול

ב- E.coli 245 קטע בןbp מהווה מוצא שכפול יחיד (OriC) ובו מספר אתרי קישור לחלבון DnaA שגורם

. יפעל בחלון זמן צר במחזור התאDnaA. בסמיכות מקוםלפרימה ראשונית

ארכיטקטורה"חלבוני ה "IHFו -FISנקשרים גם הם ל -OriC . IHF מעודד קישור DnaAוהפעלת המוצא ,FIS

.מעכב אותם

למניעת שכפול חוזר בטרם עת

GATCתורם גם ריבוי רצפי

. מהממוצע בגנום~ 13שכיחותם בו גדולה פי . OriCב (מסומנים בכוכביות אדומות)

האנזיםDam ממתל רצפי GATCזמן קצר לאחר שכפולם אך שכיחותם ב -OriCכל עוד הם . מעכבת זאת

החדש עוד DNA- יש חלון זמן בו ה– חדש DNAכל פעם שנוצר . OriC- ממותלים לא ייפתח שכפול נוסף מ-חצי

, מוצא השכפול נותר ממותל למחצה למשך תקופה מסוימת–בגלל ריבוי הרצפים במוצא השכפול . לא ממותל

. וכך יודעות המעררכות שעוד לא הגיע הזמן להתחיל מחזור שכפול נוסף

תיקון שגיאות

קומפלמנטציה אך עליה לדעת מי הגדיל הנכון - מערכת התיקון רואה חוסר–כאשר יש טעות בשכפול ונכנס בסיס פגום

. Dam בזכות מתילציות שמבצע –מערכות תיקון מזהות את הגדיל החדש כגדיל הלא תקין . (השגוי)ומי החדש (הישן)

הפרימה הראשונית מגייסת הליקאז שימשיך את הפרימה

נכרך סביב לליבת ההיסטונים בקצת יותר מפיתול על DNA-ה- כפי שציינו

מה שמעודד – להיכרך סביבו בפיתול על חיובי DNA- גורם לDnaA. שלילי

יש קשר בין פיתולי על שליליים –יצירת פיתולי על שליליים בקרבת מקום

. לפרימה

DnaAפרון ' מגייס את הצDnaC ההליקאז הטוען מצדו אתDnaB על

. DNA-תבנית ה

יש דמיון בין חיידקים לארכיאה ואאוקריטים

בחיידקים replicator( DnaA- נקשר ל Initiatorחלבון .1

.( באאקוריטיםORC-ו

MCM- בחיידקים וDnaB). מתרחש גיוס הליקאזות .2

(באאויקרוטים

סייעו להליקאזות /חלבונים שגיסו את ההליקאזות .3

.ניתקים ממוצא השכפול


44 2008' סמסטר ב

שיבוט מוצא שכפול

נוכל להעתיק אותו ממקומו –אם מוצא השכפול הוא רצף מוגדר

לשתול אותו בקטע אינרטי שלא יודע להשתכפל ולסגל , הטבעי

. האינרטי יכולת שכפולDNA-לקטע ה

ונחבר אותו בשיטות הנדסה גנטית לקטע גן אנושי OriCניקח

. שאנו מעויינים ליצור בחיידק

שיכול לעבור שכפול OriC גן עם – כל מוצא שכפול ייחודי למין

. בחיידק לא יוכל לעבור שכפול בשמר

. המקנה יכולת שכפול אוטונומית בפונדקאי מתאים המינימלי DNA-הניתן להגדיר מוצא שכפול כקטע

. יונקישכפול עד כה לא שובט מוצא . לא תמיד ניתן לזהות מוצא שכפול על ידי שיבוט

.לא כל רצף משובט המקנה יכולת שכפול אוטונומית פועל כמוצא שכפול באתר המקורי, כמו כן

לכן נחוצות שיטות לזיהוי מוצאי ייתכן גם שרצף יתפקד כמוצא שכפול רק בשלב התפתחות או במצב פיזיולוגי מוגדר

. שכפול פעילים בסביבתם הטבעית

שתי שיטות לזיהוי מוצא השפכול

(DNA-אתר תחילת הסינטזה ב)מיפוי מוצא השכפול . 1

מתחלף תפקיד כל גדיל הורי –בנקודת המוצא

. המשכית-תבנית המשכית לבלתימ

רציף מצד אחד DNAמנקודה זו מתרחשת סינטזת

. מהצד השניokazakiוסינטזת מקטעי

ננסה למצוא איפה - ברצף הגנומי של שמר

מקטעי –מהמרכז לימין , גדיל רציף–מהמרכז לשמאל - בגדיל העליון . השונות DNA-מתחילה סינטזת שרשראות ה

okazaki . הגדיל הרציף צומח מימין ומקטעי ה, בדיוק להיפך–בגדיל התחתון-okazakiצומחים משמאל .

.בנקודת החילוף, נמצא במרכזARS-ה, מכאן שנקודת המוצא של השמר

.בשיטה זו אפשר לבדוק רק מוצא שכפול אחד: החיסרון

מימדית-זיהוי מוצא שכפול באלקטרופורזה דו. 2

. השיטה הזו מאפשרת בחינת כמה מוצאי שכפול בבת אחת

נבחן האם הרצפים פעילים כמוצא . ARSj- וARSiלקחו גנום מתאי שמר שעוברים שכפול ובוחנים שני מוצאי שכפול

.שכפול גם באתר המקורי

שעובר שכפול בעזרת אנזים DNA-חותכים את ה

בנקודת זמן המסוימת הזו החיתוך יצר מספר . הגבלה

:מקטעים שונים באופיים


45 2008' סמסטר ב

B - בועת שכפול

L –גדיל לינארי שעוד לא עבר שכפול או שסיים שכפול

Y –מכיל מזלג שכפול אחד, גדיל במהלך שכפול.

. ל אלקטרופורזה'כל אחד מסוגי המקטעים נע באופן אחר בג

(הן שונות בגודלן זו מזו)ל 'מולקולות עם צורת בועית נעות במין אלכסון על הג.

מולקולות בצורת מזלג(Y) ל'נעות במעין צורת גבעה על הג.

מולקולות לינאריות(L) ל'לא מתעכבות בנדידה ומגיעות כולם לפינה הימנית התחתונה על הג.

נסמן רדיואקטיבית גלאי שיעבור היברידיזציה עם המקטע –מכיוון שאנו רוצים לראות איזור מסוים בגנום

.הנבדק

רק את )ולא נקבל את האלכסון היורד , לא יהיו בועות שכפול, אם המקטע הנבדק אינו מכיל מוצא שכפול

.(הגבעה והכתם בפינה הימנית התחתונה

השמריrRNAמסרק מולקולארי מזהה מוצאי שכפול פעילים באתר . 3

בגנום השמר יש איזור שמקודד לכמה מאות

עותקי גן 200-כ, rRNA-חזרות של הגן ל

. שמופיעים זה אחר זה

. (ליד חלקם יש מוצאי שכפול) רצפים חוזרניים –ובאדום , התקדמות השפול–בירוק

. ונרצה לבודד את האיזור כדי לבדוק, מוצאי שכפול פוטנציאליים200- כלומר כ– ARSבתוך הרצף החוזרני הזה יש

של השמר באנזים הגבלהDNA-נעכל את כלל ה: מהגנום הכללי של השמר נבודד בשיטה פשוטה DNA-את מקטע ה

שאר הגנום של השמר יפורק . הגנים יישאר שלם200כלומר כל האיזור הענקי של , מסוים שלא מכיר את הרצף החוזרני

.rRNA-וכך נישאר עם המקטע שמכיל את ה

י גלאי אדום "היחידות החוזרות זוהו ע. DNA-מאפשר לאמוד מרחקים ב נמתח על שבב הrRNA-את המקטע המקודד ל

מהם נפתח השכפול סומנו בפעימה קצרה עם אנלוג נוקלאוטיד DNAמקטעי בעוד ש. ריבוזומליRNA-משלים רצף בגן ה

.התלכדות הסמנים נראית בצהוב. (כ בעזרת נוגדנים בצבע ירוק"וניתן לזהות אותו אח, יש לו ברום באחת העמדות)

. פעלו כמוצאי שכפולARSשרק חלק מרצפי נומהתוצאות למדכלומר , מקומות2-בפועל רואים שהשכפול מתחיל רק ב

. מקומות2-בפועל רואים שהשכפול מתחיל רק מ. נפתח השכפול

הפעלה מותנית של מוצאי שכפול אאוקריוטים

ביצורים מפותחים משתנה דגם הפעלת מוצאי השכפול במהלך

. ההתפתחות ובין מצבי התמיינות שונים

גן הגלובין , לדוגמה)גנים מתבטאים משוכפלים מוקדם יותר במחזור החלוקה מאשר גנים מושתקים , למשל

. (ברטיקולוציטים לעומת תאים שאינם מבטאים אותו

באותו תא ישתכפל אלל פעיל לפני האלל המושתק


46 2008' סמסטר ב

FISHקביעת עיתוי השכפול בעזרץ

. בשיטה זו ניתן להבחין בעיתוי השכפול הנבדל של אלל מתבטא לעומת האלל המושתק

. משתכפל קודם האלל הפעילכ"בדע

. בנקודת זמן מתאימה הוא מופיע ככתם כפול והמושתק ככתם בודד

מכילים )גלאים ברי צביעה מתאימים לגן המבוקש מכינים תאים על זכוכית נושאתיםקבעמ: מהלך הניסוי

ם נוגדנים מדגירים ע הכרומוזומליDNA-הגלאים ל מכליאים את (י נוגדנים"נוקלאוטידים מותמרים מוכרים ע

.ינטסבמיקרוסקופ פלור וצופים ת הסיגנל באמצעות נוגדן שני צבעוני מגבירים א תואמים


במקרה זה הרפליקון הוא יחידת שכפול עצמאית . מודל הרפליקון המקורי התבסס על גנום בו מוצא שכפול יחיד

.בה רצף מוצא שכפול הפועל בציס וגן בקרה הפועל בטרנס

בשל ריבוי מוצאי השכפול בגנומים אויקריוטיים הורחב מושג הרפליקון והוא מתייחס גם לקטעיDNA הנשלטים

.י מוצא שכפול משלו"א ע"כ

מוצא שכפול הוא האזור ממנו נפתח השכפול וגם רצף ה-DNAלרצף זה נקשרים . המינימאלי הנחוץ לפעולה זו

.גורמים לפרימה התחלתית ומגייסים חלבונים נוספים לזירה, חלבוני בקרה

דרך אחת היא בידוד קטע ? איך לאתר מוצאי שכפולDNA מינימלי המקנה לקטע DNA כלשהו יכולת שכפול

נגיפים , פלסימידים, כך זוהו ואופינו מוצאי שכפול בחיידקים. אוטונומית באורגניזם ממנו בודד אותו קטע

.ובשמרים אך לא ביונקים

דרך אחרת היא מיפוי גנומי של קצוות שרשרותDNAבדרך זו ניתן . צעירות שסונתזו בשלב מוקדם בשכפול

. כיווני-לקבוע את הנקודה בה משתנה יעוד של גדיל הורי מתבנית המשכית לבלתי המשכית במוצא שכפול דו

שיטת המסרק המולקולרי , משתכפלDNAשיטות נוספות שנסקרו כוללות אלקטורפורזה דו מימדית של קטעי

שיטות אלה מאפשרות לזהות מוצא שכפול אותנטי הפועל בסביבתו . לקביעת עיתוי שכפול גניםFISHושימוש ב

.הטבעית

הפעלת מוצאי שכפול פוטנציאליים של יצורים אויקריוטיים מותנית במצב התפתחות או התמיינות.

רפליזום

(replisome)מכלול חלבוני מזלג השכפול מכונה רפליזום

ולם אפשר להתרשם מקיומו על סמך מיקומם התאי של חלבוני א, הזיקה בין מרכיבי הרפליזום רופפת ולא ניתן לבודדו

. שכפול שונים במוקדים משותפים

, טופואיזומראז, (רפליקאזות) פולימראזות שכפוליות DNA, פרימאזSSB ,DNA, נציגי רפליזום בולטים הם ההליקאז

. ליגאזDNAנוקלאזות שונות ו


47 2008' סמסטר ב

הליקאזות

. גדיל-אלא בכל מקרה שבו עלינו לפרום דו, הליקאזות פעילות לא רק בשכפול

,תיקון ,הן חושפות תבניות לשכפול. RNA:DNAגדיליים או מכלואי - דוRNAקטעי , DNAזות פורמות אהליק •

. מקופלות כדי לאפשר את עיבודן או תרגומןRNAכמו כן הן פורשות מולקולות , רקומבינציה ושעתוק

לשם חילופי , (בשכפול)גדילי לשם פרימתו -דו DNAלפעמים משמשות הליקזות כמשאבות המזרימות דרכן •

. בחלקיק נגיףDNAאו לאריזת (ברקומבינציה)גדילים

.ז מושכת גדיל אחד ומפרידה אותו מהנגדיאהליק •

.ATPי הידרוליזת "האנרגיה הנחוצה לכך מסופקת ע •

.פגמים מולדים מסוימים נובעים מחוסר בהליקאז חיונית. תאים מכילים עשרות עד מאות הליקאזות שונות •

מבדק לפעילות הליקאזות

-ננסה להפריד את קטע ה. קצרDNA גדולה ונצמיד לה קטע DNAניקח תבנית

DNAאם מקטע ה. מהתבנית-DNAומכיל עדיין את , מסומן רידואקטיבית

.ל' הוא ירוץ יותר לאט ונראה אותו גבוה יותר על הג–המקטע הקצר עליו

(. 5- ל3- או מ3- ל5-מ)קיימים שני סוגי הליקאזות שפורמות בשני כיונים שונים

. גדילי- חדDNAההליקאז יכולה לנוע על

בעזרת . (עליו ההליקאזות יכולות לנוע בשני הכיוונים) סובסטרט שבו גדיל אחד –משמאל

.הניסוי המתאים אפשר לקבוע באיזה כיוון פורמת ההליקאז את הגדיל

נזכור שהליקאז פורם את הגדילים אבל לא מפרק קשרים ולכן יש לנו צורך בטופואיזמרזות

הלקיאזות שכפוליות

פורמות אתDNAהורי במסעף המזלג .

יחידות המקיפה את אחד או שני גדילי ה- תת6בנויות כטבעת בתDNAומושכת את הגדילים .

חוברות שתי טבעות משושות אוקריוטים בארכאה וא. אחת למזלג, בחיידקים מוטענות טבעות אלה בנפרד

.זמנית שני מזלגות הנובעים ממוצא משותף- שפורם בו(dodecamer)לתצמיד תריסרי


48 2008' סמסטר ב

( גבי קאופמן6)– הליקאזות

מבדק לפעילות הליקאז

קצר מוסמן DNAמצמידים לו קטע , מולקולרי-לוקחים סובסטרט מעגלי חד גדילי גבה

. שההליקאז אמור להפריד

. המעגלי שינדוד מהרDNA-לעומת ה, הקטע החופשי הקצר ינדוד לאט

. וכך נראה שאכן ההליקאז עובדת, ל'לשתי המולקולות אופן ריצה שונה על ג

. 5- ל3- ואחרות מ3- ל5-יש הליקאזות שעובדות מ

מבנה ההליקאז

הטבעת יכולה להקיף גדיל אחד או שני גדילי . תת יחידות6להליקאז מבנה טבעתי שבנוי מטבעת בת

DNA . טבעות צמודות 2באאוקריוטים ובארכיאה יש (תת יחידות 12כ "סה dodecamer) שלא

. זמנית שני מזלגות הנובעים ממוצא משותף-גדיל ופורם בו-מעין קומפלקס שעוטף דו, נפרדות

חיידקים לעומת אאקריוטים וארכאיה – כיווני פעולה מנוגדים של הליקאזות שכפוליות

DnaG והפרימאז הוא DnaBההליקאז הוא – (מימין) בחיידקים

שמושכת את הוא טבעת DnaB. (הוא עוקב אחרי ההליקאז)

. 3- ל5-היא פועלת מ – התבנית הבלתי המשכית

MCMההליקאז האאוקריוטי מכונה - (משמאל) באאוקריוטים

. 5- ל3-כי הוא עובד מ, מושך את גדיל התבנית ההמשכיתוהוא

7T' מודל חיידקי של הליקאז מתוך פאג

(. DNA-הבורג הוא גדיל ה)המבנה של ההליקאז הוא טבעת והיא נעה כמו אום על בורג

2יחידות של ההליקאז יש - התת6-בכל אחת מ. ההליקאז נע על התבנית הבלתי המשכית

אונה אחת היא ההליקאז והאונה השנייה היא . קומות שמצויות באותה שרשרת פוליפפטידית

. הפרימאז

. TTPaseההליקאז הוא . שני דומיינים של אותו פוליפפטיד, ההליקאז והפרימאז צמודים– זהו מקרה יוצא דופן

תת יחידות קושרות 6כל , ההליקאז פועל כטבעת משושה

. מהן מפרקות אותו3אך רק , נולקאוטיד

, גם כאן מדובר משאבה סיבובית– ATP synthaseהמנגנון מזכיר

. דרך המשאבהDNAאך הפעם הוא מאפשר לשאוב גדיל , מעין מנוע

. מתת יחידה קטליטית אחת לזו שאחריה, מטייל מיד לידDNA-ה

– להליקאז יש אינטרקציות עם חלבונים נוספים של מזלג השכפול

DNA polymerase ,SSBוכיוב '.


49 2008' סמסטר ב

40SVמודל של הליקאז אאוקריוטי מתוך נגיף

-Tכ שחצי מהבסיסים שלו מקודדים לחלבון רגולטורי אחד " הוא קטן כ40SVהנגיף

antigenהחצי השני של הגנום מקודד לחלבוני . הבנוי מצמד טבעות משושות

. המעטפת של הנגיף

, אחת מהן מזהה את מוצא השכפול, קומות3 יש T-antigenבכל טבעת של

ושתי האחרות משמשות Initiator( OBD –Origin Binding Domain)-משמשת כ

. כהליקאז

(הסגולה)גדיל והטבעת האמצעית -שואבת פנימה דו (הורודה)הטבעת החיצונית

. המשכית-מושכת את גדיל התבנית ההמשכית ובאופן פסיבי נפרם הגדיל של התבנית שאינה– פורמת את שני הגדילים

כ קטן שצריך לקודד לחלבון אחד שימלא הרבה "הגנום הנגיפי כ. וההליקאז התאחדו באותו חלבוןInitaior-תפקיד ה

. (מטעמי חיסכון)תפקידים

כדי שישכפל Sהנגיף שואף להכניס את התא לפזאת – כשהנגיף מדביק תא : יש גם תפקידי בקרהT-antigenלחלבון

ולכן – שמונעות מהתא להיכנס למחזור התא (tumor suppressing)הנגיף סותר את הבקרות התאיות . את הגנום שלו

. (במכרסמים הוא גורם לגידולים סרטניים) יש לנגיף זה תכונות מסרטנות

לעתים נראה כאילו שני מזגלות השכפול מתרחקים . OBD- origin binding domainהן – (הכחולות)האונות הפנימיות

. שתי ההליקאזות צמודות זו לזו פיזית ואינן מתרחקות זו מזו במהלך השכפול, אך בפועל השכפול מתואם– זה מזה

. כאשר בתוך ההליקאז יש חלל גדול שם נפרם הגדיל, בתנועה סיבוביתDNA-האונה החיצונית שואבת פנימה את ה

מתחילה ATPוכאשר יש פירוק, יש פרימה התחלתית– ATP ועוד לא מפרק DNA-כאשר החלבון נקשר ל

. גדיל אחד נמשך אקטיבית וגדיל שני משוחרר פסיבית. והפרדה אקטיבית של הגדיליםDNA-השאיבה של ה

. כיוונית-המשאבה היא מעין משאבה דו– משני הצדדים נשאבים הגדילים

זה תפקידו של , לא מזהה את מוצא השכפול MCM-רק ש– (ההליקאז באאוקריוטים) MCMבאופן דומה פועל גם

ORC .

. הגדילים שהופרדו יוצאים מתוך סדקים שמרכיבות את תת היחידות של הטבעת

. הפוך למצב בחיידקים – קודם משתחררת התבנית הבלתי המשכית

הוא דווקא זה leadingכי הגדיל המוביל , אינה נכונה כאן למעשהlagging strand- וleading strandהנומנקלטורה של

. וזה שישתחרר שני, הקבור עמוק בתוך ההליקאז


50 2008' סמסטר ב


הן . DNA או RNAגדיליות ומתפקדות במסלולים שונים בהם מעורבים -הליקאזות פורמות חומצות גרעין דו •

(. ATPכ"בד)מושכות אחד הגדילים על חשבון הידרוליזת נולקאוטיד

. אך לא שניהם, או להפך'3'5, לכל הליקאז כיוון תנועה מוגדר •

הליקאזות שכפוליות הפועלות במסעף המזלג בנויות כטבעות הקסמריות המושכות דרכן אחד מגדילי הדופלקס •

.ATPח אנרגית פרוק "ע

. בחיידק על הבלתי המשכית, אאוקריוטים הן פועלות על התבנית ההמשכית/בארכיאה •

בחיידק נטענת כנראה כל אחת מהטבעות בנפרד אך סביר שקיים תיאום . לכל מזלג שכפול טבעת הליקאז משלו •

. כלשהו ביניהן

הורי ומשחררת DNAמשאבה זו מושכת פנימה . אאוקריוטים נטען צמד טבעות הפועל כמשאבה כפולה/בארכאה •

.תחילה את הבלתי המשכית, גדיליות בתווך-תבניות חד

DNA polymerase

DNA polymeraseהאנזים מבצע . הוא סוס העבודה של מערכת השכפול

. DNA ופריימר על תבנית של dNTPsבנוכחות DNAסינטזה של

פוספט משני +הוא מפריד בין הנוקלאוזיד, dNTPs-הסובסטרט שלו הם ה

. אורגניים-המשוחררים לאחר מכן יתפרקו לשני פוספטים אי (פוספט-פירו)שני הפוספטים . הפוספטים האחרים

DNA polymerase לפריימר 3פספט לקצה +מוסיף את הנוקלאוטיד - אסטרי-יוצר קשר פוספו RNA/ גדילDNA .

של קצה השרשרת הצומחת והופך אותו לנוקלאופיל שתוקף את פוספט אלפא OH'3-האנזים נוטל פרוטון מ- המנגנון

פירוק . אסטרי חדש תוך שחרור שייר פירופוספאט-כתוצאה נוצר קשר פוספו. של הנוקלאוטיד הנכנס (הפוספט הראשון)

. י פירופוספטאז מטה את שווי המשקל לכיוון הפלמור"הפירופוספאט לפוספאט ע

מלווה גם בשינוי קונפורמציה שחרור הפירופוספאט מהפולימראז

. בתבניתשמקדם את האנזים לעמדה הבאה

. צבעוני/ ניתן לעקוב אחרי הראקציה באמצעות סימון רדיואקטיבי

DNA polymerase-מבנה ה

מבחינים בשלושה איזורים פונקציונליים – לרוב הפולימראזות מבנה של כף יד ימין

. אצבעות וכף היד עצמה, אגודל

עובר שכפול וחלק DNAבו קטע – בתוך כף היד מקנן האתר הקטליטי

. מהתבנית עליה מתפלמר הגדיל החדש

האצבעות לגייס את ותפקיד , גדיל שנוצר-האגודל הוא החלק שמהדק את הדו

לפי זיווג בסיסים ) החדש ולהתאים אותם לבסיס הבא בתבניתdNTPs-ה

.(קריק-ווטסון


51 2008' סמסטר ב

באתר קטליטי יש זוג יוני מגנזיום, בכף היד

והם האחראיים על - 3.9A– (1כגון אינטרון )שנמצאים זה מזה בדיוק באותו מרחק כמו בריבוזים (ערכית-מתכת דו)

והשני מייצב את מצב המעבר ואת קבוצת , וגורם לפרוטון לעזוב3'יון אחד משפעל את חמצן . הקטליזה של הראקציה

'5-O י חומצות אמינו בסיסיות באתר "הייצוב של מצב הביניים מתבצע גם ע. (מסייע לפרוטון לעבור אליה) העוזבת

.הקטליטי

גורם )מה שמונע בלבול ודילוג על בסיסים , מעלות90-פוספט ב-יש כיפוף של שדרת הסוכר - כדי למנוע מוטציות חסר

. כך מוגש הבסיס הנכון ולא מתרחשת מוטצית חסר, (לבחירה הנכונה של בסיס התבנית

dNTP- לNTPהפולימראז יודע להבדיל בין

היה מתנגש 2בעמדה OH-ה - NTPלו היה נכנס לכיס , dNTPהכיס אליו נכנס הגדיל החדש מותאם במיוחד לגודל של

.בחומצות האמינו שמרכיבות את הכיס

".כף"אפשר להפעיל את אתר ה– (האצבעות יצרו זיווג נכון)אם זיווג הבסיסים הוא תקין

ואז הפולימראז היה יכול להתבלבל ולא היה , כך שלא תתרחש התנגשות, כיום אפשר לשנות את חומצות האמינו באתר

. dNTP- לNTPמבחין יותר בהבדל בין

זיווג בסיסים נכון

יידחק , הנוקלאוטיד לא יתאים לכיס- כאשר מתרחש זיווג שאינו נכון

. החוצה ולא תהיה אפשרות לפלמר

קריק -אפשר ליצור קשרי ווטסון– באמצעות אנלוגים מסוימים

כך שאמנם , כ הם לא ממלאים אחר תנאים אחרים"אך אח, מדומים

לכן הם מעכבי . אך הם תוקעים את הפולימראז DNA-הם נכללים ב

DNA ויראליות-סרטניות או אנטי-פופולריים המשמשים כתרופות אנטי .

י פולימראזות הומניות ולכן יכולים לשמש "י פולימראזות ויראליות אך לא ע"לפעמים הנוקלאוטידים מוכרים ע

. כתרופות


52 2008' סמסטר ב

DNA polymeraseאבולוצית

ערכיים -לכולם אותם אלמנטים פונקציונליים יחד עם היונים הדו, תבנית יד ימין מאפיין פולימראזות ממשפחות שונות

? האם מדובר באבולוציה מתכנסת או שהיה מקור אבולוציוני משותף. המשמשים כקטליזטורים

שבהדרגה , ריבוזימיRNA polymeraseי חיקוי הדרגתי של "אחת ההיפותזות האבולוציוניות היא שהחלבונים נוצרו ע

. כל הפולימראזות שימרו את אותו עיקרון מבני אך כל אחת בדרכה שלה. י מרכיבים חלבוניים"הוחלף ע

proofreading– מערכת ההגהה

למשל , חלות טעויות בשכפול– למרות יכולת ההבחנה של הפולימראז

או כאשר הבסיס נמצא במצב , התמרה כימית/בסיס לא נכון נכנס עקב נזק

. טאוטומרי נדיר שמאפשר זיווג לא נכון

מערכת התיקון של הפולימראז עצמו יודעת להבחין בטעות ולסלק את

חלבון שיודע לכרסם – exonucleas, אתר אנזימתי נוסף, אתר הגההשכן בפולימראז יש תת יחידה של , הנוקלאוטיד

. ורק אם הוא שגוי, יוריד נוקלאוטיד אחד exonuclease–בכל פעם . 5- ל3- מDNAקצה של

. יחידה עצמאית- יכול להימצא במתחם שונה באותו פוליפפטיד או בתת5'3'אתר האקסונוקלאז

לאתר הקטליטי , ולאחר התיקון הגדיל חוזר למקום הנכון, חד הגדיל הלא נכון יורד לאתר ההגהה– כאשר נוצר זיווג שגוי

. שבכף היד

פנוטיפ מוטטורי

שקצב המוטציות שלהם גדול ' וישנם מוטנטנים של הפאג, 10-6 ראו שיש ששיעור המוטציות הוא בתדירות של 4T-ב

הופר . DNA polymerase-ונמצאו מוטציות ב, בדקו את הגנוטיפ שיוצר את הפנוטיפ הזה. (1:10-4)בשני סדרי גודל

: אפשרויות2יש . האיזון בין הפולימראז לאתר ההגהה

העלנו את שיעור – אם פגענו ביכולת להסיר שגיאות . באתר ההגהה, exonuclease-מוטציות באתר ה .א

המוטציות

ניתן להשפיע על . אך חלק מהמוטציות התמפו לדומיין של הפולימראז, האתר הקטליטי של האנזים לא נפגע .ב

. יכולת ההגהה אם משפיעים על נטיית הפולימראז לשלוח את הקצה השגוי לאתר הגהה

.אך יש צורך שהדומיין המפלמר של הפולימראז תשלח אותו לשם, מבצעת את התיקון בפועלexonuclease-ה

כל מוטציה שתפגע בחלבון שקשור . אפשר לפגוע ביציבות הגנום בדרכים רבת, לפונטיפ המוטטורי השלכות רבות

. יכולה לגרום לפנוטי מוטטורי- או להולכת אותות במערכת השכפול והתיקון DNAלתיקון , DNAלשכפול

חלק מהמוטציות יכולות לתרום – תא ששיעור המוטציות שלו גדל . הפנוטיפ המוטטורי הוא מאיץ של התהליך הסרטני

. להתפתחות תהליך סרטני

גורמות לפולימראז להיות יותר – שמשפרות את יכולת ההגהה – מוטטוריות -מוטציות אנטי' קיימות בפאג– מאידך

. אך למוטנטים אלה אין יתרון על זן הבר והם לא שורדים בתחרות חופשית, מדויקת


53 2008' סמסטר ב


• DNA polymerase י נגיפים רבים"מצויות בכל תא חי ומקודדות גם ע.

. של הגדיל הצומחOH' 3פוספט מפרקורסור טריפוספטי לקצה -5'הן מעבירות בזה אחר זה שיירי נוקלאוזיד •

מוכלא לגדיל משלים שחלקו החופשי משמש (פריימר- גדיל התחל )ראקציה זו מתבצעת כאשר הגדיל הצומח •

. תבנית לפלמור משלים

. קריק לנוקלאוטיד הראשון בתבנית-הנוקלאוטיד החדש מותאם בזיווג ווטסון •

פרוק מיידי של פירופוספט משתחרר מסיט את שיווי המשקל לכיוון הביוסינתטי ומזיז את האנזים כלפי העמדה •

.הבאה בתבנית

.תפקודי דומה שמקובל לתארו ככף יד ימין-רבות משותף ארגון מבני DNA polymerase-ל •

אם הנוקלאוטיד החדש "בוחנות"האצבעות , במבנה זה לופת האגודל קטע של התבנית וקצה הגדיל הצומח •

אסטרי -תואם לנוקלאוטיד התבנית והכף תורמת את אתר שני יוני המתכת המזרז את יצירת הקשר הפוספו

.החדש

- המרחיקה שיירי נולקאוטידים לא' 5 3'סמוך לאתר הפולימראז נמצא אתר הגהה בעל פעילות אקסונוקלאז •

.תואמים שנכללו בטעות

משתתפות בשכפול DNA polymerase-רק אחדות מה

אחת בשכפול גנום , מהן שלוש מעורבות בשכפול הגנום הגרעיני, DNA polymerase 12יש לפחות - באאוקריוטים

. או מוטגנזה/המיטוכונדריון והיתר בתיקון ו

אחת ממלאת בו תפקיד עזר והשאר מתמחות , אחת חיונית לשכפול, DNA polymerase 5יש לפחות – בחיידקים

. (לפעמים יוצרות תיקון לא מדוייק)בתיקון

בתגובה לאנטיגן חלות מוטציות נקודתיות בגן - למשל במקרה של מערכת החיסון – מוטציות לפעמים נחוצות

DNAבמקרה זה מעורבות. לרצפטור או לנוגדן שמגבירות את הגיוון של הנוגדנים ואת האפיניות שלהם לאנטיגן

polymeraseשבכוונה מכניסות מוטציות .

DNA polymerase 1 של E.coli –בעל תפקיד עזר בשכופל

DNA polymera1 של E.coliלעומת הפולימראז השכפולי ) אונות שונות 3שיש בו , הוא פוליפפטיד קטןDNA

polymerase3 תת יחידות שונות שרובן נמצאות בשני עותקים10לו יש לו ).

DNA polymerase 1ויש לו , חומצות אמינו900-בת כ, מורכב מתת יחידה קטנהexonuclease 35- ל ,

.3- ל5- נוספת שפועלת מ exonucleaseוכן

. ( שיירים3-200)והפרוססיביות נמוכה , ( שיירים לשניה16-20)קצב הפלמור שלו נמוך

לפולימראז שמשכפל מנקודת . מספר הנוקלאוטידים שהפולימראז מפלמר לפני שהוא ניתק מהתבנית – פרוססיביות

. אסור לו להתנתק, המוצא לנקודת הסיום צריכה להיות פורססיביות עצומה


54 2008' סמסטר ב

. 3- לexnocluease 5- והפולימראז ל5- לexonuclease 3– לא הצליחו להפריד בין שני הדומיינים

: הנוקלאזות מסביר את התפקיד של הפולימראז2קיום

מסיר את הפריימר וממלא את 3- לexonulcease 5-ה– DNA-בזמן הבשלת ה

אין צורך – בשביל הפעולה של הסרת הפריימר ומילוי מרווח צנוע . המרווח

.בפולימראז זריז או פרוססיבי

. י פולימראז זו"יוחלפו ע– פגומים באמצע הגדיל DNAגם קטעי

DNA polymerase 3 של E.coli –המשכפל העיקרי

מרחק של כשניים וחצי מיליוני – הוא נע ממוצא השכפול עד נקודת הסיום . משתכפל DNAזהו האחראי העיקרי לפלמור

. בפחות משעה מבלי להינתק מהתבנית אלא אם ארעה תקלה בשכפול- בסיסים

, DNA-זמנית את שני גדילי ה-יחידה קטליטית המאפשרים לו לפלמר במתואם ובו-עליו שני עותקים של תת

. ההמשכי והבלתי המשכי

מבנה

יחידות שונות וכמה מהן מצויות בו בשני - תת10 (Holoenzyme)לאנזים השלם

:קיימים שלושה הרכבים חלקיים, עותקים

. המכיל את תת היחידות (Core enzyme)אנזים הליבה .1

- העשוי משני עותקי תת(sliding clamp)המצמד הדינאמי או המחליק .2

.היחידה

פרון זה 'צ. DNA (Clamp loader)-פרון המטעין את המצמד על תבנית ה'צ .3

באנזים השלם קרי, (א מעותקי הליבה מצמד משלו"לכ)מגשר גם בין שני עותקי אנזים הליבה של האנזים השלם

.מצוי באנזים השלם רק בעותק אחד (Clamp loader)אך מטען המצמד היחידה -ישנם שני זוגות של תת

מתוך ה2/3מצמד מאפיינת גם -מצמד מחליק ומטען, חלוקה דומה לאנזים ליבה -DNA polymerase (רפליקאזות)

. של התאים האאוקריוטיים

Core enzyme- אנזים הליבה

. העדר רכיבים נוספים מגלה יכולת פלמור צנועהב- תת היחידה הקטליטית .א

. רכיב הליבה השני שמסיע לכושר הפלמור של , המגיה’ 3’5אקסונוקלאז - .ב

. או בין הליבה להרכבים החלקיים האחרים/מקשרת כנראה בין שני הרכיבים האחרים ו - .ג

לאנזים השלם שני עותקי אנזים ליבה אולם אנזים הליבה קיים בתא גם באופן עצמאי , כאמור

. ובכמה עשרות עותקים לעומת העותקים הבודדים של האנזים השלם

DNA polymerase 1יכול לגבות את כמו כן הוא . DNAאנזים הליבה החופשי פעיל בתיקון

ומגבה בכך את RNA-DNA אנזים המפרק Hהוא עושה זאת בשיתוף עם ריבונוקלאז . DNAקצוות בהבשלת

. שתפקידו להסיר את הפריימרDNA polymerase1 של '5'3האקסונוקלאז


55 2008' סמסטר ב

sliding clamp– המחליק /טבעת המצמד הדיאנמי

מקיפה את טבעת . הוא חלבון טבעתי שנוצר מהתלכדות שני עותקי תת היחידה

. גדילי- הדוDNA-ה

ניתן לראות ששתי תת היחידות יוצרות טבעת שקוטרה הפנימי גדול דיו כדי לאפשר

. לחלבוןDNA-גדילי כחישוק ואף להותיר רווח קטן בין ה-דו DNAלחלבון להקיף

DNA-לרתק את אנזים הליבה לתבנית ההוא תפקיד טבעת המצמד הדינאמי

-את הפרוססיביות הנחוצה לשכפול ה כך מקנה טבעת . DNA-ולאפשר לו לנוע לאורך התבנית עם פלמור ה

DNA.טבעת המצמד מרתקת . הפולימראז ניתקת מהתבנית עם תום הפלמור כאשר טבעת המצמד מוסרת מהתבנית

גם חלבוני שכפול נוספים וכן חלבונים DNA-לתבנית ה

. אחרים DNAהמתפקדים במסלולי מטבוליזם

(clamp loader)מטען המצמד

בצומת התבנית והגדיל DNA-ל ה עאחראי להטענת טבעת

את הוא מסיר גם את הטבעת מהתבנית לאחר שסיימה . הצומח

ומאפשר הטענת ATPפעילויות אלה מצריכות פירוק . תפקידה

ואת גדילית -במפגש הפריימר והתבנית החד DNA-המצמד על ה

.הסרת המצמד בתום סינתזת פיסת אוקזאקי

מודל הטרומבון - פלמור מתואם של שני הגדילים

בפרויקריוטים

: הסינתזה הבלתי המשכית הייתה עלולה לפגר אחרי הסינתזה ההמשכית עקב שלבים ייחודיים הכוללים

והסרתם עם הבשלת פיסת האוקאזאקי SSB-גדילית ב-חד DNAציפוי תבנית .א

,RNAסינתזת ופירוק פריימרי .ב

. מילוי המרווח ואיחוי המקטעים .ג

י צימוד פיזי "זה מושג בפרוקריוטים ע, את ההמשכית" לרסן"כדי לתאם את הסינתזות הבלתי המשכית וההמשכית יש

. בין ליבות הפולימראזSSB- מגשרים ההליקאז והT7' בפאג. המצמד-בין שתי הפולימראזות התואמות באמצעות מטען

( continuous)המשכי / המובילDNA-זמנית את גדילי ה-יכולת לפלמר בו DNA polymeras3למבנה הדימרי של

(. discontinuous)המשכי -בלתי/והנסוג

מודל הטרומבון - נשארים צמודים זה לזה למרות שכביכול היו אמורים להתרחק DNA polymerase3שני חלקי

. מיישב סתירה מדומה זו Bruce Albertsי "שהוצע ע


56 2008' סמסטר ב

מתכופפת התבנית הנסוגה כלולאה שמתרחבת על פי מודל זה

. במהלך מחזור פיסת האוקאזאקיומתכווצת מחזורית

לולאת הטרומבון גדלה עם גידול פיסת אוקאזאקי ומתכווצת עם

. השלמת הפיסה

: לתוך הלולאה משני כיווניםDNA" שאיבת"גידול הפיסה מלווה ב

גדילית במעלה -ההליקאז מזרימה תבנית חד .1

. SSBתבנית זו מתכסה מיד ב . לפיסה הצומחת

את " שואבת"הפולימראז הבלתי המשכית .2

. SSB החדש אגב הדחת DNA-גדילית במורד ומשלימה אותה בגדיל ה-שארית התבנית החד

.בכל פעם שמושלמת פיסת אוקאזאקי מדלג הפולימראז לפריימר החדש במעלה והלולאה מתכווצת

ומאוחר יותר על 7T' לולאת השכפול החזויה נצפתה במערכות משוחזרות שהושתתו תחילה על חלבוני השכפול של פאג

.T4' אלה של פאג


57 2008' סמסטר ב

( דני כנעני6 )DNAטכניקות רקומבינציית

דרך העבודה בעבר

מכיוון שההבדל . לעומת המוטנטWTעשו אנליזה גנטית של ה– כשחוקר ראה אורגניזם שיש לו מוטציה ביחס לנורמלית

. לעומת זו של המוטנט כדי לזהות איזה גנים השתנוWT- של הDNAעשו ספריית – נעוץ בגן או בגנים

היא לאו דווקא חייבת להיות באיזור מקודד – ונבדק מיקום המוטציה DNA sequencingלאחר שזיהינו את הגן נעשה

. 'הא יכולה להיות באיזור רגולטורי וכו– לחלבון

נבטא את הגן – לאחר שחושדים שגן מסוים עבר מוטציה

והגן המוטנטי ונשווה מבחינת תפקודים WT-ה

. 'מבחינת מבנה וכו, ביוכימיים

Reverse genetics– השינוי בדרך העבודה

DNA recombinant התפתחו שיטות 70-החל משנות ה

: reverse geneticsוהחלו לעבוד בשיטה הפוכה –

מזהים חלבון או גן שרוצים ללמוד עליהם אך חסר לנו

.והמידע מה החלבון עושה, הפנוטיפ

מהגן , נוכל להגיע לרצף הגן, אם יש לנו רצף של החלבון

. ונסתכל על הפנוטיפ (כולל נסיונות אינאקטיבציה של הגן)נעשה נסיונות ביטוי

. reverse geneticsהרבה מהעבודה שמתבצעת היום נעשית במתודלוגיה של

ולכן נקדיש לנושא , רבים מהפיתוחים הגדולים היום נובעים מקיומן של טכניקות של ביולוגיה מולקולרית

. הטכניקות מספר שיעורים

רסטריקציה /אנזימי הגבלה

שעובר בין )שהם סימטריים ביחס לציר האמצע , בסיסים6לפנינו רצף של

. זהו פלינדרום– (האות השלישית לרביעית

חלק . Inverted repeat-הסיב העליון והתחתון מתייחסים זה לזה ב

. מאנזימי הרסטריקציה מכירים פלינדרומים

סוגי אנזימים ודרכי חיתוך

sticky ends –5 prime protruding - האנזיםEcoR1 הוא אנזים רסטריקציה type2 (93% מאנזימי

החיתוך . אתר ההכרה ואתר החיתוך שלו זהים– (ההגבלה הם מסוג זה

stickyבכל אחד מהגדילים ונותרים לנו , השניA- הראשון לG-מתבצע בין ה

ends 5 עם קצוות-prime protruding .

Gאך הוא חותך בין , EcoR1משאיר אחריו קצוות כמו H1צBaגם האנזים

. שניC-ראשון ל


58 2008' סמסטר ב

sticky ends –3 prime protruding - האנזיםKpn1 חותך בין ה-Cהחמישי ל -

C3ומשאיר אחריו , השישי prime protruding ends .

Blunt ends – האנזיםSma1ולא – בסיסים 3לאחר , חותך בדיוק במרכז

. blunt endsאלא , sticky endsנותרים

אנו מעוניינים בקצוות קומפלמנטריים

הקצוות יכולים לעבור – י אותם אנזימים שמותירים אחריהם קצוות משלימים "אם יש לנו שני מקטעים שנחתכו ע

וניתן לחבר בין , לעתים גם אנזימים שונים משאירים אחריהם קצוות משלימים. sticky endsקל לחבר בין , היברדיזציה

. הקצוות

. blunt endsאך יש בעיה טכנית לחבר בין שני , אין מגבלה בזיווג– blunt ends-ב

. DNA lygase שייך לאנזים DNAהתפקיד לחבר את הקצוות של גדילי

גילוי אנזימי רסרטיקציה

. בהתאם לרצף, באופן ספציפיDNA זה היה בגדר חלום לחתוך 60-בתחילת שנות ה

: הבחינו בשתי תופעות40-כבר בשנות ה

התהליך מצליח רק כאשר החיידקים הם . עובר באופן טבעי מזן אחד של חיידקים לזן שניDNAבקוניוגציה .א

. כלומר יש הגבלה כלשהי, מאותה קבוצה גנטית

. (שוב יש הגבלה)רק זן מסוים , לא מצליח להדביק מספר זני חיידקים' בקטריופאג .ב

, E.coli שגודל על סלמונלה ולהדביק איתו חיידק 22T' ניסו לקחת פאג: התבררה מהות ההגבלה בניסוי הבא1996-ב

. וחלק אחר עבר דגרדציה, עבר מתילציהDNA-חלק מה- בפעמים הנדירות בהן ההדבקה הצליחה . כ זה לא הצליח"בד

. זרrestricting ,DNA, נ לחיידק המקבל יש מערכת הגנה שחותכת"ככה- ההיפותזה

ולכן המערכת כונתה , המתילציה מגינה מפני הרסטריקציה– הזר הצליח לעבור מתילציה ' של הפאגDNAאם

Restriction-modification system .

בהם type1 restriction enzymeבדיעבד ידוע שהעבודה נעשתה על , תחילה הנסיונות לבודד את האנזימים לא עבדו

. ( שם אתר ההכרה ואתר החיתוך זהיםtype2-בניגוד ל)אתר ההכרה ואתר החיתוך הם שונים

. Hind2: הצליחו לבודד את אנזים הרסטריקציה הראשון1970-ב

Restriction-modification system - המנגנון

. אנזים רסטריקציה או המתילאז: יש תחרות איזה אנזים יראה אותו ראשון– זר חודר לתא DNAכאשר

. ונגמרת ההדבקה הנגיפית DNA-יש חיתוך של ה, כ מתרחשת הרסרטקיציה"כ תהליך המתילציה איטי יותר ולכן בד"בד

. כ כבר לא יוכל לחתוך באתר ההכרה שלו"אנזים הרסרטיקציה בד– לעומת זאת אם התרחשה מתילציה


59 2008' סמסטר ב

DNAאנזימי רסרטיקציה משמשים למיפוי פיזי של

באנזים הרסטריקציה שנמצא השתמשו כדי למפות את הגנום של הוירוס

. 40SVהסרטני

. אתרי חיתוך לאנזימי הגבלה6 יש 40SVבגנום

, נכנס בין הנוקלאוטידים וגורם לפלורסנציהEtBr שמעורבב עם DNA- כזכור )

(. UV-שאפשר לראות אם מקרינים ב

חותכים את הגנום בכמה אנזימי רסרטיקציה שונים ובודקים כמה אתרי חיתוך יש

. (ל'פ הגודל של הפרגמנטים שהתקבלו בג"ע)עבור כל אנזים והיכן הם נמצאים

. עשו קישור למפה הגנטיתובנוסף , זהו מיפוי פיזי של גדלי הפרגמנט

מיפוי גנטי

לפני )ופונקציה מוקדמת (origin of replication) המעגלי הויראלי בנוסף לאתרי החיתוך היו רפליקונים DNA-על ה

. שהכרחי לשכפולT-antigenחלבון שמכונה – (הרפלקיציה

: עשו ניסוי– כדי להבין איפה מקודדות הפוקנציות השונות . late function- וearly function-הגנום הויראלי מתחלק ל

. origin of replication-זהו הפרגמנט שמכיל את ה– ביצעו סימון קצר בתימידין חם ומצאו פרגמנט שהסתמן ראשון

early-כך מצאו איזורים בגנום שמקודדים ל. שהופיע בתאmRNA-ובכל פעם מיפו את ה– לאחר מכן סימנו שוב ושוב

function ( שם נמצאT-antigenשנקשר ל -origin of replicationומאפשר את השכפול ) ,ואזורים בגנום שמקודדים ל-

late function .

. מציאת ההתאמה בין מפה פיזית למפה גנטית– הניסוי הפשוט הזה הוא הבסיס לכל הניסויים שעושים היום

-אין שימוש מסחרי ל) type2רובם , מהם נמכרים מסחרית600-כ, אנזימי רסטריקציה3000-כיום ידועים למעלה מ

type1 .)

לפעמים הם מכירים את הרצף במצב הממותל ולפעמים במצב הלא , חלק גדול מאנזימי ההגבלה מכירים את אותו הרצף

. Isoschymoresאנזימים שונים שמכירים את אותו הרצף מכונים . ממותל

EcoR1) האותיות התחיליות מצביעות על המקור ממנו בודד האנזים 3: השמות של האנזימי רסטריקציה - נומנקלטורה

(. E.coliבודד מתוך –


60 2008' סמסטר ב

Recombnant DNA Techniques –( 7דני כנעני )

דרך שיבוט לתוך וקטור–אנזימי רסטריקציה

. אנזימים נמכרים מסחרית600 אנזימי רסטריקציה מהם 6000-יש כ

קומפלמנטריים היא הדרך העיקרית בה משתמשים כדי stickyיצירת קצוות

אם אין בסיסים קומפלמנטריים באתר חיתוך . וקטור/לשבט מחדרים לנשא

אך היעילות של התהליך נמוכה – blunt אפשר להדביק בין שני קצוות –

. יותר

המחדר ואת הקוטור באותם אנזימי , לאחר שחתכנו את הרצף הגנומי

T4 DNA ligaseהאנזים (sticky)רסרטיקציה ויצרנו קצוות משלימים

אך הליגאז יכול להיות גם , זהו הליגאז היעיל ביותר) המולקולות 2יחבר בין

.ATP מולקולות 2תוך פירוק (E.coli-מ

הוקטור הראשון–פלסמידים . 1

. 1-200kb מולקולות מעגליות שנמצאות בטבע בגודל של – הנשאים העיקרים אליהם שובטו מחדרים היו פלסמידים

הפלסמידים הם מעין פרזיטים שמשתמשים במערכת האנזימתית של רפליקציה בחיידקים המקבלים כדי לשכפל את

. (באופן טבעי הם לפעמים מכילים גנים המועילים לביולוגיה מולקולרית). עצמם

.'מתכות וכיוב/בעוד שגנים אחרים מקודדים לעמידות לאנטיביוטיקות, יש גנים שמייצרים אנטיביוטיקיות

נדרשו אנזימי - כדי לבקע את הפלסמיד ולהכניס פנימה מחדר

. רסטריקציה

על הימצאות טבעית של אתרי רסטריקציה " סומכים"כיום אנו לא

משבטים – אלא אנו יוצרים את האתרים באופן מלאכותי –בפלסמידים

polylinker –נוקלאוטיד שמכיל אתרי הכרה לשורה ארוכה - מסנטזים אוליגו

. של אנזימי רסרטיקציה

Copy number –כמות העותקים של הפלסמיד בתא .

low copy number - בפלסמידים אלה הבקרה קפדנית(stringent) , והרפלקיציה , פלסמידים1-2יש רק

. שלהם מסונכרנת עם הרפלקיציה של התא

. אנו רוצים לשמור את הגן בכמות קטנה. פלסמידים כאלה יהיו טובים כשנרצה לשבט גן שהתוצר שלו טוקסי

את הגנים המקודיים לתוצרים : עם הזמן התפתחו שיטות משוכללות יותר לשמירת גנים בכמות רצויה

. רק כאשר נרצה ביטוי נוסיף משרן שיביא לביטוי של הטוקסין–טוקסיים נשים תחת פרומוטור אינדוסיבילי


61 2008' סמסטר ב

high copy number - pPBR322 - יש לו עמידות לאמפיצילין –הפלסמיד הנפוץ ביותר במעבדה

. כך שאין סנכרון של הפלסמיד עם השכפול של הגנום הכרומוזומלי, עותקים שלו בתא100-300יש . וטטרציקלין

תוך rearrangementפלסמיד גדול מדי מתחיל לעבור . הוא יציב, DNAנוח לשיבוט - (4362bp)הגודל שלו

ואינה מסונכרנת עם הרפלקיציה של הגנום relaxedהבקרה של פלסמידים אלה היא . כדי גידול של התרבית

.הכרומוזמלי

ככל . י יצירת היברידיזציה של גלאי מסומן רדיואקטיבית עם המחדר"עלזהות פלסמיד שקיבל את המחדר ניתן

יש להתחשב בעובדה שלעתים יש היברידיזציות שאינן . הסיגנל הרדיואקטיבי חזק יותר–שמספר הזיווגים יותר גבוה

. ומתרחשות לא עם המחדר הרצוי אלא עם הכרומוזום החיידקי, ספציפיות

.בעזרת הגלאי נברור את הפלסמידים שקיבלו את המחדר מתוך כלל הפלסמידים

Origin of Replication

לפעמים . oriהפלסמידים כרפליקונים מכילים

relaxed control ,highאפשר לקבל פלסמיד עם

copy number אם משמיטים איזור שמדכא את

. שכפול הפלסמיד

של פלסמיד ואיזור בקרה שלילי ori –משמאל

איזור הבקרה בנוי מגן . ori- לupstreamשמצוי

. RNA2המכונה , Pre-primer-המקודד ל

נוצר , ori- מתחיל לכיוון ה2RNAהשעתוק של

RNA-DNA hybrid( RNA עובר היברידיזציה עם

מכיר את המבנה RNAse Hהאנזים . (ori-ה

DNA-RNA , 2מבקע אתRNA וכך מתקבל

.DNA מתחילה הוספת הנוקלאוטידים וסינטזת 2RNA של prime 3בקצה . הפריימר הסופי של הגדיל המוביל

. כדי שיתבצע החיתוך2RNAיש צורך בקונפורמציה מסוימת של

RNA2- קומפלמנטרי ל1RNAמטבע הדברים . RNA1מהגדיל השני של אותו איזור הבקרה משועתק בכיוון ההפוך

לא יכול RNA2 – וכתוצאה ממנה RNA2 יודע לעשות היברידיזציה עם RNA1. שסונטז מהגדיל השני באותו איזור

. ולא יכול לשמש כפריימרRNAsae Hי "להיחתך ע

RNA1י מניעת החיתוך ויצירת הפריימר" הוא מעין רפרסור שעוצר את הרפליקציה ע .

. שמשמשים כרפרסוריםTOPכמו כן יש חלבוני

. TOP או בחלבוני הרפרסור RNA-י פגיעה ב" עrelaxed plasmidבאופן מלאכותי יצרו


62 2008' סמסטר ב

תהליך השיבוט

ומכניסים לתוכו , פלסמיד שמכיל עמידות לאמפיצילין, לוקחים נשא

מערבבים את הפלסמיד הרקומביננטי עם . קוולנטית את הגן הרצוי

יש כמה דרכים . חיידקים שמקבלים טיפול מיוחד להפיכתם לקומפטנטיים

:להפוך חיידק לקומפטנטי

שמחורר את הממברנה באופן זמני ומאפשר מעבר טיפול בסידן .א

הינו יון חיובי –כן סידן -כמו. pores-מולקולות דרך ה-של מאקרו

. בעל המטען השלילי ומקל על המעברDNA-והוא מצפה את ה

בתמיסה DNA-עם ה) מחממים את החיידקים – heat-shock .ב

. מעלות42- דקות ב2במשך (שסביבם

לאחר מכן זורעים את החיידקים שעברו טרנספורמציה על מצע סלקטיבי

(LBעם אמפצילין ) .כך שהחיידקים שלא קיבלו את הפלסמיד לא ישרדו .

תהליך החדרת DNA לתוך החיידקים הקומפטנטיים מכונה

. (אין קשר להתמרה סרטנית)טרנספורמציה

וחלק קטן מהחיידקים קיבלו , מרבית התרבת לא קיבלה את הפלסמיד

.תהליך הטרנספורמציה הוא לא יעיל- פלסמיד בעותק יחיד

כי אנו מעוניינים בפלסמיד אחד –חוסר היעילות היא לא חיסרון גדול

. של חיידקים עם פלסמידים המכילים גנים מסוימים בלבדcloneשהרי אנו רוצים ליצור , בלבד לתא

אך לא מבטיח לנו שהפלסמיד מכיל , זה מבטיח שהחיידק מכיל פלסמיד– אם עושים סלקציה עם אמפיצילין

. בניסוי זה אין לנו סלקציה למחדר. את המחדר, את האיזור הרצוי

מספיק ששמים במצע את – דומיננטי משום שאין שום דרישות מהחיידק המאכסן אמפיצילין הוא מרקר סלקטיבי

הוא מכונה מרק –מכיוון שאין דרישות מוקדמות מהחיידק המקבל . האמפיצילין וכל חיידק שלא מכיל גן לעמידות ימות

. סלקטיבי דומיננטי

מניעת היווצרות של פלסמיד ללא מחדר

.הסגירה הופכת להיות תלויה במחדר, כך פלסמיד לא יוכל להיסגר על עצמו– phosphatase-טיפול ב .א

" יראה"כי רוב הזמן הפלסמיד , כך מונעים היסגרות של הפלסמיד על עצמו–עבודה בעודף גדול מאוד של מחדר .ב

פלסמיד שכן/סביבו מחדרים ולא את הקצה השני שלו

.חיתוך באנזימי רסטריקציה שונים בשני הקצוות .ג


63 2008' סמסטר ב

העלאת ניצולת של פלסמידים

לפני הזריעה על צלחת פטרי נוסיף . אפשר לעשות הפסקת סינטזת חלבון- כדי לעלות את מספר הפלסמידים בתא

החלבונים הנחוצים לרפליקציית פלסמידים הם בעלי זמן . המעכב את הריבוזום החיידקי chloramphenicolלכמה שעות

. מחצית חיים ארוך לעומת זמן מחצית החיים של חלבונים הנדרשים לרפליקציית כרומוזמים

. החלבונים שמשמשים לרפליקציית כרומוזמים יתפרקו ולא תהיה סינטזת כרומוזומים–כלומר אם נפסיק סינטזת חלבון

.ונקבל כמות גדולה של עותקי הפלסמיד, לעומת זאת הפלסמידים ימשיכו לעבור סינטזה

דוגמאות לפלסמידים

pBR322 –בתוך הגנים יש . יש לו גנים המקנים עמידות לאמפיצילין ולטטרציקלין

מביאים להפסקת העמידות –אם משבטים לתוך אתרים אלה . אתרי רסטריציה

. לאנטיביוטיקות

אפשר לזרוע את החיידקים בטכניקת רפליקה על מצעים של אמפיצילין –התוצאה

ולראות אילו מושבות לא גדלו על צלחת אחת אך גדלו על הצלחת , וטטרציקלין

ולכן איננה )כך מזהים שמושבה קיבלה את המחדר בתוך הגן לעמידות . השנייה

. (עמידה יותר לאנטיביוטיקה

pUC19 –ניתן לשבט לפלסמיד זה את המחדר המקודד ל -lacZ . השעתוק של

ניתן לחיידקים שעברו טרנספורמציה . IPTGהגן הוא אינדוסיבילי באמצעות

IPTG ונזרע על X-gal . אם האנזיםlacZ המושבות ייראות כחולות– פעיל .

אך lacZנוקלאוטיד סינטטי לפני הגן של -האוליגו - polylinkerניתן להכניס

אם ) IPTGכעת ניתן להכניס מחדר קצר שיתבטא בנוכחות . לאחר הפרמוטור

לא יתפרק X-gal – מפסיק להיות פעיל lacZ החלבון –מכניסים מחדר גדול

כלומר אנו מאבדים את האינדיקטיביות לגבי ביטוי של , והמושבה תיראה לבנה

.(המחדר

pBluescript SK +/- – SKעל שם אתר ההכרה שמצויים בקצוות של ה -

polylinker .

גדיל - שיכול להתקיים כחדN13' של הפלסמיד הוא של בקטריופאגori-ה

RNA . הוספת היכולת הזאת מעניקה את היכולת לקבל את הפלסמיד גם

. גדיל-כחד

pBluescript SK + גדיל אחד ,pBluescript SK - שני גדילים .

למטרות PCRגדיל - אנו מעוניינים בחדDNAשישמש כתבנית .

כדי למפות את גנום האדם - יכולת השיבוט בעזרת פלסמיד היא נמוכה

!נצטרך לבצע מיליון שיבוטים


64 2008' סמסטר ב

הוקטור השני– (למדא) λ' בקטריופאג. 2

ויש בעיה באריזתו , לינאריDNAגדיל -הזה כי הוא דו' ותחילה נראה כי קשה להתעסק עם הפאג, 49kb –גודלו

. (לראש הוירוס)לקופסית

המסלול –' משתמשים במחזור החיים הליטי של הפאג

. שבסופו החיידק עובר ליזיס

בעוד שהזרוע , הפונקציות הליטיות מקודדת בזרוע הימנית

ניתן להחסיר את . השמאלית מקודדת למבני הראש והזנב

הפונקציות שמקודדות במרכז מיותרות )' האיזור המרכזי ולהכניס במקומם גנים שנרצה לשבט לתוך חיידק שיודבק בפאג

. (למסלול הליטי אך חשובות למסלול הליזוגני

שמדביק את החיידק יש שני מסלולים אפשריים' נזכור כי לפאג :

. המסלול הליטי והמסלול הליזוגני

י מוטגנזה "ע. EcoR1 אתרי הכרה של 5זה קיימים ' ברצף הגנום של פאג

האתרים 3את ) אתרי הכרה סביב לאיזור המרכזי שניתן להחסיר 2השאירו

ניתן להרחיק את האיזור המרכזי EcoR1-באמצעות חיתוך ב. (האחרים ביטלו

. ולקבל שתי זורעות מבודדות שניתן לשבט ביניהן

יש . הן לא יכולות להיארז לקופסית– 38kb-גודל שתי הזרועות יחד קטן מ

אך מצד שני יש לקחת בחשבון שלא ניתן , סקלציה כנגד הכנסת רצף ריק

.' לקופסית הפאגkb50-להכניס יותר מ

mRNA מתוך DNAיצירת

deoxy-Thymidine 12אם נייצר פריימר של . polyA- זנב הmRNA-ל .1

. ישמש כפריימרpoly-T-וה, שני הגדילים יעברו היברידיזציה–

. mRNA- על תבנית הDNA נסנטז Reverse Transcriptaseבעזרת .2

.RNA-DNAמתקבל היבריד

3. RNAכך שכאשר משתמשים ב, רגיש לסביבה אלקלית-pH=9 או

pH=10 - ה-RNAאך ה, עובר דגרדציה-DNAלא נפגע .

-poly נוסיף לגדיל קצה Terminal transferaseבעזרת האנזים

Gבקצה ה - prime3 .

- שיעבור היברידיזציה לpoly-C –נוקלאוטיד קצר -נסנטז אוליגו .4

polyG ,וה-PolyCישמש כפריימר .


65 2008' סמסטר ב

יתקבל גדיל - על המשך הפריימר DNAלאחר סינטזת .5

. גדילי- דוDNAויווצר , משלים

ולשם כך , λ' כעת נרצה לשבט את המקטע שהתקבל לפאג .6

גדיל -אם נחתוך את הדו: הבעיה. EcoR1י "יש לחתוך ע

אנו עלולים לחתוך לא רק בשני האתרים – EcoR1עם

כדי למנוע זאת . אלא באתרים נוספים במרכז–הרצויים

שממתל את הגדילים ומונע Methylase-משתמשים ב

.הכרה של אנזימי רסטריקציה

' שהתקבל לפאגDNA-שיבוט ה

DNAובעזרת , שמכילים קצוות קטומיםEcoR1 linkerלוקחים .7

lygaseנוסיף את הליקרים משני הצדדים של ה -DNAשהתקבל .

בנוסף לאתר ההכרה כיוון , בסיסים מכל צד2ללינקר הוספנו עוד

. שבאתרי רסרטיקציה שמצויים בקצה מולקולה יעילות החיתוך יורדת

8. a . נחתוך עםEcoR1 , אין חיתוך של –ובגלל המתילציה

-יווצו קצוות דביקים משני הצדדים של ה. האיזורים באמצע

DNA .

8. b .עם ' נחתוך גם את גנום הפאגEcoR1

. שהתקבלDNA-ל' נעשה ליגציה בין גנום הפאג .9

.נארוז את התוצר הרקומביננטי בויריונים .01

' עם הפאגE.coliנדביק חיידקי .11

' בכל פלאק היה פאג. מתקבל דשא של חיידקים עם פלאקים

ים רבים נוספים שהדביקו את 'יצר פאג, שהדביק חיידק

50,000מכיוון שבכל צלחת נכנסים . החיידקים השכנים

מספיק כדי , צלחות נקבל כמיליון פלאקים20- ב–פלאקים

. cDNAלייצג ספריה הומנית של

את הפילטר שמים , nitrocelluloseעושים רפליקה על פילטר - אם מחפשים מקטע נדיר

, DNAוגורמת לדנטורציה של , ים'שגורמת לליזיס של הפאג, ( גבוהpH)בתמיסה אלקלית

לאחר מכן לוקחים גלאי מסומן . גדילי קשור לפילטר- חד DNAואז נותר, הגדילים נפרדים

. קומפלמנטרי שיעבור היברידיזציה עם המקטע הנדיר שרוצים לבודד

. הרצויDNA- שמכיל את הλ' כך יודעים איזה מהפלאקים מכיל את הפאג


66 2008' סמסטר ב

( דני כנעני8) רקומביננטי DNAמאפיינים ושימושים של שיטות

. λ' הומנית בתוך פאגcDNAבשיעור שעבר הדגמו יצירת ספרית

:יתרונות השיטה

kb23עד - אפשרות להכניס מחדר גדול .א

הגודל של וקטור ריק הוא מתחת לגודל המינימלי שיכול להיארז –סלקציה מראש נגד סגירת הוקטור על עצמו .ב

.( לא נארזkb38-פחות מ)לתוך הקופסית

. ( צלחות בלבד20-כ)ים 'י כמה מאות אלפים של פאג" הומני עcDNAאפשר לייצג את כל הספריה של .ג

. שכיחים ויש נדירים שאנו עלולים לפספסmRNAיש : mRNA- עלינו לשקול את שכיחות ה–כשבונים ספריה הומנית

כדי שהתוצאות יהיו אמינות עושים . ים' צלחות יש כמיליון פאג20-וב, פלאקים50,000-כ- בצלחת פטרי גדולה

clones- מבצעים היברידיזיה ומוצאים את ה–לאחר שעשינו רפליקות . (כדי לא לפספס מקטעים נדירים)דופליקטים

. ועושים אפיוןDNA-מפיקים את ה, מרבים אותו, המעניין' דוקרים את הפאג–המעניינים אותנו

(עקב עניין הגודל)אם כי הן נדירות יותר , יש שתי דרכים נוספות שנמצאות בשימוש. היה הכלי העיקרי לשיבוטλ' פאג

זהו פלסמיד . (λ' משמעותית יותר מפאג) kb45 מעין פלסמיד היברידי שיכול לשאת עליו עד – COSMID .א

DNA- נוקלאוטידים שמצויים גם בקצוות ה12רצפים קצרים בני - COS sequencesמעגלי שמכיל

את הרצפים הללו מכירים אנזימים שיחתכו את הרצף המעגלי . ' הנחוצים לאריזה בפאגλ' הלינארי של פאג

על פני פלסמידים רגילים הוא שהם יכולים cosmidsהיתרון של . ויהפכו אותו ללינארי עם קצוות דביקים

– (עקב מוטציה) שלו לקופסית DNA- שלא יכול להכניס את הλ' אם מדביקים תא בפאג. 'להיארז בתוך פאג

. המתחרה איתו באותו תא, cosmid-הוא יארוז רק את ה

copy ואלמנטי בקרה של ori פלסמיד שמכיל אלמנטים כגון – BAC – Bacterial Artificial Chromosome .ב

number . הפלסמידים הללו מסוגלים לשאת רצפים עצומים שלDNA 200 שאורכם עדkb . קשה לעבוד עם

. יש מספר מעבדות מומחים אליהן פונים שאר החוקריםBAC-פלסמידים גדולים ולכן ל

functional complementationי "זיהוי גן ע

נוקלאוטידים שמכסים -אוליגו, ועל פיו יוצרים גלאים רבים, בשיעור שעבר דיברנו על מצב שבו יודעים רצף חלקי של חלבון

בגלאים משתמשים כדי לעשות היברידיזציה ולזהות את . את כל האפשרויות של רצפים שיכלו ליצור את החלבון

. שמעניין אותנו מבין כלל הרצפיםcDNA/הגן

-שמרים שקיבלו לתוכם את הספריה הגנומית נברור שוב כך שכל ה/תאים/לאחר סלקציה שבה בוררים את חיידקים

clones שלא עונים לקריטריון שקבענו לא ישרדו ואנו נישאר רק עם תאים שמבטאים את הפונקציה של הגן שאנו

. מתעניינים בו


67 2008' סמסטר ב

וקטור שמסוגל לעבור רפלקיציה וסלקציה בחיידקים - shuttle vectorניקח

:כדי לשבט לתוכו אנו זקוקים למרכיבים הבאים. ובשמרים

איזור המכיל אתרי הכרה של אנזימי רסטריקציה רבים– Polylinker .א

(ORI) לחייידקים ori .ב

(ARS - Autonomously Replicative Sequence) לשמרים ori .ג

selective marker .ד

הצנטורמר הינו חלק ממנגנון הסגרגציה של . צנטרומר– CENבוקטור זה יש .ה

אך . פלסמיד כזה יבטיח שתהיה סגרגסציה שווה בין תנאי הבת. לאיזור זה נקשרים חוטי הכישור. כרומוזומים

.תנאי זה אינו הכרחי עבור הניסוי המתואר

ampR –דוגמא למרקר דומיננטי

עבור מרקר זה לא דרוש רקע גנטי מסוים ובעזרת זריעה על מצע סלקטיבי אנו מבודדים את כל החיידקים שלא קיבלו

.את הפלסמיד

URA3 –דוגמא למרקר רצסיבי

URA3הינו גן מקודד לאחד האנזימים בשרשרת שמובילה לסיזטנת נוקלאוטיד ה -Uracyl . חיידק מוטנטי שפגום בגן זה

. או אם נספק לו את הגן הזה באמצעות הדבקה עם פלסמידUracylלא יוכל לחיות אלא אם יסופק לו במצע

:זהו מרקר רצסיבי משתי סיבות

, ממקור חיצוני3URAהוא יכול לעבור קומפלמנטציה עם גן .א

- שאינו פגום בגן זה WTעבור . צריך רקע מוטנטי כדי לעשות סלקציה .ב

או URA3-אין לנו יתרון להכנסת פלסמיד עם אנזים שמקודד ל

.Uracylלסלקציה על מצע חסר

:חיידקים עם שני מרקרים- שמריםshuttle vector-דוגמא ל- משמאל

היסטידין הינה חומצת אמינו . HIS3-על הפלסמיד יש גן סלקטיבי ל .א

-גם במקרה זה המרקר יכול לעבור קומפלמנטציה לפגם ב. הכרחית

HIS3עם גן תקין ומאפשר סלקציה על מצע חסר היסטידין .

. X-gal יאפשר לנו סלקציה על lacZ-הגן ל .ב

28CDC( Cell Division Cycle)בידוד הגן

CDC28( CDC – Cellהניסוי שלפנינו מתאר כיצד בודדו את הגן הראשון הקשור בהתקדמות מחזור התא הגן

Division Cycle .)

S- ל1G- במעבר מ–גבוהה באחד משני אתרים של מחזור התא ' עוצרים בטמפ', רגישים לטמפCDC-המוטנטים ב

(gap1 – ההכנה לרפליקציית DNA) 2-או מGל -M( gap2זמן ההכנה לקראת מיטוזה ) .מוטנטים 60-החוקרים יצרו כ

.והם היו מעונינים לבודד את הגן, אך לא הייתה ידועה המוטציה המדויקת, CDC28-היה להם מוטנט ב', הרגישים לטמפ


68 2008' סמסטר ב

E.coli- של שמרי בתוך וקטור פלסמיד והכנסתו לDNAיצירת ספריה גנומית של

שמשאיר פרגמנטים Sau3Aי האנזים "חותכים את הגנום השמרי ע .א

.ארוכים יחסית עם קצוות דביקים

הסיבה שבגללה לא עשו cDNA :cDNA ( לאחר שימוש

ביונקים יש . כדאי לעשות כשהגנים מאוד גדולים (mRNA-ב

כלומר תהיה לנו בעיה בוקטורים רגילים , אינרטונים רבים

בשמר אין לנו אינטרונים . כ"להחזיק פרגמנטים גדולים כ

ולכן הגנום מייצג את האיזור המקודד לחלבון (כמעט)

. (מלבד איזורי בקרה בין גנים)

שמשאיר אחריו קצוות , BamH1חותכים את הוקטור הפלמסידי עם .ב

ומתקבלת , יש ליגציה, Sau3Aמשלימים לאלה שמשאיר אחריו

.ספריה גנומית של השמר בתוך פלסמידים

E.coliעושים טרנספורמציה של הפלסמיד לחיידקי .ג

י שימוש במצע עם אמפיצילין"עושים סלקציה לחיידקים שקיבלו את הפלסמיד ע .ד

ומפיקים , אוספים לכלי, מגרדים אותן (מושבות מעשרות צלחות פטרי105-כ)לוקחים את המושבות שהתקבלו .ה

. מהן את הפלסמידים

28CDCהכנסת הספריה הגנומית לתוך שמרים וביצוע סלקציה לגן

כעת . מבודד שמכיל ספריה גנומית של שמרים DNAקיבלנו

. נרצה להכניס את הספריה הגנומית לתוך שמרים

לא יודע לחיות ) CDC28בתור שמר המוצא נשתמש במוטנט

לא יכול לשרוד ) URA3-אשר הוא גם מוטנט ל (גבוהה' בטמפ

. ( במצעUracylבלי

אך , טרנספורמציה בשמרים דומה לטרנספורמציה בחיידקים

דופן השמרים מעט עבה יותר ולכן הטיפול בשמרים טרם

-ליתיום - LiOAC-מטפלים ב)הכנסת הפלסמיד יותר אגרסיבי

(.heat shock-אתילן גליקול וב-פולי - PEG, אצטט

.לשמר (פלסמיד)מולקולות -כך אפשר להכניס מאקרו

23- פרמסיבית ' בטמפUracylלאחר ביצוע הטרנספורמציה נזרע את השמרים הטרנספורמטנים על מצע חסר .א

. מעלות

. ישרדו– URA3-רק שמרים שקיבלו את הפלסמיד ושמבטאים את הגן ל .ב

Uracyl על צלחות רבות שאינן מכילות nitrocelluloseמבצעים רפליקה של המושבות בעזרת פילטר של .ג

. מעלות36רסטריקטיבית של ' ועושים אינקובציה בטמפ


69 2008' סמסטר ב

2יש . גבוהה' וגם יכולת לשרוד בטמפ, (זאת הבטחנו גם קודם) URA3-המושבות הבודדות ששרדו מכילות את הגן ל

: מעלות36-אופציות לאופן שבו המושבות הבודדות מסוגלות להתקיים ב

.CDC28קיבלו מהפלסמיד את הגן התקין של .1

. CDC28-קיבלו מהפלסמיד גן שעשה סופרסיה למוטציה ב .2

: במקרה זה נשאל

? גבוהה' מדוע השמר בנורמה אינו מסוגל לחיות בטמפ–אם מלכתחילה יש לשמר את הגן הסופרסורי

?מדוע הצורך להוציא את הגן הסופרסורי החוצה לפלסמיד ולהכניסו לשמר

מה שמבדיל בין השניים הוא מבנה , ההסבר לכך הוא שבגנום יש איזורים פעילים וכאלה שאינם פעילים

אנו מוציאים גנים מהבקרה הנורמלית –כשחותכים את הגנום לחתיכות קצרות . הכרומטין ובקרות שונות

י "ע. שמדכא ביטוי של גנים המצויים קרוב אליוsilencerהסופרסור מצוי תחת פעילות של : לדוגמא. שלהם

ולאחר טרנספורמציה נקבל פעילות של , לסופרסורsilencer-החיתוך ההכנסה לפלסמיד הפרדנו בין ה

.(כי הוא על פלסמיד ולא על הגנום)הסופרסור

. CDC28אלא שקיבלו את הגן התקין של , בפועל התקבל רק סוג אחד של מושבות

. serine-threonine kinase-הסתבר שיש לגן מוטיבים של גן המקודד ל- כשפענחו את רצף חומצות האמינו

. Kinaseהוא (שהוא גן מרכזי בתהליך) במחזור התא CDC28הגן : המסקנה

? מעלות36הסלקטיבית של ' למה לא לזרוע ישר בטמפ? 23של ' מדוע לזרוע קודם בטמפ: תהיה על מהלך הניסוי

ייתכן שלא נוצרה ספריה גנומית ) לא נוכל לדעת את הסיבה – מעלות ולא יתקבלו מושבות 36של ' אם נזרע ישר בטמפ

כך ניתן להעריך את מספר , היא לצורך ביקורת23של ' הזריעה בטמפ. (או שהייתה בעיה בטרנספורמציה, טובה

והתקבלו מעט מאוד מושבות על הצלחות שעברו –אם הייתה טרנספורמציה לא טובה . המושבות שעברו טרנספורמציה

כי הסיכוי שמתוכן אחת המושבות קיבלה את הפלסמיד עם הגן , אין סיבה להמשיך בניסוי– מעלות 23-אינקובציה ב

.מתקבל כל הגנום- מעלות 23של ' היתרון בזריעה בטמפ. הוא נמוך ביותרCDC28התקין

אבל אנו זקוקים לכמות גדולה הרבה יותר של מושבות כי יש איזורים בין גניים שאינם - גנים בלבד 6000 אמנם יש

.(ובשלב זה אנו לא יודעים לזהות אותם)מקודדים לחלבונים

DNAקביעת רצף

1 .Chain termination - שימוש ב-ddNTP – 2שיטות הפועלות בעיקרון זה :

נשים פריימר על מנת להתחיל את סינטזת גדיל DNAג סיב של " ע–שיטה ידנית .א

OHנוקלאוטידים שאין להם ) dNTP- משתמשים בDNAכדי לסנטז גדיל . משלים

ddNTP-אם משתמשים ב. אסטרים-די-י יצירת קשרים פוספו"ע (2בעמדה

לא יהיה ניתן להמשיך (3 וגם בעמדה 2 גם בעמדה OHנוקלאוטידים שאין להם )

.ונוקלאוטיד כזה יהפוך להיות טרמינלי, את הסינטזה

.גדילי שרוצים לקבוע את הרצף שלו- חדDNA של templateהכינו


70 2008' סמסטר ב

ddNTP וסוג אחד של dNTP, פולימראזDNAמכניסים למבחנה

dNTPבכל מבחנה . (dNTP- מהריכוז של שאר ה1/100)בריכוז נמוך

(. ddGTP ,ddATP)אחר

אך לעתים ייכנס , dCTPיכניס הפולימראז - לרוב - ddCTPבמבחנת

בכל פעם תיפסק הסינטזה . וסינטזת השרשרת תיפסק, ddCTP-ה

.במקום אחר ונקבל מגוון גדילים באורכים שונים

ל אלקטרופרזה ' נתיבים בג4-נריץ את התוצרים מארבעת המבחנות ב

(Polyacrilamide) ,ל מסוגל להפריד 'הג. נחשוף לפילם ונקבל רצף בנדים, נעביר לנייר

הפרגמנט –את קביעת הרצף מתחילים מלמטה . פרגמנטים שההבדל בגודלם הוא בסיס אחד

.והגבוה ביותר הוא האחרון, התחתון ביותר הוא הקצר ביותר

יש צפיפות –לאחר מכן , בקריאה טובה800 בסיסים ועד 10-אפשר לקבל ספקטרום החל מ

.של הבנדים של הפרגמנטים הגדולים והקריאה אינה מהימנה עוד

- בקבוצה כימית עם פלורסנציה ייחודית ddNTPאם נסמן כל - (בעזרת לייזר)שיטה כימית .ב

תחילה מערבבים את כל התוצרים . בהקרנה בלייזר כל קבוצה תפלוט אור בצבע שונה

התערובת . ל פוליאקרילאמיד'לאחר מכן מכניסים לקולונה שמכילה ג, מארבעת המבחנות

ועל כל סמן פלורנסטי שיוצא מהקולונה , (קודם יוצאים המפרגמנטים הקצרים)מתחילה לרוץ

לכל )מקרינה קרן הלייזר ומתקבל פלט אחד צבעוני

. online recording - (נוקלאוטיד צבע אחר

תחילה יוצאות המולקולות הקצרות ולבסוף הגדולות

.קביעת הרצף של הגנום האנושי נקבע כך. יותר

כיום , קולונות למכשיר96תחילה יוצרו מכשירים עם

כלומר אפשר , קולונות384יש כבר מכשירים עם

. מיליון בסיסים ביום2.5כך שניתן לרצף , תגובות384להריץ במקביל

PCR –תזכורת לקראת שיטת קביעת הרצף השנייה

אך הבעיה הייתה שהוא , Klenowתחילה השתמשו באנזים

.אינו עמיד בחום והיה להוסיפו מחדש בכל מחזור

TAQ( Thermus Aquaticusכיום משתמשים באנזים

Polymerase) , אנזים תרומפילי שבודד מהגייזרים שבפארק

. PCRילוסטון ובו ניתן להשתמש במספר מחזורים של


71 2008' סמסטר ב

, רצף זר5primeניתן לשים בקצוות . ועליו להיות קומפלמנטרי לרצף בגנום, בסיסים18-אורך הפריימרים צריך להיות כ

. שיאפשרו לנו לשבט את תוצר ההגברה בפלסמיד, למשל אתרי הכרה לאנזימי רסטריציה

: שלושה שלביםPCR-ל

הגדילים נפרדים– Denaturation .א

הפריימרים נצמדים– Annealling .ב

הפולימראז מאריך את הפריימרים – Elongation .ג

.באופן קומפלמנטרי לתבנית

2 .DNA re-sequencing

( בסיסים100עד )היא יכולה לקבוע רצפים קצרים . השיטה יותר חסכונית ומאפשרת לקבוע יותר רצפים ליחידת זמן

בשיטה זו לא נשתמש לריצוף כלל הגנום של . ויעילה במקרים בהם ידוע רצף של גן ואנו רוצים לבדוק האם יש מוטציה

.יצור שהגנום שלו עוד לא רוצף

(תמונה בעמוד הבא' ר)התהליך

לא ספציפי לפרגמנטים DNAseחותכים אותו עם , שאנו מעוניינים לדעת את הרצף שלוDNAגדיל -לוקחים חד .1

אחד מכל צד של –לינקרים הקומפלמנטריים זה לזה / יצרף שני אדפטוריםDNA lygase-קצרים באופן אקראי ו

.כל פרגמנט

אדפטורים פר 40,000,000-יש כ. קושרים את האדפטור עם הפרגמנט עליו למשטח סיליקוני מלא אדפטורים .2

. (צפיפות)משטח

ובשלב הבא )האדפטור שנמצא למעלה על הפרגמנט עלול לפגוש אדפטור שצמוד למשטח ולהיצד אליו .3

. (להשתמש בו כפריימר

4. Bridge PCR - מפעיליםPCR ( בעזרתTAQ) גדיל הקשור משני הקצות שלו למשטח-ג המשטח ומתקבל דו"ע.

. זה ליד לזה, גדילים הקשורים למשטח הסליקוני-ויתקבלו שני פרגמנטים חד, עושים דנטורציה .5

צברים 40,000,000עד שבסופו של דבר יתקבלו , אמפליפליקציה, מחזורים20-מבצעים את התהליך במשך כ .6

.י גלאי פלורסנטי"כ ע" כדי שנוכל לזהות אותו אחDNAשל מולקולות

, (לכל אחד צבע משלו)מסומנים פלורסנטית ddNTP סוגי4, פריימר מסוג אחד, מוסיפים פולימראז- מרצפים .7

ובכל צבר ייכנס אותו , (chain terminator)כלומר רק הנוקלאוטיד האחרון ייכנס . וכל אחד יהיה נוקלאוטיד אחרון

.נוקלאוטיד

ומשנה את , עושים טיפול כימי שמסיר את הפורסציה. מקרינים בלייזר וכך קובעים את זהות הנוקלאוטיד שהוסף .8

.ולהוסיף עוד נוקלאוטיד פלורסנטי, של הנולקואטיד הקודם כך שיהיה אפשר להמשיך את התהליך3הקצה

('פולימראז כיוב, מסומניםddNTPsמוסיפים )שוב עושים הארכה .9

. בעזרת קרן לייזר שוב בודקים את זהות הנוקלאוטיד שנכנס .01

. ומסיקים על כל צבר את הרצף, ( בסיסים35) הארכות 35- משווים את תוצאות תמונות הלייזר שהקבלו במשך כ .11

. המקוריDNAגדיל -כך קבעים את רצף החד. שמים את המידע על הרצפים השונים זה על זה ומשווים .21


72 2008' סמסטר ב

המחירים של הבדיקות הולכים . (ובקרוב נגיע למיליארד) מיליון רצפים 40- אפשר להגיע כיום ל– קולונות 384-בניגוד ל

תעודת זהות "ויאפשר לקבל (אלפי דולרים)כך שבדיקות רוטיניות של הגנוטיפם יהיו במחירים יוצר נמוכים , ויורדים

".גנטית

ופסיכולוגיות ולכן כרגע אין סריקה לסרטן המעי הגס כפי שהוצע (של חברות הביטוח)עם זאת יש לכך השלכות כלכליות

.ב"בארה


73 2008' סמסטר ב

( דני כנעני9) וחלבון DNA ,RNAשיטות אפיון

Blotting

Edי " פותחה עDNA לאנליזה של – Southern blotשיטת

Southern1975- ב .

כינו את השיטות החדשות – Southernעל המשקל של

Northern ,ו-Western.

Northern blot – לאפיון RNA

Western blot –לאפיון חלבונים

חותכים את הפרקציה הנבדקת .א

.ל אלקטרופורזה'מריצים בג .ב

ממברנה , ל לפילטר'מעבירים את תוצרי הריצה על הג .ג

.nitrocelluloseכגון

גדילים - מגיבים את החדNorthern- ובSouthern-ב .ד

. (היברידיזציה)עם גלאי קומפלמנטרי מסומן

. מוסיפים נוגדנים נגד החלבון ומסיקים מה המשקל המולקולרי שלוWestern-ב

חושפים לפילם או בודקים פלורסנציה .ה

Southern blot

כאשר , שמים נייר סופג מעל הממברנה, Nitrocelluloseלממברנת (DNAפרגמנטי )כדי להעביר את תוצרי הריצה

. אלקליpHקצוות הנייר טובלים במיכל עם

וכך נקבל פרגמנטים מקובעים על , בסיסים יתקעו בפילטר ולא יוכלו לעבור אותו הלאה500-פרגמנטים הגדולים מ

. ל'הממברנה כתמונת ראי למה שהתקבל בג

הסיבה שבגללה משתמשים

אנו רוצים - בתמיסה אלקלית

הפרדה של , לגרום לדנטורציה

ג "כך שע, DNA-גדילי ה

גדיליים -הממברנה הם יהיו חד

.ויוכלו לעבור היברידיזציה עם הגלאי

כמות הדוגמאות שאפשר להריץ ב -Southernוב -Northernכולל מרקרים )נתיבים / באריות15-יש כ, היא מוגבלת

.ויש התעסקות רבה עם התהליך, (ושאר סמנים ביקורת


74 2008' סמסטר ב

Northern blot: לדוגמא

בנתיב השמאלי הורץmRNA מתוך תא שלא עבר אינדוקציה

ניתן לראות שאין פרמגנט שיעשה – globinβ-לשעתוק של הגן

. היברידיזציה עם הגלאי המסומן

. שמעודד אינדוקציה של הגןdnsoלאחר מכן התא טופל במשרן

ניתן – שעות לאחר הטיפול במשרן 48בנתיב המרכזי הורצה דוגמא

. קטנהmRNAויש כמות , לראות שיש תחילת ביטוי של הגן

כמות ה. שעות לאחר הטיפול במשרן96בנתיב הימני הורצה דוגמא-

mRNA 48 שהתא מבטא כעת גדולה משמעותית מזו שראינו לאחר

. שעות

הגלאי

. הגלאי תמיד קומפלמנטרי לדוגמא הנבדקת ומסומן רדיואקטיבית - Southern- ובNorthern-ב

:Northern blotיש מספר סוגי גלאים קיימים עבור

לגלאים אלה פעילות . שלו הוחלף הפוספט בפוספט רדיואקטיבי5גדילי קצר שבקצה -נוקטלאוטיד חד-אוליגו .א

.ספצפית נמוכה

למשל כל ) סוגי הנולקאוטידים רדיואקטיבית 4 מתוך 1 בגדילים אלה סומנו – DNA uniformly labeledגדיל -דו .ב

.( מסומניםC-או כל ה, מסומניםG-ה

:אפשר להכין אותו באחת משתי הדרכים הבאות. מסומן רדיואקטיבית PCR תוצר–הגלאי היעיל ביותר .ג

a. ראקצייתPCR" 1/50ניקח , מחזרי הגברה תוך שימוש בנוקלאוטידים קרים20-30 אחרי –"רגילה

–גדיל -דו: התוצאה. סוגי הנוקלאוטידים הוא רדיואקטיבי4- כאשר אחד מPCR-נכניס שוב ל, מהתוצר

. uniformly labeled –שמסומן רדיואקטיבית

b. PCR בשיטה זו נבצע את , כ מספקים לראקציה שני פריימרים שנמצאים בכמויות זהות" בד–סימטרי - א

. ( מהשני50אחד הפריימרים נמצא בכמות גדולה פי )הראקציה בנוכחות כמות לא שווה של פריימרים

במחזורים הראשונים נקבל הגברה של שני הגדילים עד שנגיע למצב שבו הכמות של אחד הפריימרים

. תשתלט על הראקציה (שמשתמשת בפריימר הנפוץ) והראקציה היחידה –תרד לכמות נמוכה מדי

. גדיל מסומן- חד–נקבל תוצר אחד , מחזורים40לאחר . נקבל אך ורק הגברה של גדיל אחד: התוצאה

. גדיל מסומן רדיואקטיבית- נקבל חד–אם נעשה את השיטה בנוכחות נוקלאוטידים רדיואקיבים

של anti-sense RNAשיטה זו יעילה כי יש רק סיב אחד מסומין ואם תכננו את הניסוי כך שיתקבל

. הנבדקRNA-עם ה (הגלאי) PCR- נוכל לעשות היברידיזציה של תוצר ה–המקטע הנבדק

PCR סימטרי משמש גם עבור יצירת - אDNAגדילי שבו נשתמש כתבנית לקביעת רצף - חדDNA .

אם רוצים לקבל גלאי RNA נשעתק במבחנה – מסומן RNAגדילי תוך הוספת נוקלאוטידים - חד

. מסומנים


75 2008' סמסטר ב

ביטוי גנים

בשנים האחרונות יש צורך להרבות מולקולות מסוימות בכמויות גדולות

. ('פקטורי גדילה וכיוב, אינסולין)

כדי לנצל את –הכניסו את הגנים המקודדים להן לוקטורי ביטוי בחיידקים

.זמן הדור הקצר של החיידקים המאפשר לסנזט כמות גדולה של חלבון

נמצא תחת רפרסיה , הינו אינדוסיבליlacZ הפרומוטור של :לדוגמא

ואז יתאפשר השעתוק של IPTGקבועה ממנה ישתחרר בעזרת המשרן

.הגן

כעת הגן – של פקטור גידול cDNA שיבטו לפלסמיד lacZ-במקום הגן ל

. lacZלפקטור הגידול נמצא תחת הפרומוטור של

כאשר בדקו את הפעילות הביולוגית של פקטורי הגידול שיוצרו : הבעיה

. (או בעלי פעילות נמוכה)הם היו משוללי פעילות - י החיידקים "ע

. שהכרחיות לפעילות החלבון (כגון גליקוזילציה)אחרי תרגום החלבון בתא יש מודיפיקציות : הסיבה

-יונקיים כדי לגרום למודיפיקציות הפוסט/מכאן שיש צורך לשים את הגנים המקודדים לחלבונים בתוך תאים הומניים

.תרגומיות כי שיתקבו חלבונים בעלי ערך תעשייתי

:( הומניcDNAבמטרה לבטא )שימוש בוקטורי ביטוי

(.Transfection סוגי 2) לתאים DNA סוגי החדרות 2נבדיל בין

הימים 4במשך . לתאים המקבליםDNA השעות לאחר הוספת 96 נשמרת במשך – זמנית - Transient .א

, בגרעין) מצוי בתוך התא DNA-ה, לגנום הכרומוזמלי של התאDNA-הראשונים אין אינטגרציה של ה

, שהוחדר לתאDNA-רק מיעוט מה. נוקלאזות תאיות-נוקלאזות ואקסו-י אנדו"ורובו עובר פירוק ע (בציטופלזמה

. יצליח לעבור אינטגרציה יציבה לגנום (ובמיעוט של התאים)

כך שרמת הביטוי גבוהה משמעותית , בקיומן של אלפי מולקולות פר תא (בניגוד לשלב היציב)שלב זה מאופיין

כאשר מתחילה האינטגרציה לגנום ונשארים עם מעט מאוד עותקים בתא , ימים4בהשוואה לביטוי לאחר )

. שעות מרגע ההדבקה אפשר לבדוק האם תא מסוים שהודבק מבטא את הגן72לאחר . (מודבק

Stable - יציבה(Transformation) – אז הפלסמיד , בסיום השלב הזמני, שעות לאחר ההדבקה96 מתחילה

וכך מוצאים את התאים G-418לאחר מכן עושים סלקציה בעזרת . עובר אינטגרציה לגנום של התא המקבל

.שבהם עבר הפלסמיד אינטגרציה לגנום


76 2008' סמסטר ב

Transient Transfection. א

:על הפלסמיד להכיל

פרומוטור

cDNAשל הגן הרלוונטי

poly-adenylation signal –רצף קצר שמכיל בגדיל ה -

sense את ההרצף ATAAA (ב-RNA הרצף יהיה

AUAAA) שנמצאdownstream 12-15 נוקלאוטידים

הרצף הזה הינו הסימן לאנדונולקאז לחתוך . cDNA-ל

נוקלאז אינה -י אנדו"את הרצף מוסיפים מכיוון שהיעילות של ראקציית החיתך ע. במקום הנכוןmRNA-את ה

. יכול ליצור כאוס ולהיות טוקסיread-throughגבוהה בתאי יונקים ושעתוק

:שתי תוספות אופציונליות לוקטור

ממקמים אותו בין שני אקסונים–אינטרון .

כך נאלץ את יחידת השעתוק לעבור . cDNA Polyadenilation signal אינטרון פרמוטור : למשל

splicing . שכשמשווים את הביטוי שלהם באותו וקטור עם אינטרונים ובלי אינטרונים - עבור גנים מסוימים -

. יציב נוצרmRNAיותר , רואים שרמת הביטוי עלתה

viral ORI – אם נכניס ori 40 של הוירוסSVואת הגן ל -T antigen 40 שלSV – אנחנו יכולים לקבל בכל תא

(. high copy number)מודבק אלפי עותקים של המולקולה

כך שהתא – T antigen- אליהם מכניסים מראש את יחידת השעתוק ל–יוצרים תאים מקבלים סטנדרטיים

ORIאם נדביק תא כזה בפלסמיד עם . (יש אינטגרציה לגנום) T angtigen-מבטא באופן קונסטיטוטיבי את ה

של הפלסמיד ואז נקבל אלפי עותקים של הגן בגרעין פר ORI- שמיוצר שם יכיר את הT antigen- ה–ויראלי

. תא

טיפול בתאים

: לתאיםDNA אופציות להכנסת 2קיימות

רוב המולקולות . (electroporationי "ע)מולקולות -חירור ממברת התאים לזמן קצר שיאפשר מעבר של שמאקרו .א

. ולא כל תא מודבק, עוברות פירוק בדרכן

מוחדר DNA- שמתאחה עם ממברנת התא והliposome- במעין שקיק שומני הDNA-לצפות את ה- ליפוזומים .ב

. אל התא

ה -DNAבשלב זה לא עובר עדיין אינטגרציה ל -DNAהכרומוזמלי .


77 2008' סמסטר ב

Stable Transfection. ב

-שמכילים את ה (י סלקציה"ע)אך עלינו לבודד את התאים , התהליך זהה

DNAהרצוי ומבטאים אותו באופן קבוע .

כגון עמידות –לשם כך נשתמש במרקרים סלקטיבים דומיננטים

.('קנמיצין וכיוב, אמפיצילין)לאנטיביוטיקות

G-418ו - neoR

418-Gמפסיק סינטזת חלבונים בשלב ה -elongation , אלא אם יעבור

(. Phospho-transferase הוא neoR )neoRי הגן הבקטריאלי "זרחון ע

neoRהגן )עלינו לדאוג לפרומוטור אאוקריוטי - neoRכדי לגרום לביטוי הגן

polyadenylation-וכן ל (הוא בקטריאלי ואנו מדביקים תאים אאוקריוטים

signal (יחידת שעתוק).

נכניס למדיום שבו electroporation-יומיים לאחר ה-ויום, neoRנדביק תאים בוקטור הביטוי שמכיל יחידת שעתוק של

ולא מבטאים את הגן , של הוקטור לתוכם באופן יציבDNA-מרבית התאים לא קיבלו את ה. G-418נמצאים התאים

neoR .לא ישרדו לכן רוב המושבות( אין להםneoR 418שיוכל להתמודד עם-Gשהוסף למצע ).

. neoRומבטאות את , המושבות ששרדו הן אלו שקיבלו את הוקטור

של הגן הרלוונטי cDNA-אך זאת לא אינדיקציה לגבי ה, שהיה בוקטור מתבטאneoRבשלב זה יודעים שלפחות הגן

. הוחדר

שיאפשר לנו להבין האם Southern blotי "נאפיין ע- כרומוזומלי DNAנפיק מהן , לאחר שנבודד את המושבות ששרדו

(.neoRולא רק של ) cDNAאכן התרחשה כניסה של

אין לנו דרך לכוון היכן ייבקע . עובר ביקוע ויעבור אינטגרציה לגנום, הוקטור נכנס לתא– באופן רגיל :הבעיה

הן לא )תהיה סלקציה נגד המושבות הללו - ייכנס לגנום cDNA-אך ה, neoRאם הביקוע יהיה על גן . הוקטור

. (ישרדו

אנו מכוונים את נקודת האינטגרציה – נכניס מולקולוה לינארית – אם נעשה נחתוך מראש את הוקטור :הפתרון

. יותר נוטה לעבור רקומיבנציה לגנום מאשר וקטור מעגלי–וקטור בעל קצוות חשופים . לגנום

. neoRכך אפשר להעשיר אירועים שלא יפגעו בגן . קצוות חופשיים מכוונים את נקודת האינטגרציה


78 2008' סמסטר ב

pcDNA3.1דוגמא לוקטור

פרומוטור ויראלי קונסטיטוטיבי חזק - פרומוטור

( PCMV)לאחד הגנים המוקדמים

נקודתinsertionלגן

polylinkerארוך

7' פרומוטור של בקטריופאגT - כדי לאפשר

קונפיגורציות אפשריות 2יש ) ssDNAיצירת

האחת תיתן גדיל באוריינטציה , ORI-למיקום ה

חיובית והשנייה תיתן גדיל באורינטציה

- T7 RNA polymeraseאם נוסיף . (שלילית

הפולימראז ישעתק את ההמשך ונקבל

ssRNAשל האיזור המשובט .

polyadenylation signal/sequence

ORI 40 של הוירוסSV

יחידת שעתוק לגן סלקטיבי דומיננטי– neoR (מכיל פרומוטור ו-Polyadenylation signal עבור neoR)

(AP )ampR –לצורך סלקציה

גנומיקה

:ליצורים אחרים ( אלף גנים32-כ)נשווה את מספר הגנים באדם

אלף גנים25לארבידופסיס

לתולעתc.elegans – 16אלף גנים

. אלף חלבונים שנוצרים מהגנים הללו150-אך בגופנו יש כ. כלומר העליונות האנושית אינה קשורה במספר הגנים

המנגנונים המאפשרים יצירת יותר חלבונים מכמות גנים מוגבלת

.להם שינויים קלים ברצף, שונים שנוצרים מאותו גןRNA מספר – alternative splicing .א

י פרוטאזות" של פרקורסור של חלבון גדול לחלבונים קטנים יותר עcelavege .ב

כך באותו חלבון נקבל מספר פעילויות שונות–תרגומיות -מודיפיקציות פוסט .ג

. מספר הגנים שהפונקציה שלהם לא ידועה עדיין מהווים כמחצית הגנום

ייקח לנו זמן - ( שנה35- אלף גנים ב16)משלב מסוים היה ברור שאם נמשיך בפענוח תפקידי החלבונים באותו הקצב

.לשם כך יש צורך בשיטות חדשות. רב מאוד


79 2008' סמסטר ב

Functional genomics

.שיטות המאפשרות פענוח מהיר של תפקיד גנים וחלבונים

DNA microarray analysis

.'פרטים שונים וכו/השיטה משמשת להבנת דגמי הביטוי של גנים בתנאים שונים

פעם על גלוקוז : אם מגדלים שמרים על שני מקורות פחמן שונים:לדוגמא

ורוצים לראות את כלל הספקטרום של ביטוי הגנים בשמר , ופעם על אתנול

. בכל אחד ממצעי הגידול

:אופן העבודה

מבודדים את ה-total mRNAמשמרים משני המצעים

מצבעיםreverse transcription בעזרת Reverse Trancriptase לצורך יצירת cDNA .

, ממצע הגלוקוז הפלורנסציה תהיה ירוקהcDNAעבור . כאשר אחד הנוקלאוטידים שהוספו מסומן פלורסנטית

, PCRנ יהיה צורך בהגברת הדגימה ולכן נעשה "ככה. הפלורסנציה תהיה אדומה– ממצע האתנול cDNAועבור

.ובריאקציה זו נסמן את הדגימות

ניקח כמויות שוות שלcDNAמסומנים של שני המצעים ונערבב

כמה אלפי טיפות על כל זכוכוית נושא–לוקחים זכוכיות נושא ועליהן מטפטפטים טיפות בכמות מזערית .

. של השמר, גדילי-חד, בכל טיפה גן אחר

נוסיף את התערובת של ה-cDNAהגנים השמריים שנצמדו לזכוכית יכולים לעבור . המסומנים משני המצעים

. היברידיזציה עם התערובת המסומנת

אם גן מבוטא –ולהיפך , הטיפה תיראה ירוקה–אם גן מסוים מבוטא רק בשמר שגדל על גלוקוז : יש תחרות

שיוצרה הייתה שווה פחות או יותר RNA-אם כמות ה. נקבל בעיקר סיגנל אדום–בעיקר בשמר שגדל על אתנול

. נראה צבע צהוב–בשני המצעים

בעזרתimager יודעים איזה גן התבטא בכל אחד - שיודע מהו הגן בכל בארית ויודע לקרוא את הפלורסנציה

. הגנים של השמר6200עושים ניטור כמותי של ביטוי מקביל של כל . מהמצעים

ובעזרת טכנולוגיות מתעשיית , אך במקום זכוכית נושא השתמשו בפרוסות סיליקון, עקרונות השיטה אומצו על החוקרים

שמייצגים את , על המשטח הסיליקוני ( בסיסים60-באורך של כ)נוקלאוטידים סינטטיים -המוליכים למחצה הכינו אוליגו

. הגנים שדבוקים למשטח

20צריך שיהיו לפחות , לא מספיק מבחינת רמת הפלורסנציה שהוא פולט- נוקלאוטיד אחד שעבר היברידיזציה -אוליגו

. נוקלאוטידים זהים שצמודים לסיליקון-אוליגו

נוקלאוטיד ואנו -יעילות היברידיזציה תלויה באוליגו: הסיבה. נוקלאוטידים שונים- אוליגו3י "כ מקובל לייצג כל גן ע"בד

. רוצים למצע את התנודתיות בתוצאות

אלא , פלורסנטיתcDNA- לא מסמנים את ה– PCR-לאחר שהגברנו ב. cDNA ולא cRNAי "ההיברידיזציה נעשית ע

. יעבור שעתוקcDNA- כדי שהpolyadnlation signal רצף של cDNA-שותלים בוקטור לאחר ה


80 2008' סמסטר ב

( דני כנעני10)ביטוי גנים

DNA microarryas

:משמשת לארבע מטרות (עליה פירטנו בשיעור הקודם)הטכניקה

. השימוש העיקרי של השיטה– RNAבדיקת פרופיל התבטאות .א

יש גנים שיש להם פולימורפיזם . קביעת פולימורפיזם– Genotyping .ב

אפשר לסנטז מקטעים שייצגו את הגן הנורמלי ואת הגן הפולימורפי , שכיח

האם הגן של הנבדק עובר - ולהשוות את תמונת ההבירידיזציה

. היברידיזציה לגן הנורמלי או לגן הפולימורפי

. כך נאבחן אנשים החשודים כחולים במחלה גנטית

בדיקה המאפשרת לקבוע האם יש – Comparative genomic hybrid .ג

DNA-על סמך עוצמת ההיברידיזציה של ה. הגברות או חוסרים בגנום

- לעתים . אפשר לראות האם גנים מסוימים עברו הגברה או לא–הגנומי של הנבדק למקטעים על המשטח

יש חוסרים –אונקוגנים מסוימים מתבטאים ביתר לא בגלל פגם ברגולציה אלא כי הגן עצמו עבר הגברה ולהיפך

. שגורמים למחלהtumor suppressor genes-ב

כדי לדעת . (כמו פקטורי שעתוק) באופן ספציפי DNAישנם חלבונים שמכירים - DNA-protein interaction .ד

י חלבונים באמצעות " שאיננו מוגן עDNA-נפרק את כל ה- האם מקטע מסוים נמצא באיטרקציה עם חלבונים

המוגנים DNA-למקטעי ה, לאחר מכן. ( שלא עטוף בחלבוניםDNAנוקלאזות שחותכות -אנדו) DNAse-טיפול ב

פורקו ולכן )נעשה היברידיזציה עם כלל המקטעים על המשטח וכך נבין איזה איזורים היו מוגנים ואילו לא

. אלף הגנים ההומניים הידועים25-יפים שמכילים את כל הפורומטורים ל'צ/יש משטחים. (חסרים

Cluster analysis

בשיטה זו בודרים את דגם ביטוי

.הגנים כשמשנים את מצב התאים

הרעיבו , לקחו פיברובלסטים הומניים

אותם כך שהתאים מפסיקים להתחלק

- ל1Gהעבירו את התאים ממצב )

0G) .מתחילים להוסיף להם סרום ובודקים אילו גנים מתחילים להתבטא( אינם מתחלקים)לאחר שהתאים נחים , כעת .

. כאשר כל שורה מייצגת זמן מסוים, שעות24הניסוי נעשה במשך

לקחו רק את הגנים שהביטוי שלהם עלה פי שניים , יפים שהכילו את כל הגנום האנושי'לא היו צ- כשהניסוי לעיל נעשה

. G0-בהשוואה לתאים המורעבים ב (בירוק) 2או שהביטוי שלהם ירד לפחות פי (אדום)

. גנים שהביטוי שלהם לא השתנה מסומנים בשחור

. סידרו את כל הגנים שהביטוי שלהם משתנה בצורה משמעותית באופן דומה לפי דגם הביטוי עם הזמן


81 2008' סמסטר ב

לדוגמא ניתן לראות קבוצת גנים . אנליזה של צברים של גנים בעלי ביטוי דומה– cluster analysis התהליך מכונה

. שיש להם דגם ביטוי דומה, בירוק, משמאל

. לאחר מכן מנסים להבין האם סידור הגנים בקבוצות השונות מרמז על פונקציה מסוימת שמשותפת לכל הגנים בקבוצה

ולכן דגם הביטוי , הם גנים שקשורים למטבוליזם של כולסטרול - (שמבוטאים פחות) Aהתברר שכל הגנים בקבוצה

. שלהם דומה

. הינם גנים הקשורים בריפוי פצע– (שמבוטאים ביתר) Eהגנים בקבוצה

. רישות של הגידול בכלי דםangiogenesis- ו– signal transduction-קשורים ב (שמבוטאים ביתר) Dהגנים בקבוצה

. יש קשר בין דגם הביטוי לפונקציה של הגנים: המסקנה

של כמות שווה לוקחים – נקודת הייחוס היא המפתח cDNA ובזמן 0 בזמן X , מערבבים יחד ומבצעים את התחרות

. שמצויים על משטח זכוכית הנושאDNA-נוקלאוטידים של ה-ג האוליגו"להיברידיזציה ע

השוואת דגם הביטוי של גנים בחולות סרטן שד

בו החוקרים ניסו , 2002-לפנינו תיאור של נסיון נוסף שהתפרסם ב

למצוא קולרציה בין דגם הביטוי של הגנים בתאי גידול ראשוני לסטטוס

. DNA microarrayהגידול ומצב החולה באמצעות שימוש בטכניקת

כל חולות סרטן השד היו עד גיל , הקבוצה שנבדקה הייתה הטרוגנית

לכולן לא היו גרורות מרוחקות . של המחלה2- ו1 וכולן בשלבים 53

.(לחלקן היו גרורות קרובות בבלוטות הלימפה)

כאשר , מהחולות ניסו לקחת את דגם הביטוי של מרבית הגנום האנושי

שכאמור הייתה מאוד )נקודת הייחוס הייתה מכלול החולות

.(הטרוגנית

מתוך תאי הגידול total RNA- לוקחים את ה:מהלך הבדיקה

. Reverse Transcriptase בעזרת cDNA-משלימים ל, הראשוני

ומוסיפים פריימרים שמכילים את cDNA- על הPCRמבצעים

וסוג אחד של נוקלאוטידים , סוגי נוקלאוטידים רגילים3-ו, את הפולימראז עצמו, 7T RNA polymeraseהפרומוטור של

-anti- מסומן פלורסנטית שיתחרה על ההיבירידיזציה עם הRNA מתקבל PCR-לאחר ראקציית ה. שמסומן פלורסנטית

sense DNAיפ' שמצוי על הצ .

מתערובת של כלל RNA של אחת מהחולות שנלקח מגידול ראשוני כנגד כמות שווה של RNAבכל היברידיזציה עורבב

.החולות

.(החולות) שורות 295כנגד , (כל טור הוא גן) גנים הומניים 70נבדקו

(.over-expression) הגברה –באדום , (under-expression) חוסר –בירוק

ובהן מטפלים בטיפול כמותרפי שאינו , Estrogen Receptor α כרבע מחולות סרטן השד לא ביטאו את :ממצא משני

.הורמונלי-נשים שמבטאות את הגן לרצפטור יכולות לעבור טיפול אנטי. ספציפי


82 2008' סמסטר ב

החולות בחלק , (הגילוי הוא בדיעבד) הן בעלות הפרוגנוזה הטובה – העליון של המשטח 1/3- החולות ב:ממצא עיקרי

. הגנים70-ויש להם דגם ביטוי דומה ב- התחתון מייצגות את החלות בעלות הפרוגנוזה הרעה

קל לראות שבחלק העליון . בו פס שחור מייצג מוות של החולה, נסתכל על על הטור הימני ביותר - מקרי מוות

. יש משמעותית פחות מקרי מוות–של הטור

בשליש העליון –שוב . בו פס מייצג מקרים של גרורות מרוחקות, נסתכל על הטור האמצעי– גרורות מרוחקות

.גרורות מרוחקות (בדיעבד)פחות חולות פיתחו , מספר הפסים השחורים יותר קטן- של המשטח

אין הבדל משמעותי בין מספר החולות שיש - הטור השמאלי מבין השלושה – גרורות קרובות בבלוטת הלימפה

. ( למטה–" רעה"וה, למעלה–" טובה"בעלות הפרוגנוזה ה)להן גרורות בבלוטות הלימפה בשתי הקבוצות

. הפרמטר של קיום גרורות קרובות אינו מוצלח לצורך ניבוי התפתחות המחלה אצל החולה– לטענת החוקרים

חוסר /יותר מדוייקת מהבדיקה הנפוצה המתבססת על קיום- הבדיקה שביצעו החוקרים של דגם ביטוי הגנים - לטעתם

. אין משמעות דיאגנוסטית לקיומן של גרורות בבלוטות הלימפה הקרובותלטענתם . גרורות קרובות

הנקודות הורודת מסמלות הופעת גרורות – במלבן מימין – התפתחות גרורות מרוחקות –מעקב ארוך שנים

.מרוחקות

השנים 3-4 הגרורות מופיעות במהלך – ("רעה"בעיקר החולות בעלות הפרוגנוזה ה)אצל חלק גדול מהחולות

אם יש קורלציה בין הופעת גרורות רחוקות תוך זמן . מהגידול הראשוניRNA-הראשונות לאחר הבדיקה של ה

. זה בעייתי עבורנו כי היינו רוצים להשפיע על הפרוגנוזה של החולות–קצר לדגם הביטוי הגנטי

: אסכולות בנוגע להתפתחות גרורות מרוחקות2קיימות

גרורות מרוחקות נוצרות לאחר זליגה של תאי הגידול דרך מערכת – seed and soil –האסכולה הישנה .א

אך לכל , רוב התאים אינם מצליחים לעבור את המכשולים שבדרך ליצירת גידול משני. הדם או הלימפה

.והתא שמצליח במשימה אינו שונה מתאים אחרים, תא יש סיכוי שווה להגיע ליצור גידול משני

ויש קבוצה קטנה , בתוך הגידול הראשוני התאים הטרוגניים– cancer stem cells –האסכולה החדשה .ב

שיכולים , מהתאים5%-0.5%שגודלה בין (האחוז שלהם משתנה בין גידולים ובין מטופלים)של תאים

תאים אלו מסוגלים להתמיין במסגרת הרקמה לכל . cancer stem cellsהמכונים , ליצור גידולים משניים

כי תהיה האפלה – מהתאים 5%באנליזה לעיל אנו לא יכולים לראות את דגם הביטוי של . סוגי התאים

. התאים האחרים95%של דגם הביטוי של

cancer-ה, עלינו לפתח תרופות כנגד התאים בעלי הפוטנציאל הגרורתי. אך האנליזה לעיל לא מפילה את התאוריה

stem cells . וטוענים שדווקא ה, של תאים1%עדיין יוותרו - מהתאים של הגידול הראשוני 99%גם אם חוסלו-cancer

stem cellsהם התאים העמידים יותר שנשארים .

. FDA-י ה"כך שהבדיקה לא אושרה ע, כלומר אחוז השגיאה גבוה מאוד, 25% של האנליזה הוא false positive – סייג

.(עם אחוז שגיאה נמוך יותר)אך לאחרונה בדיקות דומות מתחילות להיכנס לשוק


83 2008' סמסטר ב

אינאקטיבציה של גנים ספציפיים

ועלינו לעשות סלקציה למושבות החשודות , אין העדפה מיוחדת לגן זה או אחר לעבור אינאקטיביה–אם עושים מוטגנזה

היינו יכולים להשתיק גנים ספציפיים –אם היינו יכולים לכוון את הרקומבינציה . שנושאות את המוטציה לגן הרלונטי

:קיימות שתי שיטות לגרום לאינאקטיבציה של גן מסוים. ולבחון את הפנוטיפ

רקומבינציה הומולוגית .א

.RNA interferenceגדילי תוך שימוש בטכניקת - דוRNA-שימוש ב .ב

: סוגי רקומבינציות2נזכור שיש

השאיפה של הביולוגים המולקולריים היא . רקומביציה המבוססת על הכרת רצפים סצפיפיים– הומולוגית .א

. להשתיק גנים הומניים אנדוגניים ספציפים ולבחון את הפנוטיפ המתקבל

–אם מכניסים פלסמיד לתא . בתאים הומניים דווקא הרקומבינציה ההומולוגית היא הנדירה– הומולוגית-שאינה .ב

ותוך סיוע של מערכת , ואז הקצוות יכולים להביא לרקומבינציה, נוקאלוזות-י אנדו"הוא מסוגל להיחתך בגרעין ע

. אנזימתית תאית לעבור אינטגרציה לכרומוזום

כ לא קיימים "כי בד)הרקומבינציה אינה מבוססת על הכרה של רצפי הקצה של הפלסמיד לרצפים זהים בגנום

.והיא השכיחה מבין השתיים, (רצפים כאלה בגנום

:רקומיבנציה הומולוגית. א

משמאל

הבנוי משני Xאנו מעוניינים לגרום לאינאקטיבציה של הגן

לשם כך נכניס . (בכתום)ושלושה אינטרונים (בלבן)אקסונים

-G-המקנה עמידות ל, neoR הגן –לצורך הדוגמא )גן אחר

ומסביבו חלקים משני , לתוך פלסמיד ( המסומן בירוק418

כשהפלסמיד יפגוש בגרעין את הגן . Xהאקסונים של גן

ויתרחש , הוא יעבור איתו רקומבינציה הומולוגית–האנדוגני

. האנגודניX בפלסמיד לסגמנט neoRשחלוף בין הסגמנט

, יוכנס לתוך הגן התאיneoR הגן לעמידות –התוצאה

את החלק הפנימי של neoRוכאשר מחליפים באמצעות הגן

נקבל השתקה של ביטוי . נורמליX לא נקבל חלבון – Xגן

. ונוכל לבדוק בתאים המתקבלים את הפנוטיפ של ההפרעה שיצרנו, Xהגן

הפעם )עלינו לזכור לחזור על הפעולה שוב באותם תאים על האלל השני . נבצע את התהליך בתאי גזע עובריים עכבריים

. ולהזריק אותם לבלסטוציסט, לאחר האפיון נוכל לקחת את תאי הגזע. (neoRשאינו , יש להכניס מרקר סלקטיבי אחר

ואחרים מכילים , (neoRמכילים את הגן )עכברים שחלק מהאיברים שלהם מכילים את הגן הדפוק , נקבל עכברים כימריים

. כללXשאינם מבטאים את הגן " טהורים"בעזרת הכלאות נקבל עכברים . Xאת הגן

- בסיסים בכל צד הסיכוי ש1000מכיוון שאם בונים על איזורי הומולוגיה של , תחילה לא האמינו שהשיטה תוכל לעבוד

. בסיסים109*3 בסיסים בגנום הוא קלוש כי מדובר על 1000 בסיסים יראו את אותם 1000


84 2008' סמסטר ב

מימין

, (שהיא השכיחה יותר מבין שני הסוגים)הומולוגית -אך יכול להיווצר מצב שבו הפלסמיד ייכנס ברקומבינציה שאינה

. לא הוחלףXאבל לא הייתה רקומבינציה והגן , (neoRיבטאו )כלומר התאים אמנם יהיו עמידים

משני Herpes simplexמהוירוס (מסומן בצהוב, Thyrosine Kinase ) TKהוכנס הגן- כדי למנוע את המצב הזה

. neoRהצדדים של הגן

ganciclovir - י "אנלוג של תימידין שעובר אקטיבציה לאחר שהוא עובר פוספורילציה עTKשל וירוס ההרפס בלבד .

ganciclovir מתחרה עם תימידין על כניסה לשרשרת DNAכניסתו בזמן סינטזת - אך הוא טרמינלי , בזמן סינטזהDNA

.(ומשמש בין היתר כתרופה נגד הרפס)מפסיקה את הסינטזה ולכן הוא טוקסי

TKהמניים לא מסוגלים לעשות את הפוספורילציה הדרושה לאקטיבציה של / עכברייםganciclovir.

:נערוך שני שלבי סלקציה

. ישרדוneoRכך שרק תאים המבטאים , G-418 נוסיף למצע –סלקציה חיובית .א

באופן TK-כל תא שייקח את הגן המקודד ל. ganciclovirנכניס למדיום : TKסלקציה שלילית לתאים שמבטאים .ב

ganciclovir ,ganciclovir יגרום לאקטיבציה של TK ,TKיבטא את , (ללא הרקומביציה הומולוגית)רנדומלי

. והתא ימותDNAיתחרה עם תימידין ויגרום להפסקת סינטזת

. לא אמור להיכנס לגנום התאיTK- הגן המקודד ל–אם הרקומבינציה הייתה הומולוגית

כדי להעשיר את האירועים של רקומבינציה הומולוגית –

- גם מהצד השני של הגן המקודד לTK-הוסיפו את הגן המקודד ל

neoR – השילוב מכונה replacement vector .

כך שהחלק , אם יהיה שבר בפלסמיד בזמן שהוא נמצא בגרעין: הסיבה

עלול להיכנס לגנום neoR - TK- ייפרד מהגן המקודד לTK-המקודד ל

. למרות שהייתה רקומבינציה הומולוגית

10%-0%השכיחות של התאים שעברו רקומביציה הומולוגית היא

.והשכיחות תלויה במבנה הכרומטין

RNA interference. ב

. C.elegansהחוקרים רצו ללמוד גן שמתבטא בתקופה העוברית של התולעת

. האקוויולנטיRNA- יכולה לעכב את ביטוי הanti-sense RNAתצפיות ישנות הראו שהזרקה של

anti-sense RNA יוצר היבריד עם mRNAויוצר באיזור תחילת התרגום קומפלקס שמונע תרגום .

. אך היו מעט הוכחות שהשיטה אכן עובדת

י הכנסת "ע (גידל-חד) anti-sense RNA- הוכן הPCR-ב: השיטה החדשה

cDNAעם פרומוטור ל -RNA polymerase . למרבה הפתעה כשהזריקו הן

(בכל פעם הוזרק גדיל אחד בנפרד) antisense- והן את הsense-את ה

. ( פלורסנטיRNAי היברידיזציה עם "מדדו זאת ע)התוצאה הייתה אפקט חלש של הורדת הביטוי של הגן הרלוונטי


85 2008' סמסטר ב

.ומימין אין ביטוי של הגן, יש ביטוי של הגן- משמאל

- והזריקו את הדו– anti-sense- והsense-כאשר עשו היברידיזציה של ה

RNA-כל הפעילות של ה, (עיכוב טוטאלי)אין ביטוי כלל : גדיל התוצאה

! שותקה (האנדוגני)התאי

. RNA interferenceוהתהליך כונה , גדיל עבד משמעתית טוב יותר מכל אחד מהגדילים בנפרד-כלומר הדו

dsRNA בידד – חוקר אחר שעבד על צמחים –שנה מאוחר יותר

.מתוך תאים צמחיים

dsRNA-שחותך את ה, dicerבציטופלזמה קיים אנזים שמכונה

נוקלאוטידים 2כאשר יש , נוקלאוטידים22לחתיכות באורך של

siRNAהמכונה prime3( sticky ends)-שבולטים בקצוות

(short interference RNA .)

RISC( RNA Inducedי קומפלקס " הקצר מוכר עsiRNA-ה

Silencing Sequence) שמסיר את גדיל ה-sense . הקומפקלס

שמסוגל למצוא את האיזור , anti-sense-נותר קשור לגדיל ה

. ולעבור איתו היברידיזציה מלאה, mRNA-ההומולוגי ב

-חותך את ה (RNAase, נוקלאז-שהוא אנדו) slicerהאנזים

mRNAנוקלאזות שימנעו תרגום- וחושף אותו לאקסו.

miRNA – אם ההומולוגיה אינה מלאה בין miRNAל -mRNAאך יש הפרעה לתרגום, י נוקלאזות" אין חיתוך ע .

. שחייבים להיות קומפלמנטריים באופן מלאcore – נוקלאוטידים 7יש איזור של

אחד האם - קצרים ובודקים אחדmiRNAלכן מבודדים . miRNAי "היום מעריכים שכשליש מהגנים ההומניים מבוקרים ע

. mRNA-הם מסוגלים לעכב את התרגום או את היציבות של ה

. בסיסים22 באורך siRNAגדיל -קונים את התוצר הסופי של הדו: לבטל פעילות של גנים אנימליים/כיום יש שיטה לדכא

(. RNAגדילי -יש פאנל של כל הגנים ההומניים המכוסים בדו)

. siRNA 3כ מקובל שכל גן יכוסה בלפחות "ולכן בד, יהיה יעיל בעיכובRNAגדיל - לא ניתן לדעת איזה דו–על אף הנסיון

. בתוך הגנוםmiRNA נגרום לביטוי קבוע של – באופן קבוע mRNAאם רוצים להשפיע על הביטוי של גן

את הגן המקודד . shRNA( Short Hairpin RNA) המכונים – inverted repeat-לשם כך הכינו וקטורים שמקודדים ל

. miRNA- יחתוך אותו לdicerשם , יוצא לציטופלזמהshRNA- לאחר התרגום . נבטא בעזרת פרומוטור חזקshRNA-ל

יש ) lentivirusוירוסים או -כיום בעיקר משתמשים בהם בתוך וקטורי רטרו, בתוך פלסמידיםshRNA-תחילה השתמשו ב

ודורשת תהליכי , כ" אינה יעילה כDNAבעוד שטרנספצקיה עם פלסמיד , מהתאים100%להם יכולת הדבקה של

(.neoR-סלקציה כגון בדיקת עמידות ל


86 2008' סמסטר ב

( דני כנעני11)מחזור חיי התא

S: בשתי הפאזות, הגנים שמעורבים בהתמרה סרטנית מעורבים בקביעת ההתקדמות של מחזור התא80-חלק גדול מ

. (מיטוזה) M-ו (DNAסינטזת )

אך זו קביעה , כיום יודעים שזה לא מדוייק. תחילה סברו שכל תופעת ההתמרה הסרטנית נובעת מליקויים במחזור התא

.שאינה רחוקה מהמציאות

:( שעות16-24שאורכות יחד ) פאזות 4במחזור חיי התא

S phase - הפאזה העיקרית בה מתרחשת סינטזתDNA .

. שעות9-10אורכת בין

M phase - דקות30-אורכת כ. המיטוזה עצמה .

phase1G - הפאזה שבה התא מסנטז את החומרים הדרושים

( dNTPלמשל ייצור מאגר של ) DNAלהכפלת

phase2G - לא רק )הפאזה שבה התא מכין את עצמו לחלוקה

חלוקת )' אלא גם של הציטופלזמה כיוב (של הכרומוזמים

(.Cytokinesisהציטופלזמה מכונה

אם כי במצבים פיזיולוגיים מסוימים התא , כל השלבים הכרחיים

. 2G- ו1Gיכול להכין חומרי תשמורת ולקצר את משך הפאזות

- cell arrest0G - 1-בG 0 יש מעין לופ שמכונהG .התא יכול לצאת ממחזור אקטיבי ולהכניס למצב מנוחה .

. 0G- אפשר להיכנס ל1Gרק משלב

אם מוציאים . (כאשר כל התאים מתחלקים יחד) את התופעה בדקו באופן ניסויי בתרבית סינכרונית

. S יצאו מהמחזור ולא ייכנסו לפאזת 1G תאים בשלב –מהסרום את פקטורי הגידול

. S וימשיכו לפאזת 1G-התאים יחזרו ל- כאשר מחזירים את פקטורי הגידול לסרום

וכאשר , יחד0G-כך כולם יכנסו ל. י הרעבה"אפשר לגרום לסיכנרוניזציה של תאים שגדלים בתרבית ע

. כל התאים יתחילו באותה נקודה–נחזיר את פקטורי הגידול לסרום

R – Restriction point - 1 הדרך בין 2/3-בG לקראת S - יש נקודה המכונהR point . בשמרים נקודה זו

התאים בכל –מנקודה זו גם אם נרעיב את התאים . commitment pointושם נוסף הוא , start pointמכונה

. G0- ולא ייכנסו לSזאת ימשיכו לפאזת


87 2008' סמסטר ב

פקטורים במחזור חיי התא

. (מספר תאים שעברו איחוי וכעת מכילים יותר מגרעין אחד)קריונים - נעשה הנסיון הראשון ליצירת הטרו1970-ב

וירוסים יודעים לגרום לאיחוי של . קריון נוצר אם מגדלים תאים בצפיפות ומטפלים בהם בוירוס שעבר אינאקטיבציה-הטרו

שמורכב Giant Cellולכן וירוס שמדביק תאים שגדלים בצפיפות עלול לגרום ליצירת , ממברנות כשהם מדביקים תאים

. (תא המורכב ממספר גרעינים) syncytium-משני גרעינים או ל

. בעל שני גרעינים בלבדGiant cellועודדו יצירת , תנאי הזריעה לא היו צפופים מאוד1970-בניסוי ב

.קריונים מתאים שנמצאים בשלבי חלוקה שונים-הניסוי נעשה כדי להבין מהו הפנוטיפ המתקבל מיצירת הטרו

G1 + M

. M-בהם הכרומוזומים עוד לא עברו דחיסה ותאים שנמצאים ב, 1Gנלקחו תאי

. החלו לעבור דחיסה והתקבלו מעין חוטים1G-הכרומוזומים של התאים מ

נ אחד "זהו ככה) שמשרה דחיסת כרומוזמים Mנ יש חומר בתאים בפאזת "ככה: המסקנה

M-כלומר קיים פקטור דומיננטי שקיים בתאים שנמצאים ב(. M-המאפיינים של שלב ה

phase :M-phase promoting factor( MPF)

M + Interphase

, 1G ,Sבשלבי , כלומר תאים שאינם נמצאים במיטוזה) לתאים באינטרפאזה Mביצעו איחוי של תאים שמצויים בפאזת

2G) . בכולם הגררעין של התא שהיה באינטפראזה נכנס לחלוקה מוקדמת( לפאזתS) :ממברנת הגרעין נעלמה ,

.'והתרחשה דחיסה של הכרומוזמים וכו

. הינו פקטור דומיננטי שמשפיע על תאים באינטרפאזהM-phase promoting factorזוהי הוכחה נוספת כי

G1 + S

מכאן , נדחפו לרפליקציה מוקדמת מדי1G-התאים שהיו ב. 1G- עם תאים שנמצאים בSאיחו תאים שנמצאים בשלב

.להכינס לרפליצקיה מוקדמת מדי (1G-לפחות תאים ב) יש פקטור דומיננטי אחר שדוחף – Sבשלב הניחו ש

G2 + S

. לא היה ניתן לגרום להם להיכנס שוב לרפליקציה– 2G עם תאים בפאזת Sכשאיחו תאים בפאזת

. מחכה ואינו משכפל את עצמו2Gהגרעין של התא שהיה בשלב

.רפליקציה- לעבור רה2Gכלומר או שהפקטור שראינו בניסוי לעיל נהרס או שהוא נתקל במעכב שלא מאפשר לתאי

G1 + G2

נראה שהפקטור ו, סיימו מיטוזה כרגע1Gהתאים בפאזת . לא התרחש דבר2G עם תאים בפאזת 1G-כשאיחו תאים ב

. להיכנס מוקדם מדי לחלוקה2Gשכן הוא לא גרם לתאי 1G- התפרק בM-phase-Promoting Factorהמיטוטי

או שיש מעכב שגורם להתנגדות (לבילי) התפרק S-phaseונראה שהפקטור של , S רק סיימו את פאזת 2Gתאי

.S להיכנס לפאזת 1Gלפעילות הפקטור שמנע מהפקטור לגרום לתאי


88 2008' סמסטר ב

:המסקנות

יכול Mפקטור דומיננטי בתאים בפאזת .א

לגרום למיטוזה בכל תא שנמצא

.באינטרפאזה

1G גורם לתאי Sפקטור דומננטי בפאזת .ב

. מוקדם מהדרושSלהיכנס לפאזת

החלוקה המיוטית בתאי המין

המיוזה מתחילה מתא סומטי דיפלואידי שמכילN2כרומוזומים .

פאזתS - התא מכפיל את ה-DNAפלואידי - שלו ויש לו כעת מספר טטרה

(. N4)של כרומוזמים

1פאזתM - נוצרים שני תאי בת שכל –לאחר חלוקה מיוטית ראשונה

. כרומוזמיםN2אחד מהם מכיל

אך , יש שוב הכפלה של המידע הגנטי, הסומטי, במהלך הרגיל

מתרחשת חלוקה –מכיוון שמדובר בתאי מין ולא בתאים סומטיים

זוהי למעשה הפרה של ההתקדמות )מיוטית שנייה ללא הכפלה

Checkהפרה של מערכת הרגולציה של , הנורמלית של מחזור התא

points .)

2פאזתM –נוצרים שני תאי בת שבכל אחד מהם N כרומוזומים ,

. כרומוזמיםN2שממתינים לאיחוי עם תא מין נוסף ליצירת זיגוטה בעלת

oocyte-החלוקה המיוטית ב

.עליו להמתין לסיגנלים מתאימים, תא הביצית אינו מתחיל ומסיים את המיוזות מיד

In vivoו -in vitroשגורמים לתא הורמון הפרוגסטרוןי" הטריגר שגורם לביצית להיכנס למיוזה הראשונה נוצר ע

( Polar body)כאשר האחד מהם הוא גוף קוטבי , כרומוזמיםN2להתחלק לשני תאים המכילים ( כרומוזמיםN4שמכיל )

תא הבת הגדול ממשיך ומתחיל להיכנס למיוזה שנייה . שיילך ויתנוון והשני תא בת גדול שמכיל את מרבית הציטוזפלמה

. אך אינו משלים אותה עד להפריה

רק לאחר ההפריה עם תא

כניסת המטען הגנטי )הזרע

תא הבת הגדול - (הזכרי

יכול להשלים את המיוזה

ולהוציא גוף קוטבי , השנייה

כעת . (שיתנוון אף הוא)שני

. כרומוזומים בלבדNתא הבת הגדול והגוף הקוטבי מכילים


89 2008' סמסטר ב

oocytes-ניסויים ב

1971

- חוקר יפני עשה נסיונות ב1971-ב

oocytes בגלל גודלן ) של קרפדות

.(נוח לעבוד איתן

12לאחר המיוזות יש - בקרפדות

. קצרים מהרגיל2G- ו1Gחלוקות סינכרוניות מהירות עם שלבי

והזריקו אותה לתא (התאים שמחכים להפריה)החקרים הוציאו ציטופלזמה מהתאים העצורים במטאפאזה השנייה

ללא פרוגסטרון התרחשה מיוזה , בתא זה. (התא הראשוני שעוד לא קיבל סיגנל למיוזה הראשונה) 2G-שנמצא ב

.(בשלב שבו התא מחכה להפריה כדי להשלים את המיוזה השנייה)והתא נעצר במיוזה השניה , ראשונה

. 2Gנ יש פקטור דומיננטי בציטופלזמה של תאים במיוזה השנייה שמשרה חלוקה מיוטית על תאי "ככה: המסקנה

ולכן למעשה הזרקת הציטופלזמה היא לא יותר מאשר הזרקת , ייתכן ששרידי פרגוסטרון היו קיימים בציטופלזמה, מאידך

. ואין פקטורים נוספים, פרוגסטרון

והחלו , כ עד שלא סביר שהיא זו שגורמת למיוזה"כמות הפרוגסטרון נמהלה כהניסוי נעשה שוב ושוב עד אשר

. להאמין כי אכן מדובר בפקטור ציטופלזמתי שמשרה מיוזה

.(ת זהים"ר) Maturation Promoting Factor – MPFאת הפקטור שמקורו בציטופלזמה שמביא למיוזות כינו

יכולים להחליף – Maturation Promoting Factor- וM-phase Promoting Factorמבחינת הפעילות : ההיפותזה

. (בהמשך' ר– MPF- הצליחו לנקות לראשונה את ה– 1988-רק ב). וייתכן שמדובר באותו פקטור, אחד את השני

1984

לאורך תהליכי החלוקה MPF-בניסוי זה בחנו את מידת פעילות ה. נעשו נסיונות נוספים על ביציות של קרפדות1984-ב

.של הביצית

להשרות MPF-ונבדקה יכולת ה, לאחר טיפול בפרגוסטרון נלקחה דגימת ציטופלזמה מתוך התאים בכל אחד מהשלבים

י הזרקת ציטופלזמה בשלבים שונים של מטורציית הביצית לביציות "ע, שוב) 2G-על הביציות ב (Maturation)מטורציה

(.2Gבפאזת

וכאשר , במהלך תהליך המטורציה יש נדידה של הכישור

ג רקע " רואים שמופיעה נקודה לבנה ע–מאירים על הביצית

, הופעת הנקודה הבהירה היא סימן לקיומה של מטורציה. חום

. חלוקות2לקיומן של

. בביציותMPF הייתה רמה גבוהה של –כל זמן שלא הושלמה החלוקה : כך התקבל הגרף שמשמאל

. MPF- התרחשה ירידה חדה ברמת ה–ברגע שהתרחשה הפריה

. ומיד לאחריה צניחהMPF-בחלוקה המיטוטית הראשונה של העובר התרשחה עליה ברמת ה

. מתאימות לסיומי שלבי המיוזהMPF-והירידה ברמות ה, העליות מתאימות להתחלות של שלבי המיוזה


90 2008' סמסטר ב

ניסוי בצדפות

esther-di5-methionine- ובS35-מתוך צדפות סומנה ב (extract)תמצית

שנכנסים לחלבונים שעוברים סינטזה ומאפשרים מעקב אחרי החלבונים

מריצים ) דקות על תוכן התאים 10מסתכלים מדי . שסונטזו בפרק זמן מסוים

. (לים של פוליאקריאמיד ובודקים הופעת חלבונים מסוימים'את החלבנים על ג

נצפו שלושה –ג רקע של חלבונים רבים שמסומנים ומסונטזים כל זמן "ע

, כלומר החלבונים מסונטזים)חלבונים שרמתם עולה ויורדת במחזוריות

.('שוב מסונטזים וכו, עוברים דגרדציה

. דקות האם הגרעין מתחלק או לא10כן בדקו מדי -כמו

. (גרעינים מתחלקים)מציין את מספר התאים שמצויים במיטוזה - הקו הכחול

נעלם ושוב , שמגיע לשיאCyclin מציין את רמות החלבון – הקו הסגלגל

. 'רמתו עולה ומגיעה לשיא וכיוב

(MPF-מתאים לתכונה הנדרשת מ) מופיע תמיד לפני חלוקה ונעלם cyclin-שכן ה, MPF- קשור לcyclin: ההיפותזה

1988

: תת יחידות2- והראו שזה חלבון שמורכב מMPF בודדו את 1988-ב

cyclinהומולוג של .א

(. Threonine- וSerine-קינאזה בעל אפיניות גבוהה לבצע פוספורוליציה ב) Serine Threonine Kinase .ב

.CDK – Cyclin Dependant Kinaseכונה - MPF-ה, החלבון

כן שהוא מזכיר את , שמר אבולוציוניתCDK של החלבון מחיות שונות ראו שהרצף של mRNA-לאחר שבדדו את ה

שראינו בעבר כאחראי על עמידות לטמפרטורה גבוהה 28CDC( Cell Division Cycle 28 –הרצף של קינאז אחר

.(בשמרים

כשהכניסו לשמרים את הגן ההומני של CDK (הכניסו אותו כ-cDNAעל פלסמיד ) - ה-CDK ההומני עשה

. קומפלמנטציה לעמידות לטמפרטורה גבוהה

חלבונים 3 באורגניזם אחד נמצאו Cyclin A ,Cyclin B1 ,Cyclin B2כפי שצפו קודם לכן .

ניסוי בביציות צפרדע

המערכת שהתקבלה הכילה . לתמצית של הביצית הוסיפו גרעין מתא זרע: נעשתה עבדה על ביציות של צפרדע1988-ב

5המערכת הזו הצליחה להכפיל את הגנום שלה ולעבור . גרעין הפלואידי של תא זרע שמוקף בציטופלזמה של ביצית

. מחזורי חלוקה

– הא קינאז MPF-מכיוון ש. סמך המידע שנבע מהניסויים שנעשו קודם לכן- נעשתה עלMPFמדידת הפעילות של

אך – MPFאמנם ההיסטון הוא לא הסובסטרט הטבעי של . histone H1נבדקה מידת הפוספורילציה של החלבון

. וזוהי אינדיקציה מספקת, In vitroלקינאזות יש סובסטרטרים מלאכותיים

.cyclin Bלים של פוליאקרילאמיד לבדיקת כמות 'אותן הריצו על ג, לאחר מכן נלקחו דגימות מתוך הציטופלזמה


91 2008' סמסטר ב

האירועים המוקדמים שמתרחשים בתחילת - רקע תכלת

, היעלמות ממברנת הגרעין של תא הזרע–החלוקה

.ודחיסת הכרומוזמים

בסיום – תהליכים שמתרחשים בטלופאזה – רקע כתום

הופעה מחודשת של ממברנת הגרעין והיעלמות - החלוקה

. הכרומוזומים הדחוסים

(a )– (שמאל למעלה) ניסוי בתמצית לא מטופלת

זה לא מפתיע כי אמרנו שאין פעילות ) cyclin B באה עם העליה בריכוז MPFעליה בפעילות : נצפתה עליה מקבילה

MPF ללא cyclin B ,Cyclin dependant…. .)

. מתחילים תהליכים מוקדמים של המיטוזה– cyclin B וריכוז MPF-בסמוך לשיא של פעילות ה

.MPF ובעקבותיה ירידה בפעילות cyclin Bמתרחשת ירידה של (לפני תהליכי הטלופאזה)לפני שיש יציאה מהמיטוזה

.cyclin B ודגרדציה של MPFכדי לצאת ממיטוזה חייבת להתרחש ירידה של : המסקנה

(b )–ניסוי בתמצית שטופלה ב -RNAse (ימין למעלה)

. ולא הרחשה פעילות מיטוטית כללRNAse-התמצית טופלה ב

.MPF אין פעילות cyclin Bללא . RNAse-י ה"ונפגעו ע, הכרחי למיטוזהcyclin B- שמקודד לRNA: המסקנה

(c )–ניסוי בתמצית שטופלה ב -RNAse שהסף לה mRNAהמקודד ל -cyclin B (שמאל למטה)

שעשה , היה טיפול עדיןRNAse-הטיפול ב. cyclin B- סיננטי שמקודד לRNA הוסיפו RNAse-לתמצית שטופלה ב

rRNA- וrRNA( tRNA או tRNA בלבד ולא למרכיבים אחרים שחשובים לסינטזת חלבון כמו mRNA-דגדציה ל

. ( קשה לפגוע בהםRNAse-מתאפיינים במבנה מרחבי קומפקטי ול

. cyclin- המקודד לmRNA- שהתרחש כתוצאה מהוספת הcyclin B-כלומר הטיפול העדין לא פגע בסינטזת ה

נוסףRNA-ואין צורך ב, בלבדCyclin Bלצורך מיטוזה נדרשת סינטזה ודגדרציה של : המסקנה

(d )–ניסוי בתמצית שטופלה ב -RNAse שהוסף לה mRNAהמקודד ל -cyclin Bשאינו עובר דגרדציה

טרמינלי שמאפיינות חלבונים עם זמן מחצית N- חומצות אמינו בקצה ה8-יש כ - cyclin B- הנורמלי שמקודד לmRNA-ל

ייתכן שמגנון הדגרדציה של כל החלבונים קצרי החיים . D-box( Destruction box)המכונות (יציבות נמוכה)חיים קצר

.D-boxי מערכות הדגרציה הוא אותו "ומנגנון ההכרה של החלבונים ע, הוא משותף

שאינו עובר , יציב, חדשmRNAונוצר , D-box-נוקלאוטיד שמקודד ל- את האליגוcyclin B של cDNA-הוציאו מתוך ה

.דגדרציה

Cyclin B המוטנטי מאפשר כניסה למיטוזה אך הרחשה התייצבות של פעילות MPFואין יציאה ממיטוזה .

. MPFואליו מתלווה ירידה בפעילות , הכרחית ליציאה ממיטוזהcyclin Bדגרדציה של : המסקנה


92 2008' סמסטר ב

cyclinsדגרדציה של

cyclinsהמנגנון הזה . עוברים דגרדציה באמצעות מנגנון היוביקוויטינציה

אברון שמהווה מכלול פרוטאזות שעושות דגרדציה - הינו תלוי פרוטאוזום

. Poly-ubiquitineי "של חלבונים שעברו סימון ע

י "השלב הקריטי במנגנון היוביקוויטינציה הוא הכרה של הסובסטרט ע

( באיור משמאל3שלב ). 3Eקומפלקס

3Eהוא קומפלקס חלבוני כללי אינו ספציפי .

כלומר מדובר במורכבות , 3E קומפלקסים שונים של 1000-יש כ

י מנגנון "מתגלים יותר ויותר חלבונים שעוברים דגרדציה ע. עצומה

. היוביקווטיניציה

APC – Anaphase מכונה cyclin- בעל הספציפיות ל3Eהקומפלקס

Promoting Factor ,והפקטור שמעניק את הספציפיות ל-cyclin

. Cdh1מכונה

הכניסה לאנפאזה תלויה בדגרדציה של ה -cycin.

(APCאינו ספציפי ל -cyclin ,הספציפת ל, הוא גם עובד בשלב מוקדם יותר של המיטוזה על סובסטרט אחר-cyclin

(. Cdh1-נובעת מ

החלבוןMPF פעיל כאשר הקינאז (CDK) צמוד ל-cyclin.

APC עובר איחוד עם Cdh1.

הקומפלקסAPC+Cdh1מכיר את ה -cyclin ומסמן אותו

.ביוביקוויטין

ה-cyclinעובר דגרדציה בפרוטאוזום וה -MPF אינו פעיל

. (הקינאז מפסיקה לזרחן)

בסיום– CDK 1 אחרים בתא שמאפיינים את שלבG

. Cdh1מזרחנים את

Cdh1מזורחן ניתק מ -APC ואינו יכול לסמן עוד את cyclin B

. (אם נותרו עוד כאלה)

כשמתחילה סינטזת . תהליך זה מאפשר למחזוריות להמשיךcyclin B

. CDK מסוגל לא לעבור דגרדציה ולמצוא את cyclin- ה–לקראת המיטוזה


93 2008' סמסטר ב

: הוא שיווי משקל שני תהליכיםAPC-ו (לא מזורחן) cdh1האיחוי בין

זרחון מתמיד של –מצד אחד Cdh1י " לאורך כל המחזור עCDKשונים .

י פוספטאז " הורדת הזרחן ע–מצד שניCDC14 שמנסה כל הזמן להוריד את הזרחן הקיים על Cdh1.

חסר Cdh1כך ששיווי המשקל נוטה לכיוון , שונים שמוריד את פעילותם CDKרק לפני האנפאזה מופיע מעכב של אותם

.זרחן

Cdh1 חסר זרחן שיודע ליצור קומפלקס עם APC הקומפלקס יכול לסמן את ה -cyclin cyclin יעבור דגרדציה

MPF אינו פעיל (להיכנס לאנפאזה) התא יוכל לצאת ממיטוזה .

עקב הזרחון המתמיד של פקטור , APC+Cdh1 רוב הזמן אין קומפלקס –מלבד חלון זמנים מאוד קטן בזמן המיטוזה

. Cdh1הספציפיות

ישנם אלפי חלבונים שמהווים סובסטרטים של CDKממשיכים לפענח את הסובסטרטים 1988מאז . שונים

. והרגולציה של התהליכים

Restriction Point –הבסיס המולקולרי

1G מהדרך לאחר 2/3- נקודה ב– Restriction point-ניזכר ב

התא –גם אם נרעיב את התא - מנקודה זו . Sלקראת פאזת

בעוד שהרעבה של התא לפני , יכפיל את הגנום שלו ויתחלק

התא לא יכפיל את הגנום )נקודה זו תגרום לעצירה של התא

.(שלו ולא יתחלק

1Gבאמצע פאזת

. 6CDK- וCDK :4CDK פעילים בתא שניR-לפני נקודת ה

שהוא אחד מתוך שני , Rb הקומפלקסים הללו מזרחנים את המרכיב R-בנקודת ה. cyclin Dהחלבון המתאים להם הוא

.RetinoBlastoma הינו תוצר של הגן Rb- הינו פקטור שעתוק וRb+E2F .E2Fהמרכיבים בהטרודימר

.E2F הינו ריתוק של Rb+E2Fמטרת הקומפלקס . 1Gהפוספורילציה מתחילה באמצע פאזת

E2F הוא Master Transcription Factor , פקטור שעתוק שחלק מהמטרות שלו הם גנים המקודדים לפקטורי שעתוק

. חסר זרחןRbוהוא יכול להימצא בתוך הקומפלקס רק כאשר , מצוי בתוך הקומפלקס הוא אינו פעילE2Fכאשר . נוספים

1Gבסוף פאזת

Rb4י " עובר פוספורליציה עCDK 6 אוCDK , ניתק הקשר בינו

למשל לגנים )ונקשר למטרותיו בגרעין , שהופך פעילE2Fלבין

הנחוצים לסינטזה של נוקלאוטידים שיאפשרו סינטזת חומצות

-הגן שמקודד ל - E2Fאחת מממטרותיו של , לדוגמא. (גרעין

2CDK ,CDKולסינטזה של , שיעבוד בשלב מאוחר יותרcyclin Eהמתאים לו .

E2F גורם לשעתוק של הגנים את הגנים שיידרשו בפאזת S , כמו כן הואpositive autoregulator ,( גורם

.(עצמו-להפעלת השעתוק שלו


94 2008' סמסטר ב

Rb+E2F מסיים את הזרחון של כלל הקומפלקסקים cyclin E+CDK2הקומפלקס - כדי להבטיח את המשך התהליך

.Sכעת התא יכול לסנטז את כל החומרים להם הוא זקוק לפאזת . (במקרה ונותרו כאלה שאים מפוספרים)

Rb( Retinoblastoma)

Rbהתגלה ב -Tumor Suppressing Gene –גן המעכב גידולים של סרטן ברשתית שמתפתח בילדים .

מחקר גנטי אודותיו גילה שבחולים בהם אלל אחד מתוך . הראשון שבודדTumor Suppressing Gene-זהו ה

ג הרקע של אלל מוטנטי ואלל תקין מתרחשת בגיל מוקדם "ע, (עקב מוטציה נקדותית או חסר)השניים הוא מוטנטי

. (התקין)מוטציה על האלל השני

הקומפלקס אינו משתק את , הפוספורליציה של התאים מואצת כי אין בלם, E2Fהמוטציה מביאה לשחרור של

E2F ,ומתרחשת חלוקה מואצת של תאים שמביאה להתהליך סרטני .

הביא למסקנה שיש קשר בין חלבונים של Tumor Suppressor Gene( Rb)י " מבוקר עE2Fגילוי העובדה כי

.מחזור חיי התא לסרטן

Tumor Suppressing Gene-דוגמא נוספת ל

4CDKהדוגמא השניה התגלתה כשבודדו את קומפקסים של

.Cyclin Dעם

כשבודדו את אחד הקומפלקסים נמצא בו חלבון נוסף שמשקלו

16 kiloDalton ,והוא כונה , שרצפו מוכרp16 .

בדקו בחולי מלנומה בדקו האם יש להם חוסרים גדולים או

: ונמצאו חסר ניכר בשני גנים, מוטציות פונקציונליות בגנום

p16חוסר בגן המקודד לחלבון .א

. p15חסר בגן הצמוד אליו המקודד לחלבון .ב

. עבור התפתחות מלנומהTumor suppressor Genesשני הגנים הללו הם : ההיופתזה

– CDK4+Cyclin Dכל זמן שהחלבונים קשורים לקומפלקס . 4CDK הם מעכבים של p15- וp16-הוכיחו ביוכימית ש

אין על הקומפלקס – עברו מוטציה p16- וp15אם החלבונים . E2Fולשחרר את , Rb לזרחן את 4CDK-הם מונעים מ

כך שהתאים חופשיים להתחלק כרצונם וליצור , E2F ולשחרר את Rbהקומפקלס חופשי לזרחן את , בקרה טבעית

.מלנומה


95 2008' סמסטר ב

re-replicationהמנגנון המולקולרי שמונע

initiation complex-שמרכז סביבו חלבונים שהכחיים ליצירת ה, ORI-קומפלקס שנוצר ב, ORCג הכרומוזום יש "ע

. להתחלת שכפול

תתרחשת ORC-ורק לאחר הקישור שלהם ל, רק כאשר הם חסרי זרחןORC- יכולים להיקשר לCTD1- וCDC6חלבוני

. איניציאציית שכפול

, 1CTD ואת 6CDC המצויים בתא מזרחנים את CDK- ה– ORC-והחלבונים קשורים ל, לאחר שהייתה איניציאציה

.ומאפשרים את תחילת הרפליקציה, שמאבדים את האפיניות לכרומוזום וניתקים ממנו

.ORC- מזורחנים ולא יכולים להיקשר שוב לCTD1- וCDC6 כי חלבוני –כעת לא יכולה להתרחש עוד רפליקציה

- וCDC6 עובר דגדרציה והפוספטאז שקיים קונסטיטוטיבית מוריד את הזרחן מחלבוני CDKבחלון בתחילת האנאפזה

CTD1 (אין פוספוריליציה מחודשת כי כאמורCDK עבר דגדרציה ) , וחלבוניCDC6ו -CTD1 חסרי הזרחן יכולים

. ולהתחיל את השכפולORC-להתחבר ל

מזורחנים ניתקים CTD1- וCDC6חלבוני - מהרגע שהתא הגיע לשלב מסוים , re-replicationזוהי הסיבה שבגללה אין

יעברו דגרדציה בחלון CDK- שמצויים בתא עד אשר הCKDי "וממשיכים לעבר זרחון ע, מקומפלקס הרפליקציה

.הזדמנויות קצר


96 2008' סמסטר ב

( לילי ורדימון12)מסלולי העברת אינפורמציה גנטית

: מסלולים להעברת אינפורמציה גנטית2קיימים

משתכפל והאינפורמציה הגנטית עוברת מאב לבןDNA - שכפול .א

חלבוןDNA RNA - שעתוק .ב

. גנים30,000-בגנום יש פחות מ. מקודד לחלבוניםDNA- מכלל ה2%רק

כי החלבונים המשועתקים קובעים את , הבקרה על השעתוק חשובה ביותר

.כי בכל התאים הגנום הוא זהה, אופי התא והרקמה

המנגנון המולקולרי של ביטוי סלקטיבי

למשל תאים שעברו . י התא" עמתרחש לאחר איבוד גנים שהביטוי הסלקטיבי של גנים ברקמות השונות בעבר האמינו

.התמיינות לתאי עצב מאבדים גנים שמבוטאים באופן ספציפי בתאי כבד

.שיבוט הוכיח שבכל תא סומטי יש את כל המידע הגנטי הדרוש ליצירת אורגניזם שלם

לתא זה משתילים . נותר תא שמכיל בעיקר ציטופלזמה ומיטוכונדריות, מסירים מביצית של פונדקאית את הגרעין שלה

את הביצית מחזירים לפונדקאית ובודקים . של התורם (שמכיל גנים ספציפיים בלבד, ממויין)גרעין שנקלח מתא סומטי

. האם מתפתח אורגניזם שלם

. לתורם הגרעין100%-האורגניזם שמתקבל דומה ב

, התא מתחלק, מגדלים את התאים בתרבית תומכת, מפרקים אותו לתאים בודדים, בדומה אפשר לקחת שורש של גזר

שוב תא שורש מכיל את –' שורש וכו, מתמיין עובר התפתחות עוברית כמו תא זרע מופרה ויוצר גזר שלם שמכיל עלים

.כל האינפורמציה הדרושה ליצירת צמח שלם

.תאי-באורגניזם רב" איבוד גנים"כך נשללה התאוריה של

מימדי-ל דו'בדיקת מולקולות החלבון המצטברות בתא באמצעות ג

החלבונים הללו משמשים לפעילויות . שקיימים בכלל התאיםhouse-keepingיש חלבונים שמתורגמים מגנים המכונים

. DNAשמתרחשות בכלל התאים כגון סינטזת

.במצבים שונים/אך יש הבדלים בדגמי הביטוי של שאר הגנים בתאים מרקמות שונות

proteomics –ל שמשתמכת על שתי תכונות של החלבונים' בדיקה בעזרת הרצה בג:

משקל מולקולרי, גודל

פועל יוצא של חומצות האמינו שמרכיבות את החלבון, מטען חשמלי .

. נקדוה זו מכונה הנקודה האיזואלקטרית, 0נטו של החלבון הופך - המטען– מסוים pH-ב


97 2008' סמסטר ב

אלקטרית- לפי הנקודה האיזו–הפרדה ראשונה

, בנקודה מסוימת– תחת שדה חשמלי pHכלומר אם נריץ חלבונים בגרדיאנט של

.החלבונים יעצרו ויווצר בנד- האופיינית לכל חלבון Iso-electric pointבאותה

לפי משקל מולקולרי–הפרדה שנייה

. ל של מולקולות טעונות שלילית'שהוא ג, SDS-כעת נריץ את החלבונים ב

כך שהמטען האינטרינזי של חומצות , SDSלכל חומצה אמינית ייצמדו שתי מולקולות

.כעת כלל החלבונים טעונים שלילית. SDS-י ה"כי הוא ממוסך שלילית ע, אמינו בטל

פ המשקל "ל ע' החלבונים נעים בג– (בפעם השניה)לאחר הפעלת שדה חשמלי

. הקטנים ינועו מהר יותר– (כולם טעונים שלילית)המולקולרי בלבד

י צביעה כללית של " נתקשה לזהות אותו ע–כאשר יש כמות מזערית של חלבון

.SDS-החלבונים שנמצאים על ה

מדגירים את התאים מהם מפיקים את החלבונים במדיום שמכיל : הפתרון

יוכנסו - בהתליך התרגום : המטרה. חומצות אמינו מסומנות רדיאוקטיבית

.חומצות אמינו רדיאוקטיביות לחלבונים החדשים

בין תאים מרקמות , דגם הביטוי, אפשר להשוות את דגם הפסים–בסיום

.י חשיפה לפילם"שונות או בין רקמה בריאה לרקמה סרטנית ע

הבדל ברמת החלבונים לאו דווקא משקף הבדלים ברמת השעתוק

.בחלק מהתאים עלול להתרחש ביקוע של החלבון לאחר התרגום .א

אך בתאים מסוימים נראה רמה – לגן מסוים mRNA יכול להתרחש שעתוק זהה של –בקרה ברמת התרגום .ב

.גבוהה של חלבון ובתאים אחרים רמת אותו חלבון תהיה נמוכה

DNA microarray- בתאים השונים נשתמש בmRNAכדי לבדוק את דגם הביטוי של

ממציםmRNA משני תאים שונים שרוצים לבדוק (Aו -B)

בעזרתPCR מכינים cDNA לתא ) מסומן פלורסנטיתA צבע

( צבע ירוקBלתא , אדום

מדגירים (שעליו מוקמו בסדר ידוע גנים של הגנום האנושי)יפ 'על צ

יוצרים תנאים המתאימים . המסומן משני התאיםcDNA-את ה

. המסומןcDNA-יפ ל'להיברידיזציה בין הצ

שוטפים את ה-cDNAיפ' שלא נקשרו לצ


98 2008' סמסטר ב

המכשיר מקרין בלייזר באורכי גל המתאימים לצבע הפלורסנטי של . בודקים את התוצאות גלאי פלורסנטי

:ומתקבל פלט צבעוני, הגלאים

o גן מתא –נקודה ירוקה Bמבוטא ביתר

o גן מתא –נקודה אדומה A מבוטא ביתר

o הביטוי זהה בשני התאים –נקודה צהובה

o אין ביטוי באף אחד מהתאים–נקודה לבנה

: מדגימות בקרה ברמת השעתוק אך קיימים הסברים נוספיםDNA microarrayאמנם נראה שתוצאות

.יציבות: מלבד הבדלים ברמת השעתוק בין שני התאים–" נקודה אדומה"הסבר אפשרי נוסף שיכול להסביר

-באחת הרקמות ה: mRNAאך יש מנגנון שמבקר את היציבות של , ייתכן שהשעתוק מתרחש בשני התאים באותה רמה

mRNA עובר דגרדציה ( למשל בעזרתsiRNA) .במקרה כזה ב-DNA microarrayרואים הבדלים דרמטיים בכמויות ה -

RNA ,אך למעשה כמות ה-mRNAהמשותעק זהה .

. מצביעה על כמות התוצר החלבוני שיווצרmRNA-ברוב המקרים כמות ה- עם זאת

בקרת שעתוק בפרוקריוטים

.הבקרה ברמת השעתוק היא הבקרה המרכזית –בתאים פרוקריוטים

ולכן – בפרוקריוטים קצר מאוד mRNAזמן מחצית החיים של .1

.הבדלים בשעתוק באים לידי ביטוי במהירות בתרגום

mRNAעם היווצרות . בפרוקריוטים השעתוק והתרגום צמודים .2

כלומר אין חלון הזדמנויות גדול , הוא מתחיל לעבור תרגום

.לבקרה ברמת החלבון

זמן הדור הקצר של הפרוקריוטים מחייב תגבוה מהירה .3

.לשינויים בסביבה

שלבי בקרה אפשריים באאוקריוטים

בתאים אאוקריוטים יש מורכבות גדולה בתהליך השעתוק והתרגום ויש

:נקודות בקרה רבות אפשריות

בקרה שעתוק .א

(' וכוsplicing-על תהליכי ה) RNAבקרה על עיבוד .ב

לציטופלזמהmRNAהעברת .ג

mRNAבקרה על רמת היציבות של .ד

בקרת תרגום .ה

בקרה על עיבוד החלבון .ו


99 2008' סמסטר ב

שעתוק

.תהליך השעתוק מבוסס על עקרונות דומים לתהליך הרפליקציה

בנקודה מסוימת שבו מתחיל גן על . DNA נוצר על תבנית של RNAגדיל

ופותח בועת RNA polymerase מתיישב האנזים dsDNAאחד הגדילים של

תוך שימוש RNAגדילים מתחיל שעתוק של -על אחד משני החד. שעתוק

תוך שמירה על כללי זיווג של , DNA-בנוקלאוטידים הדומים לאלו של ה

.כך שנוצרת מולקולה אנטי פרללית לתבנית, קריק-ווטסון

הבועה , הנבנה הולך ומתארךRNA-הזנב של ה. 5- ל3-כאשר התבנית היא מ, 3- ל5-המולקולה שנבנית היא נוצרת מ

תוך , האיזור ששועתק נסגר חזרה לסליל כפול ונפתח באיזור שקדמי לו. DNA-הולכת ומתקדמת לאורך מולקולת ה

. חיוביים בכיוון ההתקדמות ופיתולי על שליליים מאחורי כיוון ההתקדמות (super-coils)יצירת פיתולי על

מבנה הנוקלאוטיד

: מלבד מספר הבדליםDNA- דומים לאלה של הRNA-הנוקלאוטידים ב

DNA-ריבוז ב-אוקסי- לעומת דהRNA-ריבוז ב: הסוכר .א

לעומת DNA- בThymineשלושה מהבסיסים זהים מלבד : הבסיסים .ב

Uracylב -RNA

RNAעקרונות בסיסיים בסינטזה של

י התקפה נוקלאופילית של "השרשרת מוארכת עOH בעמדה

תוך , של הנוקלאוטיד המתווסףα על הפוספט בעמדה 3

פספט שיפורק -אסטרי ושחרור פירו-די-יצירת קשר פוספו

. פוסטאז-י פירו"בהמשך ע

פוספט הוא הכוח המניע לראקציית -הפירוק של הפירו

RNA-סינטזת ה

הפוספטים שלו3הנוקלאוטיד הראשון הוא היחיד שמשמר בשלב זה את ,

. שלהם בלבדα -שאר הנוקלאוטידים נותרים עם פוספט ה

כאשר יש חשיבת לבחירת , עם פתיחת בועת השעתוק יש שני גדילים

mRNA-מפני שהגדילים אמנם קומפלמנטריים אך ה, הגדיל שישועתק

.שיווצר משני הגדילים יהיה שונה ויקודד לחלבונים שונים

ברוב המקרים רק גדיל אחד משועתק ל-DNAבזמן נתון באיזור מסוים .


100 2008' סמסטר ב

התבנית

anti-sense, template -גדיל ה-DNA

.RNA-התחתון שימש כתבנית ל

sense, coding strand - גדיל ה-DNA

. RNA-דומה מאוד ל. הקומפלמנטרי

י הסתכלות על הגדיל המשלים לגדיל "ע

RNA-התבנית אפשר להסיק על רצף ה

. ורצף החלבון

. RNA כל אחד מהגדילים יכול לשמש ליצירת

הגנים מפוזרים על שני הגדילים והשעתוק

אך בכל , מתבצע בכל אחד מגדיל אחר

פעם בכיוון אחר כדי להקפיד על שעתוק

כאשר המולקולה נבנית , 5- ל3-מתבנית מ

. 3- ל5-מ

נפוץ בעיקר בוירוסים שם האינפורמציה )כל גן על גדיל אחר , קיימים מקרים שבו איזור מסוים מקודד לשני גנים שונים

. (צריכה להיות קומפקטית ודחוסה

DNA- וRNAהדומה בסינטזת

3- ל5-שני הגדילים נבנים מ

3התקפה נוקלאופילית של – מנגנון אלונגציה דומה`OH בקצה השרשרת הצומחת על פוספט α בנוקלאוטיד

.המוסף

י הידרוליזת פירופוספט"סינתזה מונעת עה.

היאתבניתה DNA.

(נו תנאי ליצירת קשר פוספודיאסטרייזיווג בסיסים ה)נוצר רצף קומפלמנטרי

DNA- וRNAהשונה בסינטזת

RNA polymerase יכול ליזום גדיל RNA ללא צורך בפריימר (בניגוד ל-DNA polymerase .)

קצב הסינטזה שלRNA polymerase איטי מקצב הסינטזה של DNApolymerase ,30-50. ביותר מסדר גודל

. DNA polymerase- נוקלאוטידים לשניה של ה800 לעומת RNA polymerase-נוקלאוטידים לשניה ל

RNA polymeraseשלא כמו ל, עושה יותר שגיאות-DNA polymerase - ולכן הוא עושה , אין לו מערכת הגהה

ויש עוד , מכיוון שהטעויות לא עוברות בתורשה, אך השגיאות הן לא קריטיות. נוקלאוטידים104-105טעות מדי

. mRNAמולקולות תקינות רבות של


101 2008' סמסטר ב

DNA לעומת RNAהבדלים במבנה המרחבי של

גדיל - נמצא בתא בעיקר כדוDNA- בעוד שssRNA נמצא התא בעיקר כגדיל בודד RNA –טופולוגי : ההבדל העיקרי

dsDNA .

RNA יכול ליצור מבנים שניוניים ושלישוניים בזכות היותו

:כגון, גדיל-חד

Hairpin - י רצף שהוא "מתאפשר עinverted

repeatובאמצע איזור שאינו קומפלמנטרי

loop stem &

Bulge

. קיפולים המתאפשרים לקומפלמנטציה באיזורים סמוכים– מבנה שניוני

, מתאפשר אף הוא הודות לקומפלמנטציה של איזורים מרוחקים– מבנה שלישוני

שמאפשר קיפול נוסף של המולקולה

tRNA מתקפל ב– למשל -L-shpaeהודות לקיפול שלישוני .

RNAסוגי

E.coli –בפרוקריוטים

mRNA –מכלל ה2%מהוות . נוקלאוטידים75-3000קיימות מולקולות שאורכן בין . מקודד לחלבונים -RNA

בפרוקריוטים

tRNA –מכלל ה16%מהוות , נוקלאוטידים75-90אורכן , קצרות, נושאת חומצות אמינו -RNA , ויש כמה

.tRNAעשרות של

rRNA –סוגים של 3-4קיימים , האברונים שמבצעים את התרגום בתא, משמשת ליצירת הריבוזום rRNA

. התאיRNA- מה82%מהווים . נוקלאוטידים3100- ו1500, 100באורכים

באאוקריוטים

ובטור , steady-state בזמן RNA- אחוז כל אחד מסוגי ה–בטור משמאל

.RNA בזמן סינטזת RNA- אחוז ה–מימין

hnRNA – זהו הפרוקרסור הגרעיני של mRNA , לפני שהמולקולה יוצאת

. מהגרעין לציטופלזמה

:סתירה

בזמן steady-state – mRNA מכל ה3% ציטופלזמתי מהווה רק -

RNA ,ו-hnRNA מה7% גרעיני מהווה רק -RNA.

ממולקולות ה58% – לעומת זאת בזמן סינטזה -RNA המסונזטות הן hnRNA !

מתפרק RNA) בציטופלזמה לעומת הכמות הגדולה שסונטזה עקב בעיית היציבות mRNAכלומר נותר מעט מאוד

. (במהירות


102 2008' סמסטר ב

RNA polymerase-י ה"זיהוי נקודת התחלת הגן ע

החוקרים הניחו את הרצפים של הגנים זה על זה כך שבכולם נקודת E.coliכשהחלו להצטבר רצפים של גנים של

+(. 1 מכונה mRNA-הנוקלאוטיד הראשון שמשועתק ל)השעתוק הייתה במיקום זהה

שיתקבל משעתוק של RNA-של הגדיל שדומה ל, coding strand-של ה, DNAגדיל -הרצפים שנבדקו היו של חדי

.(ולא התבנית)התבנית

. רצפי קונצנזוס2, שנמצאים במעלה נקודת תחילת השעתוק, דומים בכל הגנים, קופסאות של רצפים שמורים2נמצאו

Pribnow box או TATA box - נוקלאוטידים מנקודת תחילת השעתוק- 10מרכזו של הרצף הזה הוא בערך

נוקלאוטידים במעלה הזרם מנקודת תחילת השעתק- 35מרכזו של הרצף השני הוא בערך.

משפיעים על השעתוק–או כשמקטינים את המרחק בין שני הרצפים , כשמבצעים מוטציות ברצפים אלה .

.זוהי הוכחה שהרצפים הללו משפיעים על השעתוק של הגנים שנמצאים במורדם

נצליח – AA- לGTואם נשנה את הרצף , (TATAAT)שונה מרצף הקונצנזוס (TATGTT)הרצף של אופרון הלקטוז

. (מוטציות לא תמיד מדכאות שעתוק)לעלות את רמת השעתוק

! נקודת השעתוק תשתנה אף היא בהתאם–כאשר משנים את מיקום הרצפים

:תפקידי הרצפים

קביעת נקודת תחילת השעתוק .א

השפעה על עוצמת השעתוק .ב

. אודותיהם נדבר בשיעור הבא, ניתן לבצע שני ניסויים– נקשר לרצפים אלו RNA polymeraseכדי לקבוע האם


103 2008' סמסטר ב

( לילי ורדימון13)שעתוק

. לנקודת תחילת השעתוקupstreamנוקלאוטידים - 35ו- 10ניזכר בשני הרצפים החוזרניים שנמצאים

.DNA-רצפים אלה קובעים את נקודת תחילת השעתוק ואת עוצמת השעתוק של ה

שכאמור משותפים להרבה , נקשר לרצפים החוזרניים הללוRNA polymeraseנסקור שתי שיטות שנועדו לקבוע האם

. גנים

Gel shift- שיטה ראשונה

.והיא מסוגלת לזהות כמויות קטנות של החלבון הקשור, DNA-השיטה נועדה לקבוע האם חלבון נקשר ל

". חם", אנו עובדים עם רצף רדיואקטיבי

מהלך השיטה

מדגירים את הרצפים החשודים עםRNA polymerase.

כאשר תנאי ההרצה נטיביים ומבטיחים שהקומפלקס , תחת שדה חשמלי (אקריל אמיד-פולי)ל 'מריצים בגDNA-

.חלבון לא יתפרק

, כך שנראה בנד נוסף, ללא חלבוןDNAל מאשר התנועה של ' שקשור אליו חלבון איטית יותר בגDNAהתנועה של

. שיימצא גבוה יותר

נקשר לכלל הרצפים או רק לרצף RNA polymeraseאנו לא יודעים האם - הבעיה היא שמתוצאות הניסוי לעיל

. הפרומוטור

: באורך דומה DNAכדי לוודא את הספציפיות ניצור תחרות עם שני סוגים של

DNA נוסיף למבחנה את אותם רצפי–" קר" ספציפי DNA , אך הפעם רצפים שאינם מסומנים רדיואקטיבית

והסימון הרדיואקטיבי , תתרחש תחרות– ספציפי RNA polymeraseאם הקישור של . בריכוזים הולכים ועולים

.על הקישור לחלבון, החםDNA- הקר שנמצא בעודף יתחרה עם הDNA-ה, יילך ויירד

(ל'שלא רואים בהרצה בג" קר"כי החלבון ייקשר לרצף ה)יילך וייחלש , נצפה שהבנד העליון

DNA נוסיף למבחנה פיסות –" קר" לא ספציפי DNAחסרות רצפי הפרומוטור ,RNA polymerase לא ייקשר

.והבנד העליון לא אמור להיחלש, לא תתרחש תחרות, אליהם


104 2008' סמסטר ב

DNase footprinting- שיטה שניה

:לשיטה זו יתרון וחיסרון יחסית לשיטה הראשונה

DNA-יחסית ל (RNA polymerase) דרוש הרבה חלבון :החיסרון

אלא ניתן , DNA אפשר לקבוע לא רק האם החלבון נקשר ספציפית לרצף :היתרון

.את המיקום המדויק ברצף שאליו נקשר החלבון, גם לזהות את האיזור

(משמאל)ללא חלבון - 1מבחנה

. באופן לא ספציפיDNA מעכל מולקולות DNAseהאנזים

DNA-במבחנה זו שמים רק את ה. נסמן את הפרומוטור רדיואקטיבית

. P32 באחד הגדילים בפופסט רדיואקטיבי 5הרדיואקטיבי שמסומן בקצה

. DNAseלמבחנה מוסיפים

כך שבאופן סטטיסטי האנזים יחתוך רק פעם , צריך להיות נמוךDNAse-ריכוז ה

בזמן נתון של DNA- לDNAse-היחס בין ריכוז ה. DNA-אחת במולקולת ה

. (אפשר לכמת זאת בניסויים)הדגרה יביא לחיתוך אחד פר מולקולה

למעשה נצפה , חתוכות באורכים שוניםDNAאנו צופים שהחיתוך יביא למולקולות

. בכלל האורכים האפשריים DNAכלומר נקבל מולקולות. לראות חיתוך לאחר כל נוקלאוטיד

. ונסתכל על הבנדים הרדיואקטיביים שמתקבלים, ל דנטורטיבי'לאחר החיתוך נריץ בג

. של בנדים שהמרחק ביניהם הוא נוקלאוטיד אחד (הנתיב השמאלי ביותר)נצפה לקבל סולם

(RNA polymeraseעם ) עם חלבון – 2מבחנה

. לרצףRNA polymeraseתחילה נאפשר זמן לקישור של . RNA polymeraseהפעם עם , חוזרים על הניסוי

כך שהפעם לא נראה חיתוך לאחר כל , DNAseהחלבון ממסך את יכולת החיתוך של , שיחתוך את הרצףDNAseנוסיף

.ולא נקבל רצפים בכל האורכים האפשריים, נוקלאוטיד

רואים רק את החלקים , שוב)ל 'מריצים את הגדילים בג, DNA-לאחר סיום העיכול מפרידים את החלבון מגדילי ה

. (המסומנים רדיואקטיבית

אין , ל אין סולם'באיזור מסוים על הג (בנתיב השני משמאל): התוצאה

אלו . ל'ג הג"כלומר פרגמנטים באורכים מסוימים לא הופיעו ע, בנדים

RNA לא יכל לחתוך עקב נוכחות DNAse-האיזורים בהם ה

polymerase . מתוך חישוב הגודל של הגדיל המקורי ובחינת הגדלים

-אפשר לקבוע במדויק מהו האיזור ברצף ה- של הפרגמנטים שנחתכו

DNAי החלבון" שהיה ממוסך ע .

של גן פרוקריוטי אליו נקשר ל' משמאל תוצאת הרצה בג RNA

polymerase .שממוקמים האחד , מתקבלים שני איזורים שלא נחתכים

האיזורים זוהו באופן יותר מדויק מאשר האיזורים . לנקודת תחילת השעתוקupstream- 35נוקלאוטידים והשני כ- 10כ

.י השוואת רצפים"ההומולוגיים השמורים שזוהו ע


105 2008' סמסטר ב

UP element

:מזהים שני רצפים עיקריים- בפרוקריוטים

TATA box – 6-7נוקלאוטידים

box35 -6נוקלאוטידים

UPלפרומוטורים חזקים במיוחד יש בנוסף

element שמשמש אף הוא לקישור תת

.RNA polymerase-יחידה של ה

ובגדיל , למרות שהפולימראז נקשר לשני הגדילים, coding strand-פ ה"המיקום היחסי של רצפי הקונצנזוס נקבעים ע

.השני יש רצפים משלימים

הפרומוטור

מקום הקישור שלRNA polymerase

נקודת התחלת השעתוק(start site)

ככל שהרצף יותר דומה לרצף הקונצנזוס . עוצמת הקישור נקבעת לפי הרצף המצוי בפרומוטור– עוצמת הקישור

. חזק יותרRNA polymerase הקישור של –

יעילות השעתוק יותר נמוכה ככל ש -RNA polymeraseנקשר חלש יותר .

( שעתוקמדכאים או משפעלים- רפרסור ואקטיבטור - חלבונים רגולטורים )תדירות התחלת השעתוק

לפי כיוון (רק גדיל אחד)הגדיל המשועתקRNA polymerase.

RNA polymerase של E.coli

holoenzyme – α2ββ’ωσ – יחידות αבעוד שיחידות , זהותβשונות .

core enzyme – α2ββ’ω – ללא יחידה σ (סיגמא) . צורה זו מופיעה מיד לאחר

.תחילת השעתוק

מאפייני הפולימראז בפרויקריוטים

3שמשעתקת את כל (שלא כמו באאוקריוטים)פולימראז אחת בלבד

(דומה בחיידקים רבים) RNA-סוגי ה

450משקל מולקולרי כוללkDalton

כ–מבנה מאורך המכסה -bp60


106 2008' סמסטר ב

תפקיד תתי היחידות

כדי להבין את תהליך השעתוק ניסו להרכיב מערכת שבה אפשר לקבל

RNA polymerase-לצורך כך צריך לנקות את ה. in votroשעתוק

קולונות מפרידות לפי פרמטרים )באמצעות כרומטוגרפיית קולונות

.(מטען, גודל, אפיניות: שונים

מה , שוטפים בריכוזי מלח עולים, בקולונהRNA-מעבירים את ה

בריכוז . (core enzyme) לשאר הקומפלקס σשמאפשר להפריד בין

ובריכוזים הגבוהים יותר , (σ)נמוך של מלח תצא תת היחידה סיגמא

.core enzyme יצא –

DNA- לholoenzyme לעומת core enzymeקבועי הקישור של

. הקישור יותר חזק–ככל שקבוע הקישור יותר קטן

ל-core enzyme – יש Km אחד לכל מולקולת DNA ( לרבות

.DNA- קישור חזק כלל ל– 10-10 – (הפרומוטור

ל-holoenzyme - קבועי קישור שונים:

o (קישור חלש מאוד)10-6- לרצף שלא מכיל פרומוטור

o עוד יותר , קישור חזק) 10-11 –לרצף שמכיל פרומוטור

(core enzyme-מה

מנגנון הפעולה של האנזים

core enzymeנקשר באופן אקראי ל -DNA (.10-10) בקישור חזק

holo- יש מעבר של האנזים לσלאחר קישור של תת היחידה

enzyme ,הקישור . (10-6)חלש יחסית /והקישור הפוך לרופף

- לסרוק את מולקולות הRNA polymerase-החלש מאפשר ל

DNA ,לרצפי הקונצנזוס, עד אשר הוא מגיע לפרומוטור, לנוע עליה .

עם ההגעה לפרומוטור האנזים עובר שינוי קונפורמציה ונקשר חזק

פתיחה : מה שגורם להתחלת השעתוק, (10-11)מאוד לפרומוטור

שגורמת , יש סינטזה של נוקלאוטידים בודדים–מיד עם פתיחת הבועה . של בועת השעתוק והנעת מערכת השעתוק

. core enzyme- נותר הDNA-כך שעל ה, (σ)המביא לשחרור של תת היחידה סיגמא , לשינוי קונפורמטיבי נוסף באנזים

(, 10-10- ל1110-) לאיזור הפרומוטור יורד מעט core enzyme-חוזק הקישור של ה - σלאחר יציאת תת היחידה

.mRNA- על הגדיל וההארכה של הcore enzyme-ומתאפשרת המשך תנועה של ה

. נוסף ולסייע בשעתוק של גן נוסףRNA polymerase- יכולה כעת להיקשר לσתת היחידה


107 2008' סמסטר ב

-factorσמאפשר את הקישור הספציפי החזק לפרומוטור

כאשר יש , תת היחידה הזו מתיישבת באופן ספציפי על רצפי הקונצנזוס

. חשיבות לפולריות היחסית של תת היחידה לעומת רצפי הפרומוטור

.מכתיבה את כיוון השעתוק ואת הגדיל שישמש כתבניתהפולריות

mRNAלכל אחת מתת היחידות תפקיד בהכרה של הפרומוטור ובסינטזה של

תת היחידותα –מעורבות באיניציאציה ובאינטרקציה עם פקטורים שמבקרים את השעתוק .

תת היחידותβ -וכן בקישור ה, מעורבות באיניציאציה ובאלונגציה-DNA

תת היחידהσ –תפקידה להכיר את רצפי פרומוטור

תת היחידהω (אומגה) –מגייסת את המרכיבים של הפולימראז ומייצבת את הקשר ביניהם .

מבנה מרחבי של האנזים

ממוקם –באיזור האוכף . מבנה אוכף שמתאים לתפקיד שלוRNA polymerase-ל

.mRNA בזמן הסינטזה של DNA-ה

והקשר לבקרת ביטוי גנים בחיידקיםσסוגי תת יחידה

.(סיגמא) σ תת היחידה –הגורם שמשתנה . RNA הוא משותף ותמיד מעורב בסינטזת core enzyme-ה

-. 35ו- 10 והוא מכיר פרומוטורים שמכילים את רצפי הקונצנזוס של 70σכאשר הראשי מכונה , σיש כמה סוגי

המאפיינים גנים בעלי תפקיד , -35ו- 10בהם יש רצפים אחרים באיזורים , בחיידקים יש גנים עם פרומוטורים אחרים

:מסוים

חלבוניheat shock - שכן תוצרי הגנים הללו מאפשרים , הביטוי של גנים אלה משופעל במצבים של עקת חום

. לחיידק להתמודד עם עקות למיניהן

החיידק משעתק את הגנים שמאפשרים לו – גנים המבטואים כאשר החיידק נמצא במדיום חסר חנקן

. להתמודד עם ההרעבה

וינווטו את הפולימראז 70σ אחרות שיתחרו עם σהיכולת לשעת את הגנים הייחודיים הללו מותנית בנוכחות תת יחידות

.מביטוי של גנים סטנדרטיים לביטוי של הגנים הייחודיים

RNA- שמביא לשינויים בsignal transduction מתרחש – ('הרעבה וכו/חום)כשהחיידק נמצא בתנאים מגבילים

polymerase וגורם לו לקשור באופן

σ-מועדף בתנאים המסוימים הללו את ה

שמכירה את הפרומוטורים של הגנים

.הייחודיים


108 2008' סמסטר ב

1SPO' בפאגσי מספר פקטורי "דוגמא לבקרת שעתוק ע

: סלקטיבי ומדורג, קבוצות גנים שצריך לבטא בסדר קבוע 3 יש 1SPO' לפאג

70- הפולימראז של הוירוס עושה שימוש ב–לביטוי של הקבוצה הראשונה - גנים מוקדמיםσשל החיידק .

. של החיידק70σ י"כלומר הפרומוטורים של הגנים המוקדמים צריכים להיות מוכרים ע

הגן האחרון במשפחת הגנים המוקדמים מקודד לפקטורσ 28 – חדשσ (70-קטן יותר מσ) .28, התוצרσ מתחיל

וכך RNA polymerase- מה70σולהדיח את , 70σעד שריכוזו מספיק גבוה כדי להתחרות עם , להצטבר בתא

להבטיח שהגנים המוקדמים לא ישועתקו יותר

ששונים , כעת מתרחש מעבר לשעתוק של הגנים שמבוטאים בשלב הביניים– גנים המבוטאים בשלב ביניים

.28σי "הפרומוטורים שלהם מזוהים ע, ברצף הפרומוטור מהגנים המוקדמים

.28σ שריכוזו יילך ויעלה עד לנקודה שבה הוא ידיח את 34σ-שוב הגן האחרון בקבוצה זו מקודד ל

34י "הפרומוטורים של גנים אלה מזוהים ע. מקודדים לחלבוני המעטפת של הוירוס - גנים מאוחריםσ , שמשנה

.וגורם לשעתוק של הגנים המאוחרים, RNA polymeraseאת הספציפיות של

היכולת שלRNA

polymerase להיקשר

והפרומטורים σלפקטורי

השונים מאפשרים בקרת

!שעתוק

הטרמינטור

RNA polymerase וניתוק של mRNA-לשחרור של ה, לטרמינציה, לסיום השעתוק, הטרמינטור הוא הסיגנל לסיום הגן

.DNA-מה

. של תוצר השעתוק3 לקצה upstreamהטרמינטור נמצא

. שמשועתקmRNA-כל הטרמינטורים בפרוקריוטים ורוב הטרמינטורים באאוקריוטים יוצרים מבנה שניוני של ה

:מפרידים בין שני סגי טרמינציה

ρ-Independent( ρ – Rho ,רו)

ρ-dependant

. hairpinנוצר מבנה - המסונטז RNA-בזכות הרצפים הספציפיים בסופו של ה

.גדילי שמתקפל על עצמו- החדRNA-אך המבנה התלת מימדי נוצר ב, DNA-י תבנית ה"למעשה הרצפים מוכתבים ע


109 2008' סמסטר ב

ρ-Independent termination

הגדיל העליון בתמונה ) coding strand-נסתכל על ה

(: mRNA-אלא הגדיל שנראה כמו ה, שאינו התבנית, לעיל

פלינדרום , inverted repeatאיזור הטרמינטור מכיל

הגדיל שמשמש כתבנית לשעתוק . TTTTובמורד לו יש

. התחתון, הוא המשלים

הוא רצף שמאפשר קומפלמנטציה Inverted repeat-ה

קריק עם התעגלות -פ זיווג ווטסון"ע, של הגדיל על עצמו

. hairpin/stem&loopקלה באמצע ליצירת

שמייצבים C- ובG- עשירים בinverted repeat-רצפי ה

. UUUU מכיל רצף RNA-אחריהם ה, hairpin-את מבנה ה

ניתקים – mRNA- של ה3ככל שנוספים נוקלאוטידים לקצה

. ומשתחרר מהפולימראז הולךmRNA-וה, 5נוקלאוטידים בקצה

: inverted repeatיש תחרות על הקומפלמנטציה עם רצפי

קומפלמנטציה של הגדיל שמשמש כתבנית - מצד אחד–

.דופלקס-הטרו

קומפלמנטציה עצמית לרצפים שכבר סונזטו על ה–מצד שני -

mRNA .

נותרים , יותר יציב מהקשר עם התבניתmRNA-מכיוון שהקשר עם ה

-מעט בסיסים בבועת השעתוק שסוחבים איתם החוצה את כל ה

mRNAלא רק שמספר הנוקלאוטידים שנותר בבועה קטן. שסונטז ,

אלו קשרים חלשים . דופלקס- שמרכיבים את ההטרוA-Uמדובר בקשרי

ואז ניתוק של , מבועת השעתוקmRNAשגורמים לניתוק של , יחסית

.וסיום השעתוק, מגדיל התבניתRNA polymerase-ה

ρ-dependent termination

. RNA polymerase- מmRNA-את ניתוק ה, מאפשר את הטרמינציה ρ( Rho)החלבון

. mRNA-ובעל רצף נוקלאוטידים שמשמש אתר הכרה ל, תת יחידות זהות6- הינו קומפלקס המורכב מρהחלבון

ρ של ה5 נקשר לקצה -mRNA (שעשיר ב-C) מיד

החלבון יודע . ATPעם היווצרותו תוך הידרוליזת

להתגלגל ובכך לעקוב , mRNA-ללפף סביבו את ה

. RNA polymerase-ולרוץ צמוד ל


110 2008' סמסטר ב

- ρ -לטרמינטור שאינו תלוי בρ -ההבדל העיקרי ברצף של טרמינטור שתלוי ב

מה שגורם , (stem & loop שיוצר inverted repeatיש ) UUUUהיעדר

שנוצר עקב ) stem&loop-בגלל מבנה ה. לרצף לחוסר יכולת להתנתק לבד

RNAיש השתהות של - mRNA-של ה (Inverted repeatרצפי

polymerase המביאה לאינטרקציה בין החלבון ρ לתת יחידה β שגורמת

.הגן של השעתוק ולסיום השעתוק מבועת mRNAלניתוק של

.י מוטציה ב "ניתנת לשיחזור עρ -טרמינציה שנפגעה עקב מוטציה ב

ρלחלבון יחסית באוריינטציהmRNA –משמאל

בעוד ', 3בקצה , הנוקלאוטידם מוספים מלמטה–

. מחליק בתוך החלבון כלפי מעלה' 5שקצה

בתוך החלבון יש מגרעת שמשמשת לליפוף

mRNA בתהליך תלוי ATP.

להתקדם בסמוךρ-התהליך מאפשר ל

. RNA polymerase-ל

(למדא) λ' בקרת ביטוי גנים במהלך שעתוק של פאג–טרמינציה -אנטי

.ים כדי לבקר באופן סלקטיבי ביטוי של גנים'י הפאג" מנוצל עρ-מנגנון הטרמינציה שתלוי ב

: יש שני מסלולים' לפאג

ויצירת חלבונים המאפשרים ליזיס של המאחסן שיביאו , כולל בתוכו יצירת ויריונים חדשים– מסלול ליטי .א

. לשחרור של הויריונים והדבקת התאים השכנים

, לתוך גנום התא' עושים אינטגרציה של החומר הגנטי של הפאג– כדי למנוע הרס של המאחסן – מסלול ליזוגני .ב

יוכל ' לאחר מכן הפאג. (הקצב הוא כמובן איטי יתר)יחד עם הגנום התאי ' וכך תהיה רפליקציה של הפאג

.להתפרץ ולהדביק תאים נוספים

מדביק באופן ליזוגני ואחרים הוא ' אחוז מסוים של התאים הפאג

.מדביק במסלול הליטי

האם ' צריכה להתבצע ההחלטה של הפאג–מיד לאחר ההדבקה

שהוא מסלול יותר איטי ויותר )לפעול במסלול הליטי או הליזוגני

. ("מסובך"

, משהה את המסלול הליטי ונותן אפשרות למסלול הליזוגני' הפאג

.טרמינציה-שמתרחש הודות למערכת האנטי


111 2008' סמסטר ב

-ρ יש –' באופרון של הפאגNמיד אחרי סיום הגן הראשון

dependant termination signal.

mRNA- של המאחסן והρמגוייס חלבון , stem & loopנוצר

משתחררים מבועת cro ולגן Nהקצרים שמקודדים רק לגן

לא יודעים לשפעל את ( cro- וN)שני הגנים הללו . השעתוק

.התהליך הליטי

. טרמינציה- מעורב בתהליך של אנטיNהגן

יש השהיה של המסלול –ברגע שיש טרמינציה של שעתוק האופרון

.Nונקבעת לפי רמת החלבון , ההשהיה מוגבלת. יש זמן להעביר את הגנום שלו לגנום של המאחסן' לפאג–הליטי

mRNA, יש ביטול של תהילך הטרמינציה–בריכוז גבוה מספיק . הולך ומצטבר עד שהוא מגיע לרמה קריטית Nהחלבון

.ויסונטזו כל הגנים של התהליך הליטי, הסינטזה של האופרון תימשך, לא ייפול מבועת השעתוק

Nטרמינציה של הגן -מנגנון האנטי

. Nשמשמש אתר הכרה של החלבון (אחר) stem&loop יש מבנה של N- הקצר שמקודד לmRNA-ל

נכנס לאתר הוא מגייס חלבונים נוספים של המאחסן N-וכש, יאכלס את האתר כשריכוזו בתא מספיק גבוהNהחלבון

. mRNA שממשיך לשעתק וליצור RNA polymeraseשמאפשרים תקשורת עם

מייצב את Nאך החלבון, mRNA- אמור לשחרר את הρהחלבון , Nכאשר מגיע סיגנל הטרמינציה אחרי הגן

ומתאפשרת המשך סינטזה של , mRNA- לשחרר את הρ מנטרל את היכולת של N –קשור ρ -ולמרות ש, הפולימראז

. האופרון של הגנים של המסלול הליטי

בקרת ביטוי גנים

: קבוצות עיקריות2-הגנים מתחלקים ל

גנים קונסטיטוטיביים – hose-keeping genes –ביטויים לא מושפע מתנאי הסביבה .

.'ריבוזומים וכיוב, tRNAתא תמיד צריך

יש מערכות . גנים הנדרשים רק במקרים מסוימים לצורך ביצוע פונקציות מסוימות– גנים אינדוסיביליים

. לאינדוקציה של גנים ספציפיים

- כ מערך הבקרה הוא שלילי "בד

הגנים יושבים תחת בקרה

תחת מערך רפרסיה , שלילית

שמאפשר אקטיבציה סלקטיבית

.של גנים


112 2008' סמסטר ב

י מספר אופרטורים באופרון הלקטוז"בקרת ביטוי גנים ע

הגנים ממוקמים , כמו בשאר האופרונים, באופרון זה. לפנינו אופרון הלקטוז

-צבר הגנים משותעק ל. י פרומוטור יחיד"בסמיכות ובקרתם מבוססת ע

mRNAפוליציסטרוני שיתורגם בהמשך לחלבונים שונים .

:באופרון הלקטוז מספר אופרטורים

1O – 11 רצף האופרטור שנמצא באיזור – האופרטור העיקרי +

.C- וG- מושלם המורכב בעיקר מinverted repeatהוא כמעט

3O2- וO – pseudo-operatorsבעלי תפקיד חשוב ברפרסיה .

יש חפיפה לתוצאה ( משמאל5עמודה ) lac repressor- של פרומוטור וFootprintingכשעושים

.( משמאל4עמודה ) RNA polymerase-המתקבלת בניסוי עם הפרומוטור ו

כלומר כשהרפרסור נקשר הוא חוסם את האיזור אליו אמור להיקשר RNA polymerase

.ובכך חוסם את השעתוק

(מר-הטטרה)אופן קישור הרפרסור

לכל אחת מתת היחידות . מר-הרפרסור נקשר לפרומוטור כטטרה

כל זוג הליקסים מחוברים . DNA- שנקשר לα-helixמבנה של

על גדיל inverted repeat-כל הליקס נקשר ל. בקצה ויוצרים דימר

.כ דימר"סה, כלומר על כל אחד משני הגדילים יש הליקס. אחר

היא הכי גבוהה ואליה 1Oאפיניות הקישור בשני הגדילים של

– (אין הבדל משמעותי) 3O- או ל2O-מר נקשר ל-הדימר השני בטטרמה. תמיד ייקשר דימר

. (אין שעתוק)התוצאה זהה

.DNA-מר נוצר לופ ב- וכדי להיקשר לטטרה–שני הדימרים נקשרים לשני האופרטורים

. RNA polymeraseומונע את ההתיישבות של , הלופ הוא חסימה פיזית של השעתוק

. ושל החלבונים של אופרון הלקטוז, mRNA ובודקים הצטברות של E.coliמגדלים - משמאל

, מסוים עליה ברמת החלבוניםlag-ואז ב, mRNA- יש עליה ב–לאחר הוספת הלקטוז

.הצטברות של חלבון אחד ואז של החלבון השני

אך יש רמה קבועה של שני , mRNA מיד נצפית ירידה של –כשמסלקים את הלקטוז

.(ההצטברות לא נעלמת)החלבונים

mRNA- ה–כך שברגע שנפסק השעתוק , פחות יציב מחלבוניםmRNA – יורדת מיד mRNA-הסיבה שבגללה רמת ה

לשני החלבונים קצב תרגום שונה –הסיבה שבגללה יש הבדל בריכוזי החלבונים שנוצרו . שהספיק להיווצר מתפרק

(. mRNA-י סיגנלים ברצף ה"שגם הוא מוכתב ע)


113 2008' סמסטר ב

( לילי ורדימון14 )–בקרת ביטוי גנים

אופרון הלקטוז

בקרה שלילית–אופרון הלקטוז

. האינדוסר של אופרון הלקטוז הוא צורת ביניים של פירוק הלקטוז

: סוכרים דרך שלב ביניים- לשני חדβ-galactosidaseי "הלקטוז מפורק ע

allolactose ,שהוא אינדוסר של הרפרסור.

יוצר לופ , DNA-בשיעור שעבר ראינו כיצד הרפרסור נקשר ל

.ומונע שעתוק

ג הרפרסור קובעת האם הרפרסור " עallolactose-קישור ה

.DNA-ייקשר או לא ייקשר ל

in vitroמשתמשים ב -IPTGבמקום ב -allolactose .

. הינו אינדוסר קבועIPTGכלומר , allo lactose- הוא אינו מתפרק כמו ה– IPTG-היתרון העיקרי בשימוש ב

על הרפרסורallo-lactose/IPTGהמנגנון המולקולרי שבו משפיע

קיים איזור מסוים בחלבון . מר-הרפרסור הוא טטרמה, כפי שראינו

. allolactoseאליו נקשר ואיזור אחר , מר-לייצוב הטטרהשאחראי

major-כל אחת מארבע תת היחידות תורמת הליקסים שנכנסים ל

grooveספציפיים ב רצפים שמכירים-DNA , יוצרים את הקישור לשני

.יוצרים את הלופ ומעכבים את השעתוק, האופרטורים

הניחו את תוצאות הגיבוש . IPTGגיבשו את הרפרסור בנוכחות ובהיעדר

.אחת על השניה

רפרסור שאינו קשור ל–בצבע בהיר -IPTG

רפרסור קשור ל–בצבע כהה -IPTG

כאשר )הליקסים שמופיעים רק בגרסה הבהירה -קל לראות למטה אלפא

הליקסים -האלפא - IPTG-כשיש קישור ל. (IPTG-הרפרסור אינו קשור ל

- לא יכול להיקשר לIPTG-ולכן רפרסור שקשור ל. מתקפלים לתוך המולקולה

DNA .אינם זמינים לקישור ל, ההליקסים נעלמים, חל שינוי מבני-DNA ואין

. רפרסיה


114 2008' סמסטר ב

לקטוז+ביטוי הגנים של אופרון הלקטוז במצע גלוקוז

וגילו שאין סינטזת חלבון כאשר β-galactosidaseבחנו את הביטוי של החלבון

.סינטזה מתאפשרת בשלב שבו מתכלה הגלוקוז במדיום. יש גלוקוז במצע

- מתקבלת עקומה דו– (בשחור)כשמסתכלים על עקומת הגידול של התאים

כאשר זהו , בנקודה שבה הגלוקוז במדיום נגמרplateuנוצר . diauxie, שלבית

.ואחריה ממשיך הגידול האקספוננציאלי, השלב שבו מתחילה סינטזה של האופרון

בקרה חיובית- אופרון הלקטוז

- רק כאשר הוא קשור לDNA-שיכול להיקשר ל, הוא חלבון דימר CAP( Catabolic Activating Protein)החלבון

cAMPעקב שינוי קונפורמטיבי .

. מעוכב בנוכחות גלוקוזAdenyate Cylcase משום שהאנזים cAMPבנוכחות גלוקוז אין יצירת

. אינו זמין לקישור לאופרוןCAP-כך ש, cAMP לא קשור CAP- ל–כלומר כשיש גלוקוז

CAPהחלבון

RNA polymerase-אתר קישור ל, DNA-החלבון מכיל אתר קישור ל

.cAMP-ואתר קישור ל

הסתבר (cAMP-כשהוא קשור ל) CAP- של חלבון הfootprintingכשעשו

RNA לנקודת הקישור של upstream נקשר לפרומוטור CAP-שה

polymerase .

רצף הקונצנזוס של אופרון הלקטוז

נצליח – AA- לGTואם נשנה את הרצף , (TATAAT)שונה מרצף הקונצנזוס (TATGTT)הרצף של אופרון הלקטוז

. (מוטציות לא תמיד מדכאות שעתוק)לעלות את רמת השעתוק

ולאופרונים אחרים ) האופרון שמר על רצפים שאינם אופטימליים כי זה מאפשר לאופרון הלקטוז –במהלך האבולוציה

בנוכחות חלבון נוסף שמחזק את RNA polymeraseלהתנות את הפעילות של (סוכרים-שאחראיים לפירוק של דו

. DNA- לRNA polymeraseהקישור של

RNAהרצפים הקיימים אינם מאפשרים הכרה אופטימלית של

polymeraseאת הפרומוטור .

הוא משמש כאקטיבטור של – קשור CAP-רק כאשר חלבון ה

RNA polymeraseומייצב את הקישור .


115 2008' סמסטר ב

מידת השעתוק של גני האופרון במצעים שונים

יש גלוקוז, אין לקטוז .א

o כי )הרפרסור בקנופורמציה כזו שבה הוא מחובר לאופרטור

(allolactoseאין

o ל-CAP אין cAMP (כי יש גלוקוז) ,כלומר הוא לא קשור ל-

DNA.

o כי , תמיד יש רמה מסוימת)רמת השעתוק כמעט לא קיימת

שיאפשרו כניסה של permeaseחובה שיהיו חלבוני

.(הלקטוז במקרה ויופיע במצע לקטוז

ויש גלוקוז, יש לקטוז .ב

a. הרפרסור הודח מה-DNA בעקבות קישור של

allolactose

b. ל-CAP אין cAMPוהוא אינו קשור ל -DNA

c. תאורטית היעדר רפרסור . רמת השעתוק נמוכה

אך , RNA polymeraseמאפשר קישור של

. CAPהקישור לא מספיק יציב כי אין

ואין גלוקוז, יש לקטוז .ג

a. הרפרסור מודח מה-DNA בעקבות קישור של allolactose ,

b. ל-CAP קשור cAMP ,והוא נקשר ל-DNA

c. רמת השעתוק גבוהה .RNA polymeraseוחלבון ה, יכול לשעתק את האופרון כי אין רפרסור-CAP

.השתעוק הוא יעיל ביותר. DNA- לRNA polymeraseנוכח ומייצב את הקישור של

אופרון הטריפטופאן

האופרון מכיל מספר גנים שמעורבים בסינטזה

(.trp)של חומצת האמינו טריפטופאן

: מערכות בקרה 2באופרון זה

במעלה . בדומה לאופרון הלקטוז, יש רפרסיה– עודף חמור של טריפטופאן .א

- שמקודד לרפרסור שיכול להיקשר לאתר ההכרה על הtrpRהאופרון יש גן

DNAוכאשר , דימר-הרפרסור הוא הומו. רק בנוכחות טריפטופאן בתאים

-קו) שני טריפטופאנים נקשרים לרפרסור –כשטריפטופאן נמצא בעודף

(. מאפשרים לו להיקשר לאופרטור)ומפעילים אותו (רפרסורים

כאשר ריכוז הטריפטופאן לא מספיק כדי לגייס את – עודף קל של טריפטופאן .ב

. כך שמבחינת התא אין סיבה להפעיל את האופרון, אך עם זאת עדיין יש עודף קל, ולהפעיל אותו, הרפרסור


116 2008' סמסטר ב

Leader region - מערכת בקרה נוספת למקרים של עודף קל

upstreamרצף שנמצא , נוצרה מערכת בקרה נוספת

על , attenuationשאחראי על , לגנים של האופרון

האיזור הזה יודע לפקח על . החלשת הביטוי של הגן

. השעתוק במקרים של עודף קל בלבד

1רצף: ארבעה מקטעים רלוונטייםLeader-באיזור ה

4רצף, (בצהוב) 3רצף, (בורוד) 2רצף, (בסגול)

.(תכלת)

(צהוב) 3ורצף (ורוד) 2רצף – inverted repeats , יודעים ליצר מבנה תלת

(מימין). מימדי שאינו מפסיק את השעתוק

(תכלת) 4ורצף (צהוב) 3רצף – inverted repeats , יודעים ליצר מבנה של

hairpin ,המביא ל-ρ-independent termination . כלומר אם נוצר מבנה

(משמאל). הוא מפסיק את השעתוק–כזה

stop-ו (AUG)יש לו סיגנל לאיניציאציה של תרגום , מקודד לפפטיד קצר, trpL ,attenuator הרצף – (בסגול) 1רצף

codon .בפפטיד הקצר שני קודונים לטריפטופאן .

. עם טריפטופאןtRNAתלויה בזמינותן של מולקולות מהירות הסינטזה של הפפטיד

-מכאן ההמשך תלוי בריכוז של ה, mRNA- מיד עם היווצרות הmRNA-בפרוקריוטים הריבוזום מתחיל לתרגם את ה

tRNAעם טריפטופאן :

הריבוזום משתהה בזמן - רמת טריפטופאן נמוכה מאוד

ששועתק 2רצף. התרגום של שני קודוני הטירפטופאן

עוד לפני ) 3 עם רצףhairpinבינתיים יודע ליצור מבנה של

לאחר מכן יימשך התרגום של שאר . ( משועתק4שרצף

. downstreamהרצפים ושל כל החלבונים של האופרון שנמצאים

הריבוזומים רודפים במהירות אחרי - עודף קל של טריפטופאן

RNA polymerase (אין מחסור ב, אין השתהות-tRNA עם

יוצר 3ובינתיים רצף, 2הריבוזום ממסך על רצף. (טריפטופאן

. שגורם לסיגנל לטרמינציה4מבנה עם רצף

RNA polymeraseמתנתק מה -DNA , ישattenuation ,

, שנגרמת בגלל שיש עודף קל של טריפטופאן שמאפשר את הסינטזה המהירה של הפפטיד, הפסקת שעתוק

. 2והמיסוך של רצף

באופרוני Hisו -Leu (אין רפרסור) זהו מנגנון הבקרה היחיד


117 2008' סמסטר ב

בקרת שעתוק גנים באאוקריוטים

:הבקרה יותר מורכבת

ברמת החלבונים

o יש מספרRNA polymerases

o מעורבים פקטורי שעתוק כלליים

o אקטיבטורים-מעורבות אקטיבטורים וקו

(האקסונים) ישנם אתרי בקרה קרובים ורחוקים מהחלקים המקודדים – ברמת אתרי הבקרה.

בעל תפקיד חשוב בתהליכי שעתוק, מאפיין אאוקריוטים– כרומטין.

לאנזימים של נשווה בין מיקום הגנים המקודדים

מסלול ייצור הטריפטופאן בפרוקריוטים

:ובאאוקריוטים

חלבונים 5 גנים שיוצרים 5יש - בפרוקריוטים

.שונים תחת פרומוטור אחד

כל אחד מהגנים הללו יושבים במקום – בשמר

לכל גן יש . (לעתים על כרומוזמים אחרים)אחר

ולכן כמות , איזורי בקרה וטרמינציה משלו

.החמר הגנטי הנדרשת גדולה יותר

נשווה בין כמות החומר הגנטי הנדרשת לבקרה של הגנים

יש איזור בקרה קומפקטי יחסית לפני האופרון - בפרוקריוטים

.שמכיל את האיזורים המקודדים לחלבונים

לגן - באאוקריוטיםβglobin יש מספר אקסונים שמקודדים

אך )יש איזורי אינטרונים שמוצאים בתהליך השחבור , לחלבון

בנוסף קיימים איזורי . (הם צריכים להישמר ולעבור מדור לדור

פרומוטור שנמצא יחסית סמוך לנקודת : בקרה גדולים מאוד

ואיזורי בקרה נוספים מרוחקים שהמרחק , תחילת השעתוק

. kb50-ביניהם לבין האקסונים יכול להגיע ל

.זהו הסבר אפשרי לכמות החומר הגנטי הגדולה שיש באאוקריוטים


118 2008' סמסטר ב

RNA polymeraseאאוקריוטי

:בניגוד לפרוקריוטים יש כמה סוגי פולימראזות, באאוקריוטים

פולימראזות גרעיניות3

מולקולות שונות של 3- שיעבור חיתוך לpre-rRNA- משעתקת גנים שמקודדים ל– בגרעינון RNA polyerase1 .א

rRNA .גנים בלבד200-משעתקת כ .

. אלף גנים30משעתקת כמעט . snRNA- וmRNA משעתקת – בגרעין RNA polymerase2 .ב

. גנים בלבד30-50משעתקת . snRNA- וpre-tRNA ,5S rRNA משעתקת – בגרעין RNA polymerase3 .ג

הן נבדלות ברגישותן לחומר (DNA על שרשרת RNAבונות )תפקודית כל הפולימראזות דומות /למרות שמבחינה טכנית

α-aminitin:

RNA polymerase1 –אינו רגיש כלל ל -α-amanitin

RNA polymerase2 – 1 רגיש לריכוז שלμg/ml

RNA polymerase3 - 10רגיש לריכוז שלμg/ml

פולימראז נוספת

מכאן ההסבר שמקור ) הפרוקריוטי polymerase-היא דומה ל. ובכלורופלסטים בצמחים, ח"נמצאת במיטכונדריה בבע

.(המיטוכונדריה היא בחיידק

הפרדת פולימראזות בכרומטוגרפיית קולנות

ושוטפים , DEAE-sephadexשמים בקולונת , לוקחים תמצית תאים

, (בשחור)אוספים פרקציות מהקולונה . בריכוזים הולכים ועולים של מלח

.ולאחר מכן בודקים את נוכחות הפולימראזות

בריכוזי מלח נמוכים /בלי מלח - (10עד )בפרקציות הראשונות–

.(שלא נקשרים לקולונה)יוצאים רוב החלבונים

יוצא - (בריכוזי מלח בינוניים)~ 20בפרקציותRNA polymerase1

יוצא ~ 40בפרקציותRNA polymerase2

יוצא ~ 50בפרקציותRNA polymerase3 .

.RNA polymeraseבודקים בפרקציות השונות שנאספו האם יש שם פעילות של

.α-aminitin- משתמשים בתכונת הרגישות ל–כדי להפריד בין סוגי הפולימראזות

. DNAלכל פרקציה מוסיפים נוקלאוטידים מסומנים רדיואקטיבית ותבנית

.(בתכלת) α-aminitin 1μg/mlופעם בריכוז של (בורוד) α-aminitin פעם ללא –את הניסוי עושים פעמיים

בנוכחות RNAאך מפסיק לסנטז , α-aminitin ללא RNAשיודע לסנטז , (שחור)יש חלבון ~ 40ניתן לראות שבפרקציה

α-aminitin 1μg/ml מכאן שהחלבון הוא RNA polymerase2 .

. RNA polymerase1 (אינו רגיש) α-aminitin בהיעדר ובנוכחות RNAיש חלבון שממשיך לסנטז ~ 20בפרקציה


119 2008' סמסטר ב

באאוקריוטיםRNA polymeraseמבנה

RNA polymerase-ה, בניגוד למספר המוגבל של תת יחידות שמעורבות בבניית הקומפלקס החלבוני הפרוקריוטי

RNAיחידות של -הדומה למבנה של תת, כאשר לחלקן מבנה הומולוגי, תת יחידות12-האאוקריוטיות מכילות כ

polymeraseפרויקריוטי .

יש מספר תת יחידות שדומות –אם משווים בין הפולימראזות שונות

.זו לזו

יש – הפרוקריוטי core enzyme- תת היחידות שהן הבסיס ל5מלבד

תת יחידות נוספות שמופיעות בשלושת הפולימראזות 4

. האאוקריוטיות

לכל , בנוסף לתת היחידות שנמצאות בכל שלושת הפולימראזות

.של תת יחידות נוספות הייחודיות לה (3-7)פולימראז מספר שונה

הנבדלת מתת היחידות 1 יחידה תתRNA polymerase2-ל

CTD( Carboxy היא מכילה זנב – 3- ו1המקבילות בפולימראזות

Terminal Domain) פעמים 26שמכיל רצפים שחוזרים על עצמם בין

. פעמים באדם52-בשמר ל

שלוש – Serine, Treonine, Tyrosine-הרצף החוזרני עשיר ב

הזרחון קריטי בשעתוק של גנים . חומצות אמינו שיכולות לעבור זרחון

. RNA polymerase2י "שמבוקרים ע

RNA polymerase2מבנה

בתמונה מוצגים רק החלקים ההומלוגיים לפולימראז

שתי הפולימראזות יוצרות מבנה אוכף שבו . הפרוקריוטי

. DNA-נכנסת מולקולת ה

RNA polymeraseי "זיהוי הגנים ע

הכיווניות )הזיהוי של הפרומוטור זהה לזו שבפרויקריוטים

אך האיניציאציה של השעתוק ותהליך הבקרה של , (חשובה

.השעתוק מורכבים יותר

אנו רוצים לדעת בדיוק באיזה - של גן ספציפי mRNA-ואנו יודעים לזהות את ה, למרות שיש לנו את הרצף של הגן

+(. 1מהו ה)נוקלאוטיד מתחיל השעתוק


120 2008' סמסטר ב

נקודת תחילת השעתוק

: שיטות שמאפשרות לקבוע מהי נקודת תחילת השעתוק2

והרצף , 5 שמסומן רדיואקטיבית בקצה ssDNAמכינים גלאי - Nuclear protection או S1 endonuclease .א

לנקודה Upstreamמבטיחים שהגלאי ארוך מספיק וחולש על פני איזור שנמצא . שלו משלים לגדיל התבנית

.שמוערכת כנקודת התחלת השעתוק

endonuceaseשהוא , 1Sוחושפים לאנזים , של גן מסוים שהופק מהתאים עם הגלאי המסומןmRNAמדגירים

עד לנקודה ( אך זה לא רלוונטיmRNA-וה)האנזים יחתוך את הגלאי . בלבדssDNA או ssRNAשיודע לחתוך

.mRNAדופלקס עם -ההטרו, גדיל-שבה מתחיל הדו

ששומר על מבנים )ל דנטורטיבי 'דופלקס החתוך ונריץ את התוצרים בג-בשלב הבא נעשה דנטורציה של ההטרו

. שההבדל בגודלן הוא נוקלאוטיד אחד בלבד והן יוצרות סולםDNAחתיכות , לצד סמן (גדיליים-לינאריים חד

. (אנו עושים את הבדיקה עם גלאי מסומן רדיאוקטיבית ולכן נראה רק אותו)

נוכל להסיק –מפני שאנו יודעים את הרצף של הגלאי שסונטז . מדגם הפסים המתקבל נסיק על גודלו של הגלאי

. את נקודת תחילת השעתוק5ידי ספירה אחורה מהקצה -על

שהרצף שלו , מסומן רדיואקטיבית, נוקלאוטידים20- הפעם מכינים פריימר קצר בן כ– primer extension .ב

.(משתדלים שהפריימר יהיה קרוב ככל האפשר לנקודת תחילת השעתוק המוערכת)משלים לאיזור שמקודד לגן

. של גן מסוים מהתאים ומאפשרים היברידיזציה עם הפריימר המסומןmRNAמפיקים

כך שהסינטזה תימשך עד שהתבנית , ונוקלאוטידיםReverse Transcriptaseבשלב הבא מוסיפים את האנזים

. Reverse Transcriptase- תיגמר לmRNA-של ה

. ל דנורטיבי לצד סמן'ושוב מריצים בג, mRNA-עם סיום הראקציה עושים דנטורציה של הפריימר המוארך וה

.קובעים את אורך הפרגמנט- פ דגם הפסים והשוואה לסולם שיוצר הסמן "ע

. נסיק על נקודת תחילת השעתוק - mRNA- שקודד לDNA- מתוך ידיעת הרצף של ה

אם הפריימר נצמד - שחבור : הבעיה

ייתכן –לאקסון לאחר שעבר שחבור

שנקודת תחילת השעתוק רחוקה הרבה

והאקסון שלנו מופרד מנקודת , יותר

. תחילת השעתוק באינטרונים שהוצאו

לאחר מספר פעמים בהם חוזרים על

אפשר בכל פעם לתכנן פריימר –הניסוי

קרוב יותר לנקודת תחילת , אחר

בסופו של דבר נגיע לפריימר . השעתוק

שימוקם על האקסון הראשון שמכיל את

. נקודת תחילת השעתוק ואיזור האיניציאציה


121 2008' סמסטר ב

רצפי הבסיסים במעלה נקודת תחילת השעתוק

.וקבעו עבור כל אחד מהבסיסים את שכיחות הופעתו בכל אחת מהנקודות, גנים60-בדקו את הרצפים ב

TATA box

.T- וAיש קופסה שמראה שכיחות גבוהה של נוקלאוטידי - לנקודת תחילת השעתוק upstream- 34ו- 26באיזור שבין

. וכן הלאה, Tולכן רצף הקונצנזוס הוא , T מהמקרים מופיע 82%- ב–ראו שבנקודה מסוימת

, שנמצאת ברוב הגניםTATA boxכך נמצאה

.במעלה נקודת תחילת השעתוק

– משפיעה על שעתוק TATA box-כדי לוודא ש

עשו בה מוטציות מוכוונות וראו השפעה על

.השעתוק

רצפים נוספים

: RNA polymeraseי " קופסאות רצפים שמופיעים בגנים אאוקריוטים שמשועקים ע4-זוהו כ

BRE – אתר קישור לפקטור TFIIB( TF2B )–מופיע במעלה ה -TATA box .

TATA box

Inr – (אין שימור אבולוציוני של הרצף) יש רצף קונצנזוס שונה בין דרוזופילה לאדם.

DPE –רצף שנצא במורד לנקודת תחילת השעתוק

וריאביליות גדולה בין הגנים

אחרים מכילים את , בלבדInrאחרים מכילים , בלבדTATA boxיש גנים שמכילים

.'שניהם וכו

תפקידן של כלל הקופסאות עדיין נחקר ותפקידן עדיין לא ברור באינציאצית

. השעתוק

אך הם נדרשים , לא מכיר את הרצפים האלהRNA polymerase-כיום ידוע ש

אך במנגנון שונה , משפיעים על עוצמת השעתוק, ליצירת קומפלקס איניציאציה

.בהשוואה לפרוקריוטים

RNA polymerase2פקטורי שעתוק של

נקבל בכל – שמכיל תת היחידה סיגמא ונוקלאוטידים DNA RNA polymeraseכשנשים על מולקולת - בפרוקריוטים

. מנקודת תחילת השעתוק, פעם שעתוק אמין

– עם כל האיזורים וקופסאות ההכרה יחד עם נוקלאוטידים DNA על RNA polymerase2אם נשים את - באאוקריוטים

. לא מכיר את הפרומוטור באופן אמיןRNA polymerase ,לא מנקודת תחילת השעתוק, נקבל שעתוק רנדומלי

. שמתחיל מנקודת תחילת השעתוק, אפשר ליצור שעתוק אמין–כאשר מוסיפים למערכת באאוקריוטים גם תמצית תאים

. כדי לזהות את נקודת תחילת השעתוקRNA polymerase-יש בתאים מרכיב נוסף שנדרש ל: המסקנה


122 2008' סמסטר ב

II/2הספרה , TF2X( Transcription Factorמרכיבים אלו מכונים

.( שם הפקטור– RNA polymerase2 ,Xעבור

.כדי לקבל שעתוק אמין יש להוסיף את כלל הפקטורים

. הפקטורים שנים מאוד זה מזה

TF2Bבעוד שאחרים כמו , הינו חלבון אחדTF2H הינו קומפלקס

. תת יחידות8שמכיל

General Transcription Factorsכל המרכיבים הללו מכונים

הם , שמאפשרים את יצירת קומפלקס האיניציאציה של השעתוק

ואת פתיחת בועת RNA polymeraseהמאפשרים את הזיהוי של

.השעתוק באופן ספציפי לרצף


123 2008' סמסטר ב

( לילי ורדימון15) פקטורי שעתוק –בקרת ביטוי גנים

GTF – General Transcription Factors

אינו מספיק בשביל להתחיל שעתוק אמין שמתחיל בנקודת התחלת RNA polymerase-בשיעור שעבר ציינו ש

.השעתוק

. לשלושת הפולימראזות יש פקטורי שעתוק כלליים הנדרשים לאינציאציית שעתוק

TF2D

: מורכב גם מTF2Dבעיקרון , קיימת חוסר אחידות בטרמינולוגיה

TBP – TATA Binding Protein (ולעתים כחלק מ, לפעמים הוא מצויין בנפרד-TF2B.)

TAF – TATA Associated Factor – ישנם סוגים שונים של TAFs .

TBP – TATA Binding Protein

. המבנה השלישוני של החלבון מראה סימטריה כפולה, סימטריה מיוחדתTBP-ל

כך ששני חצאים שלו אך מדובר בחלבון בודד שמתקפל , החלבון נראה כדימר

. נראים זהים

TBPהחלבון – major groove- שנקשרים לDNA-בניגוד לרוב חלבונים קושרי ה

שפותח DNA- יוצר קיפול בTBP –כדי להגיע לבסיסים . minor groove-נקשר ל

. Minor groove-את ה

DNA- יש כיפוף של ה– DNA- לTBPכלומר בנקודות הקישור של

. שנקשרים לרצפים אחרים שנמצאים בסביבהTAFs-הודות ל, TATA קושר גם רצפים שאינם TBP –למרות השם שלו

מנגנוני קישור ואיניציאציית שעתוק

.RNA polymerase-קיימים שני מנגנונים אפשריים לגיוס הקומפלקס של פקטורי שעתוק כלליים ו

ומשמש כמעין מנחת DNA- נקשר לTBP – (מימין) .א

RNAלקומפלקס שמכיל את כלל הפקטורים עם

polymerase.

אחריו מגויסים , נקשר ראשון TBP– (משמאל) .ב

כאשר גיוס של כל , הפקטורים האחרים בסדר מסוים

אחד מהפקטורים מכשיר את הגיוס של הפקטור

.שייקשר אחריו


124 2008' סמסטר ב

Gel shift

נשתמש שוב , ומי לא, DNA-כדי לקבוע מי מהחלבונים נקשר ל

. (שראינו גם בשיעור שעבר) Gel shiftבשיטת

ומקבלים , ל'מריצים ג, באופן רדיואקטיביDNAמסמנים פיסת

.DNA-לפי הגודל של פיסת ה, (נמוך)בנד

עם חלבונים בודדים וקומפלקסים DNA-מדגירים את פיסת ה

נקבל בנד – DNA-אם החלבון נקשר ספציפית לפיסת ה. שונים

.חלבון ירוצו לאט יותר+כי הפיסה, יותר גבוה

. 'וכו, נקבל בנד עוד יותר גבוה–אם נוסיף חלבון נוסף

פ " עDNA-מיקום הבנד ירמוז לנו על סוג הקומפלקס שנקשר ל

. המקרא למטה

עם DNA-המריחה נוצרת כשמדגירים את ה, ריבוי הבנדים

אחרות קשורות לשני , חלק מהפיסות קשורות לחלבון אחד- כמה חלבונים

.חלבונים וכן הלאה

והאם יש , DNA-בשיטה זו בדקו איזה מהחלבונים יודעים להיקשר ל

. סדר לקישור

DNA הדגירו פקטורי שעתוק כלליים עם פיסת –בכל אחד מהנתיבים

.רדיואקטיבית

בלבד יודע להיקשר TF2D- הנתיבים הראשונים נסיק ש5מתוצאות

– TF2Dכששמו את כל פקטורי השעתוק מלבד ). DNA-באופן יציב ל

.(אין קישור, מתקבל רק בנד אחד

מקבלים בנד חלש של (6נתיב )כשמכניסים למבחנה את כלל הפקטורים

ומקבלים בנדים רבים שמייצגים מספר הולך ועולה של , TF2Dקישור

.DNA-פקטורי שעתוק שונים שנקשרו ל

. ולהבין את הקומפלקסים הנוצריםDNA-להבין את סדר הקישור ל, אפשר לעשות מספר קומבינציות


125 2008' סמסטר ב

:על סמך התוצאות הללו הוצע המודל של יצירת קומפלקס התחלת השעתוק

.TBP- שמלווים את הTAFs- המורכב מTF2Dקישור של .1

הרצפים שליד ה -TATA – קובעים אילו TAFs ייקשרו

.לפרומוטור

TF2Bקישור של .2

CTD-זנב ה. TF2F אליו קשור RNA polymeraseקישור של .3

. חייב להיות לא מזורחןRNA polymerase-של ה

נוצר pre-initiation complex

TF2Eקישור של .4

-שהופך את הקומפלקס מ, המרכיב הקריטי– TF2Hקישור של .5

pre-initiation complexל -initiation complex .

:אנזימתיות/ שתי תכונות קריטיותTF2H-ל

מאפשרת את פתיחת בועת השעתוק–הליקאז

מאפשרת זרחון אתרים ספציפיים על זנב ה–קינאז -

CTD של RNA polymerase

שני התהליכים הללו מאפשרים יצירתinitation

complexוהתחלת שעתוק .

מבנה האוכף של הקומפלקס מאפשר לקומפלקס לחבוק את מולקולת ה -DNA.

ChIP- Chromatin Immuno-Precipitation

– GTF)השיטה בה השתמשו כדי לברר האם כל פקטורי השעתוק הכלליים

General Transcription Factors) נדרשים גם לאלונגציה של השעתוק או שהם

. מעורבים רק באינציאציית שעתוק

האם החלבון : על השאלה הנשאלת להיות מאוד ספציפית- כדי להשתמש בשיטה

או שהוא נקשר גם לרצפים , הסגול נקשר לאיזור הפרומוטור בלבד של גן מסוים

. In vivoבמעלה הפרומוטור /אחרים שנמצאים במורד

: דרך העבודה

Chromatin fixation - מטפלים בתאים ב-formaldehyde – שעושה צימוד (cross-linking) בין חלבונים ל-

DNAהחומר נכנס לתאים שלמים ומקבע את המצב בתא כפי שהוא בזמן נתון. ובין חלבונים לחלבונים.

Sonication - פתיחת התאים וחיתוך של מולקולות ה-DNAנקבל –י ויסות של זמן הסוניקציה "ע. באופן אקראי

. נקולאוטידים500פרגמנטים שגודלם בערך

מוסיפים נוגדנים שקשורים ל-sephadex ,ל-beads . כך שהנוגדנים(שעל ה-beads) נקשרים לחלבון הנבדק .


126 2008' סמסטר ב

מסרכזים את המבחנה כך שה-beadsעם הנוגדנים והחלבון שקשור ל -DNAשוקעים ומגיעים לפלט .

מפרקים את )שוטפים את הפלט ומרחיפים אותו בתמיסה שעושה רוורסיה של הצימוד , מסלקים את הנזל העליון

(.form-aldehydeי " עDNA-הקשר שנוצר שבין החלבונים ל

ונשארים עם מולקולות , מסלקים את החלבונים מהמערכתDNAבודדות שהיו קשורות לחלבון .

עושיםPCR - משתמשים בפריימרים שיאפשרו סינטזה של כל האיזורים על ה-DNA שאנו מעוניינים לבדוק האם

. החלבון נקשר אליהם או לא

תהיה המבחנה היחידה שבה יתקבל - המבחנה שמכילה את הרצף הזה –אם החלבון נקשר רק לרצף מסוים

. (ל'נגלה את התוצרים שהתקבלו בהרצה בג) PCR-תוצר מראקציות ה

:חשוב לזכור

(1+) נקודת תחילת השעתוק.

קודוןATG – נקודת

.איניציאציית התרגום

נזכור שה -mRNA מכיל UTRלפני ואחרי ה -ORF ,ולכן שעתוק ותרגום לא מתחילים באותה נקודה.

בשמרים1GAL נסתכל על דוגמא של שעתוק ChIPכדי להבין את השימוש בשיטת

.י גלקטוז" משופעל עGAL1ביטוי הגן , בשמרים

1ACT- ל1GAL בין mRNA-השוואה בין כמות ה

. בהיעדר ובנוכחות גלקטוזGAL1 של mRNA-תחילה אנו מסתכלים על כמות ה

.ACT1 בשם house-keeping gene –הביקורת

. ניתן לראות את ההבדלים בעובי הבנד המתקבל בגלל ההבדלים ברמת השעתוק

. הולכת ועולה ככל שריכוז הגלקטוז עולה1GALרמת השעתוק של הגן

נקשרים לאיזור זה במהלך RNA polymerase-כדי לבדוק האם פקטורי השעתוק ו, ORF-נסתכל על נקודה אקראית ב

.האלונגציה

ChIP בדיקה האם אחת מתת היחידות של – ראשון RNA Polymerase2

(משמאל) ORFנקשרת לפרומוטור ולאיזורי

: שנועדו למספר איזוריםPCRנעשה מספר תגובות

RNA כשמתחיל שעתוק של הגן מוצאים יותר –הפרומוטור .א

polymerase כמות . (הבנד הופך עבה יותר) שיושב על הפרומוטור

.החלבון הולכת ועולה עם העלייה בריכוז הגלקטוז

. עלייה בעוצמת הבנד עם העלייה בשעתוק הגן– GAL1 של הגן ORF .ב

אין שינוי ברמת השעתוק של הגן–פריימרים שמכוונים לפרומוטור של גן אחר - ביקורת .ג


127 2008' סמסטר ב

ChIP בדיקה האם – שני TPB נקשר לפרומוטור ולאיזורי ORF (מימין)

.1GAL לפרומוטור של TBPיש עליה בקישור של- ככל שיש עליה בשעתוק של הגן - הפרומוטור .א

.TBP אין הבדל ברמת הקישור של – GAL1 של הגן ORF .ב

אין שינוי ברמת השעתוק של הגן–ביקורת .ג

.רואים אותו רק באיזור הפרומוטור, אינו ממשיך באלונגציה, RNA polymerase אינו מלווה את TBP: המסקנה

נוספיםChIPביצוע

באופן דומה נשאל על כל שאר ה -GTFהאם הם מלווים את ה -RNA polymerase ( האם הם מממשיכים

. (בזמן תהליך האלונגציה, ORF-להיקשר ל

יש עליה (TF2D-מלבד ב)בכל הפקטורים

בקישור של פקטורים שונים לפרומוטור של

. של הגןORF-אך לא ל, 1GALהגן

RNA polymeraseזאת בניגוד לקישור של

. ORF-שנקשר הן לפרומוטור והן ל

פקטור השעתוק היחיד שבו אין עליה בקישור לפרומוטור הוא TF2D ,בהתחשב , התופעה לא הגיונית

.DNA-בעובדה שזהו הפקטור הראשון שנקשר ל

-אך הסתבר ש, TAF1בניסוי שלפנינו השתמשו בנוגדן נגד . שוניםTAFs- ומTBP- מורכב מTF2D: הסיבה

1TAF ,לא משתתף באיניציאציית השעתוק של הגן הזה, במקרה.

מעגל השעתוק האאוקריוטי

קישורTBP עם TAF

TF2B

TF2F – RNA polymerase

TF2E

TF2H – ההצטרפות של פקטור זה גורמת לפתיחת

מה שמאפשר , CTD-בועת השעתוק וזרחון זנב ה

. תחילת שעתוק

על הפרומוטור נשארים כל פקטורי השעתוק לאחר ש -

RNA polymeraseהפקטורים הנותרים . מתחיל בשעתוק

RNAשממתינה לסיבוב נוסף של , משמשים לתחנת עגינה

polymerase .

60- למשך סינטזה של עד כTF2F- וRNA polymerase –TF2E-טוענים ששני מרכיבים נשארים ללוות את ה

(. ChIP-ולכן לא רואים אותן ב)נוקלאוטידים בלבד


128 2008' סמסטר ב

CTD-זרחון זנב ה

Serine בזנב ה5 בעמדה -CTDי " מזורחן עTF2H ,

.ולאחר מכן חומצות אמינו נוספות מזורחנות

-זנב ה- מסיים את השעתוק RNA polymerase-כש

CTDעליו –וכדי שהפולימראז ישעתק שוב , שלו מזורחן

. להסיר את הזרחון

המנגנון בשאר הפולימראזות

גם . לא נקשרים באופן ישיר לפרומוטורRNA polymerase3- וRNA polymerase1גם - RNA polymerase2כמו

כולם –החלבונים והפולימראז עצמה , DNA-אך הרצפים על ה, במקרה זה הקישור לפרומוטור תלוי בפקטורי שעתוק

.(העיקרון דומה) RNA polymerase2שונים מאלו שבמנגנון הקישור של

של גנים ספציפיים, ביטוי סלקטיבי

הרי , לא מסבירים את תופעת הביטוי הסלקטיבי של גנים מסוימים בתאים מסוימים–כל המנגנונים שתיארנו עד כה

, הן בתאים שבהם הגנים מבוטאים)הגנים מכילים את אותם רצפים והתאים מכילים את אותם פקטורים בכל סוגי התאים

. (והן בתאים שבהם הגנים לא מבוטאים

איזורי בקרה מרוחקים

ולחפש את האיזורים , החלו לבחון איזורים יותר מרוחקים מהפרומוטור

.הנדרשים כדי לקבל ביטוי גבוה של גן מסוים בתא מסוים

בכל פעם חתכו חלק , 5-חתכו מאיזורי הבקרה של הגן הנבדק את הקצה ה

את חתיכות הגן . כך שהתקבלו חתיכות בגדלים שונים, מעט גדול יותר

. הכניסו לפלסמיד עם גן מדווח

כולם מכילים את הגן המדווח ורצף באורך אחר , התקבלו פלסמידים רבים

.איזורי הבקרה/של איזור הפרומוטור

מקודד לחלבונים שאינם קיימים בתא הנבדק שאפשר – גן מדווח

. פליטת האור שלו/לכמת את התוצר שלו

:משתמשים בגנים

CAT Chloramphenicol Acetyl Transferase))

Luciferase ( חותךluciferinומתקבל תוצר פלורסנטי )

β-galactosidase.

ובודקים מהו הרצף שמקנה את הביטוי של הגן , לאחר מכן עושים טרנספקציה של הפלסמידים לתאים אאוקריוטים

. המדווח


129 2008' סמסטר ב

שיטות טרנספקציה של DNAלתאים אאוקריוטים :

CaP – Calcium-Phosphateיוצר משקע לא מסיס עם ה -DNA שנספח על פני התא ונכנס לתוך התא

. באנדוציטוזה

Electroporation – זרם חשמלי במתח גבוה לזמן קצר גורם ליצירת חורים ננומטריים בממברנת התא

. לחדור לתאDNA-ומאפשר ל

ליפוזומים הם . השיטה המקובלת כיום– ליפוזומים

ליפידים -שכבה של פוספו-מעין וזיקולות עם דו

הליפוזום נכנס לתא . שבתוכה כולאים את הפלסמיד

זה )בתהליך של אנדוציטוזה או בתהליך של איחוי

הפלסמיד מוצא את דרכו לתוך , (לא ברור לגמרי

וזמין לשעתוק , (במנגנון שאינו ברור לגמרי)הגרעין

. לאחר מכן הגן יעבור תרגום ונוכל לאתר אותו, RNA polymeraseי "ע

:תוצאות הניסוי

.(שהיא כמובן תלויה במקטעי איזורי הבקרה שהוכנסו), לאחר הטרנספקציה בודקים את מידת הביטוי של הגן המדווח

: לאור התוצאות אפשר להציע את מיקומם של איזורי הבקרה

3 ליצירת 2האיזור שהוחסר ממקטע

5 ליצירת מקטע 4האיזור שהוחסר ממקטע

Linker scanningאת האיזורים החשודים נבדוק בשיטת

. רצף הפלסמיד–בכתום

. איזור הבקרה הנבדק–בצהוב

. גן מדווח–בתכלת

בכל פעם –נהנדס פלסמידים שבהם באיזור החשוד כאיזור בקרה

תוך יצירת חפיפה קטנה בין , נחליף מקטע קטן במקטע אחר

.האיזורים המוחלפים

עושים טרנספקציה של הפלסמידים לתאים ושוב בודקים את רמת

.הביטוי של הגן המדווח

כעת אפשר להציע את המקטעים הספציפיים שמעורבים בבקרת

. הביטוי

. קופסאות בקרה3יש : המסקנה


130 2008' סמסטר ב

:שיטת העבודה

.אנו מעוניינים להחליף מקטע מסוים במקטע סינטטי

את הרצף של (משמאל)ברשותנו פלסמיד שמכיל

, Eשמכיל את אתר הרסטריקציה (הפלסמיד)הוקטור

. (מימין) Bעם אתר הרסטריקציה ומכיל גם את הרצף של הגן המדווח

PCRמשתמשים בשני פריימרים– ראשון :

o שמכיל אתר הכרה לאנזים רסטריקציה , מאיזור הוקטורE.

o שמכיל בקצה את הרצף הסינטטי , לסיום הפרגמנט שרוצים לשחלף, (בכחול)קומלפנטרי לגבול

.Hשרוצים להכניס פנימה ואתר הכרה לאנזים רסטריקציה

.E ובקצה השני את אתר Hיתקבל פרגמנט ארוך שמכיל בקצה את הרצף הסינטטי ואתר הרסטריקציה

PCRשני הפריימרים– שני :

o מאיזור הגן המדווח שמכיל אתר הכרה לאנזים רסטירצקיהB.

o שמכיל בקצה את הרצף הסינטטי , לסיום הפרגמנט שרוצים לשחלף, (בתכלת)קומפלנטרי לגבול

.Hשרוצים להכניס פנימה ואתר הכרה לאנזים רסטריקציה

.B ובקצה השני את אתר Hואתר הרסטריקציה , יתקבל פרגמנט ארוך שמכיל בקצה את הרצף הסינטטי

.sticky endsומקבלים , חותכים בשלושת אנזימי הרסטריקציה

, H הם ייקשרו זה לזה בגלל הקצוות הדביקים שנוצרו לאחר חיתוך באנזים הרסטריקציה –כשנדגיר את שני הפרגמנטים

. משני הקצוותB- וEשמכיל את המקטע הסינטטי במרכז ואת אתרי הרסרטיקציה , גדילי-ויתקבל מקטע דו

PCR שני הפריימרים– (הגברה) שלישי :

o שמכיל אתר הכרה לאנזים רסטריקציה , מאיזור הוקטורE.

o מאיזור הגן המדווח שמכיל אתר הכרה לאנזים רסטירצקיהB.

. תתקבל כמות גדולה של הפרגמנט הרצוי שמכיל את הרצף הסינטטי במרכז

.ובעזרת רקומבינציה נכניס את המקטע הסינטטי לתוך הפלסמיד, E- וBחותכים את הפלסמיד באנזימי הרסטריקציה

תאיים-אופן ארגון איזורי הבקרה בשמרים בהשוואה ליצורים רב

בשמר

TATA-box - לנקודת - 90נמצאת

.תחילת השעתוק

UAS - Upstream Activating

Sequence – רוב הגנים השמריים

upstreamמכילים איזור בקרה יחיד

.TATA-box-ל


131 2008' סמסטר ב

ביצורים עילאיים

:באורכים גדולים, יש איזורי בקרה מרובים

Promotor Proximal Elements –איזורים הקרובים לנקודת תחילת השעתוק

Enhancers – איזורים שנמצאים במרחקים עצומים מהגן

o במורד נקודת תחילת השעתוק/במעלה .

o מחוץ לאיזור המקודד/באינטרונים .

המרחק של איזורי הבקרה יכול להיות עד kbp50מהאיזורים המקודדים .

בשכיחות/השוני הוא בקומיבנטוריקה, רצפי הבקרה זהים

. איזורי הבקרה הם לא ייחודיים לכל גן

לכל גן יש צירוף אחר של אלמנטי , יש משחק של קומיבנטוריקה

. אך אבני הבניין משותפות לגנים רבים, הבקרה שייחודי לגן

: לדוגמא

GC-box פעמים ב6 הינו רצף שמופיע -SV40 ,ופעמיים ב-

Thymidine Kinase .

CAAT-box –רצף שמופיע ב -Thymidine Kinase אך חסר

.SV40-ב

ובכל גן אותם איזורי , לא כל הגנים יכילו את כל איזורי הבקרה

.סידור שונה/ יהיו בשכיחות שונה–הבקרה שקיימים בגנים נוספים


132 2008' סמסטר ב

( לילי ורדימון16) רצפי בקרה –בקרת ביטוי גנים

לגנים אאוקריוטים יש רצפי בקרה

:הנדרשים לביטויים של הגנים

איזורי בקרה הסמוכים לנקודת תחילת השעתוק–פרוקסימליים .

Enhancer –באינטרונים או מחוץ לאיזור , איזורים שיכולים להימצא במרחק רב מנקודת תחילת השעתוק

. המקודד

שכן הם משמשים אתרי קישור , הרצפים הספציפיים משנים את רמת הביטוי

. לחלבונים שמשפיעים על השעתוק

GC-box – ב: לדוגמא) נמצאת סמוך לנקודת תחילת השעתוק-SV40 חזרות 6 יש

.(של הרצף בפרומוטור

אך בשיטה זו לא , footprinting- נשתמש ב–כדי לזהות חלבונים שנקשרים לרצף

.אלא רק האם יש קישור חלבונים לרצף, נגלה את סוג החלבון הנקשר

בעזרת קולונת זיקה–זיהוי החלבון הנקשר

הסובסטרט בקולונה . נשתמש בקולונת זיקה– מבין כלל החלבונים GC-box-שנקשר ל (באדום)כדי לזהות את החלבון

. DNAהוא מולקולות

מעבירים את תמצית . אקראייםDNA הקולונה מכילה רצפי – 1שלב

יישטפו DNA-החלבונים שאין להם כלל זיקה ל. התאים בקולונה

ויישטפו רק לאחר שטיפה , DNA-ואחרים ייקשרו לרצפי ה, מיד

ביניהם יישטף , (medium salt wash)בתמיסה בריכוז מלח בינוני

. החלבון שאנו מחפשים

וכעת , בשיטה זו אנו מצמצים דרמטית את כמות החלבונים שנבדוק

.DNA-נמשיך את הסלקציה רק עם חלבונים בעלי אפיניות ל

שמעניין אותנו DNA- המטריקס בקולונה זו קשור לרצף ה– 2שלב

ושוב (התמצית שהתקבלה מהשטיפה בתמיסת המלח)מטעינים את התוצר . GC-box, בלבד

. שוטפים עם מלח בריכוז בינוני

והחלבון היחיד שיישאר קשור , באופן לא ספציפי יישטפוDNAכל החלבונים שקושרים

. אותו אנו מחפשיםGC-box-בקולונה הוא החלבון שיש לו אפיניות גבוהה ל

( 3נתיב )בשטיפה הראשונה , (ריבוי בנדים)יורד מכלול רב של חלבונים (2נתיב ) תחילה

נקבל בנד מסוים (4נתיב )ובשטיפה השנייה , כמות החלבונים שיוצאים יורדת דרמטית

. Sp1שהוא החלבון , CG-box-שנקשר ל


133 2008' סמסטר ב

DNAse footprinting נבדוק בשיטת GC-box- אפיניות גבוהה לSp1כדי לוודא שאכן יש לחלבון

רצפי 6 שמכיל 40SVוהוסיפו אותו לרצף הפרומוטור של , כשלקחו את החלבון שניקינו בקולונת הזיקה

GC-box – בבנדים" חלל" מתקבל ,DNAseלא מצליח לחתוך מקומות מסוימים על הפרומוטור .

.GC-box- אכן נקשר לSp1החלבון : המסקנה

טרנספקציה-קו, functional assay( in vivo) נבצע –כדי לדעת האם יש תפקיד לחלבון

שמכיל גן שמקודד לחלבון הנבדק 1יוצרים פלסמיד (Sp1.)

אותו נרצה להכניס , אך אנו לא יודעים את הרצף שמקודד לו, ברשותנו חלבון שבודדנו בקולונת הזיקה

, מתוך כך נבדוק במאגר שמכיל את כלל הרצף הגנטי, נרצף את רצף חומצות האמינו של החלבון. לפלסמיד

. נכניס לפלסמיד תחת פרומוטור חזקSp1 של cDNA-את ה. ונמצא את הרצף המתאים שמקודד לחלבון

לאיזור הפרומוטור המינימלי שמאפשר את . שמכיל גן מדווח2יוצרים פלסמיד

או ) GC-boxיצירת הקומפלקס של איניציאציית השעתוק מוסיפים את הרצף

השעתוק תלוי בקישור של פקטור . (40SVלחילופין משתמשים בפרומוטור של

. ולא יתרחש בלעדיוGC-box-השעתוק המתאים ל

(מחדירים כמה פלסמידים בבת אחת לתא אחד)טרנספקציה לתא -עושים קו .

כמו כל פקטור . שיצא לציטוזול ויתורגם לחלבוןmRNA- ישועתק לSp1-הגן שמקודד ל

שמאפשרים לחזור NLS( Nuclear Localization Signal) מכיל אלמנטי Sp1 –שעתוק

. נקבל ביטוי של הגן המדווח– GC-box- מכיר את הSp1אם אכן . לפני הגן המדווחGC-box-ולהכיר את ה, לגרעין

והן בפקטור השעתוק GC-boxכדי לדווא שביטוי הגן תלוי הן ברצפי הבקרה - הניסוי דורש את הביקורות המתאימות

Sp1 .בשני הניסויים אנו לא אמורים לקבל ביטוי של הגן המדווח.

ונבדוק ביטוי של הגן המדווחSp1-נערוך את הניסוי ללא הפלסמיד שמכיל את הגן ל .א

ונבדוק ביטוי של הגן המדווחGC-box אינו מכיל 2נערוך את הניסוי עם שני הפלסמידים אך כאשר פלסמיד .ב

(adenovirusפרומוטור של ) GC-boxבקרה עם פלסמיד שאינו מכיל . ב

: נערכו ארבע טרנספקציות

(Sp1-אינו תלוי ב, GC-boxללא ) adenovirus שמכיל פרומוטור של 2פלסמיד

יש ביטוי של הגן– 1ללא פלסמיד .א

יש ביטוי של הגן– 1טרנספקציה עם פלסמיד-קו .ב

(.GC-box רצפי 6פרומוטור מינימלי עם ) 40SV שמכיל פרומוטור של 2פלסמיד

אין ביטוי של הגן – 1ללא פלסמיד .א

יש ביטוי של הגן– 1טרנספקציה עם פלסמיד-קו .ב

:למעשה הבנד שראינו לעיל שהתקבל יכול להיות תוצאה של מספר ניסויים שונים

היברידיזציה עם גלאי קומפלמנטרי של הגן המדווח– Northern blot .א

בדיקה בעזרת נוגדנים לגילוי נוכחות של הגן המדווח– Western blot .ב

RNAse protection .ג


134 2008' סמסטר ב

מורכבות הבקרה וקומבינטוריקה של פקטורי שעתוק

כל האתרים משמאל הם רצפים המשמשים אתרי הכרה לפקטורי

והנוכחות , שעתוק שיודעים להיקשר בצורה יציבה לרצף מסוים

.שלהם נמצאה כמשפעלת שעתוק

כך שבתאים שבהם , לכל רצף יש את החלבון הספציפי שנקשר אליו

ובתאים שבהם חסר פקטור , הגן יבוטא- יש פקטור שעתוק

. הגן לא יבוטא–השעתוק

. (פקטור אחד לפחות לכל גן) פקטורי שעתוק 30,000מנגנון בקרה כזה היה דורש : הבעיה

הפרומוטורים מכילים אתרי –כדי לבקר מספר גדול של גנים באופן ספציפי עם מעט מאוד פקטורי שעתוק : הפתרון

ושימוש במעט , מה שמאפשר קומבינטוריקה מורכבת- כמות האתרים שונה /בכל פעם הרכב האתרים. הכרה רבים

. פקטורי שעתוק כדי ליצור את הספציפיות

. יבטאו את הגן– פקטורי השעתוק הדרושים כלרק תאים שמכילים את - במנגנון זה

. קיימים צירופים שונים של נוכחות פקטורי שעתוק ברקמות שונות. תאים מסוגים שונים חולקים חלק מפקטורי השעתוק

. מרוחקיםenhancers-פקטורי השעתוק נדרשים באיזור פרוקסימלי וב. לפנינו דוגמא לגן שמתבטא רק בתאי כבד

. ( רקמות או בכלל הרקמות בגוףX-ייתכן שהם מבוטאים ב)חלק מפקטורי השעתוק הדרושים לא ייחודיים לתאי כבד

הייחודיים )ורק הקומבינטוריקה של נוכחות של כל פקטורי השעתוק , אך יש שני פקטורי שעתוק היחודיים לתאי כבד

. תביא לביטוי של הגן (והכלליים

המנגנון המולקולרי שבו קישור משפעל ביטוי של גנים

:לפנינו שתי אפשרויות הגיוניות

ובכך מייצבים , ולקומפלקס האיניציאציה של השעתוק מצד שני, מצד אחדDNA-פקטורי השעתוק נקשרים ל .א

אתר : שני אתרים/ יש לפקטור השעתוק שתי תכונות–אם האפשרות הזו נכונה . DNA-את הקומפלקס על ה

. DNA-קישור לקומפלקס האיניציאציה ואתר קישור ל

RNA polymerase- ומסייעת לDNA- משנה את הקנפורמציה של הDNA-הקישור של הפקטורים ל .ב

של פקטור השעתוק צריך להיות מספיק כדי DNA- אתר הקישור ל–אם האפשרות הזו נכונה . לשעתק

.(לא נזדקק עוד לדבר כדי לקבל ביטוי של הגן)לשפעל את השעתוק

כדי להבחין בין שתי האפשרויות- ניסוי בחוסרים

. ועשו בו חוסרים סדרתייםGAL4 של פקטור שעתוק שמרי cDNAלקחו

בפרומוטור UAS- בTATA-box-כדי לוודא שאכן פקטור השעתוק נקשר ל

הכניסו את הגן המקודד )טרנספקציה כפי שראינו לעיל - ביצעו קו–שמרי

.( לפניוTATA-box עם lacZ שמכיל את הגן המדווח 2ויצרו פלסמיד, 1 לתוך פלסמידGAL4-ל


135 2008' סמסטר ב

יצירת חוסרים )כעת נבדוק בעזרת הורדת מקטעים מהחלבון

DNAונבדוק בכל פעם האם המקטע שנותר יודע לקשור (מכוונים

.ולשפעל שעתוק

:התוצאה

החלבון השלם נקשר ל-UAS , ויש אקטיבציה משמעותית

.של השעתוק

חומצות האמינו בקצה ה50לאחר חיתוך של -N טרמינלי –

.שתי היכולות אבדו

אמינו מהקצה ה90-לאחר חיתוך של כ -C טרמינלי חלה

(אין פגיעה בקישור)ירידה קטנה ביכולת לשפעל שעתוק

חומצת אמינו מהקצה ה130-לאחר חיתוך של כ -N אין ) טרמינלי חלה ירידה משמועתית ביכולת לשפעל לשעתק

.(פגיעה בקישור

חומצות אמינו מהקצה ה190-לאחר חיתוך של כ -C היכולת לקשור ) טרמינלי היכולת לשפעל שעתוק אבדה

DNAנותרה בעינה ) .

חומצות אמינו ראשונות 74בחלבונים שהכילו (מהקצה ה-Nטרמינלי ) (. אין יכולת שפעול)יכולת הקישור נשארה

בחלבונים שמכילים את החלק ה-Cטרמינלי וה -N שתי – (כל החלק המרכזי של החלבון חסר) טרמינלי בלבד

.התכונות נשמרות

האחד אחראי לשפעול , שני אתרים שונים פיזית, לחלבון יש שתי תכונות נפרדות- הניסוי הזה מציע שככל הנראה

. והאיזורים שונים במאפייניהם, השעתוק והשני לקישור

הקצה ה-N אחראי על קישור ל– טרמינלי של החלבון -DNA.

הקצה ה-C אחראי על שפעול השעתוק– טרמינלי של החלבון .

יש לזכור שבניסוי זה לא שללנו שקישור מביא לשינוי קונפורמציה ) עצם הקישור אינו גורם לשפעול השעתוק: המסקנה

. ( שתורם לאקטיבציית השעתוקDNA-של ה

מבנה פקטורי שעתוק

Activating domain-ו, (בכתום) DNA binding domainלפקטורי שעתוק

.(בירוק)

עשויים . המיקום היחסי של האיזורים על החלבון משתנה בין פקטורי השעתוק

DNA binding domainאך רק , activating domainsלהיות מספר

. אחד


136 2008' סמסטר ב

פקטורי שעתוק הם מודולריים

.ולהכניס אותו בפקטור שעתוק אחר- מפקטור שעתוק אחד DNA binding domainאפשר להסיר מקטע של

אליו נקשר פקטור שעתוק ירוק וגן כתום אליו , גן ירוק- בדוגמא משמאל

.נקשר פקטור שעתוק כתום

של activating domain-ניקח את ה: ניצור פקטור שעתוק כימרי

. של הגן הכתוםDNA binding domain-החלבון הירוק ונקשור ל

-מאחר והרצף של הקישור ל, נקבל חלבון כימרי שיאקטב את הגן הכתום

DNAלמרות שהפקטור הכימרי . קריטי לפעילות של פקטור השעתוק

הוא יצליח לשפעל את – של הגן הירוק activating domainנושא

(. activating domain-למקורו של ה/אין חשיבות לזהות)הביטוי

הבסיס המבני לזיהוי של פקטור השעתוק את רצף ההכרה שלו

י קשרים בין חומצות אמינו " נעשה עDNA-הקישור בין פקטור שעתוק ל

הקשר מבוסס על אינטרקציות חלשות יחסית של קשרי . DNA-לבסיסי ה

הקישור נעשה –כדי לאפשר קישור יציב וספציפי . ולס-דר-מימן וקשרי ון

אם אין התאמה בין חומצות ) נקודות שונות באתר הכרה 10-20-ב

לא יהיה שפעול –האמינו של החלבון לפקטור השעתוק באתרים רבים

.(של השעתוק

ספציפיות = מספר גדול של אתרים + קשרים חלשים

DNA binding domainמבנה

:לדומיין יש מספר מוגבל של מבנים מיוחדים ואופיינים

1 .Zinc finger motif – Sp1כדוגמא

Sp1נקשר ל -DNA binging domainבאמצעות אבץ .

לפקטורי שעתוק אחרים יש אפילו ) אצבעות אבץ Sp1 3-ל

. (עשרות אצבעות אבץ

4ביניהן , חומצות אמינו30- מורכבת מ–מבנה ראשוני של אצבע אבץ

. ( היסטידינים2- ציסטאינים ו2 ציסטאינים או 4)חומצות אמינו חשובות

המבנה השניוני של הרצף הזה מזכיר צורה של - המבנה השניוני

. חומצות האמינו לעיל נמצאות בקורדינציה לאטום אבץ4כאשר , אצבע

- אנטיβ-sheets ובשני α-helix- מאופיין ב–המבנה השלישוני

. sheets-ושתיים על אחד ה, ל נמצאות על ההליקס"כאשר שתי חומצות אמינו מתוך הארבעה הנ, פרלליים


137 2008' סמסטר ב

. α-helix-האיזור שיוצר את הקשר עם הנוקלאוטידים הוא ה

נקשר לשני α-helixכאשר בכל פעם , אצבעות האבץSp1 3-ל

.DNA-זוגות נוקלאוטידים על ה

מתוך המבנה הקריסטלוגרפי אפשר לראות שיש

, α-helix -זוגות נוקלאוטידים שאינם מעורבים בקשר ל

אך המרחק שהם יוצרים בין הזוגות הקושרים חשוב

. חוסר של הזוג שלא מעורב באינטרקציה תקרב בין הזוגות האחרים ותפגע בקישור. ביותר

לא פוגמת – (או להיפך) A-T- בG-Cכי החלפת הזוג , אנו יודעים שזהות הזוג שאינו מעורב בקישור לא חשובה

.בקישור לפקטור השעתוק

2 .Helix loop helix motif – Maxכדוגמא

יש משפחות של פקטורי שעתוק שחולקות מבנה . כדימריםDNA-חלק גדול מפקטורי השעתוק נקשרים לאתרי הקישור ב

. דימרים-והפקטורים ששייכים לאותה משפחה יכולים ליצור הטרו, דומה

. DNA-כי כל אחד מהחלבונים מרכיב רצף אחר על ה, כך מתאפשר מגוון רב של אתרי קישור

.ויוצר לופ, מכיוון שיש הליקס שמסתובב, helix-loop helix motiמשפחה אחת כזו מכונה

עשיר בחומצות אמינו בסיסיות DNA-שמעורב באינטרקציה עם ה" תחתון"החלק ה

לקישור )משמש לדימריזציה " עליון"והחלק ה, DNA-שמאפשרות קישור לבסיסי ה

האיזור שמאפשר את הדימריזה . coiled coilכך שנוצר , (של פקטור השעתוק השני

-ה). DNA-אחרת הקומפלקס לא יציב ונופל מה, DNA-הכרחי לקישור ל

Activating domain דימר שמכונה - הומו–משמאל . ( יכול להיות בכל מקוםMax

. שמעורב בהתמיינות תאי שריר

3 .motif Leucine zipper

הניחו זה על זה את רצפי חומצות האמינו של פקטורי

ומצאו איזור שעשיר , שעתוק שונים שיודעים ליצור דימרים

ובהמשך את חומצת האמינו , בחומצות אמינו בסיסיות

leucine חומצות אמינו7 שמופיעה לאחר כל .

זהו מספר חומצות האמינו הנדרש כדי – חומצות אמינו 7

.α-helixלהשלים שני סיבובים של

נוצר מעין רוכסן שמשמש לדימרזיציה של שתי תת leucine-בעזרת ה

. או תת יחידות זהות, יחידות שונות

כאשר האיזור הירוק , leucine המודל שהוצע לרוכסן –בתמונה מימין

. DNA-למטה מכיל את חומצות האמינו הבסיסיות שנקשרות ל

נמצאים זה ליד זה leucine-אלא שה, הסתבר שהמבנה הוא לא ממש רוכסן

.(משמאל)והסלילים מתלפפים זה על זה


138 2008' סמסטר ב

המגוון המתאפשר הודות לדימרים של פקטורי שעתוק

כדימרים DNA-העובדה שפקטורי שעתוק נקשרים חלקם ל

מסבירה כיצד יחסית מספר קטן של חלבונים יכול להכיר מספר

ויכול לשפעל שעתוק של DNA-גדול של אתרי הכרה שונים ב

.מספר גדול של גנים

כל אחד , פקטורי שעתוק מאותה משפחה3 דוגמא של –משמאל

דימרים - הטרו3-דימרים ו- הומו3י יצירת "ע. מהם מכיר רצף אחר

. אתרי הכרה6 נוכל להכיר –

. דימרים תכיר מגוון עצום של אתרי הכרה- פקטורי שעתוק שיכולים ליצור הומודימרים והטרו10מכאן שמשפחה שיש בה

Transcription Activating Domainמבנה

. של פקטורי שעתוקactivating domains-ברור וידוע שמשותף ל, אין מבנה מוגדר

דומיינים חומציים

דומיינים עשירים בגולטמין

דומיינים עשירים בפרולין

co-hybrideחלקם ניסויי . הבנת הפעילות של הדומיינים התקבלה בעזרת ביצוע ניסויים

systems שבודקים עם אילו חלבונים יכולים Activating domainsליצור אינטרקציה .

אפשר לבדוק אינטרקציה של הדומיין עם כל אחד מהמרכיבים של קומפלקס אינציאציית

בפקטור השעתוק להיקשר לחלבונים activating domain היכולת של –שהרי הבסיס לשפעול השעתוק , השעתוק

(. basal transcription machinery)שמרכיבים את הקומפלקס

. הסיכוי להתחלת שעתוק עולה–וכשהקומפלקס יותר יציב , הקישור מייצב את הקומפלקס

Sp1 –דוגמא

אתר האקטיבציה שלSp1( Q) יודע להיקשר ל-TAFs , מה שמייצב את קומפלקס

. האיניציאציה

.אקטיבטורים-קו/לעתים הקישור מתווך בעזרת מדיאטורים

בירוק - בתמונה העליונה -Activating domainנקשרים ישירות ל -TAFs או

.למדיאטורים

. DNA- נקשרים לDNA binding domain –בכחול

basal transcription-יודע לקשור גם את ה- אקטיבטור -קו/מדיאטור

machinery –וגם את ה -activating domain ,והוא משמש כמעין גשר.

מולקולת ה-DNA יכולה להתקפל על עצמה וכך הפקטורים השונים שנקשרים

. מגיעים כולם למגע עם הקומפלקס הענק- רחוק מנקודת תחילת השעתוק


139 2008' סמסטר ב

תפקיד הכרומטין בבקרת שעתוק

. האאוקריוטי עטוף בחלבוני כרומטין שגורם לשפעול השעתוק להיות עוד יותר מורכבDNA-ה

. שני ליפופים פר נוקלוזום– core histones מלופפת סביב DNA-מולקולת ה

:ולו מספר תפקידים, כאשר המבנה המורכב ביותר הוא הכרומוזום, המבנה מתקפל ויוצר מבנים מורכבים

המבנה מאפשר לארוז מולקולה ענקית בגרעין קטן .א

מאפשר לחלק את האינפורמציה הגנטית שווה בשווה בין שני תאי הבת .ב

בזמן חלוקת התא

לא יוכלו לעבור הכרה של – שארוז באופן דחוס DNA-בקרת שעתוק .ג

.י כרומטין"שכן אתרי ההכרה של הפקטורים ממוסכים ע, פקטורי שעתוק

ולכן על הפקטורים להתגבר על , דיכוי של השעתוק– ברירת המחדל של הכרומטין

. דחוס/המבנה הסגור

אפשר לראות בנדים באורכים – DNAseאם חותכים את המולקולה בריכוז נמוך של

.י ההיסטונים" ואיזורים שמוגנים עDNAse-שונים שמוכיחים כי יש איזורים נגישים ל

1Hהיסטון

האיזור מחבר בין ) linker DNA- נקשר ל1Hהיסטון

גורם למבנה –הקישור מאפשר את הקירוב בין הנוקלאוזומים . (נוקלאוזומים

. להיות עוד יותר קומפקטי

זנבות ההיסטונים

ואינם מהווים חלק , טרמינלי שנותרים חופשייםN-להיסטונים יש זנבות בקצה ה

. מהמבנה הקומפקטי של הנוקלאוזום

core- סביב הDNA-בשלב הראשון הם מכתיבים את צורת הליפוף של ה

histone ,אך לזנבות יש תפקיד נוסף .

. המלופף על הנוקלאוזוםDNA-חומצה טעונה חיובית שמאפשרת לה ליצור קשר עם ה, Lysine-הזנבות עשירים ב

חוסמת את הגישה של פקטורי core histonesהאינטרקציה עם

.DNA-שעתוק ל

יש צורך לנטרל את –האתגר של מערכת השעתוק כדי לאקטב גן

. HAT – Hystone Acetyl transferaseי אנזימי "האינטרקציה ע

מטעינים את החומצה על , acetyl CoA- משתמשים בHATאנזימי

האצטילציה מנטרלת את המטען החיובי , (NH-על ה)הקצה הטעון

כך שהזנבות של ההיסטונים , ופותחת את הקשריםlysine-של ה

. DNA-מתנתקים מה


140 2008' סמסטר ב

תכונה שלישית של פקטור שעתוק– Chromatin remodeling complex- וHATגיוס

:יש תכונה שלישית ( ושפעול שעתוקDNA-קישור ל) התכונות שציינו דוקם 2-כלומר לפקטורי שעתוק יש בנוסף ל

ולגייס קומפקלסים (DNA-למרות המבנה הקומפקטי של ה) DNA- יודע להיקשר לאיזור הכרה בactivating domain-ה

.HATחלבוניים בעלי יחידה קטליטית שיש לה פעילות של

או מחלישה את הקומפקטיות , היחידה הקטליטית עושה אצטילציה של זנבות ההיסטונים ליד פקטור הקישור וכך מתירה

.של המבנה ומאפשר תגישה לשאר מרכיבי הקומפלקס

ATPקומפלקסים בעלי פעילות תלוית , chromatin remodeling complex פקטורי שעתוק יודעים לגייס –בנוסף

המרווח הקבוע בין הנוקלאוזמים )וכך לרווח איזורים מסוימים , DNA-לשנע את הנוקלאוזמים על ה/שיודעים להזיז

.(משתנה

HATקומפלקסי

חלבונים שמאפשרים -י גיוס קומפלקסים רבי"נעשית ע (אצטילציה)הפעילות האנזימתית

בדוגמא שלפנינו , את הקישור של פקטורי שעתוק שונים ולכל קומפלקס יש יחידה קטליטית

.PCAFובבני אדם היחידה הקטליטית היא , Gcn5שמקורה בשמר שמה

כלומר הפעילות של HATחבויה בקומפלקס גדול .

יש מקרים שבהם פקטור שעתוק מצליח להיקשר ) UAS- נקשר לHAT complex - בשמר

. ( למרות שהרצף נמצא על נוקלאוזום בזכות אפיניות גדולה שלוUAS-ל

1000פעילות האצטילציה של הקומפלקס יכולה להגיע עד למרחק של

TATA-האצטילציה חושפת את רצפי ה. היסטונים לכל כיוון5- כ–בסיסים

. ופקטורים נוספיםTF2Bואיזורים אחרים שמאפשרים קישור של

יש משפחות של HAT שיודעים לעשות אצטילציה של Lysineספציפיים בהיסטונים שונים .

מודיפיקציה קוולנטית, ההיסטונים עוברים אצטילציה– כיום מדברים על קודון היסטוני .

.י קומפלקסים שונים כגון זרחון ומתילציה"המבוצעות ע, יש עוד מודיפיקציות קוולנטיות שעוברים ההיסטונים

. באופן רופף יותר או פחות DNAהמודיפיקציות השונות תורמות ליכולת של ההיסטונים לקשור

רפסורים- פקטורי שעתוק

- וDNA binding domain-ישנם פקטורי שעתוק שמורכבים מ

Repressing domain ( במקוםActivating domain.)

בעלי פעילות , פקטורים אלה יודעים לגייס קומפלקסים אחרים

שמאפשרת את האינטרקציה בין , אצטילציה-אנזימתית של דה

חוסמת את אתרי ההכרה לשאר מרכיבי , DNA-זנבות ההיסטון ל

.מדכאת שעתוק/ ובכך מונעת, קומפלקס האיניציאציה ושאר פקטורי שעתוק


141 2008' סמסטר ב

Chromatin remodeling complex( 17לילי ורדימון )

SWI/SNFקומפלקס

.'מתילציות וכיוב, זרחון–יש מודיפיקציות רבות שנעשות על הכרומטין

.מונע קישור של פקטורי שעתוק/המודפיקציות הללו מהוות את הקוד ההיסטוני שמאפשר

remodeling - אלא גם תזוזה של נוקלאוזומים לאורך ה, לא מדובר רק על מודיפקציות קוולנטיות-DNA . המיקום היחסי

. SWI/SNFיכול להשתנות בעקבות פעילות של הקומפלקס

SWI/SNFחלבוני עם יחידה קטליטית - הינו קומפלקס רב

הפעילות של הקומפלקס תלוית . שאחראית ליצירת התזוזה

ATPואנו לא מבינים בדיוק את המנגנון שבו היא מתרחשת .

:נערכו מספר ניסויים שמדגימים את התזוזה של הנוקלאוזומים

1ניסוי

:ניקח את המרכיבים הבאים

פיסתDNA (לא מסומנת) קרה

האורך ) נוקלאוטידים 200באורך

( core histoneהנחוץ כדי להקיף

.core histone-שמלופפת סביב ל

מולקולתDNA מסומנת

.רדיואקטיבית בקצה

קומפלקסSWI/SNF.

. ATPרק לאחת המבחנות מוסיפים, מחלקים את ארבעת המרכיבים לשתי מבחנות

.ובודקים רק את החומרים הרדיואקטיביים, ל'מריצים את התוצרים על הג

במבחנה שלא הכילה ATP –פיסת ה -DNAל' המסומנת נעה לבדה לתחתית הג .

במבחנה שהכילה ATP רואים shiftשהתרחשה הודות לקומפלקס , בתנועהSWI/SNFשששיחלף את מולקולת ה -

DNAכך שבנוסף לבנד של ה, הקרה בנוקלאוזום במולקולה הרדיואקטיבית-DNAנראה –ל ' המסומן בתחתית הג

.(שנע לאט יותר)למעלה בנד של הנוקלאוזום

. אחת לשניהDNAלקומפלקס הזה יש יכולת להעביר את הנוקלאוזום ממולקולת : המסקנה


142 2008' סמסטר ב

2ניסוי

אתרי חיתוך 2 שלה יש DNAבונים נוקלאוזומים במבחנה עם פיסת

.B- וA: לאנזימי רסרטיקציה

שיעור החיתוך יהיה – לאנזימי הרסטריקציה DNA-כשחושפים את פיסת ה

אם אתר החיתוך נמצא . תלוי במיקום יחסי של אתרי החיתוך על הכרומטין

.בין הנוקלאוזומים הוא יהיה יותר זמין לחיתוך spacer( linker DNA)-ב

- שנמצא על הB נקבל חיתוך יחסית נמוך יחסית לחיתוך באתר ההכרה – נמצא על הנוקלאוזום Aאם אתר ההכרה

Linker.

רואים שינוי –ובודקים שוב את יכולת החיתוך - ATP יחד עם SWI/SNFלאחר שמוסיפים למבחנה את הקומפלקס

. B וירידה בחיתוך באתר ההכרה Aחלה עליה בחיתוך באתר ההכרה . בדגם החיתוך

. DNA-של הנוקלאוזומים על ה, מצליח להסיט את המיקום היחסי של אתרי ההכרהSWI/SNFהקומפקלס : המסקנה

בשעתוקSWI/SNFחשיבות הקומפלקס

עם אתרי קישור β-globinבניסוי שלפנינו לוקחים גן של

. לפקטורי שעתוק שונים

מכניסים למבחנה , אורזים את הגן בנוקלאוזומים

.בתנאים שונים ובודקים את שיעור השעתוק של הגן

הארגון הכרומטיני לא –כשהגן ארוז במבנה נוקלאוזומי

.מאפשר שעתוק של הגן

ערום עם קומפלקס האיניציאציה של DNA –הביקורת

. השעתוק ללא פקטורי השעתוק הנדרשים

.ATP עם SWI/SNF נוכחות קומפלקס – (+)או (-)

: התוצאות

עובר שעתוק SWI/SNFבלי (DNA)גן ערום .1

לא עובר שעתוקEKLF ללא SWI/SNFגן במבנה כרומטיני ללא .2

. לא עובר שעתוקEKLF עם SWI/SNFגן במבנה כרומטיני ללא .3

לא עובר שעתוק– EKLF ללא SWI/SNFגן במבנה כרומטיני עם קומפלקס .4

עובר שעתוק – EKLF עם SWI/SNFגן במבנה כרומטיני עם קומפלקס .5

עובר שעתוק ברמה נמוכה – GATA עם SWI/SNFגן במבנה כרומטיני ללא קומפלקס .6

עובר שעתוק ברמה גבוהה – GATA עם SWI/SNFגן במבנה כרומטיני ללא קומפלקס .7

. במצב כרומטיני DNA נחוץ כדי לשעתקremodeling-קומפלקס ה: המסקנה


143 2008' סמסטר ב

boundaries/isolators –רצפים למניעת אובדן הספציפיות באצטילציה

אתר קישור לפקטור שעתוק , DNA-לפנינו איזור ב

Gcn4 ,שנקשר ל-UAS שנמצא בין הנוקלאוזומים

. בסמוך לנקודת תחילת השעתוק

הקישור של פקטור השעתוק מתרחש לפעמים

אפיניות הקישור הגבוהה )באיזור שעוטף נוקלאוזום

- לאחר הקישור של פקטור השעתוק . (של פקטורי שעתוק מסוימים מאפשרת להם לקשור גם באיזורים לא נגישים

:מגויסים שאר הקומפלקסים

קומפלקסHATשמבצע אצטילציה

קומפלקסים שמרווחים את המבנה

קומפלקס איניציאציית השעתוק.

נוקלאוזומים לשני 5-כ) בסיסים מקום הקישור שלו 1000- מבצע אצטילציה של היסטונים במרחק של כ HATהקומפלקס

. פועלים גם כשהופכים אותםehancerזו הסיבה שאתרי . (הכיוונים

יש מספר גנים שיושבים בסמוך , DNAעל פיסת : הבעיה

. (שני פרומוטורים סמוכים בכיוונים מנוגדים)

remodeling יכול לעשות HATכך שהעובדה שקומפקלס

משמעותה שאיבדנו את - לשני הכיוונים DNA-של ה

. הספציפיות של פקטור השעתוק לשפעול גן מסוים

נוצרו אלמנטים המכונים –כדי למנוע אובדן ספציפיות

boundaries , אוIsolators ,שהם רצפים שמצויים באיזורים שבין גנים סמוכים .

, שגורם לגיוס של קומפלקסים שיוצרים את הגבולות (CTCFלדוגמא החלבון )הרצפים הללו קושרים חלבונים מסוימים

. ומבטיחים שהרפיית הכרומטין תהיה מוגבלת לגן אחד בלבד

סיכום–מנגנון הבקרה של השעתוק

. הבקרה עברה אבולוציה בין פרוקריוטים לאאוקריטים

פרומוטור או -י חלבונים ספצפיים שיכולים לשמש קו" יש רצפים שמוכרים עDNA-בשלב הראשון הגיעו להבנה שברצף ה

minimal-promotor .רצפים אלה משמשים אתרי הכרה לפקטורי שעתוק כלליים ול-RNA polymerase , שם נבנה

.קומפלקס האיניציאציה

A – תחילה גילו גילו אלמנטי

בקרה פרוקסימליים לנקודת

ואיזורי בקרה , תחילת השעתוק

הדרושים לבקרת , דיסטליים

.שעתוק


144 2008' סמסטר ב

B –והחלבונים הנקשרים , האלמנטים הללו קושרים פקטורי שעתוק ספציפיים

.משפיעים על השעתוק במספר דרכים

C - 1: לדוגמא. הקישור יכול להתבצע באופן ישיר או באמצעות מדיאטוריםSP

.ומייצב את קומפלקס האיניציאציה, TF2D של TAFs-נקשר לאחד ה

D – פקטורי שעתוק יודעים לגייס קומפלקסים חלבוניים שמשפיעים על המבנה

: הכרומטיני בשני אופנים

מודיפיקציות על זנבות ההיסטונים שמרפים את הקשר עם ה-DNA

(רפרסורים) DNA-או מחזקים את הקשר עם ה, (אקטיבטורים)

הזזת הנקולאוזומים על ה-DNA בעזרת קומפקלסי Chromatin

remodeling complexes.

כבר בביצית המופרית בשלבי ההתפתחות העוברית הראשונים נוצרים הבדלים

שיש להם אפקטים על מגוון פקטורי השעתוק שיבוטאו בתאי הבת , בין התאים

.כך שרק בתאים שמכילים פקטורי שעתוק יהיה ביטוי של הגנים הרלוונטיים. שלהם

השפעת סיגנלים חיצוניים על השעתוק

יש סוגי , הביטוי של גנים נתון במקרים רבים לסיגנלים חיצוניים

נסתכל כדוגמא על ביטוי של גנים של . בקרה חיצונית רבים

. מערכת החיסון שמופעלים רק כאשר יש בהם צורך

ומערכת החיסוןNFkBפקטור השעתוק

הוא בקר ראשי של גנים במערכת החיסון ומורכב NFkBפקטור

. p50- וp65: משתי תת יחידות

גנים 150פקטור השעתוק הזה יודע לבקר באופן ישיר לפחות

אך באופן נורמלי הוא מצוי , הקשורים במערכת החיסון

הסיבה שבגללה הוא לא עובר . בציטופלזמה במצב לא פעיל

איזור עתיר בחומצות אמינו טעונות - i-kB( .NLSי החלבון " חסום עNLS- היא שה– (שם תהיה לו השפעה)לגרעין

.( בממברנת הגרעיןPoresי מנגנון שמעביר חלבונים מהציטופלזמה לגרעין דרך "חיובית שמוכר ע

התאים המודבקים בוירוס או תאים בסביבת . פעילות הפקטור נדרשת כאשר יש זיהום בקטריאלי או הדבקה ויראלית

( TNF-α וכן IL-1)החלבונים . TNF-αובאיזור הדלקת מופרש גם , IL-1הזיהום החיידקי מפרישים אינטרלוקינים כגון

(. Bלמשל על תאי )ממברנליים שיושבים על תאי מערכת החיסון -מהווים ליגנדים לשני רצפטורים טרנס

ומופעל קינאז נוסף של הרצפטור שיודע לזרחן את , פוספורילציה-הרצפטורים עוברים אוטו- עם הקישור של הליגנד

TAK1 . 1כשהחלבוןTAKיחידות - תת3גם הוא קינאז שמזרחן קומפלקס של , מזורחן הוא מאוקטבi-kB kinase

. iKb –הקומפלקס הזה יזרחן בתורו את הסובטרט שלו . (α,β,γמורכב מתת יחידות )


145 2008' סמסטר ב

זרחון של 1TAK זרחון של פוספורוליציה - אוטומסלול העברת האותות מתחיל בקישור ליגנד לרצפטור

. i-kBהקומפלקס

67, יוביקוויטין) שרשרת חלבונים קטנים ikB- שיחבר לE3 ubiquitine ligaseי החלבון " מוכר עi-kBבמצב המזורחן

החלבון נכנס . סימן לדגרדציה בפרוטאוזום, זהו תג– poly-ubiquitineכשמצורף לחלבון . באופן קוולנטי (חומצות אמינו

. בקצה האחד של הפרוטאוזום הצילינדרי ויוצא גרוס לחומצות אמינו מהקצה השני של הפרוטאוזום

נקשרות לרצפים , שתי תת היחידות של הפקטור נכנסות לגרעין, NLS- יש חשיפה של רצף ה– מסולק i-kB-ברגע ש

שיסונטז ובכך יבקר שלילית את , עצמוi-Kbאחד הגנים שמבוקר במנגנון זה הוא . שהן מכירות ומשפעלות ביטוי גנים

.NFkBפעילות השפעול של

שגורם לשפעול של הקומפלקס , (במנגנון לא ברור) גם קרינה מייננת מפעילה את המסלול הזהI-kB .

Nuclear receptor superfamily

. סטרואידים וטירואידים, A ,Dהליגנדים הם ויטמין . י ליגנדים מסיסים בליפידים"פקטורי שעתוק המבוקרים ע

.סטרואידים מיוצרים בבלוטת האדרנל ומגיעים אל התאים באמצעות זרם הדם

. ומגיעים אל התאים באמצעות זרם הדםthyroid-טירואידים נוצרים בבלוטת ה

והויטמינים עוברים מטבוליזם כדי להפוך לליגנדים מתאימים לרצפטורים , מהתזונהD וויטמין Aאנו מקבלים ויטמין

.שלהם

: הקבוצה הגדולה ביותר של הליגנדים ומורכבת ממספר שחקנים עיקריים– סטרודאידים

ההומון הראשי שמיוצר באדם–קורטיזול

אחראיים על יצירת הפנוטיפ הנשי- אסטרוגנים

אחראיים על הפנוטיפ הגברי- אנדרוגניים

. קורטיקואידים משפעלים את הפעילות של הרצפטור הגרעיני שמעורב בעיכוב תהליכים דלקתיים בתא-הורמונים גלוקו

כי הסטרואיד יודע להפעיל באמצעות הרצפטור שלו גנים , זו הסיבה שבגללה נותנים סטרואידים מבחוץ בלדקת חריפה)

.(שנוגדים את התהליך הדלקתי

:המבנה של הרצפטורים הגרעיניים

DNA binding domain – איזור קישור לאתר

יש הומולוגיה גבוהה במיוחד . ההכרה של הגן

.באיזור זה בין הרצפטורים השונים

Ligand binding domain – איזור אליו נקשר

גבוהה -הומולוגיה בינונית. הליגנד, הסטרואיד

.לרצפים אחרים

Trans activating domain - variable region –יש שוני רב בין הרצפטורים, באיזור זה אין הומולוגיה כלל .

. כלומר כל אחד מהרצפטורים הגרעינים מגייס קומפלקסים שונים ומשפעל שעתוק בדרכים שונות


146 2008' סמסטר ב

אופן הפעולה של רצפטורים גרעיניים

Gluco-corticoid Receptor( GR.)הרצפטור הנחקר הוא

. (בעזרת נוגדנים שמסומנים פלורסנטית)פלורסנציה -לפנינו ניסוי שנעשה באמצעות שיטת אימונו

הכניסו את הפלסמיד לתאים אאוקריוטים ובדקו איפה מבוטא , β-Galactosidase-לקחו פלסמיד שמכיל גן שמקודד ל

:התוצאות. החלבון

החלבון מבוטא - בטרנספקציה פשוטה

. בציטופלזמה של התא

כאשר יוצרים פלסמיד שמקודד לחלבון כימרי

- GR- מאוחה לβ-galactosidaseשבו

. החלבון הוא ציטופלזמתי

dexamethazoneאם מוסיפים לתאים

של ביטוי יש (קורטיקואיד פוטנטי מאוד-גלוקו)

. בגרעין גם החלבון

כשעשו טרנספקציה פשוטה של הגן וה-GR –מספיק לנו רק ה, הבינו כי למעשה לא צריך את כל הרצפטור-

Ligand Binding domainכדי שהחלבון יבוטא גם בגרעין .

קורטיקואידים-מנגנון הפעולה של סטרואידים גלוקו

יושב בציטופלזמה של התא כשהוא קשור באמצעות GRהרצפטור

Liganb Binding Domain לקופלקס חלבונים Hsp90( Heat

shock proteins) שאחראיים לשמירת ה-GRבציטופלזמה .

ההורמון נקשר ההורמון נכנס לתאים בדיפוזיה דרך ממברנת התא

כתוצאה מכך שינוי קונפורמטיבי Ligand Binding Domain -ל

GRמה שמאפשר את הנדידה של , יש שחרור של הקומפלקס

.ומאקטב את השעתוק (כדימר) הרצפטור הגרעיני נקשר לרצפים ספציפיים DNA binding domainבאמצות . לגרעין

HRE – Hormone Response Element –רצף אליו נקשר ה -GR (או רצפטור גרעיני אחר) , בעקבות הקישור

: דרכים3-מתרחש שפעול שעתוק ב

remodeling complexגיוס של .א

. לנוקלאוזוםDNA- שיעשה אציטלציה לזנבות של ההיסטונים ומרפה את הקשר בין ה HATגיוס קומפלקס .ב

.מדיאטורים שמתווכים את הקישור לקומפלקס איניציאציית הקישור, גיוס קומפלקסים .ג

. ששעתוקם תלוי בהורמונים חיצוניים, כך מאוקטבים גנים מסוימים


147 2008' סמסטר ב

RNA processing( 17 –נון- שוש בר)

: עוברים עיבוד לאחר שעתוקםRNA- כל ה– פרויקריוטי mRNAלמעט

עיבודtRNA בפרוקריוטים

עיבודrRNAבפרוקריוטים

עיבודtRNA (ולל שחבורכ) באאוקריוטים

עיבודrRNA (שחבור והרכבת ריבוזומים) באאוקריוטים

עיבוד mRNAבאאוקריוטים

o cap 5 לקצה’

o poly(A) 3 לקצה’

o שחבור

מאפייני העיבוד

tRNAו -rRNA רקורסרים ארוכים המעובדים הן בפרוקריוטים והן באאוקריוטיםהם פ

mRNA שחבור עובר(splicing )רק באאוקריוטים

ורק , מתרחש בגרעין העיבוד– באאוקריוטים RNAיוצא לציטופלזמה בשל

פרוקריוטים

בפרוקריוטיםtRNAעיבוד

.E. coli זורים בכרומוזום שליאשניים -אחד מקודדים בtRNA-סוגי ה (40-30)כל

.tRNA-יש פולימראז יחיד בפרוקריוטים שמשעתק את ה

. שונים בפרקורסור משותףtRNAs שבעהאו עד , (flanking )’5 ’3 יחיד עם אזורים tRNAפרקורסור מכיל

. שיש לסלקdownstream- וupstream ואיזורים tRNAבתוך הפרוקוסור יש

: שלבי העיבוד

שמרחיק את הקצה , אסטרי-די- אנדונוקלאז חותך את הקשר הפוספו –RNase P– (דייקני) ’5הרחקת הקצה (1

האנזים הזה שמור אבלוציונית. באופן מדויק5-ב

(CCA-ב) 3-אקסונוקלאז שחותך באופן לא מדויק ועלול לפגוע בקצה ה - RNase D – ’3הרחקת הקצה (2

לעיתים משועתק ) CCA ’3הוספת או תיקון הקצה (3

CCA nucleotidyl transferaseי "ע (ולעיתים מוסף

, חיזור - (בורוד)מודיפיקציות בסיסים וסוכרים (4

.' וכוקישור איזופנטניל, מתילציה, דאמינציה

. אינטרונים שיש להסיר (אופייני לאאוקריוטים)- בצהוב


148 2008' סמסטר ב

, בסיסים מסוימים הופכים אחרים: המודיפקציות

מופיע Inosine. למשל החלפת חמצן לגופרית

יושב מול )קודון -בעמדה הראשונה של האנטי

. (העמדה השלישית של הקודון

tRNAמבנה שניוני של

. אינו מזווג3כן קצה -כמו. inverted repeats- יש צורך ב- כדי שיווצרו הגבעולים המאפיינים את המבנה

.tRNAשלושה גבעולים לפרקורסור של , במבנה זה יש שלוש זרועות

מאפייני ריבוזים

RNAבעל פעילות קטליטית

2קבוצת’OH3- ו’OHיכולות להיות מעורבות הן ישירות בקטליזה והן בקביעת מבנה מרחבי

ל-RNAשלישוני המאפשר אתר פעיל/ מבנה שניוני

(אמינו . ח20 בסיסים לעומת4) פחות מגוון מחלבון

משתתף בעיקר בהידרוליזת RNA(ריאקצית שיחלוף פרוטון)

RNAse P - 5חיתוך קצה

RNAse P אנזים שהוא לא חלבון– הוא ריבוזים .

-pre חותך בדייקנות כל) ’5 הרצף המקדים תוך שיחרורחדש Phosphate’5 החותך חתך יחיד ויוצר קצה אנדונוקלאז

tRNA.)

!שלישוני כבר בפרקורסור/ מתקפל למבנה שניוניtRNA-ה

לפי )שניהם חיוניים לפעילות – (20kDa) וחלבון קטן (337b ,M1RNA) קטן RNAמדובר בקומפלקס בלתי קוולנטי של

(שחזור פעילות, מוטציות

(mpA, mpB)י גנים נפרדים ורחוקים בגנום "תת היחידות השונות מקודדות ע

RNA בדייקנות ובמהירות במערכת’5 לבדו חותך קצה in vitro (ספרמידין, מגנזיום גבוה)ובתנאים בלתי פיסיולוגים

כלומר בסביבה אוהדת . pre-tRNA-RNase Pמפגש הומאפשרים את החלבון או הספרמידין ממסכים מטען שלילי

והוא נותן סביבה אוהדת לריבוזים , פקטור עזר בלבד–החלבון . עושה ביקוע של הפרקורסורRNA-החלק של ה

. ולסובסטרט שלו

:(שמקיים הריבוזים)דרישות מאנזים

כ " בד–כדי שתהיה פעילות אנזימתית יש צורך בקבוצה פעילה באתר הפעילserine ( עםOHפנוי ).

. 2 פנוי בעמדה OH יש RNA-ל

מבנה שלישוני שנוצר הודות ל-OH 2 בעמדה .


149 2008' סמסטר ב

RNAse D – 3 יצירת קצה

.CCA ’3- בועוצרמונופוספט -5 נוקלאוטידים ’3מן הקצה המשחרר אקסונוקלאז

Nucleotidylכי האנזים , אין בעיה–אך גם אם הוא מפספס , CCA-עד שהוא מגיע ל, הוא מכרסם מהקצה

transferase יודע להוסיף CCA .

. מכיר את המבנה השלישוני של הפרקורסורRNAse-ה

י נוקלאזות"אסטרי ע-די-שבירת קשר פוספו

RNAי האנדונוקלאזות המעורבות בעיבוד " כולל עP’5- וOH’3כ נוצר " בד - סוגי קצוות שני יכולות ליצור אנדונוקלאזות

.(למעט אנזימי שחבור)

’5’3 פועלות בכיוון – אקסונוקלאזות

רק ’5בעוד שהרחקה מקצה (או אנדונוקלאזות)י אקסונוקלאזות " יכולה להתבצע ע’3לפיכך הרחקה של שיירים מקצה

.י אנדונוקלאזות"ע

שני סוגי הקצוות

. של נוקלאוטידיםP'5 לקצה OH'3הקשר הוא תמיד בין קצה

. את הנוקלאוטיד הבאOH'3תמיד מוסיפים לקצה

:אסטריים-די-שני אופנים לשבירת קשרים פוספו

מתקבל קצה –הדירוליזה שכיחה OH'3 וקצה P'5 .

ligaseכך חותכות . יודע לחבר את שני הקצוות חזרה

.(מלבד אנזימי שחבור)רוב הנוקלאזות

ביקוע שמותיר קצהP'3ו -OH'5 - כדי לחבר בין שני

ולהוריד פוספט 5הקצוות יש להוסיף פוספט לקצה

.3מקצה

בפרוקריוטיםrRNAעיבוד

:להן יש פתרון, דרישות2יש

צריך הרבהrRNAכי הוא ה -RNAב. העיקרי בתא-E.Coli אופרונים שמקודדים ל7 יש -rRNA – מה שמבטיח

.כמות גדולה

הפתרון הוא אופרון–יש צורך שכל תת היחידות יהיו בכמויות דומות .

.rRNA- ה סוגי3 בין יחס קבוע מבטיחrRNA- סוגי ה3 המכיל את pre-rRNAהפרקורסור

רב באורך ורצפי שוניאך , (16S, 23S, 5S)בוגרים rRNA -ם ל באזורים המקודדיומתילציה שימור–באופרונים השונים

.( הבוגריםrRNA-שבין ה) spacers- והleader (5’), trailer (3’)-ה


150 2008' סמסטר ב

מה שמחייב , tRNAs מקננים trailer-וב (23S-ו 16Sבין ) spacers-ב

כמו RNase Pי " עtRNA של ’5חיתוך ) tRNA- וrRNA בעיבוד צימוד

( pre-tRNAבכל

.שכיחים הם היותר pre-rRNA- המקננים בtRNAs-ה

2 המסומן במספר האנזים –RNAse P.

1 האנזים המסומן במספר - RNAse3 .

RNAse 3ב -E.coli

RNAse3שחותך, הוא אנדונוקאלז ספציפיRNA משני הצדדים בו זמנית, את שני הגדילדים, גדילי- דו.

.בצורה מאוד מדויקת, חותך כמו אנזים רסטריקציהRNAse3למעשה

pre-rRNA בלולאות כל ה ענק לולאות מבנים של גבעולים עם 2 יוצר-

16SrRNA23- וכל הSrRNA.

spacers- ב קומפלמנטרים המבנה השניוני של הגבעול תלוי ברצפים

. הבוגרrRNA-משני צידי ה

-pre- וpre-16S rRNA ונוצרים אתרים2בכל גבעול נחתכים בדייקנות

23S rRNA (רצף ולא האנזים מזהה בגבעול מבנה).

rRNAחלקם , ( חלבונים30-40)כבר כפרוקרסור הוא קשור לחלבונים ריבוזומליים , אינו מעובד כאשר הוא עירום

.כיווון שנוכחותם דרושה לחיתוך, rRNA-מצטרפים עוד לפני החיתוך של ה

pre-rRNAאנזימים נוספים שמעבדים

המזהות מבנה שניוני של (M5, M16, M23)ריבונוקלאזות - אחרים אנדו נמצאו בחיידקיםE.Coli- בRNase3-בדומה ל

. גבעול ומבקעות בדייקנות את שני גדילי הגבעול

pre-23S rRNA- וpre-16S rRNA לאחר חיתוך הגבעול מעובדים התוצרים הראשוניים

.סופיים ’3- ו’5 בעיבוד משתתפים אנזימים נוספים היוצרים קצוות

אאוקריוטים

באאוקריוטיםRNAעיבוד

ויש רצפי , שאינה קיימת באאוקריוטים מכיוון שהגנים מופסקים, חלבוןDNA RNA לינאריות -בחיידקים יש קו

.אינטרונים שיש להסיר לאחר השעתוק

ביצורים ) rRNA- ובחלק מהגנים לtRNA-אך גם בגנים ל mRNA( hnRNA)-אינטרונים נמצאים בעיקר בפרקורסור ל

. (נמוכים


151 2008' סמסטר ב

(או באברון)קבוצות שחבור בגרעין

טבלה משמאל' ר

באאוקריוטיםrRNA- וtRNAריבוזמים שמעבדים

RNAse P

שמור ) tRNA של 5הריבוזים חותך את הקצה

. (מפרוקריוטים

.חלבוני העזר של הריבוזים משתנים בין יצורים שונים

5Cחלבון יחיד - בחיידקים •

כולם חיוניים, חלבונים שונים9- בשמרים •

חלבונים שונים10– באדם •

RNAse MRP

.rRNAריבוזים נוסף שמעורב בעיבוד

- וrRNAמה שמאפשר תיאום בעיבוד של , RNAse MRP מרכיבים גם את RNAse Pחלק מהחלבונים שמרכיבים את

tRNA .

באאוקריוטיםtRNAעיבוד

ההומני נקשר RNase P-ה –MRPלמרות החלבונים המשותפים עם

.pre-tRNA- לבלעדיבאופן

-pre- נקשר לLa . Laי האנטיגן"מבוקרת ע הומני RNase Pהפעילות של

tRNAי " ובכך מונע את עיבודו עRNase P.

La אינו נקשר ולכן מזרז עיבודמזורחן tRNA . בנוסףLa מזורחן מעכב

.RNA polymerase3 י" ע tRNAשיעתוק של

. anticodon- של ה3-נמצא בדיוק מהצד ה (IVSשמכונה גם )האינטרון

tRNAs : Ser, Phe, Tyr, Leu, Ile, Trp, Pro, Lysוהם נמצאים בתת קבוצות של , 14-60bp– אורך האינטרון

.שונותtRNA בעוד שאין דמיון בין אינטרונים בקבוצות , (כמעט)אינטרון זהה – כאשר באותה קבוצה ובאותו יצור

.ATP-י שחבור התלוי ב"הרחקת האינטרון מתרחשת ע

: עקרונות השחבור

-כשמקור הפוספט המשחבר ב, tRNA- הספציפיים לLigase- וtRNA Nucleaseפועלים בשחבור - בשמרים •

ATPולא ב -tRNA . השחבור תלוי במבנה מרחבי שלtRNA ,שחבור בין אקסונים של וכך נמנע tRNAsשכנים .

.(tRNAs- מ10%-רק ב) נדיריםאך הם , לאנטיקודון’3– מיקום האינטרונים מצויים גם כן באותו - בבעלי חוליות •

רק – והרצף באינטרון אינו חשוב (’5אקסון ) המקוריtRNA- אקסונים ב2המחבר פוספט מקור ההפעם

.הקונפורמציה


152 2008' סמסטר ב

:האנזימים המשחברים

:משמרים בודדו tRNAsהאנזימים המעורבים בשחבור

חותך ש , הקשור לממברנת הגרעיןנוקלאז-אנדו .1

בו ’3במדויק בקצוות האינטרון ומותיר באקסונים קצה

OH’5 ציקלי וקצה ’3’2פוספט

הליגאז הוא חלבון . אקסונים בשלבים2 משחבר ליגאז .2

.פפטיד יחיד-בעל מגוון פעילויות בפולי kDalton90בן

OH’5- לATP- מPiקינאז מוסיף •

כעת יכולה . AMPי קישור " עPi’5ליגאז משפעל •

את OH-להתרחש התקפה נוקלאופיית של ה

.הפוספט

P’2 ל ’3’2אסטראז ציקלי פותח -די-פוספו •

פוספודיאסטרי ’5’3 קושר ליגאז .3

P’2 מרחיק את פוספטאז .4

באאוקריוטיםrRNAעיבוד

RNA Polymerase1 משעתק pre-rRNA , סוגי 3- ליחידפרקורסור rRNA. 3ורמת כל , בגרעינוןמעובד הפררוקסור

.שווההסוגים

5S ( שהוא חלק מתת היחידה

RNAי "משועתק ע (הגדולה

polymerase3 מעובדואינו .

של (50-5000)הגן מכיל מספר רב

(, tandem arrays )עותקים זהים

. השיעתוק ושמורים באותו היצורלבקרתהחיוניים (NTS)משועתקים -שביניהם מרווחים בלתי

.( ETS )’3- ו’5 ובקצוות( ITS) השונים rRNA-הבין בעת העיבוד המורחקים spacers -באזור המשועתק

.אך הם מסייעים לבקרת שעתוק, enhancers לא בדיוק – NTSאיזורי

S28 ,5.8Sי " שמשעותקים עRNA polymerase1ו -S5י " שנוצר עRNA polymerase3 – ירכיבו את תת

.היחידה הגדולה של הריבוזום

S18י " שמשעותק עRNA polymerase3יהווה את תת היחידה הקטנה .


153 2008' סמסטר ב

rRNA-הרכבת ריבוזומים מ

.rRNAקיימים שלבים רבים ופקטורים רבים בשעתוק של

ובאסוציאציה עם , יוצרים לולאהtandem arrays -ה

. הגרעינוןחלבונים נוצר

. מצומד להרכבת ריבוזומיםrRNA-עיבוד ה

: בהרכבת ריבוזומיםקואורדינציהקיימת

יעתוק שrRNA י" ע RNA polymerase1

יעתוק שS5י" ע RNA polymerase3

שיעתוקmRNAי " של חלבונים ריבוזומליים עRNA

polymerase2.

. אך רואים אותו כאיזור נפרד כי שם מורכב הריבוזום, ללא ממברנה, ריבוזום אאוקריוטי נוצר בגרעינון שהוא איזור בגרעין

שתי תת היחידות הגמורות יוצאות מהגרעינון . וכל החלבונים נכנסים לגרעין ולגרעינון, rRNAלגרעינון מגיע פרקורסור

. דרך הגרעין לציטופלזמה

– בתמונה משמאל

חלבוני ריבוזום–באדום

חלבונים מסייעים –בירוק /בצהוב

בכחול– snpRNP .


154 2008' סמסטר ב

(נון- שוש בר18) אאוקריוטי RNAעיבוד

snoRNA – מעבד rRNAבאאוקריוטים

rRNAי מודיפיקציה של בסיסים " עובר עיבוד ע( התהליך מתרחש גם בעיבוד שלtRNAפרוקריוטי ) .

. וחלבוןRNAשמכילים , RNPסוג של , snoRNAהתהליך מתרחש בסיוע של חלקיקי

: נוספים הםRNP( RNA-Protein complex .)RNP-ריבוזום הוא דוגמא ל

snoRNA -small nucleolar RNA – מצוי בגרעינון מעורב בעיבוד rRNA

snRNA –מעורב בעיבוד , מצוי בגרעיןmRNA

scRNA –מצוי בציטופלזמה

מקורן באינטרונים snoRNA-חלק ממולקולות ה. והוא עובד בטרנס, בסיסים100-500 הוא snoRNAהאורך של

. mRNA-שמסולקים בשחבור מ

:snoRNA משפחות של 2יש

box C/D – ב2 עושה מתילציה של עמדה -rRNAאאוקריוטי

box H/ACA - מכוון את המודיפיקציה שלpseudo-uridine.

ביקועrRNA –במנגנון לא ידוע

האתר הפעיל

והוא , guide RNA – שעובר בתור מכוון RNAהאתר הפעיל של האנזים הוא

(. זיווג בסיסים)בעזרת קומפלמנטריות (rRNA)מכיר את הסובסטרט שלו

למעשה יש פה . שעובר מתילציה (rRNA) והסובסטרט שלו snoRNA –משמאל

.חיקוי של אתר פעיל אנזימתי

יש - שמורכב ממעין גבעול snoRNA-באמצע ה. guide RNA רואים –למטה

ושם מתרחשת (rRNA)מעין בועה אליה נכנס הסובסטרט , איזור בלתי מזווג

pseudo-uridine( ψ .)-המדיפקיציה ל

המקום לזיווג , מספק את הבסיס הגאומטריguide RNAכלומר

.הבסיסים

חלות (90S pre-ribosome)על הפרוקרוסר של ריבוזום

ואז נוקלאזות , snoRNAי "מודיפיקציות על הביסים ומתילציות ע

ותת יחידות , הכל מתרחש בגרעינון. pre-rRNA-חותכות את ה

. לציטופלזמהPore complex-שלמות של הריבוזום יוצאות דרך ה


155 2008' סמסטר ב

snoRNAמכוונים מודיפיקציות גם ב -mRNA ,tRNA ,ו-snRNA.

מוטיב ה-guideRNAב, אינה תקף בפרוקריוטים-E.coliי "י חלבונים ולא ע" המודיפיקציה שעובר היא עguide

RNA ,אך נמצאו הומולוגים ל-snoRNAבארכיאה .

באאוקריוטים נמוכיםrRNAשחבור עצמי של

group I intronsמסולקים מ -rRNA של איזורים נמוכים בעזרת RNA

!ללא חלבונים

.המבנה השניוני של האינטרון חיוני לפעילות החיתוך וקירוב הקצוות

שבה שוברים ויוצרים קשר – אסטריפיקציה-הראקציה היא טרנס

ואינה , אך ראקציית השחבור מתבצעת ללא חלבונים כלל, זמנית-קוולנטי בו

. GTP או ATPתלוית

prime splice site-3-ומימין prime-splice site( donor)-5- משמאל

(acceptor.)

. שמסייע לראקציה2 בעמדה OH החופשי מכיל גם G-ה

:מהלך הראקציה

י "האיניציאציה של הראקציה נעשית עGחופשי עם OH פנוי

כך שנוצר , של האינטרוןα'5 שיתקיף נוקלאופילית פוספט 3בעמדה

. G-אסטרי בין אינטרון ל-די-קשר פוספו

ולאקסון יש עכשיו , אקסון נשבר-הקשר אינטרוןOH 3 פנוי בעמדה.

OH 3 של האקסון יכול להתקיף נוקלאופילית את 3 בעמדה-prime-splice-site לפי המבנה השניוני הייחודי של

נוצר קשר בין שני . (mRNA-הזיהוי של האינטרון הוא לפי מבנה ולא לפי רצף כפי שרואים ב)האינטרון

.האקסונים

האינטרון עוזב עם , אינטרון נשבר-הקשר אקסוןOH ו, 3 חופשי בקצה-G 5 בקצה .

ועלינו לסלק את האינטרון כדי שלא יחזור פנימה בין שני האקסונים, מכיוון שהראקציה הפיכה לגמרי .

RNA לבדו עם Gחופשי במבחנה יודע ליצור את התגובה

אאוקריוטיmRNAעיבוד

.י ריבוזום"יוצא לציטופלזה ושם מתורגם ע, מעובד ומסומן בגרעין, נוצרMRNA –באאוקריוטים

. והתרגום מתרחש מיד עם השעתוק בציטופלזמה, פרוקריוטי לא מעובדmRNA- בניגוד לאאוקריוטים

פוליריבוזום/פוליזום

, כל ריבוזום מתרגם חלבון מקצה אמיני לקצה קרבוקסילי. עליו יושבים ריבוזומים שמתרגמים אותוmRNAמבנה של

.החלבון יותר קצר - 5-ככל שהוא יותר קרוב לקצה ה


156 2008' סמסטר ב

pre-mRNA – overview (פירוט בהמשך על כל אחד מהתהליכים' ר)

pre-mRNA או hnRNAוהוא מהווה את הפרוקרוסר ל, אינו יציב-mRNA .

hnRNA( Heterogeneous Nuclear RNA .)מפני שחלק מהמולקולות איבדו כבר חלק מהאינטרונים המולקולה מכונה

mRNAי " שיוצא מהגרעין עובר סימון עU ,יוצא לציטופלזמה ומיד מאבד את הסימון בגלל השחבור .

.האינטרונים מהווים חלק גדול מתוצר השעתוק החיוני

mRNA- נותרים גם על הpre-mRNA-חלק מהסימונים שיש על ה

.3 בקצה poly-A וזנב 5 בקצה capכגון , הבוגר

.רוב האינפורמציה שאובדת היא מהמרכז

בסיסים בלבד 20-40כבר לאחר היווצרות של . pre-mRNA –למעלה

. 5 לקצה cap-נכנס ה

יש איזור טרמינציה (כמו בחיידקים)לפולימראז אין טרמינטור מדויק

לאחר מכן מתרחש . שבסופו הפולימראז מגמגם עד שנופל מהמולקולה

. ( בגנוםpoly-Tאין ) לא מקודד בגנום poly-A .poly-A-ומוסף זנב ה, חדש3נוצר קצה , י אנדונוקאלז"ביקוע ע

(.poly-A- וcap)שני התהליכים מתרחשים בו זמנית

של 5 התרגום אינו מתחיל בקצה mRNA של 3 ואינו מסתיים בקצה mRNA

בין ה -cap'5ל -AUG (קודון איניצאציית התרגום) בסיסים 50-2000שאורכו , יש איזור שאינו מתורגם (5UTR ,)

.המאפשר בקרת תרגום

יש איזור שאינו מתורגם 3 בין קודון טרמינציית התרגום לקצה (3UTR)

- ונשאר בpre-mRNA-רצף שמופיע ב: ההגדרה של אקסון היא. אך הם לא מופיעים בחלבון– הם אקסונים UTR-שני ה

mRNA (אין קשר לתרגום).

הנוקלאוטיד הראשון שמכניס , עם זאתRNA polymerase 2ל -pre-mRNAהוא גם זה שמופיע ב -mRNA . אנו

.(היה נותר מקסימום פופסט אחד- י אנדונוקאלז "לו היה חיתוך ע)יודעים זאת כי יש לו את שלושת הפוספטים

CTD – מעורב בעיבוד של pre-mRNA

RNA polymerase2 גם עושה אינציאציה וגם עושה את האלונגציה (מייצר את ה-pre-mRNA .)

RNA-שנמצא ליד התעלה ממנה יוצא ה CTD( C-Terminal Domain) יש איזור קרבוקסילי RNA polymerasre2-ל

שמעבירות את , (Tyrosine, Proline, Serine, Threonine) עשיר בחומצות אמינו שעוברות זרחון CTD. המסונטז

.הפולימראז ממצב של איניציאציה למצב של אלונגציה

וחשובה יעילות, הנקודה הקריטית באיניציאציה היא להתחיל את השעתוק בנקודה הנכונה- באיניציאציה.

חשובה המהירות ולא הדיוק- באלונגציה .

הזרחון מוביל להחלפת פקטורי איניציאציה בפקטורי אלונגציה , שמאפשר את המעבר מאיניציאציה לאלונגציהCTD-ה

.poly-adenylation- וcapping ,splicing-וכן מגייס את פקטורי העיבוד שמעורבים ב

.(להבטחת התיאום)חלק מפקטורי האיניציאציה מעורבים גם בעיבוד


157 2008' סמסטר ב

הורדת הזרחן מ-ser5 בקצה CTDגורמת לדיסוציאציה של מנגנון ה -capping .לאחר סיום ה-capping – יש

.ser5- וser2-פוספטאזות וקינאזות ספציפיים ל

זרחון שלser2ב -CTDגורם לגיוס מנגנוני שחבור

poly-adenylation קשורה בטרמינציית השעתוק3 של קצה

pre-mRNA קשור לחלבונים ויוצר עימם hnRNP

pre-mRNA אינו חופשי בגרעין אלא קשור למכלול חלבונים גרעיניים שיוצרים את hnRNP( Heterogenous

RiboNuceloProteins) .האינטרקציה עם החלבונים מונעת זיווג בסיסים של ה-pre-mRNA ומאפשרת איטרקציה עם

.הפקטורים ומנגנוני העיבוד

-מכאן שיש להם תפקיד בהוצאת ה)חלק מהחלבונים נמצאים רק בגרעין וחלק מתמחזרים בין הגרעין לציטופלזמה

mRNAמהגרעין לציטופלזמה ).

ולפחות , (RNA Binding Domain) אחד RBDומכילים לפחות , pre-mRNA-החלבונים קשורים לאיזורים שונים ב

.דומיין נוסף אחד לאינטרקציה עם חלבונים אחרים

hnRNP בחלבוני RBDמתחמי

RNP motif הוא ה-RBDמשמאל דוגמא . חומצות אמינו80- השכיח ביותר ואורכו כ

- ויוצרים את המגע עם הβ-strands- שנמצאים על הRNP עם מוטיבי UIAלחלבון

RNAועם איזורים נוספים בחלבון .

RGG box – חזרות 5 מכיל Arg-Gly-Glyוביניהן חומצות אמינו ארומטיות .RGG

boxקיים גם ב -RBDשל חלבוני פאג 'λו -HIV.

KH motif – או ) חומצות אמינו שמופיע בשני עותקים 45 איזור בן

. RGGוביניהם חזרות (יותר

5-prime Capping

שנוצר , 5-5 שנקשר בקשר ייחודי – methyl-guanosineמדובר בשייר של

. בסיסים20-40 מגיע לאורך של pre-mRNA-ברגע שה, בגרעין

-methyl קושר אליו RNA polymerase2הנוקלאוטיד הראשון שיצר

guanosine.

בשני OH’3- וOH’2יש לו , חופשי5לנוקלאוטיד הראשון למעשה אין קצה

.הקצוות

. של הריבוז בנוקאלוטידים הראשון והשניOH’2-לעתים נוספת קבוצת מתיל ב

CTD מגייס את הדימר Capping Enzyme( CE) שאחראי לשלוש , הדימרי

.הראקציות האנזימתיות


158 2008' סמסטר ב

– הפוספטים 3נשים לב כי מבין

מקורם בנוקאלטיד הראשון 2רק

, RNA polymeraseשסינטז

. מסולקγפוספט

-7-מקור הפוספט השלישי הוא ב

metyl-guanosine . הפוספטים שלו2-אך הוא נפטר מ, פוספטים3במקור גם לו יש .

:cap-חשיבות ה

פקטורי איניציאציה של תרגום מחפשים את ה - בתרגום-cap , זהו חלק ממנגנון האיניציאציה והקישור של תת

. AUG- עד שמגיעים לRNA- הם סורקים את הcap-לאחר הקישור ל. היחידה הקטנה של הריבוזום

ה– בהגנה -cap5- מסייע להגנה של הקצה ה

3-prime cleavage-poly-adenylation

200-מוסיף כ PolyAdenylate Polymerase( PAP)נוקלאז ולאחריו האנזים -י אנדו"תחילה מתרחש ביקוע ע

AMP- לATP תוך הידרוליזה של RNA-והוא נכנס ל, (Poly-T-אין קידוד ל) אינו אינפורמטיבי A-זנב ה. Aנוקלאוטידי

.אך אינו דרוש תבנית ( עצמוmRNA-שמהווה ה)לאנזים דרוש פריימר . (PPi)פוספט -ויציאת פירו

PAP עובד רק על mRNA

י פקטורים שמעורבים בעיבוד " עmRNA- אך ייקשר ויזהה את הrRNA- או לtRNA- לא ייקשר לPAP-מבטיחים ש

ומשאיר poly-adenylation מביא איתו פקטורי RNA polymerase2למעשה . RNA polymerase2י "שמגוייסים ע

. קצר יותר בשמרים ובצמחים מאשר ביונקיםpoly-A-זנב ה. אותם על תוצר השעתוק שלו

poly-Aמתקצר עם משך החיים של ה -mRNAאך רוב ה, ואינו חיוני למעבר לציטופלזמה-mRNAצריכים אותו .

mRNA של היסטונים אינו מכיל poly-A והם מיד עוברים

.לציטופלזמה לתרגום

poly-Aמייצב את ה -mRNA – המולקולה – מתחת לרמה מסוימת

.מתפרקת

3 אם האנלוג-deoxy-adenosine( cordycepin) נכנס ל-RNA –

, chain terminatorלמעשה האנלוג הוא . poly-Aהוא מונע הוספת

. הבאA- ואז לא יכול להתווסף הOH במקום H שלו יש 3שכן בעמדה

כדי לנקות mRNA – עושים קולונת זיקה עם Poly-T , כך שרק

ולאחר מכן כשעושים , תישאר בקולונהPoly-Aמולקולה שיש לה

. המולקולות הללו יירדו בקולונה–שטיפה


159 2008' סמסטר ב


RNA polymerase2מביא על ה -CTD שלו פקטורים שנקשרים לרצף AAUAA ( הוא חולף על פני הרצף

. (וממשיך לשעתק הלאה

בסיסים 30-40-י אנדונקואלז כ"מתרחש חיתוך ע downstream , 3ונחשף קצה’OHכך ה, חדש-RNA ישמש

.PAPכפריימר של

האנזיםPAP יוסיף נוקלאוטידי A.

עדיין יתרחש ביקוע–אדנליציה -אך אם עיכבנו פולי, אדנליציה- יש צימוד בין ביקוע לפולי .

הרצף AAUAA( AU-rich) נותר ב-mRNAבסיסים 10-35- בוגר כUpstreamלזנב ה -poy-A .

.אדנליציה-אך מוטציות ברצף זה ביטלו את הפולי. ולכן אין לו השפעה על התרגוםUTR3-כ הוא יושב ב"בד

רצף GU-richאך בניגוד ל, אנדליציה- בסיסים מעבר לאתר הביקוע הכרחי לביקוע ופולי50- שנמצא כ-AAUAA - הוא

. הבוגרmRNA-נזרק החוצה ואינו מגיע ל

אדנילציה-פקטורי ביקוע ופולי

U1 snRNP הינו hnRNPשמכיל חלבון ו -RNAאנדילציה- שמצוי בגרעין והכרחי לפולי.

.משתתפים-חלבון נוצר בסדר מחייב קומפלקס רב- וחלבוןRNA-בהתבסס על אינטרקציות ספציפיות של חלבון

CPSF (Cleavage & Poly-adenylation Specificity

Factor) מגיע על זנב ה-CTD של RNA polymerase2 ונקשר

. יחידות- תת4 מכיל CPSFהקומפלקס . AAUAA-ל

CStF( Cleavage STimulatory Factor) מגיע על זנב ה-

CTD ונקשר לרצף GU rich . תת 4גם קומפלקס זה מכיל

.והוא מייצב את הקומפלקס, יחידות

נוצר קיפול ב, יש אינטרקציה בין שני הקומפלקסים-pre-mRNA ומגוייסים Cleavage Factors( CF) נוספים

(CF1ו -CF2) ,נוקלאזות-שהן אנדו.

3לאחר הביקוע נותר’OH , ומיד מגויס האנזיםPAP , ומתחיל

.אדנליציה-לעשות פולי

200-250ואז , מוספים באיטיותA שיירי 12תחילה : פאזותPAP 2-ל

. מוספים במהירותAשיירי

PAB2( Poly-A-Binding נקשרים חלבוני – A 12לזנב של

proteins) המכילים מתחםRNPמה שקובע כמה שיירי , אופייניA

- לסיים את הפוליPAP- מאותת ל2PABכן -כמו. יוספו לאחר מכן

(המנגנון לא ידוע) נוקלאוטידים 200-אדנילציה כשהוספו כ

רק ) RNA polymerase2י " שנוצרים עmRNAאדנליציה תתרחש רק על -פולי - CTD-מכיוון שהפקטורים מגיעים על ה

. (אדנליציה- ואת פקטורי הפוליCTDהוא מכיל


160 2008' סמסטר ב

splicing- שחבור

. לינארי עם החלבון-גן אאוקריוטי אינו קו

כשלקחוDNAו -cDNA( mRNA) ועשו היברידיזציה נוצרוR-loops

כלומר ) cDNA- ואינם קיימים בDNA-שנוצים עקב רצפים שקיימים ב

. אלו הם האינטרונים, (mRNA-ב

זאת בעוד ש-hnRNAתואם לחלוטין ל -DNAגנומי .

.(אין צורך בציטופלזמה)הגרעין לבדו יודע לשחבר . לציטופלזמהmRNAלפני שיוצא , תהליך השחבור מתרחש בגרעין

. כ ברוב הגנים האאוקריוטים" ורק אחadenovirus-האינטרונים הראשונים נמצאו תחילה ב

.(אם כי לא חובה שיהיו אינטרונים כדי לבטא גן)אינטרונים נדירים בשמרים ושכיחים ביצורים עילאיים

לפני קודון האיניציאציה של , UTR( Un-Translated Region)האקסונים כוללים גם איזורים בלתי מתורגמים המכונים

. התרגום ואחרי קודון הטרמינציה של התרגום

החלוקה למתחמים של אינטרונים ואקסונים , הארגון, למרות שהרצפים של אינטרונים שונים בין היצורים השונים

. 2 או 1 תמיד מופיעים באקסון ATPלמשל מתחמים קושרי. בעכבר ובאדם שמורה

המשקפות רצפים חוזרים בחלבון, ליחידות חוזרות אינטרונים המחלקים אזור מקודד 50 –בקולגן.

DHFR – בעוד שבבסיסים 31,000 -בגן בעכבר. סינטזה של חומצות גרעין-חלבון שמעורב בביו-mRNA

! מהאינפורמציה ששועתקה95%כלומר נזרקת . בלבדבסיסים 1,600

כאשר הרצפים האמצעיים מורחקים , לאחר שעתוק של כל האיטרונים וכל האקסוניםRNA-אינטרונים מורחקים מה

.נשמרים (poly-A וזנב cap)והקצוות

השחבור הוא לא אקראי, האינטרונים מורחקים בסדר מסוים

ונריץ , של גן מסוים בגרעיןmRNA+polyA-נסתכל על מכלול ה

.ל'בג

, ל' היינו מקבלים מריחה בהרצה בג–לו ההרחקה הייתה אקראית

.אך מקבלים סולם

ולפי הידע שלנו על , המתקבליםmRNA-לפי האורכים של ה

נוכל להסיק באיזה סדר מורחקים –האורכים של האינטרונים

.האינטרונים

אך יש סדר קבוע– 5- ל3- או מ3- ל5- השחבור הוא לא מ .

(splice junctions)חשיבות צמתי השחבור

acceptor site-ו, אינטרון משמאל- מצומת אקסוןdonor siteלקחו

,וחיברו אותן למולקולה אחת כימרית, אקסון שנייה-מצומת אינטרון

. והתקבל שחבור נכון

כלומר רוב האינפורמציה הנדרשת לשחבור היא בצומת ברצפי

.Branch code- שמתחיל את הרצף הAנוקלאוטיד , עם זאת יש אינפורמציה במרכז. הקונצנזוס


161 2008' סמסטר ב

הרצפים השמורים בצמתים

acceptor- בAG- וdonor site- בGUהרצפים הם

site .לאחר השחבור נותרAG בקצה האקסון שסמוך

. 3 באקסון בקצה G-ו, 5לקצה

כלומר השחבור תמיד יוצר AGG .

Aמתחיל את ה -branch point , אחריו יש פירימידינים רבים(Y) ,שם חל הביקוע- פורינים 2כ יש "ומיד אח.

.Aהשחבור במולקולה הכימרית הצליח כי אחד משני הצדדים הביא עימו את


2יש התקפה נוקלאופילית של’OH של A (ה-branch point) על ה-G של אקסון ה3 השמור בקצה -donor site

( של האינטרון5בקצה )

(נוצר ונשבר קשר)אסטרפיקציה ראשונה -מתבצעת טנרס .Aמכאן )נוצרת הסתעפות , יוצר קשר קוולנטי משולש

(. branch pointהשם

האקסון - אסטריפיקציה שנייה -טרנסdonor (5-בקצה ה) 3נותר עם’OHכעת הוא יתקוף את ה. חופשי-

acception point . הוא מזהה אותה במדויק מכיוון שאחריAוהוא מתקיף , יש רצף של הרבה פירימידינים

downstreamלשני הפורינים הראשונים שהוא מוצא .

ה, אקסון-נבקע קשר אינטרון, נוצר קשר בין האקסונים-lariatמסולק או משמש , נפתח לאינטרון לינאריsnRNA .

הרעיון דומה למה שראינו ב -splicingשל אינטרונים מ -group 1שמסולקים מ -rRNA.


162 2008' סמסטר ב

(נון- שוש בר– 19 )mRNAשחבור

שחבור

.קריטיים לתהליך השחבור, (חשיבות לקצוות)רצפים שמורים קצרים מאוד באקסונים

.(אתר ההסתעפות) branch point-מלבד ה, לעומת זאת לרצפים באינטרונים חשיבות מעטה

.שכן התהליך מאוד מדויק, יש מחלות שהבעיה בהן היא בתהליך השחבור

.β-globin-שגורמות לשחבור מוטעה בשרשרת ה GT( donor site)-בטלסמיה יש מוטציות ב: לדוגמא

פעולות רבות מבוצעות. (גודלו כשל ריבוזום) snRNA סוגי 5- חלבונים ו150 שמכיל spliceosomeי "השחבור מתבצע ע

. branch point- והdonor/acceptor site- מאפשר זיהוי של רצפי הsnRNA: לדוגמא. snRNA-י ה" ע

בגדול- מנגנון השחבור

. למטה– 2ואקסון מספר , למעלה– 1אקסון מספר

. מתקרביםacceptor site- ו donor site,מתרחש קיפול של האינטרון

כאשר , 2Uי " עacceptor-וה, 6Uי "ולאחר מכן ע 1U י“ע מזוהה donor -ה

5Uמקרב בין השניים .

.קריק-ועל קומפלמנטריות ווטסון, RNAכל ההיכרויות מבוססת על

-על ה (branch point-ה, מתוך האינטרון) Aמתרחשת התקפה נוקלאפוילית של

donor site – נוצר lariat ,שני האקסונים מתחברים ומשתחרר האינטרון.

snRNA

מולקולותRNA נמצאות בתאים אאוקריוטים בעיקר בגרעין , שאינן מקודדות ( בסיסים100-300) קטנות

(snRNA) , אך גם בציטוזופלזמה(scRNA) ובגרעינון(snoRNA.)

סוגי 5בבעלי חוליות יש snRNA :U1, U2, U4, U5, U6 – כולם מעורבים בעיבוד pre-mRNAובשחבור כ -

trans-acting RNA( .U3 הינו snoRNPשמשתתף בסינטזת ריבוזומים ).

כ "בדsnRNA מורכבות עם חלבונים ליצירת snRNP –שמהווה חלק מה -spliceosome .

snRNP

10-12גודלםS (כרבע מתת היחידה הקטנה של הריבוזום).

( מכמות הריבוזומים בתא10%עד )כמותם גדולה.

מה שמסביר את העובדה שרצפי ה, הם חשובים לתפקוד הגרעין-RNAוהחלבונים שמורים החל מחרקים .

בכלsnRNAPאך רק , חלקם משותפים וחלקם ייחודיים, מספר חלבונים שונהsnRNAאחד !

snRNPנמצאים בגרעין אך לעתים יוצאים לציטופלזמה .

snRNAPשונים מצטרפים ועוזבים את ה -spliceosome כל ) בזמנים שוניםsnRNP מבצע שלב אחר בתהליך

.(השחבור

הסתבר ש -in vivoה -spliceosomeשמורכב ממספר , קיים כחלקיק אחדsnRNP ,כך שיש בעיה להגיד ש-snRNP

. בשלבים שונים" עוזבים"


163 2008' סמסטר ב

בשחבורsnRNPתפקידי

: תפקידים בשחבורsnRNP 3-ל

branch site- והacceptor site-זיהוי ה .א

קירוב של שני האתרים .ב

.RNAסיוע לקטליזה בראקציות ביקוע וליגציה של /קטליזה .ג

: סוגי אינטרקציות3 מתקיימים pre-mRNA- לsnRNAP ובין כל snRNPבין סוגי , snRNPבתוך כל

RNA-RNAהיא האינטרקציה החשובה ביותר .

RNA-חלבון

חלבון-חלבון

U1 snRNP

חלבונים ו8מכיל , וחרקים, עופות, קיים ביונקים -U1 snRNA .נדרש המרכיב החלבוני, הוא אינו פעיל לבדו ,

אך , עושה קטליזהRNA- ה– RNAse P: בדומה). בלבדRNA-הפונקציה שלו היא בחלק ה, למרות שההכרה

.(נדרש החלבון

אדנילציה -פולי/משתתף בשחבור ובביקוע: בין תפקידיו( נוגדנים נגדU1 עיכבו את שני התהליכים in vitro.)

של ה5בקצה : החלק החשוב ביותר -RNAבסיסים קומפלמנטרי ל9גדילי בן - יש איזור חד -donor site . חוסר

. של האיזור הזה מונע שחבור

בשלב מאוחר יותרU6 מזהה את

ומחליף pre-mRNA-אותו איזור על ה

.1Uאת

- עובר זיווג עם קצה האקסון של הU1snRNAהאיזור הבלתי מזווג של . acceptor site –מימין , donor site –משמאל

donor site .

הרצף של ) כי כשעשו מוטציה בשני הרצפים – יודעים שהחשיבות היא לקומפלמנטריות בלבד ולא לרצף עצמוpre-

mRNA והרצף של U1) , תהליך השחבור התרחש כמצופה–כלומר שחזרו את הקומפלמנטריות אך לא את הרצף .

U2 snRNA

היא דווקא U2 של branch point-הקומפלמנטריות ל

מעניין . (U1- כפי שראינו ב5ולא בקצה )באמצע המולקולה

מה שמאפשר , אינו נכנס לזיווגbranch point-ה, A-ש

. ליצור מאוחר יותר את ההתקפה הנוקלאופיליתAלאותו


164 2008' סמסטר ב

מתחיל את הקסקדה U2AFהחלבון

. branch point- לdownstreamפירימידין שנמצא -פולי- מכיר את הU2AFהחלבון

נקשר ומסלק את BPB .U2 מגייס את החלבון U2AFהחלבון : נוצרת קסקדה מחייבת

BPB .

1U6- מסולק ומוחלף בU.

מקרבת את שני האתרים U6( donor site)-ל U2( branch point)אינטרקציה בין

.(משמאל' ר)

U5snRNA

.acceptor site- מכיר את הU5כעת

Spliceosome

ה-spliceosome5- מורכב מ snRNPומבצע את השחבור .

50-60משקלוS40-ו, בתאים אנימלייםSבשמרים .

in vitro –כאשר כל אחד מה, אפשר להרכיב אותו בשלבים-snRNPמוסף עוזב בסדר מסוים .pre-mRNA

.כך ניתן לדעת את שלבי הראקציה. מוסף באופן חיצוני

in vivo – spliecosomeהחלקיק יציב וכל פעם . פריורית- הוא חלקיק אחד שמכיל את כל תת המרכיבים א

.יש מעין שינוי בקונפורמציה, "עוזב"כלומר אף מרכיב לא באמת . pre-mRNA-מראה פן אחר ל

נ מכילה את "תת היחידה הגדולה ככה. תת יחידות עיקריות שביניהן תעלה2-מורכב מ, המבנה שלו גלובולרי

-pre-נ ממוקם ה"ובתעלה ככה, snRNP-חמשת ה

mRNAהמשתחבר .

צילמו הרבה תמונות –במיקרוסקופיה אלטקרונית בקור

ובעזרת תוכנת מחשב הורכב המבנה , מזוויות שונות

.התלת מימדי


165 2008' סמסטר ב

:הקומפלקס מורכב בסדר מחייב

E-early – U1מזהה את ה -donor siteי זיווג בסיסים " ע

U2AFפירימידין ומגייס את החלבון - נקשר לפוליBPB שנקשר

(. branch point)לאותו אתר

Complex A – 2Uנקשר ל -branch point ובסיועו של U2AF

בזיווג בסיסים כאשר branch point-הוא נקשר ל. PBPמסלק את

Aנמצא בחוץ .

B Complex –ה -RNA של U4, U5, U6נקשרים לקומפלקס

נקשר 5U. מתקרביםdonor, acceptor, branch point-אתרי ה

. donor site- ב1Uומחליף את , 4U- נפרד מacceptor site .6U-ל

C Complex– 4 – קטליזהU6- עוזב את הקומפלקס ומאפשר לU

. נוצר אתר פעיל וממוקמות הקבוצות המגיבות– 2U-להיקשר ל

o בין ה–אסטריפיקציה ראשונה -טרנס -donor siteל -branch point.

o בין אתרי ה–אסטריפיקציה שניה -טרנס -donorוה acceptor מתרחשת בתיווך של U5.

. lariat intron- משתחררים מהsnRNP-וה, בוגר משתחררmRNA - בסיום

בסיסים 23-37- כ– (כלומר לא שמור מאוד) אם נמצא אתר הסתעפות חבוי upstreamל -acceptor site – יתרחש

והן (בציס) בינו לבין עצמו pre-mRNA-הן ב- בשחבור היא החשובה ביותר RNA-RNAהאינטרקציה. שחבור נורמלי

.(בטרנס) pre-mRNA- לsnRNPבין

Alternative spliceosome

מרכיבים 2הוא מכיל . שמשתתף בשחבורspliceosomeנמצא סוג נוסף ונדיר של (צמחים/יונקים)באואקריוטים גבוהים

- וdonor- באתר הAU מאחר והוא מכיר AC-ATהוא מכונה . (U6- וU4) מרכיבים משותפים 2-ו (U12- וU11)ייחודיים

ACבאתר ה -acceptor . בנוסף הוא משחבר אינטרונים רגילים עם קצוותGT-AG.

סיכום– mRNAעיבוד

י "תחילת שעתוק עRNA polymerase2 – בסיסים20-40 יצירת

capping – 5-5 יצירת קשר

המשך שעתוק

גמגום באיזור טרמינציה ונפילה שלRNA polymerase2

מתקבל - שחבורmRNAבוגר .

אדנילציה-פולי

כיסוי בחלבונים ויציאה לציטופלזמה

בקרה על איכות ה-mRNA


166 2008' סמסטר ב

Alternative splicing - שחבור חלופי

מכלול )לפרוטאום (מכלול הגנים)מהגנום (בסדר גודל)הקפיצה המשמעותית . והמון חלבונים (יחסית)יש מעט גנים

כמעט ואין , יכול להשתחבר במספר אופניםmRNAאותו תוצר של . מתצבעת באמצעות שחבור חלופי (החלבונים

mRNAשמשתחברים תמיד באותו אופן .

363אך יש גנים עם , אקסונים שניתן לשחברם במספר מוגדר של אופנים חלופיים8-9בגן הממוצע באדם

.אקסונים

60%י שני " מהגנים בתאי יונקים מיוצגים עmRNAלפחות .

אופנים חלופיים38,000-יש גנים בדרוזופילה שיתן לשחברם ב .

בעוד שאורכו של אינטרון , בסיסים150אורכו של אקסון ממוצע הוא

.( בסיסים800,000ועד ) בסיסים 0003,ממוצע הוא

מודלים לשחבור חלופי

הכללת , דילוג על פני אקסונים) מודלים שונים לשחבור חלופי –משמאל

(.משמאל' ר. )(' הבוגר וכיובmRNA-אינטרונים ב

הרצפים שמגדירים אתרי השחבור

. חלבונים60- ומעל לsnRNP 5י "התהליך סבוך ומתבצע ע, מצד אחד יש דיוק רב בשחבור

לא ייתכן שכל כלומר . יש מגוון עצום של אופציות שחבור–מצד שני

הפועלים י שלושת הרצפים האינטרוניים"תהליך השחבור מבוקר ע

רצפים מינימליסטיים (, donor, acceptor, branch point)בציס

.באינטרונים שאינם כה שמורים

.(בציס)בתוך האקסון צריכה להיות אינפורמציה שמגדירה אותו כאקסון : המסקנה

התאמה למסגרות קריאה שתתורגם )וגם לקידוד (י פקטורים שונים"זיהוי ע)האינפורמציה צריכה לשמש לשחבור

כלומר זהו לא המנגנון שמאפשר , DNA-תמיד נמצאת ב( שפועלת בציס)אך האינפורמציה באקסונים . (בהמשך לחלבון

. לנו להבחין בין מצבי שחבור שונים

ושונים בין שלבים במחזור חיי , ששונים בין מצבי התמיינות, פקטורים שפועלים בטרנס ושונים בין תא לתא: הפתרון

. לא נוכל לעשות שחבור חלופי–כל זמן שאין פקטורים מתאימים . התא

RNA- בdonor-ומשאיר אותם על אתר ה, CTD- מביא עימו פקטורי שחבור על הRNA polymerase2-תחילה חשבו ש

. הצומח

: הבעיות במנגנון זה

האינטרון הראשון שנוצר הוא לאו דווקא הראשון שמסולק

כל האינטרונים היו מורחקים תמיד–ובמנגנון לעיל , שחבור חלופי הוא מאוד שכיח .

שמשמשים גם לשחבור וגם משמשים , רצפים בציס)רצפים בתוך האקסונים : זוהי ההוכחה שיש אינפורמציה נוספת

.( הבוגרmRNA-שיוצאים ל, כרצף מקודד


167 2008' סמסטר ב

pseudo-exons

. pseudo-exon שמזוהים בטעות ומשתחבר donor/acceptorישנם רצפים שדומים לרצפים המינימליים באתרי

: הפתרון

העדפה בזיהוי אתרי שחבור הסמוכים לאקסונים .

הרצפים בצמתים(donor site, acceptor site) נדרשים , הכרחיים אך לא מספיקים כדי לבצע שחבורהם

.הרצפים האקסוניים

silent mutation ושחבור

silent mutation - אך לעתים , כ חסרת השפעה על רצף חומצות האמינו" בד–החלפה של נוקלאוטיד שלישי בקודון

!נעשה שינוי של אתר השחבור: הסיבה. החלבון כלל לא נוצר

Exonic cis-acting splicing signals

ESE – Exonic Splicing Enhancer –מאפשר הבחנה בין . ומגדיר היטב את האקסון, רצף אקסוני שעובד בציס

.הם חיוניים שחבור חלופי. הוא שכיח באקסונים קונסטיטוטיביים ועשיר בפורינים. אקסונים-אקסונים לפסאודו

ESS – Exonic Splicing Silencer – (מגדיר אותו כאינטרון למעשה) רצף שמגדיר את האקסון פחות טוב .

.ESS- וESEבתוך אקסון אחד יושבים גם רצפי : הבעיה

שחבור תלוי בזהות . פקטורים שעובדים בטרנס: הפתרון

. הפקטורים החלבוניים שקיימים בתא

אם יש רק פקטורים שמזהים את ה-ESE – הרצף יהיה

. אקסון

אם יש רק פקטורים שמזהים את ה-ESS –הרצף יוגדר כאינטרון .

כמות הפקטורים והאפיניות שלהם לרצפי השונים : יש תחרות בין שני סוגי הפקטורים–אם יש את שני הרצפים

. תקבע את גורל הרצף

SR-proteins –הפקטורים שנקשרים ל -ESEבאקסונים

SR-protein –חלבון עשיר ב -Serineו -Arginine .לחלבונים אלה יש שני מתחמים:

מתחםRRM( RNA recognition Motif )–שנקשר ל -

ESE.

מתחםRS –עשיר ב -serineוב -arginine , יוצר

.ESE- לupstreamפירמידינים - שנקשר לרצף הפוליU2AFחלבון ומסייע לגייס את החלבון -אינטרקציית חלבון

. מגדיר את הרצף הימני כאקסוןSR protein –י הגיוס של כל המרכיבים לשני הקצוות "ע

SR proteinsהכרחיים לשחבור קונסטיטוטיבי ומבקרים שחבור חלופי .


168 2008' סמסטר ב

SR proteinיודע לגייס שני מרכיבים :

U2AFל -acceptor siteהסמוך

U1snRNPל -donor site שנמצא upstream אליו ( באמצעות חלבון שלא נדבר עליו– srm160 .)

כאשר חלבוני hnRNAP חסרי מתחם RSנקשרים ל -ESEהם לא יכולים לגייס את שאר הפקטורים !

ESS

אך הם " מסוכנים"כלומר הם , ESS הם DNA- מהרצפים האקראיים ב1/3-כ

. דורשים פקטורים מתאימים שיכירו אותם

:mRNA- שמונעים כניסתם של הרצפים הללו לESS-מנגנוני פעולה אפשריים של ה

פקטורים שנקשרים ל-ESSיודעים למסך את ה -ESE (פירימידינים-כגון קישור לרצף הפולי) או אתרי שחבור.

חלבון מעכב שנקשר ל-ESSמונע גיוס של פקטורים נוספים .

ISE- וISSבאינטרונים יש רצפי

. יכולים להיקשר זה לזה וליצור לופ ולדחוק אקסון החוצהISSרצפי

סיכום - mRNAעיבוד ויצוא , תיאום בין שעתוק

השחבור ואפילו היציאה החוצה מתחילים עוד לפני שהסתיים

RNAי "כל התהליכים מצומדים ומתואמים ע. השעתוק

polymerase2בעזרת זנב ה -CTDזאת בניגוד למה שחשבו . שלו

שכל תהליך חייב להסתיים בטרם יתחיל התהליך שבא –בעבר

.אחריו

. ומגוייסים בתיאום מירביCTD-כל השחקנים נמצאים על ה

טרמינלי של תת היחידה של C- הינו הקצה הCTD-ניזכר כי ה

RNA polymerase2 , שמכילה מספר חזרות של רצףTyrosine ,

Serine, Prolineו -Threonine .הרצף מזורחן במהלך השעתוק ,

מה שמעביר את הפולימראז ממצב של איניציאציה למצב של

. RNA-אלונגציה של ה

פקטורי , capping( CE)המתחם המזורחן מגייס מראש אנזימי

. אדנילציה-שחבור ופקטורי פולי


169 2008' סמסטר ב

תפקידי האינטרונים

בקרת זרימה שלmRNAמהגרעין לציטופלזמה

אדניליציה חלופית נוצרים -משחבור חלופי או פולי- מגווןmRNAשונים מאותו גן שמקודדים לחלבונים שונים .

exon shuffling - נוצרת . מאפשרים מעבר של אינפורמציה של גנים בין אורגניזמים שונים ובאותו אורגניזם

. exon shuffling –קומבינטוריקה של אקסונים

וכדי לשמור על האקסון על החיתוך , כי עלינו לשמור על מסגרת קריאה–רקובינציות בין אקסונים היא בעייתית

.להתבצע במקום מוגדר מאוד

. לעומת זאת אין לנו בעיה דומה עם אינטרונים

חותכים את האקסון – shuffling-במהלך ה

שמקודד למשל לאתר פעיל של )הרלוונטי

כאשר משני צדדיו יש חלקים (אנזים כלשהו

. מתוך האינטרונים שהיו לידו

חצאי ) כשנכניס את החתיכה הזו –לאחר מכן

לתוך גן אחר (האינטרונים עם האקסון באמצע

האינטרונים , אנו שומרים על צמתי השחבור–

. י האקסון" ונקבל גן בעל האתר הפעיל שמקודד ע–ההיברידיים יוצאו לאחר מכן בשחבור

IgM-שחבור חלופי ב

: יש שתי צורותIgM-ל

הוא . ממברנלית ומופרשת

עובר שחבור חלופי בשני

2Mאתרים באקסון

שמאפשרים את הקצה

. הקרבוקסילי השונה

כדי להבטיח רק סוג אחד של

נשתמש בפקטורים –שחבור

.בעלי זיקה שונה

64kD –חלבון שמהווה חלק מ -CtSF . בתאBבעוד , כמותו מוגבלת

.שבתא פלזמה כמותו עולה משמעותית

- ראינו שחבור חלופי שמאפשר ל– Bכשהכנסנו את הפקטור מבחוץ לתא

IgMלהיות מופרש .

. ESE- וESSנמצאו (שמשמש לעתים אינטרון ולעתים אקסון) 2Mבאקסון


170 2008' סמסטר ב

RNA editing

, יש לכך השלכות על התרגום)בו מתרחשת התמרת בסיסים לאחר השעתוק , התהליך מוגבל מאוד אך משמעותי

.(והתהליך מרחיב משמעותית את מגוון החלבונים

מהבסיסים עוברים 50%ועד , התהליך נפוץ–בפרוטוזואה וצמחים

מודיפיקציות

אמינציה -ומתרחשת רק דה, התהליך מוגבר ביותר–ביונקים

.(הרחקת אמין מאחד הבסיסים)

מקום , שייר מתירני, I( I Inosine- הופך לA-ו. U- הופך לCכך

. (להגדלת הפרוטאום

U- לCאמינציה של -דה

apo-B100 נוצר בכבד ומהווה מרכיב של LDL.

apoB-48 –חלבון קצר שנוצר מהמעי ומרכיב את ה -chylomicron .

: הגן לשני החלבונים הוא יחיד–במעי

אם נותר הקודוןCAA – ישועתק apoB100.

אם יש שינוי שעושהde-aminase (אנזים ייחודי לכבד) שהופך את הקוד ל-UAA – זהו stop codon שגורם

.apoB-48 –לשעתוק של החלבון הקצר יותר

I- לAאמיציה של -דה

, אחד יכול לעבור אינטרקציה עם הקודוןtRNA- יותר מ– Inosineאם הפכנו

.כלומר שינינו את רצף חומצות האמינו

ADAR – Adenosine Deaminase)אמיציה -האנזים שמבצע את הדה

Acting on RNA) פועל עלRNAהוא התפתח מ)גדילי בלבד - דו-ADAT –

(.tRNAאנזים שפועל על

RNA הומני ופרימאטי יודעים ליצור RNAבזכות רצפי , גדילי- דוALU

. de-aminase- שהוא הסובסטרט של הdsRNAקומפלמנטריים ומתקבל

תיפקודים ב והעצביםמערכת ב בעיקר התהליך אופייני לפרימאטים ומתרחש

יחידות של תעלות יונים במערכת -ברצפים המקודדים לתת - נוירולוגיים

, אמינו יחידה בחלבוןומצת שינתה חmRNAעריכת . העצבים המרכזית

.גררה שינוי בחדירות התעלה ליוני סידן החיונית להתפתחות המוחש

הוא חמור ADAR1נזים אאוט לא-הפנוטיפ של עכברי נוק- האנזים חשוב מאוד

(. ADARsי" נוספים המטופלים ע RNAsפו וזוהושכן נצ) ונרחב


171 2008' סמסטר ב

(נון- שוש בר20)תרגום חלבונים

מולקולות , אנזימים)י חלבונים "רוב הפוקנציות התאיות מבוצעות ע

.('חלבונים מבניים וכו, סיגנל

התרגום הוא . חלבונים מתורגמים תמיד מהקצה האמיני לקרבוקסילי

מתאימה – mRNA- של ה5האינפורמציה בקצה . 3- ל5-מ

.לאינפורמציה בקצה האמיני של החלבון

ואין כלל בקרת , בחיידקים תהליך התרגום והשעתוק מצומדים

.תרגום

נקודת ההתחלה – איניצאיציה – AUG .יעילות התרגום שונה בין גנים באאוקריוטים .

מקודד גם לחומצת האמינו הראשונה וגם AUGכלומר . Methionine( AUG)יש רק קודון אחד לחומצת האמינו

? כיצד נבדיל בין שני המקרים. שנמצא באמצע השרשרתMethionine-ל

שכן בפרוקריוטים יש , מתחיל תרגום– הראשון שפוגש הריבוזום AUG-המנגנון לא יכול להיות כזה שבו ב

. ציסטרוניות-תופעה של פולי

שמכוונת את upstreamיש אינפורמציה - שמקודד להתחלת שעתוק בפרויקריוטים AUG-כדי להבחין ב

- השרשרת הפוליפפטיידת מתחילה ב–יש לציין שבפרוקריוטים . (כלומר רצף בציס)הריבוזום להתחלת שעתוק

fromyl-Methionine שלו tRNAייחודי .

:Methionine- לtRNAיש שני

o Initatir tRNA - מביא חומצת אמינו לאיניציאציה

o Elongator tRNA - מביא חומצת אמינו במהלך האלונגציה.

התקדמות הסינטזה– אלונגציה

סיום התרגום– טרמינציה

וחלבונים mRNAמאפייני

( חומצות אמינו לחלבונים20-ו, נוקלאוטידים בחומצות גרעין4)חלבונים וחומצות גרעין בנויים ממונומרים שונים .

ומהקצה האמיני לקרבוקסילי בחלבונים, בחומצות גרעין3- ל5-מ: הפלמור מתרחש תמיד בכיוון אחד.

הוא צריך להתקפל על עצמו ולעבור . כ מעובד בעת או לאחר יצירתו לצורה פונקציונלית"התוצר החלבוני בד

. ( שמתרחשת באוקריוטים בלבד–זירחון וגליקוזילציה , מתילציה, חיתוך)תרגומיות -מודיפיקציות פוסט

שמשתתפים בתרגוםRNAסוגי

. מערכת התרגום דומה בכל התאים האאוקריוטים והפרוקריוטים ומבטיחה קישור של חומצות האמינו ברצף הנכון

. קובעת את חומצת האמינו שתיכנס לחלבוןtRNA- לmRNAהאינטרקציה בין

חומצת האמינו השגויה (קודון שלו-שאינה מתאימה לאנטי, קשרנו אליו חומצת אמינו לא נכונה) tRNA-אם שיטינו ב

.tRNAאין בקרה על חומצת האמינו שיושבת על . תיכנס לחלבון


172 2008' סמסטר ב

: בעלי תפקידים שונים משתפים פעולה בתרגוםRNA- סוגי ה3

mRNA –הצופן לאינפורמציה גנטית המועתקת מ. התבנית-DNA ( רצף הנוקלאוטידים קובע את רצף חומצות

(האמינו

tRNA –שמתרגם את רצף הנוקלאוטידים ב, זהו המפענח. אדפטור-mRNAלרצף חומצות אמינו בחלבון .

.(עם מספר קודונים שונים) tRNAיש חומצות אמינו עם מספר

. אחד להיקשר ליותר מקודון אחדtRNA- שמאפשר לwobble-בזכות מנגנון ה (61ולא ) tRNA 32כ יש "סה

rRNA –כיום מאמינים שהחלבונים מחזיקים כפיגום את ה -rRNA (שה, בעבר חשבו בדיוק להיפך-rRNA הוא

. (רק פיגום שמאפשר את הפעילות של החלבונים הריבוזומליים

ריבוזום

.חלקיק הקושר ומתאם את מכלול המולקולות המשתתפות בסינטזת חלבון

. ומתרגם את האינפורמציהmRNA- וחלבונים ספציפיים נע לאורך הtRNAהריבוזום יחד עם

ולריבוזומים שיושבים קרוב , יש חלבון קצר– 5כאשר לריבוזומים שיושבים קרוב לקצה , כל ריבוזום מסנטז חלבון שלם

. חלבון ארוך– 3לקצה

תאיות-מערכות תרגום אל

ולקבל DNA-כיום אפשר להתחיל מ. שאיפשרה זיהוי השלבים והמרכיבים החיוניים לתרגום (in vitro)גישה ניסויית

.E.coliכן ניתן לתרגם גנים הומניים בתוך חיידקי -כמו. תוצר חלבוני

המערכת כללה תמציתE.coli ,ריבוזומים, ליזאט רטיקלוציטים, תמצית נבטי חיטה ,tRNA ,פקטורים חלבוניים ,

mRNAדקות90-המערכת יעילה רק ל. וחומצות אמינו .

ניתן להזריקmRNA לביציות צפרדע (Xenopus) .אך גם ה, שעות48-המערכת אמנם יעילה ל-mRNA

.האנדוגני יתורגם

. מכתיב את רצף חומצות האמינו בחלבוןmRNA-וכי רצף בסיסי ה, מקודד לחלבוןmRNA-במערכת זו הוכח ש

.cDNA-כיום רצף החלבון מוסק מה

לאחר התרגום /אלא אם תוצר התרגום הראשוני עובר עיבוד בעת, in vivo זהה לחלבון שבודד in vitroתוצר חלבוני

.(טרנסלוקציה, גליקוזילציה, חיתוך)

כל ריבוזום וכל פקטור תרגום מתרגמים . (רקמה/אינה ספציפית למין)כך גם הסיקו כי מערכת התאגום היא אוניברסלית

.mRNAכל


173 2008' סמסטר ב

הצופן הגנטי

לאחר mRNA- אותיות שנושא ה3-מורכב מ, הקוד פשוט ואניברסלי

.DNA-שהועתקו מה

. אפשרויות64=43. בסיסים המקודדים לחומצת אמינו אחת3 –קודון

תכונות הקוד הגנטי

קודוני 61 יש –דגנרטיבי הקוד senseחומצות אמינו 20- ל

(, tryptophan- וMethionineמלבד עבור , synonymsיש )

stop codon( UGA ,UAG ,UAA .) 3-ו

.יש העדפה לשימוש בקודונים שונים במינים שונים

ללא סימני פיסוקברציפותקודונים נקראים

למעט במיטוכונדריהשמור הקוד הגנטי.

כל קודון מקודד לחומצת אמינו אחת בלבד– משמעי-חדהקוד .

נקודת ההתחלה קובעת את ה. של השרשרת הפוליפפטידיתההתחלה והסיוםהקוד הגנטי מסמן את נקודות-

ORF ( מסגרות קריאה אפשריות3לכל רצף ) ,שנשמרת לאורך התרגום.

משנה רק חומצת –שינוי של בסיס אחד . בסיסים מקודדים רק חומצת אמינו אחת3כל . קודונים אינם חופפים

(במקרה זה מסגרת הקריאה שונה בין שני הגנים, אלא במקרה של גנים בתוך גנים)אמינו

אם עשינו מוטציה ב: הניסוי שהוכיח זאת-U –

חומצות אמינו בהנחה ויש 2אמורות להתחלף

אם אין –או חומצת אמינו אחת בלבד , חפיפה

. חפיפה

gene within genes –ים ' תופעה שקיימת בבטקריופאג–

. קיימת כאשר רוצים לקבל מקסימום אינפורמציה במינימום מקום

נמצאים באותו מיקום B וגן Aגן

מסגרות 2אך יש , DNA-פיזי על ה

קריאה שונות שמקודדות לשני

. חלבונים שונים

: wobble סוגי 3קיימים

XY-Pyrimidine (C, T)

XY-purine (A, G)

XY-N

.(בחלבון נקבל את אותה חומצת אמינו- למרות שהיה שינוי בבסיס השלישי ) מקטין את השפעת מוטציות wobble-ה


174 2008' סמסטר ב

frameshift

.deletion/insertionי "כ שינוי מסגרת הקריאה נוצר ע"בד

יש מקרים בודדים של דילוג של הריבוזום על בסיס , עם זאת

.(התהליך מבוקר מאוד)מסוים בכוונה

כדי להסיק היכן . cDNA אופציות לקריאת 3- משמאל

stop codons( non-sense .) נחפש –מתחילים לקרוא

. הנכוןORF-ואז מסיקים שזהו לא ה, stop codon-כ מגיעים ל" בד– קודונים 30לאחר , באופן סטטיסי

. frame-shift אזי לא יהיה – בסיסים 3 של Insertion/deletionכאשר עושים

במחלת ה -CF יש deletion בסיסים שיוצרים חסר של חומצת אמינו אחת במשאבת כלור 3 של (ATPase .)

. למרות שהוא מתפקד כראוי, החלבון שמתקבל לא מגיע לממברנה הפלזמתית

פענוח הקוד הגנטי

פולימרים-הומו

RNA- להרס הRNAse- טיפלו בE.coli -תאית מ-לקחו מערכת תרגום אל

סונטז חלבון שהורכב מחומצות האמינו mRNA Poly-U החדירו החיידקי

Phenylalanine .

כיצד קיבלו תרגום של UUU ללא AUGבתנאים המתאימים ? בתחילתו

. AUG אפשר לעשות איניציאציית תרגום ללא – ('מלח גבוה וכו)

.Proline- שמקודד לpoly-C-ו, Lysine- שמקודד לpoly-Aבצורה דומה פוענחו

פולימרים רגולריים-ניסוי עם קו

.( נוקלאוטידים4 ,3 ,2) רצף בסיסים חוזר ומוגדר –פולימר רגולרי -קו

: לדוגמא

רצף רגולרי של שני בסיסים(AC)– ACACACACמאפשר שתי מסגרות קריאה :ACA-CAC או CAC-ACA ,

. Thr-His-Thr-His-שתורגמו ל

רצף רגולרי של שלושה בסיסים(AAC )– AACAACAAC מסגרות קריאה3 מאפשר :AAC-AAC ,ACA-ACA

.Gln-ו, Asp ,Thr-שתורגמו ל, CAA-CAAאו

כך הסיקו ש -ACAמקודד ל -Thr .


175 2008' סמסטר ב

ניסוי קישור לריבוזום

ונבדק הקישור ( קודונים64 )tri-nucleotide 64סונטזו

. tRNA 20-שלהם ל

tRNAנקשר לריבוזום כתלות ב -tri-nucleotide.

שקשורים tRNA amino-acyl-( tRNAהעבירו דרך ממברנה

-ו, (לחומצת אמינו מסומנות בסימון רדיואקטיבי או עם גפרית

tri-nucleotide ,בעוד , שעברו את הממברנה בקלות

. (הם גדולים מדי)שריבוזומים לא עוברים את הממברנה

מצאו שריבוזום –כשבודדו את מה שנותר על הממברנה

. tri-nucleotide- ספציפי כתלות בamino-acyl tRNA-נקשר ל

. קודון מקודד לחומצת אמינו יחידההקישור ספציפי וחד משמעי

wobble-היפותזת ה

כלומר כמה – שקטן ממספר הקודונים tRNAלכל חומצת אמינו מספר

. iso-accepting tRNAהתופעה מכונה . tRNAי אותו "קודונים מוכרים ע

והעמדה השלישית בקודון , (5קצה )קודון -הזיווג של העמדה הראשונה באנטי

י שני הבסיסים הראשונים "הספציפיות מוקנית ע. אינו אובליגטורי–(3קצה )

.זיווג הבסיסים החלש בעמדה השלישית מאפשר דיסוציאציה מהירה. בקודון

. השונותwobble- אפשרויות ה–משמאל

I- , U-G ,I-A ,I-U הזיווגים שנוצרים –למרות שמדובר בזיווגים לא קונבציוליים

C - שמרניים למדי .

למשל ל) כאשר יש לפנינו רביעיית קודונים לאותה חומצת אמינו-proline

CCA ,CCC ,CCG ,CCU )– נצטרך לפחות שני tRNA.

C ל-tRNA אחד Iבעמדת ה -wobble שיכיר את A ,Uו -Cול -tRNA נוסף U או

. G שיכיר את wobble-בעמדת ה

כאשר לפנינו שישיית קודונים לאותה חומצת אמינו–

. tRNAנצטרך לפחות שלושה


176 2008' סמסטר ב

tRNA

.אדפטור, ולכן נחוצה מולקולה מתאמת, לחומצות האמינו בחלבוןmRNAאין זיהוי כימי ישיר בין בסיסי

tRNA – האדפטור שוצר קשרי מימן עם mRNAהמתרגמת את רצף הבסיסים . ונושא חומצת אמינו מתאימה לריבוזום

. לרצף חומצות האמינו בחלבוןmRNAשל

.(י יצירת קשרי מימן" הספציפיות נוצרת ע–בחומצות גרעין )

. חומצות האמינו20- שספציפיות לtRNA 20קיימות לפחות

. מרמת הריבוזום10ורמתם פי , tRNA סוגי 30-40 יש E.coli-ב

.5קודון שמתרחשת בקצה -אנטי- לא משפיעה כלל האינטרקציה קודוןtRNA- של ה3חומצת האמינו שנמצאת בקצה

. לחומצת אמינו הינו קשר אסטרי עתיר אנרגיהtRNA- בOH-3-הקשר בין הקצה ה

. ואינו מסתובב חופשי (amino-acyl tRNA) טעון בחומצות אמינו tRNA-רוב ה

tRNAמבנה

tRNA נוקלאוטידים73-93 מורכב משרשרת אחת בת .

ועם אנזימי , mRNAויוצרים אינטרקציה דומה עם , מבנה דומה כי כולם נקשרים לריבוזום באותו אופןtRNA-לכל ה

שיחבר synthetaseי סוגים שונים של " השונים לא זהים כמובן כי הם צריכים להיות מוכרים עtRNA-ה. אקטיבציה

.אליהם את חומצת האמינו המתאימה

. tRNA-יקבע איזו חומצת אמינו תיקשר לsynthetase - שמכיר הtRNA- הרצף על ה–הקוד הגנטי השני

של אותה חומצת אמינו תכונות tRNA-לכל ה

אם כי , tRNA-משותפות ששונות מתכונות של שאר ה

. יש רצפים קצרים שמוריםtRNA-לכל ה

של 5קצה tRNA נוצר כאשר RNAse P

ולכן יש שם רק , די אסטרי-חותך קשר פוספו

.( בדרך כללpG)פוספט אחד

תמיד הרצף – 3בקצה CCA ,3-כאשר ל-OH

. קשורה חומצת אמינוAdenoisneשל

Modified bases –שעתוקי- עיבוד פוסט

.ומאפשרים אינטרקציות ספציפיות, י מודפיקציות" בסיסים בלתי שגרתיים שנוצרים ע7-15 מכילות tRNAמולקולות

חלקן ) להכיר אותו synthetase-ומאפשרות ל, אחריםtRNA- יש מודיפיקציות אחרות שמבדילות אותו מtRNAלכל

. ( ארגון מחדש של כל הטבעת–ואחרות ניכרות , מתילציות–קלות

. ספציפיים למודיפיקציות השונותRNAי אנזימים או "המודיפיקציות מתבצעות ע

. או למיןtRNA- ואחרות ייעודיות לtRNA-חלק מהמודיפיקציות מתרחשות בכל ה

.השפעה על קישור לקודון והשפעה על מבנה וזיווג בסיסים, synthetaseי " לאפשר זיהוי ע–תפקידן העיקרי


177 2008' סמסטר ב

tRNAמבנה מרחבי של

שבקצותיהן לולאות , זרועות5יש בו . רק כמחצית הבסיסים מזווגים ליצירת הליקס כפול. עלה תלתן– המבנה השניוני

.שאינן מזווגות

ניצבים זה לזה ( בסיסים10בכל אחד )שני קטעי הליקס כפול . Lהמבנה המרחבי האמיתי הוא דמוי - המבנה השלישוני

:Lליצירת

בהליקס אחד זרוע ה-acceptor לחומצת

TψCאמינו המשכית עם הזרוע

בהליקס השני זרועD , המשכית עם זרוע

קודון-האנטי

. D- וTψC הלולאות – L-בזווית ה

A80קודון נמצאים במרחק של - והאנטיCAA-ה

. (זה מחוץ לצורך ההכרה של הריבוזום)בדיוק זה מזה

, A-A)ומייצב אותה , זיווג בסיסים בלתי שגרתי מאפשר גמישות של המולקולה

. ( של הריבוזOH-2 בין בסיסים באיזורים בלתי הליקאליים ועם G-G-ו

והאיזור ההליקאלי הסמוך אינם באינטרקציה חזקה עם שאר המולקולה CCA-ה

. ועשויים לעבור שינוי קונפורמציה

דורש שפעול של חומצת האמינוtRNA-קישור חומצת אמינו ל

על כל חומצת אמינו : יצירת קשר פפטידי הינו התהליך האנרגטי התובעני ביותר

. קשרי פוספטים4 נצרכים –שנקשרת

synthetase מכיר tRNA ומכיר חומצות אמינו , (במנגנון לא ברור) מתאימים

.מתאימות וקושר את השניים בקשר אסטרי

:synthetaseי "הראקציה שמבוצעת ע

amino-acyl adenylate יצירת – Adneylation .א

AMP-נוצר אנהידריד מ. (AMP-קשירת חומצת אמינו ל)

קבוצת הקרבוקסיל של חומצת האמינו . ומחומצת אמינו

. PPi ומשוחרר ATPנקשר לפוספט של

amino-acyl adenylate- את ה– aminoacyl transfer .ב

Adenosine על הריבוז של OH-2 או OH-3-מעבירים ל

-amino)נוצר אסטר עתיר אנרגיה . tRNA של 3בקצה

acyl tRNA)

פוספט-י הירוליזת פירו"ומונעת ע, הראקציה תלויה במגנזיום .

2- מכיוון שהריבוזום לא מכיר קישור של חומצת אמינו ל-OH ,3-לאחר מכן יהיה צורך לשנות את הקשר ל-OH .


178 2008' סמסטר ב

Amino-acyl tRNA synthetase

.( של כל חומצת אמינוtRNA-כל אחד מכיר את מכלול ה) חומצות אמינו 20- שספציפיות לsynthetase 20ישנם

שגוי והא מכניס את tRNA-הריבוזום לא יודע שמדובר ב - tRNA- טעה וקשר חומצת אמינו שגויה לsynthetase-אם ה

(. proof readingלריבוזום אין )חומצת האמינו הלא נכונה

.Class2- וClass1: משפחות לפי מבנה ולפי הרצפים2- האנזימים נחלקים ל20

.( אנזימים משתי המשפחות9בעוד שבאאוקריואים גבוהים נמצאו קומפלקסים של , בחיידקים כל אנזים הוא חלבון נפרד)

Class1

o 102- אנזימים מונומריים שקושרים את חומצת האמינו ל-OHעל ה -Adenosineב -tRNA ( לאחר מכן

(OH-3-יתבצע המעבר ל

o מזהים חומצות אמינו גדולות והידרופוביות

o קודון לפני קישור של ה-רובם מכירים את האנטי-

amino-acyl (חומצת האמינו עם ה-AMP )–האנטי -

. קודון הוא חלק מההכה אך לא מהווה את כל ההכרה

o מכילים רצפים שונים מלבד שני רצפים הומולוגיים

(KMSKSו -HIGH .)

Class2

o 10מרים -טטרה-דימרים או הומו- אנזימים הומו

- של הOH-3שקושרים את חומצת האמינו לקצה

Adenosineשל ה -tRNA .

o גם להם יש שלושה מקטעים הומולוגיים המאופיינים

ומהווים מרכז קטליטיanti-parallel -sheets 7-ב

o אלא את גבעול ה, הם לא מכירים כלל את האנטיקודון- acceptorשמוביל ל-CAA

.tRNA- יוצר אינטרקציה עם החלק הקעור של הsynthetase-ה

synthetase-יכולת ההגהה של ה

amino-acyl-AMPי ה" מוטעה מזוהה ומפורק ע-synthetaseב -editing pocket ( ברגע שיש קישור של חומצת האמינו

. ( לא ניתן לעשות עוד הגהה– tRNA-ל

.tRNA אך תלוי בנוכחות tRNA-הפירוק אמנם מתרחש לפני הקישור ל

: (מסננת כפולה) שלבי סלקציה 2כלומר יש

האתר הסינטטי דוחה חומצות אמינו גדולות מדי– בשלב הקישור של חומצת האמינו 100העדפה של פי

מפרק – (קטן מהסינטטי) האתר ההידורליטי – בשלב הגהה 100העדפה של פי aminoacyl-AMPקטנים מדי .

. של חומצת האמינו המתאימה10,000 העדפה של פי –כ "סה


179 2008' סמסטר ב

1:4,000- רק ב–למרות זאת . Isoleucine- לValine יש דמיון רב בין :לדוגמא

.Isoleucine במקום Valineמוכנס

Valine-AMP כל מה שמצליח להיכנס לאתר ) נכנס לאתר ההידוליטי ומפורק

. ולכן אינו מפורקIsoleucine-AMPהאתר קטן מדי בשביל . (יפורק

synthetase-י ה" עtRNA-זיהוי ה

synthetase- מהימנות התרגום תלויה בספציפיות של ה–למעשה

. וחומצות אמינו וקושרות ביניהםtRNAשמזהות

.tRNA- בסיסים שעברו מודפיקציות שמקלים על זיהויו של הtRNA-ל

מכיר דטרמיננטות מולקולריות שמגדירות את synthetase-ה

של חומצת אמינו tRNA-מכלול ה) iso-accepting tRNA-ה

מסוים קושר את אותה חומצת אמינו synthetase. (מסוימת

. קודונים- עם מגוון אנטיtRNA-ל

. synthetase-מה שרואות ה- הקוד הגנטי השניוני

פוענח מנגנון הזיהוי של tRNAלמרות הדמיון המבני בין

. tRNA- את הsynthetase-ה

מהניסויים הללו הבינו שיש נוקלאוטידים . תכיר אותוsynthetase אחר ובדקו איזו tRNA- אחד לtRNA בין swapעשו

. tRNA-בעוד שאחרים משותפים לכל ה, שמשמשים להכרה

באתרי הכרה L בחלק הקעור של tRNA מזהה synthetase-ה

:לדוגמא. מינימליים

בסיסים הספיקו כדי לשנות את 12נמצא ששינוי של

. Serine- לLeucine- מtRNAהספציפיות של

הספציפיות ל-Alanineבסיסים מזווגים 2י " מוקנית ע

של deletionעשו - בדוגמא משמאל . acceptor-בגבעול ה

הכרחי – 70ונמצא שהזיווג . 13-66כל הנוקלאוטידים בין

. ומספיק

קודון -גבעול ולולאת האנטי. Dולולאת , גבעול: איזורי הכרה נוספים

. משמשים אתר הכרה מוגבל מאוד


180 2008' סמסטר ב

(נון- שוש בר– 21 )הריבוזום

הריבוזום

35מכסה )מדובר בקומפלקס גדול . המכונה המולקולרית על פניה מתרחשים המאורעות בעת סינטזת חלבון

. המתמחה בסינטזת חלבוןRNA-אנזימתי שמורכב מחלבון ו-ומולטי (mRNA-נוקלאוטידים של תבנית ה

. הריבוזום הינו יציב ומסונטז קונסטיטוטיבית למעט במצבי הרעבה של חומצות אמינו בהם הריבוזומים מתפרקים

– E.coli-משקל הריבוזום ב. ממשקלו היבש25%המהווים , ריבוזומים לתא15,000-20,000יש - E.coli-ריבוזומים ב

2.8x106קוטרו , דלתוןA200 , ומקדם השקיעה שלוS70 .

. mRNAפוליריבוזום אחדים העסוקים התרגום אותה מולקולת = פוליזום

. והתהליך אינו אפשרי בתמיסה, כרוכה במנגנון קטליטי מורכב ומתואםסינטזת החלבון

מבנה הריבוזום

קטנה – הם מורכבים משתי תת יחידות . במבנה והתפקיד בפרוקריוטים ובאאוקריוטים, בעיקרון, ריבוזומים דומים

(. 15kDaltonקטנים שמשקלם עד )ים נ ומספר רב של חלבוRNAכל אחת מכילה מספר מועט של מולקולות , וגדולה

ובתת , ( בסיסים35-כאמור מתאימה ל) mRNAבין שתי תת היחידות יש תעלה עבור : רגולרי-לריבוזום מבנה מרחבי אי

– חומצת אמינו 30כלומר רק לאחר סינטזת , חומצות אמינו30-מתאימה ל)היחידה הגדולה יש תעלה לפפטיד הצומח

. (החלבון מתחיל לבצבץ מתת היחידה הגדולה

. (ל" נקשרים החלבונים הנrRNAעוד בזמן עיבוד )מהווה מסגרת אליה נקשרים חלבונים באופן ספצפי – rRNA-ה

. ( בין שמרים לבין חיידקיםrRNAאין להחליף ) חיוני להרכבה ולפונקציונליות של הריבוזום rRNA-ה

. כלומר האינפורמציה היא במרכיבים עצמם - (self assembly)ריבוזמים שוחזרו ממרכיבים - E.coli-ב

. אך על הממברנה הפנימית יש ריבוזום שיושבים ומתרגמים חלבונים, ER-בפרוקריוטים אין ממברנה ל

: תת היחידות של הריבוזום

S70 –פרוקריוטי .א

50S - 36שתי יחידות , חלבוניםrRNA – S5ו -S23.

30S -21יחידת , חלבוניםrRNA אחת -S16

.אין בקרת תרגום ולכן המבנה מוגדר– בפרוקריוטים

S80 –אאוקריוטי .ב

60S - יחידות 3, חלבונים49-כ rRNA – S5 ,S28 ,ו-S5.8 - אין מספר מדויק מפני שהמערכת לא

.יש שינויים לצורך בקרה, אחידה

(יוצר את הקשר הפפטידי) peptydil transferase center-מכילה את ה

40S -יחידת , חלבונים33-כrRNA אחת S18 - מכילה את ה-decoding centerשבורר את ה -

tRNAלפי הקודונים ב -mRNA.

.איזור יצירת הקשר הפפטידי נמצא סמוך לתת היחידה הגדולה. את השלוחות שנעות, הרגולריות-ניתן לראות את אי


181 2008' סמסטר ב

חלבוני הריבוזום

. ולא מצביעים על המשקל המולקולרי, המספרים שניתנו לחלבונים הם סדרתיים

L – חלבונים של תת היחידה הגדולה ,S – חלבונים של תת היחידה הקטנה .

גיבוש הריבוזום

החלבונים מאוד , גבוהות' מפני שהריבוזום הזה יותר עמיד לטמפ, נעשה מחיידק תרומפיליS70הבידוד של הריבוזום

. נטורציה בקלות-יציבים ולא עוברים דה

אך תפקוד , והחלבונים בפריפריהrRNAהוא דרך – כשסיימו לגבש את הריבוזום הבינו שהקשר בין שתי תת היחידות

. rRNAמתבסס על

. מה שמסביר את שימורםtRNA-הריבוזום בא במגע ישיר עם עיקר המוטיבים ב (E- וP ,A)בשלושת האתרים

בסיסים אלו נמצאים . של תת היחידה הקטנהS16- משרה שינוי קונפרמציה בבסיסים שמורים בtRNAקישור

-ה– אנטיקודון הוא מוצלח-כלומר כשמפגש קודון. טיקודוןנא- שבמפגש קודוןminor groove-באינטרקציה הדוקה עם ה

rRNAואחד התפקידים של , טיקודוןנא-זהו מנגנון ברירה נוסף למפגש קודון, מחזק את ההכרהrRNA .

הרכבת ריבוזומים

rRNAגבעול שיש לו מעין בועות של חוסר )כ בגבעולים בלתי מושלמים "בד, תרים ספציפייםא קושרים חלבונים ב

. (קומפלמנטציה

י "רחיק מריבוזום קיים חלק ממרכיביו החלבונים עהול, ניתן להרכיב ריבוזום ממרכיביו– סדר קישור החלבונים קבוע

. או שימוש במלח גבוה (שאחראי לאינטרקציות בין מרכיבי הריבוזום)גנזיום מהרחקת

. rRNA- של ה5-נקשרים בעיקר לקצה ההחלבונים ו, rRNA מתרחשת טרם סיום השעתוק של in vivoהרכבת הריבוזום

פוליזומים

כל אחד ) mRNAזמנית רותה שרשרת -מספר ריבוזומים המתרגמים בו

. (פועל באופן בלתי תלוי ומתרגם פפטיד שלם

שכן נוצרות במקביל , קיומו של הפוליזום מגביר את יעילות התרגום

אין צורך להמתין שריבוזום אחד יסיים את )מספר מולקולות חלבון

. (הסינטזה

יש לזכור ) נוקלאוטידים 80ריבוזום מדי – הצפיפות המירבית

. ( נוקלאוטידים35שטח של " תופס"שהריבוזום עצמו

הוא ER-יש רקמות שבהן יש המון חלבוני הפרשה ובהן כמעט כל ה. באאוקריוטים מאוד מרושת בריבוזומיםER-ה

RER .החלבונים המסונטזים על ריבוזומים שצמודים ל-ERצומחים לתוך חלל ה -ER . ברגע שיפסק התרגום –

. ER-אך האינטרקציה הזו לא מחזיקה את הריבוזום על ה – SRP- וSRP-receptorאמנם יש . ER-הריבוזומים יפלו מה

. גם בחיידקים יש ריבוזומים שקשורים לממברנות


182 2008' סמסטר ב

סינטזת החלבון

אנזימי , tRNA, ריבוזימים) סוגי מולקולות 100-מחייב שיתוף ותיאום של מעל ל – מורכבתהליך התרגום מאוד

. ('פקטורי תרגום חלבוניים וכו, mRNA, אקטיבציה

מהירתהליך התרגום מאוד

ב-E.coli – כי משועתקים )מה שמתאים לצימוד בין שעתוק לתרגום , חומצות אמינו לשניה20מסונטזות

. הוא יכול לעבור תרגום– מסונטז mRNA-ברגע שה. ( בסיסים לשניה100עד

אך יש מיליון קשרים פפטידיים שנוצרים , חומצות אמינו לשניה2-4– התרגום יותר איטי – באאוקריוטים

. (י ריבוזומים רבים"כי מתבצע תרגום ע)בכל שניה בתא

N של שרשרת צומחת לקצה Cיצירת קשר פפטידי בין קצה – למעשה הריבוזום מקטלז ראקציה כימית יחידה

. בחומצת האמינו החדשה המוספת

קשרי 2השקענו ) tRNA-התהליך הוא ספונטני כי השקענו את האנרגיה ביצירת הקשר האסטרי בין חומצת האמינו ל

. באה אחריההחומצת האמינו הדרושה לסינטזת ה יגרכל חומצת אמינו מספקת את האנ. (פוספט עתירי אנרגיה

C( Dintzis ) לקצה Nהניסוי שהוכיח שהחלבון מסונטז מקצה

. כדוריות דם אדומות צעירות שמייצרות אך ורק גלובין– רטיקולוציטים

לאחר מכן נאספו רק החלבונים שסיימו . רים סינטזה בסימונים באורכים שוניםבים שעונ חלבוLeu H3-החוקרים סימנו ב

. את הסינטזה והשתחררו מהריבוזום

. (שחותך קשרים פפטידים לאחר חומצות אמינו בסיסות טעונות חיוביות כגון ארגינין)לאחר מכן חתכו בטריפסין

: לסיום בדקו את תוצרי החיתוך והסימון

התקבל סימון רק בקצה – כשהסימון היה לזמן קצרC .

נותרו לו מעט מאוד – כשהחלבון כבר היה בסיום

. חומצות אמינו לסנטז עד לטרמינציה

כלל החלבון סומן– בסימון ארוך .

י קישור " של השרשרת הצומחת משופעל עC-בכל השלבים הקצה ה

בכל . ( אליו קשור הפפטיד שסונטזtRNA )peptidyl tRNA-קוולנטי ל

. וצר מחדש עם חומצת האמינו הבאה בתורנפעם הקשר נשבר ו

. להוספת חומצת האמינו הבאה אחריה (שמקורה בקשר האסטרי)כל חומצת אמינו נושאת אנרגית אקטיבציה

3- ל5-הניסוי שהוכיח שהתרגום הוא מ

. N-Lys(Lys)nAsn-C: תוצר התרגום. תאית- תורגם במערכת אלAAA(AAA)nAAC-3-5הנוקלאוטיד הסינטטי

– 53- משמש כתבנית שנקראת מmRNA-ומאידך ה, 53 צומח בכיוון mRNA-ה– מכיוון שבזמן השעתוק

. תרגום בפרוקריוטים-מתאפשר הצימוד שעתוק


183 2008' סמסטר ב

שלבים בסינטזת חלבון

איניציאציה

אלונגציה

טרמינציה

בפרוקריוטיםאיניציאציה

. איניציאציה מתחילה עם תת היחידה הקטנה בלבד

סימן – בקצה Methionineבחלבונים שבהם אין . Methionine-כל החלבונים בטבע מתחילים ב– למעט במיטוכונדריה

. שהיה חיתוך של קצה החלבון

f-Metמבטיח שחומצת האמינו יכולה להיכנס רק לתחילת השרשרת ולא לאמצע השרשרת .

. (היא רק מסייעת להגברת היעילות)פורמילציה מסייעת לתרגום אך אינה הכרחית

פרוקריוטים

אינו שכיח בעמדות אחרות Met .Met מכילים בקצה האמיני E.coli-כמחצית החלבונים ב

. בחלבונים

N-fotmyl-Methionine( f-Met )וטים סינטזת כל חלבון מתחילה עם שייר של יבפרוקר

tRNAi = tRNAinitiator = tRNAfMet ייחדי המכונה tRNA-שקשור ל

. כל אחד מהם מעורב בתהליך אחד בלבד, tRNA סוגי 2כלומר יש לנו

. עצמוtRNA- טמונה בtRNA-הספציפיות לאן בשרשרת ייכנס ה

י "שייר הפורמיל מורחק ע– לאחר סינטזת החלבון – לעתים

Deformylaseי " ולעתים כל שייר המתיונין מורחק ע

Aminopeptidase .

tRNAfMetו - tRNAMet

חופשי הן Met קושר Methionyl synthetaseאנזים האקטיבציה

. tRNAMet-והן לtRNAfMet -ל

- שקשור לMet-ושר שייר פורמיל לק Trnasformylaseהאנזים

tRNAfMet, אך אין פורמיצליה שלMetחופשי או כזה שקשור ל -

tRNAMet .

f-Metר הפרמיל סותם את הקבוצה האמינית ומונע את כניסת ישי

אך מאפשת קישור לאתר )לאמצע שרשרת פוליפפטידית

.(איניציאציה בריבוזום

tRNAMetבאאוקריוטים יש initiatorאך אין פורמילציה .


184 2008' סמסטר ב

אתר האיניציאציה בפרוקריוטים

. AUG < GUG < UUG: קודונים ביעילות שונה3 מזהה tRNAfMet .tRNAfMetאתר האיניציאיה קושר רק

: הקריאה של הקודון תלויה בהקשר

GUGמוכר כ -valineאך כ, באמצע השרשרת-Methionineבתחילת השרשרת .

AUGי " בתחילת השרשרת מוכר עtRNAfMetי " ובאמצע השרשרת עtRNAMet .

, השני יש קודון איניאציה משלוORF-ל. אחד אחרי השניORFכלומר כמה , בפרוקריוטים יש פוליציסטרוניות:הבעיה

. אלא במרכז השרשרת5 אינו בקצה AUG-אך ה

. יש אינפורמציה שמכוונת את הריבוזום לקודון האיניציאציה– לקודון האיניציאציה upstream :הפתרון

תיתכן חפיפה בין קודוני טרמיציה ואיניציאציה של שני ציסטרונים סמוכים מה שמגביר את היעילות כי – בפרוקריוטים

(AUGA-3-5: לדוגמא)הריבוזומים כבר שם

RBS( Ribosome Binding Site )– אתר קישור לריבוזום

ותת היחידה , שלהP יישב באתר mRNA-אציה של הצית היחידה הקטנה כך שקודון האיניתאנו רוצים להושיב את

. down-streamתכסה את הנוקלאוטידים

- בסיסים מצוי ב3-9במרחק , AUG- לupstream– לצורך הכוונת הריבוזום

mRNA רצף עשיר בפורינים המכונה Shine-Dalgarno ( רצףSD )

שלו קומפלמנטרי לרצף 3אשר הקצה , rRNA S16לתת היחידה הקטנה יש

Shine-Dalgarno (הרצף שמור מאוד) .

גילו את רצף SDי אי הוספת " כאשר עיכבו אלונגציה עtRNA .

לאחר חיתוך עם . אך לא יכול להמשיךmRNA-הריבוזום מתיישב על ה

RNAseגילו היכן מתיישב הריבוזום .

או ) AUGותמיד להביא לכך שקודון , יכול להופיע במספר מקומותSD רצף

GUG) (. מאפשר פוליציסטרוניות)הסמוך יהוו קודוני איניציאציה

שם נוצר קומפלקס , של הריבוזוםS30זהו אתר הקישור לתת היחידה

. tRNAfMet-האיניציאציה בצירוף פקטורים חלבונים ו

SDחשיבות רצף

אם חותכים את ה-S16 3 או עושים מוטציות בקצה

. יש פגיעה קשה בתרגום– שלו

האנטיביוטיקהColicin E3 של 3 מבקעת את הקצה

. ומונע לחלוטין איניציאציית תרגוםS16-ה

בתעשיית הביוטכנולוגיה משתמשים בחיידקים כדי

התרגום עלה בסדרי - לגן המקודד לאינסולין שהחדירו לחיידקים SDכשמוסיפים את הרצף . לסנטז אינסולין

. גודל


185 2008' סמסטר ב

אתרי הריבוזום

: תת היחידות2 במפגש tRNA- אתרי קישור ל3לריבוזום

(.P היחיד שנקשר לאתר amino-acyl tRNA- השהוא) tRNAfMet- וpeptidyl tRNAאליו נקשר – Pאתר .א

(tRNAfMetמלבד ) amino-acyl tRNA-אליו נקשרים באלונגציה כל ה – Aאתר .ב

. חופשי שאיבד את חומצת האמינו שלו לטובת הפפטידtRNAממנו עוזב – Eאתר .ג

tRNAinitiator = tRNAfMet

. (מעורב באיניציאציה אך לא באלונגציה) Aאך לא לאתר , Pהוא נכנס לאתר

.IF2-אך שייר הפורמיל משפר את יעילות הקישור ל, הפורמילציה אינה הכרחית

. המתאיםRNA- ולהכיל את הsynthetase-י ה"הוא חייב להיות מוכר ע

: מאפיינים

2הבסיסים האחרונים בזרוע חומצת האמינו מזווגים בכל ה -

tRNA ,למעט ב-tRNAfMet .הכרחי לאיניציאציה חוסר הזיווג

. ולפורמילציה

במקרה של מוטציה שגורמת לזיווג של שני הבסיסים

tRNAfMetייכנס גם באמצע השרשרת .

3 זגות G-Cשקיימים רק ב, קודון- בלולאת האנטי- tRNAfMet והם

P ישירות לאתר tRNA-אלו שמאפשרים את הכניסה של ה

.החלקי

לאתר ראין הכרח בסדר הקישו P – אין הבדל אם ייקשר קודם

tRNAfMet קודם או mRNA .

פקטורי איניציאציה

S30 ,mRNAשכולל את תת היחידה , מסייעים ליצרת קומפלקס האיניציאציהGTP- וIF3 ,IF2 ,IF1פקטורי איניציאציה

tRNAfMet -ו (עם אתר קישור לריבוזום)

IF1 – קשור לאתר A , של מונע קישורtRNA לאתרAומסייע לקישור של , חלקי בשלב מוקדם מדיIF2 לאתר P.

IF2 – אתמביא tRNAfMet לאתר P .IF2 הינו GTP binding protein ,GTPase באתר ביושש P כשהוא

.שלו GTP-בצורת ה

IF3 - קשור לאתרE . יחידה הנקשר לתת הואS30 לא תיקשר לומבטיח שהיא-S50 כדי להבטיח את

(.tRNAfMet- לPמגבירה את הספציפיות של אתר ) האיניציאציה


186 2008' סמסטר ב

2IF

.P וכך הוא מגיע לאתר IF1-הוא קשור ל. tRNAfMet- וS30 ,1IF שמקשר בין GTPAse-מדובר ב

לבוני חG -חלבון שיש עליו הואGTP –הההפעלה של כשיש . קשרהייודע ל, הוא פעיל-GTPase – פופסט

. GDPבון עם ומתקבל חל, יורד

הוא בעל פעילת 50S -נו במקרה של. GAPצריכות פקטור משפעל המכונה ו, חלשותלבדן הן GTPAseכ "בד

GAP . כשנותרGDP - הקומפלקס , יסוציאציהמתרחשת ד, שאינו יודע להיקשר עוד, לבלתי פעילהופך החלבון

. נפרד

עושה את GEFהחלבון . (exchange, שחלוף) GTP- בGDP- יתאפשר הודות להחלפת הGTP-שחזור ה

. EFTsהוא אחד מפקטורי האלונגציה ומכונה , השחלוף

2GTP-IF יוצר קומפלקס ספציפי עם tRNAfMetי " במקרים שבהם הקצה האמיני חסום עמשתפרתוהספציפיות ) בלבד

-ויש קומפלמנטציה קודון, החלקיPכך שקודון האיניציאציה הוא באתר tRNAfMet -הפקטור ממקם את ה. (פורמיל

.IF1- וIF3שנושאת כבר את S30- נקשר ישירות ל2GTP-IF. אנטיקודון

יצירת קומפלקס האיניציאציה

הקישור שלmRNA מערב זיווג בסיסים בין אתר קישור לריבוזום

(.S30-חלק מה) S16 של 3-לקצה ה (mRNA על SDרצף )

תת היחידהS50מצטרפת (נוצר ריבוזום שלם ,S70) ,ו-IF3עוזב .

ה-GAP ( מכונה גםFactor Binding Center) שלS50 משפעל

.GDP- לGTPוחלה הידרוליזה של , IF2 של GTPase-את ה

IF2מאבד את האפיניות לריבוזום ול -tRNAfMetולכן GDP-IF2 עוזב

. נותר פנויAאתר . IF1יחד עם

קישור בלתי תלוי של ריבוזומים לציסטרונים השונים ויעילות האיניציאציה

. קובעת את יעילות התרגום

רק לאחר הגעת תת היחידה . הסכמה לא מדויקת - באיור התחתון משמאל

. 2- ו1ורק לאחר הקישור מסולקים פקטורים , מסולק3פקטור – הגדולה

בפרוקריוטיםגציהנאלו

: שנוספת לשרשרתעבור כל חומצת אמינו שלבים המתרחש 3מחזורי בן תהליך

באתר peptidyl tRNAהקישור תלוי בנוכחות . (פ הקודון שנמצא באתר"ע) A באתר amino-acyl tRNAקישור .1

P ,י "ומתווך עEFT .

יצירת קשר פפטידי .2

טרנסלוקציה .3


187 2008' סמסטר ב

amio-acyl tRNAקישור . 1

EFT

( GEF בעל פעילות) EFTS-ו, EFTU (GTPase): פקטורי אלונגציה2

תוך הידרוליזת A לאתר aminoacyl tRNAמתווכים את הקישור של

GTP .

הופך IF2 ,GTP של GTPase- משפעל את ה50S- בGAP-מרכיב ה

GDP ,ו-IF2 עוזב .EFTS שחלף את ה מ-GDPב -GTPזר את ח ומש

IF2 תחיל עוד מחזור איניציאציה בריבוזום אחרי שיכד .

EFTU – 43 הינו חלבון במשקלkDalton שרגיש לחום

(u=unstable .) גם הואGTPase שקושר GTP ומפרק GDP.

(.tRNAfMetמלבד ) amino-acyl tRNA-הוא קושר את כל ה

עם קומפקלס טרנארי וGTP עם קומפלקס בינארייודע ליצור

GTP ועם amino-acyl tRNA אותו הוא מוביל לאתר A .

aminoacylבדומה לכמות של ) בתא EFTU עותקי 70,000יש

tRNA –רובם אגב נמצאים בקומפלקס הטרנארי ).

. הוא ממסך את חומצת האמינו ומונע ממנה ליצור קשר פפטידי, 3 הוא לקצה amino-acyl tRNA-הקישור ל

- לGTP-וכשמתרחשת ההידרוליזה מ, S50 של GAPי" שלו משופעל עGTPase-ה - Aלאחר הכניסה לאתר

GDP –הוא מתנתק מ -amino-acyl tRNA , וקבוצת האמין של חומצת האמינו נחשפת ליצירת קשר פפטידי עם

. אין יצירת קשר פפטידי– כל זמן שהקומפלקס לא יושב בריבוזום כלומר . peptidyl tRNA-ה

. הם מוודאים שהקשר ייווצר רק כאשר נכנסת חומצת אמינו מתאימה, מתזמנים את התהליךGTPase-ה

EFTs –פטור שחלוף ,GEF . 74גודלוkDalton , הוא עמיד יחסית(s=stable) ונמצא בכמות קטנה יחסית בתא

.(בדומה לכמות הריבוזומים, עותקים10,000)

EFTu- נקשר לEFTsהתהליך מתרחש כאשר . EFTU-פעיל שקשור לGTP - לERTu- שקשור לGDPהוא משחלף

. הקומפלקס מתפרק– GTPכאשר נקשר . ויוצר איתו קומפלקס

. ועוזבGTP-הוא משחזר את ה, מכיוון שהוא כמו אנזים, EFTU-ותו קטנה הרבה יותר בהשוואה לכמ

GTP-חשיבות ה

GTP לקישור וכן הקומפלקס הטרנארי ליצירת חיוניamino-acyl-tRNA לאתר A.

הנחוצה EFTU של לדיסוציאציהאינה חיונית לקישור אלא (פי אנלוג שאינו עובר הידרוליזה-על) GTP של הידרוליזה

(.ואי אפשר להמשיך לסנטז את החלבון– סכת וחומצת האמינו ממ– אם אין דיסוציאציה )ליצירת הקשר הפפטידי

לבין aminoacyl-tRNAהאינטראקציה בין בעוד ש, הפיכות הינן GTP-EFTUובין EFTS- וEFTUהאינטראקציות בין

GTP-EFTU ורק הידרוליזה של , הפיכהאינהGTP תביא לשחרורו של amino-acyl tRNA .

. סינתזה–מכאן שכיוון הריאקציה


188 2008' סמסטר ב

יצירת קשר פפטידי . 2

סמוכים P- וAתרים א. כימית וקטליזה קטליזה גיאומטריתהריבוזום תורם

. קודונים סמוכים2 מזווגות עם tRNAכך שמולקולות

- של ההאמינית כך שהקבוצה מכוונים tRNA- מולקולות ה2 של 3'הקצוות

amino-acyl tRNA האמינו ומצת של חהקרבוניל וצת את קבמתקיפה

.peptidyl-tRNA-הקשורה לבשרשרת האחרונה

fMet מ משופעל או פפטידיל משופעל עובר-tRNA של האמינית לקבוצה

aminoacyl-tRNA , נוצר באתרA peptidyl-tRNA אמינו ומצת בחארוך

.חופשי tRNA נותר Pנוספת ובאתר

הקשר הפפטידי נוצר באיזור תת היחידה הגדולה של הריבוזום המכונה

peptidyl transferase center (23S של תת היחידה הגדולה ,

בדקו זאת כאשר . ( הוא זה שיוצר את הקשרים הפפטידיים,הריבוזים

. עדיין נוצרו חלבוניםראו שים ונהרחיקו את מרבית החלבו

והחלבונים מרוחקים מאיזור הקטליזה , A3 למרחק שלקטליזה עובדת עד

. ת שיכלה ליצור את הקשרר מכאן שאין אף ישות אחA18-כ

. ( באאוקריוטיםCycloheaxmide-ו) בפרוקריוטים Chloarmphenicolי "יצירת הקשר הפפטידי מועכבת ע

נמצאים באינטרקציה CCA-שני ה. בקצה אליו קשורה חומצת האמינוCCAיש ( P- וAבאתרים ) tRNA-השני ל

. rRNA-ל 3- הקצה ההאינטרקציה היא ביןלמעשה . 23S-גאומטרית עם ה

עוזר לקטליזה CCA- מכיוון שהOH-3- אליו חומצת האמינו קשורה לtRNAריבוזום מקבל רק . כן יש קטליזה כימית-כמו

קשר מימן עם )שכן הוא משתתף ביצירת הקשר הפפטדי (OH-2-מ) OH-3-על הריבוזום להעביר את הקשר ל. הכימית

( חזקלנוקלאופיל החנקן הופך את אמינו' קב

tRNAMet- הקשור לMetאו של ) הפוליפפטידית השרשרת של המשופעל הקצה הקרבוקסילי- בכל שלב ושלב initiator

הבאהאמינו ה חומצת של אמינית לקבוצה ונקשר P באתר tRNA - את העוזב

. A באתרtRNA-הקשורה ל

משופעליםaminoa-acyl- וpeptidyl . ספונטנית–יצירת הקשר הפפטידי

.tRNA-בקישורם ל

טרנסלוקציה . 3

כך , הבאלאחר יצירת הקשר הפפטידי על המערכת להתכונן למחזור האלונגציה

.(3b) אחד קודוןמרחק מדויק של , ’3 לכיוון mRNA- לאורך השעל הריבוזום לנוע

ולהשתחרר E לאתר ולעבור P את אתר לעזוב החופשית tRNA-על מולקולת ה

.בציטופלסמהחזרה למאגר


189 2008' סמסטר ב

P נותר באתר האנטיקודון ואילו איזור הגדולההיחידה - שבתתE לאתר tRNA- של ה’3בשלב הביניים עובר רק הקצה

.הקטנההיחידה -שבתת

עובר tRNA- של פפטידיל’3תחילה הקצה - שלבי-מעבר זה דו גם . P לאתר Aעבור מאתר לpeptidyl tRNAעל

.הקטנההיחידה - שבתתA נותר באתר האנטיקודוןאיזור ש בעוד הגדולההיחידה - שבתתPלאתר

mRNA ("נייח"אין הבדל מי יזוז ומי יהיה ) וריבוזמים זזים בתנועה יחסית .

. אנטיקודון נשמרת-האינטרקציה קודוןבזמן שהטרנסלוקציה מתרחשת

, P לאתר A שדוחק את הקומפלקס מאתר EFGלשם נקשר פקטור , מתפנה מקוםA באתר הבתת היחידה הגדול

. להשלמת הטרנסלוקציהאחראי EFGהפקטור . E לאתר Pשהיה באתר הקומפלקס שדוחקת את

EFG

.GTP-EFTU החדש יביא amino-acyl tRNA-את ה .Translocaseהפקטור הוא

. (הם מתחרים כביכול על הקישור לריבוזום) EFTU-לו EFG-ל Aבאתר הריבוזום נקשר לסרוגין

EFGעותקים ממנו בכל תא20,000-יש כ, הינו חלבון חשוב בתא .

. GTPשמזרז הידוליזת , GAPהוא נמצא בקשר עם

. ומשתחרר מהריבוזוםP לאתר A הוא מעודד טרנסלוקציה מאתר – לתת היחידה הקטנה GDP-EFGכאשר מגיע

.mRNA- ה נשמר ומסייע לתנועתP לאתר A הנדחק מאתר tRNA-אנטיקודון של ה-הקשר קודון

. משתחררtRNA- ניתק והE לאתר Pמאתר הנדחקtRNA-אנטיקודון של ה-הקשר קודון

GTP-חשיבות ה

ההידרוליזה הכרחית . GDP-EFG- לGTP-EFG-ועובר מ, (GAPי "ע) עובר הידרוליזה GTPבמהלך הטרנסלוקציה

. מהריבוזוםEFGלשחרור של

fucidic acid השחרור של מעכבת אתGDP-EFG מאתר A , ולכן מונעת את

לא GTP-EFTU-amino acyl tRNA( EFGהקישור של הקומפלקס הטרנארי

. ( לריבוזום להיתקעםגורמה ש, EFTU אליו אמור להיכנסמפנה את האתר

הריבוזום – thyromisin לא משתחרר עקב EFTUאם פקטור – באופן דומה

. GTP-EFGולא יוכל לקשור , ייתקע

.GTP-EFG- הטרנארי ל בין הקומפלקסיש דמיון (A)מתחרים על אותו אתר (EFTU-ו EFG)מכיוון ששני הפקטורים

tRNA- דומה מאוד לEFG-החלק התחתון ב– מימין . בירוק – tRNA- משמאל

: מאפשרת שינויי קונפורמציה בריבוזוםGTPהידרוליזת

EFTU להפעלתaminoacyl-tRNA שבאתר A

EFG לתנועת הריבוזום

4 לכל קשר פפטידי לפחות :התהליך שצורך את מירב האנרגיה מבין התהליכים הביוסינתטיים בתא– יצירת חלבון

2GTPGDP +ATPAMP קשרי פוספט עתירי אנרגיה


190 2008' סמסטר ב

Puromycin-רגישות ל

ואיפשרה , תרגום חלבונים בחיידקיםתמעכב Puromycinהאנטיביוטיקה

CAA- דומה מאוד לPurmoycinהמבנה של . EFGאת גילויו של פקטור

ללאקודון הוא נכנס -אנטימכיוון שאין לו . (לא קשר אסטריל) tRNAשל

.קודוןתלות בזהות ה

הוא - amino-acyl tRNA כאלPuromycin-הריבוזום מתייחס ל •

. Aמוכנס לאתר

יודע לעשות התקפה נוקלאופילית על puromycinהאמין של •

ונוצר קשר פפטידי לכל דבר – peptidyl tRNA-ל של ההקרבוני

. Puromycin-בין הפפטיד המסונטז ל

אין קשר קרבוקסילי שיכול ליצור קשר פפטידי – ב הבא לשבה היא שיהבע

-peptidylמשתחרר , הבא בתורaminoacyl tRNA- עם הנוסף

puromycin, מתקבלת טרמינציה מוקדמת .

ואתר peptdyl tRNA י" תפוס עPאתר כאשר רק בריבוזום Aלאתר נכנס amino-acyl tRNA - puromycin-בדומה ל

Aהתרחשה טרנסלוקציה כאשר הושלם שלב יצירת הקשר הפפטידי אך טרם. פנוי –puromycin אינו נכנס לריבוזום ,

(.GDP-EFGי "ע) תפוסA אתר שכן

. EFGאת וGTPדורשת שPuromycin-די להקנות רגישות לכטרנסלוקציה דרושה

. puromycin-ר שמקנה רגישות לו התגלה כפקטEFGכלומר פקטור


191 2008' סמסטר ב

(נון- שוש בר– 22)טרמינציה

טרמינציה בפרוקריוטים

(: STOP codon, Nonsense codons)תהליך התרגום מסתיים באחד משלוש קודוני טרמינציה

UAG( amber)

UAA( ochre)

UGA( opal)

(nosenseמסיקים זאת עקב קיומן של מוטציות )קודון טרמינציה אחד מספיק כדי לגרום לטרמינציה

: הסיבות לכך הן. ולא אחד, ברצף STOPלעתים יש מספר קודוני

מניעתRead-through – יש מצבים בהם מפספסים את הקודון

הראשון והתרגום ממשיך

מוטציה ב-tRNA , שיוצרתtRNA סופרסורי שמכניסה חומצת אמינו

(והתרגום נמשך)שגויה

ללא טרמינציה הריבוזום לא נופל מה–שחרור הריבוזום -mRNA ולא

. אחריםmRNAיכול לתרגם

הם אינם Aובהיגעם לאתר , קומפלמנטרייםtRNAלקודוני טרמינציה אין

קודוני טרמינציה מזוהים . A לאתר aminoacyl tRNAמאפשרים קישור של

(.RF –Release Factors)פקטורי שחרור חלבוניים י "ישירות ע

ונסיון ליצור קשר , P באתר tRNA-מתרחשת שבירת קשר אסטרי בין הפפטיד ל

, אך מכיוון שאין שם אפשרות ליצור קשר, RF-פפטידי של הפפטיד עם ה

.הפפטיד יוצר קשר עם מים ומשתחרר

RF- פקטורי שחרור

2-הם נחלקים ל. tRNA-פקטורי השחרור משפעלים הידרוליזה של הפפטיד מה

:קבוצות

Calss1 – מזהים קודון STOP ומזרזרים הידרוליזה של הפפטיד

. לקודון הטרמינציהmRNA-הם נקשרים בזיווג חלבון. Pמאתר

:הכרחיים יש שני פקטורים E.coli-ב

o RF1 –ספציפי ל -UAG (ו-UAA)

o RF2 –ספציפי ל -UGA-( UAA)

Class2 הן GTPase( הוא משפר את , שאינו הכרחי בפרוקריוטים

מזרזים דיסוציאציה מהריבוזום של פקטורי –( RF2- וRF1היעילות של

Calss1 .י "לאחר שחרור הפפטיד הם מבוקרים עGTP


192 2008' סמסטר ב

o RF3 הוא GTPaseיש לו מתחם קושר . חיוני באאוקריוטים אך לא בפרוקריוטיםGTP , הוא הומולוגי

. (כי כולם מתחרים על אותו בריבוזום) EFTu- וEFGלפקטורי האלונגציה

כש -RF3 וכאשר הוא מבוטא ביתר יש זירוז של הטרמינציה, יש בעיה בזיהוי של שלושת הקודונים– מוטנטי

STOP codon- את הclass1 RFמנגנון הזיהוי של פקטורי

.tRNAמבחינה פונקציונלית הם מחקים את הפעילות של

. peptidyl tRNA מצוי P רק כאשר באתר Aהם יכולים להיקשר לאתר

במרכז STOP codon-שמתיישב ליד ה peptide anticodon חומצות אמינו המכונה 3הספציפיות לקודון תלויה ברצף

.(של תת היחידה הקטנה של הריבוזום)הפענוח

peptide anticodonיוצרת עם הקודון אינטרקציית חלבון -RNA ( ולאRNA-RNAכפי שראינו עד כה )

שחרור /החיוני להידרוליזת GGQ( Glycine-Glycine-Glutamate)מכילים רצף שמור (RF2- וRF1 )Class1פקטורי

מעורב ישירות בהידרוליזה או GGQ ולא ברור האם peptidyl transferase-הוא ממקום בסמוך למרכז ה. הפפטיד

. יגרום להידרוליזהPeptidyl transferase-שהוא משרה שינוי כך שה

RF class2( RF3) תפקידי – GTPתפקיד

.(כמו איניציאציה ואלונגציה) RF3י " עGTPטרמינציה דורשת הידוליזה

.RF3ובזה עוזר להם , עליהם להשתחרר מהריבזום– גרמו לשחרור הפפטיד RF2 או RF1-לאחר ש

RF3 נקשר לריבוזום רק כאשר מצויים שם RF1 או RF2 באתר A בצורת ה (חלש) הוא נקשר-GDPשלו .

שינויי הקונפורמציה שנובעים משחרור הפפטיד גרמים לשחלוףGDPב -GTP ( פעילותGEF.)

GTP-RF3 לריבוזום ודוחק את בחוזקה נקשר RF1/RF2

GTP-RF3נוגע ב -factor binding center( GAP) ועובר הידרוליזה חזרה ל-GDP .

בניגוד למצב מקודם– GDP-RF3 לא יכול להיקשר לריבוזום (מכיוון ש-RF1/RF2עזבו ) והוא נאלץ לעזוב .

כאשר מתרחשת מוטציה במתחם G של RF3 הוא נותר נעול על הריבוזום ( מחזור קטליטי יחיד -dominant lethal.)

read throughמנגנון

read through יכולה להתרחש בתור מנגנון חכם וחיוני ( לא רק כמוטציה או במקרים שלtRNAסופרסורי ) שמאפשר

.חלבונים יותר ארוכים (לעתים) וליצור STOP codonלחלוף על פני

aminoacyl נוכל להכניס –או שיש בעיה באפיניות שלהם , נמצאים בתא בכמות נמוכה במיוחדRF2 או RF1כאשר

tRNA לאתר A במקום RF –ואז נקבל אלונגציה למרות הזיווג הלא מושלם .

:י פתיחת מרכז הפענוח של תת היחידה הקטנה"הריבוזום משתתף בתרגום ע

בקודוןsense – GTP-EFTU-aminoacyl tRNA

בקודוןSTOP –ל -RF בקישור איטי של RF –יש תחרות ,aminoacyl tRNA" והטרמיציה נמנעת" מנצח.


193 2008' סמסטר ב

IF3- וRRF ,EFGמיחזור הריבוזומים בעזרת

מכיוון שהריבוזום עדיין קשור , אך התרגום טרם הסתיים, RF-עוזבים גם ה, לאחר שהפפטיד נקשר למולקולות מים ועוזב

ועליו יהיה לעבור דיסוציאציה לשתי תת , (אצילציה-שעברו דה) יתומות tRNA לשתי מולקולות E- וP ובאתרים mRNA-ל

.יחידותיו

. RRF( Ribosome Recycling Factor)- בתהליך המיחזור משתתף הפקטור החיוני למחזור –בפרוקריוטים

EFG ( פקטור אלונגציה–כזכור ,GTPase) להביא לתנועה יחסית של , יודע לעשות טרנסלוקציהmRNA ביחס

(GTPלאחר שהשקענו ) בין האתרים במנגנון הדומינו tRNA-לדחוק את ה, לריבוזום

RRF נקשר לאתר A הפנוי ומחקה tRNA

RRF מגייס את EFGובדומה לתפקידו באלונגציה מרחיק את ה -tRNA מאתרי Pו -E .

RRFו -EFGמשתחררים מהריבוזום יחד עם ה -mRNA . אך שתי תת היחידות עדיין , הריבוזום נותר יתום

.קשורות זו לזו

IF3מסייע לשחרור ה -mRNAונקשר לתת היחידה הקטנה ומחזיק אותה חופשיה מתת היחידה הגדולה .

IF3שבו תיקשר תת היחידה , נותר קשור לתת היחידה הקטנה ועוזב רק כשיתרחש תהליך איניציאציה נוסף

.הגדולה

תרגום באאוקריוטים

איניציאציה באאוקריוטים

.30עולה על (eIF)אך באאוקריוטים מספר פקטורי האיניצאיה , בעיקרון האיניציאציה דומה בפרוקריוטים ובאאוקריוטים

tRNAMet- קשורה מראש ל40Sתת היחידה הקטנה initiator .(גם באאוקריוטים יש הבדל ביןtRNAMet

initiator ל -

tRNAMetרק ש, שמשתתף באלונגציה-tRNAMetinitiatorאינו עובר פורמילציה ).

40S + tRNAMetהקומפלקס initiator נקשר ל-cap של ה5 בקצה -mRNAוסורק את ה -UTR (100עד , כ"הקצר בד

. רצף קצר ומאוד לא שמור– Kozakלרצף עד שהוא מגיע mRNA- של ה3-והולך ומתקדם לכיוון הקצה ה, (בסיסים

כאשר . (30kCal<, גבעולים ולולאות חלשים)הסריקה מתאפשרת הודות להליקאז שפותח את המבנים השניוניים

. הריבוזום לא יכול לסרוק וקודון האיניציאציה לא יבוא לידי ביטוי–המבנים מורכבים ויציבים

עליהם נדבר IRES- ובuORF-לא תקף ב) נקבע כקודון האיניציאציהKozak הראשון הסמוך לרצף AUG-ה

. המודל מתאים למונוציסטרוניות באאוקריוטים, (בהמשך

- ול5 הריבוזום קשור בו זמנית לקצה –( 5 בסיסים מהקצה 40- נמצא במרחק שקטן מAUGקרי ה) קצר UTR-כאשר ה

AUG .

. מפחית את יעילות התרגום אך לא הכרחי לתרגוםcapהיעדר


194 2008' סמסטר ב

eIFX- פקטורי איניציאציה

eIF1A – נקשר לתת היחידה S40

2eIF( GTPase )– מסייע לקישור של tRNAMetinitiator40- לS (בדומה ל-IF2בפרוקריוטים ).

3eIF – הפקטור הראשון שנקשר לתת היחידה

( בפרוקריוטיםIF3-בדומה ל) –הקטנה

eIF4F –מורכב ממספר תת יחידות :

o eIF4E –נקשר ל -capשל ה -mRNA ומסייע

eIF4Gלגייס את

o eIF4G – מסייע לגייס את eIF4A ,ונקשר ל-PAB( poly-A Binding Protein)

o eIF4A –י "משופעל ע, ההליקאזeIF4B , וצורךATPלצורך הפעילות שלו

eIF5( GTPase) מסייע לדיסוציאציה של פקטורים שונים מתת היחידה הקטנה לפני שתת היחידה הגדולה

. נקשרת

eIF6 –נקשר לתת היחידה הקטנה וגורם לדיסוציאציה של הריבוזום לשתי תת היחידות .

tRNAMetinitiator

tRNAMetההבדל בין initiator לעומת tRNAMet – שגורם להבדל במבנה השלישוני64 של הריבוז בבסיס 2 זירחון בעמדה .

בזרוע שמובילה לחומצת אמינו AT ההבדל היה זיווג –ניזכר שבפרוקריוטים ). ישמש לאלונגציהtRNA- ה–ללא זרחון

.( בזרוע הקאנטיקודוןGC זוגות בסיסי 3וזיווג של

tRNAMetקישור initiatorל -S40

יצירת קומפלקס טרנארי : GTP-eIF2 רק מכיר tRNAMetinitiator ונקשר

.אליו

לתת היחידהS40 נקשר eIF1A

eIF5Bמגייס את הקומפלקס הטרנארי ל -S40

eIF1A (שכבר קשור ל-S40) ו-eIF3 (שנקשר לתת היחידה הקטנה)

-pre ונוצר S40-מייצבים את הקישור של הקומפלקס הטרנארי ל

initiation complex( S43.)

mRNAנקשר ל -S43

ל-cap של mRNA נקשרים פקטורי eIF4F( cap binding proteins .)

.GTPהקישור גורם להדירוליזת

אינטרקציה ביןeIF3 (על תת היחידה הקטנה) ל-eIF4F (על ה-cap )

. כך שנוצר קומפלקס האיניציאציהS43- לmRNAקושרים בין


195 2008' סמסטר ב

Kozakרצף

AUG-בדרך כלל מדובר ב. קודון האיניציאציה, AUG-הסריקה של תת היחידה הקטנה נפסקת כאשר היא מגיעה ל

מזוהה כקודון איניאציה רק בתוך AUG. הראשון אך לא בהכרח

.Kozakרצף

אינו שמור כלל Kozak- ה– שראינו בפרוקריוטיםSDבניגוד לרצף

G/AXXAUGG: בסיסים7ומכיל

מהלך האיניציאציה

קודון האיניציאציה מזוהה בזיווג בסיסים עם האנטיקודון של

tRNAMetinitiatorשממוקם על תת היחידה הקטנה .

tRNAMet- שקשור לeIF2הזיווג מאפשר שחרור של initiator ( מהווה

שנקשר לתת היחידה ) eIF3ושל (חלק מהקומפלקס הטרנארי

.(הקטנה ועד כה מנע קישור של תת היחידה הגדולה

השחרור של שני הפקטורים מאפשר את ההצטרפות של תת

קודון /שמייצב את הקומפלקס באתר, S60היחידה הגדולה

. האיניציאציה

eIF1Aכגון ) עוזבים שאר הפקטורים – S60לאחר ההצטרפות של

5eIF-השחרור של הפקטורים ספונטני אך מסתייע ב. (eIF4C-ו

כלומר התזמון , הם מתזמנותGTPase-נזכור ש. (GTPaseשהוא )

. באאוקריוטים יותר חשוב מאשר בפרוקריוטים

התרגום מתחיל כאשר tRNAMetinitiator וקודון האיניציאציה

.S80 של הריבוזום השלם Pממוקמים באתר

יהיה על הריבוזום השלם להתפרק כדי שיוכל –בסיום התרגום

.להתחיל מחזור תרגום נוסף

הדיסוציאציה של שתי תת היחידות

שנקשר לתת eIF6-מתאפשרת הודות ל

קומפלקס של ) eIF3-היחידה הגדולה ול

.S40- שנקשר ל( תת יחידות8


196 2008' סמסטר ב

uORF- וIRES –בקרת תרגום

IRES

IRES( Internal Ribosome Entry Site )אך באאוקריוטים קיים רצף , בקרת תרגום אינה קיימת כלל בפרוקריוטים

.mRNA של 5 בקצה cap-שמאפשר איניציאציה שאינה תלויה בסריקה מה

Kozak –י "הוא לעתים ממוסך ע, בנוסף להיותו מתירני–שם מצטרפת תת היחידה הגדולה , אתר הקישור לריבוזום

פקטורי האיניציאציה –( 30kCal>)אם המבנה ארוך או בעל מבנים שניוניים מורכבים . mRNA-מבנים שניוניים ב

eIF4A (י "שמשופעל עeIF4Bלא יכולים להתמודד איתם ).

בנגיף הפוליו ובאונקוגנים cap חסרי mRNAאך קיימים . חיוניcap- ה– בסיסים 40-1000 הוא UTR-כאשר גודל ה

(PDGF –פקטור גידול שנגזר מטסיות דם ).

י הפרעה לפקטורי " נגיף הפוליו מעכב תרגום חלבוני עeIF4Fאך אינם נחוצים , הדרושים לאיניציאציית התרגום

. IRES או בעלי cap חסרי mRNAלתרגום

הסמוך אליו משמש כקודון AUG- ה– IRESכשקיים רצף

. איניאציה

אלא נכנס , cap-כלומר הריבוזום לא מתחיל את הסריקה ב

cap- לUTR ,downstream-רחוק מה, mRNA-באמצע ה

. (בדומה למה שמתרחש בפרוקריוטים)

בהנדסה גנטית בעזרת IRES (אפשר לבטא שני חלבונים באותה מסגרת) יוצרים ביציסטרוניות.

uORF – upstream ORF

. נוצרת תחרות בין שתי מסגרות קריאה–כשיש גורם מגביל

שתי המסגרות יכולות לעבור –אם יש מספיק פקטורים

. יתורגםuORF- יעוכב בעוד שORF –אך אם יש מעט פקטורים , (IRES-שתיהן מספיק קרובות ל)תרגום

eIF2בקרת פעילות של פקטור האיניאציה

: תת יחידות3-ומורכב מ, שמור ביונקים ובצמחים

α – נושאת GTPכאשר הוא מזורחן הוא קושר בזיקה גבוהה את . לאקטיבציהβ לשחלף ) ומונע ממנו לפעול

GDPל -GTP) . כל הפעילות של – ממנו מזורחן 20%כאשר eIF2נמנעת .

β –זהו ה -GEF , פקטור שחלוףGDPל -GTP ( מכניסGTP) . כאשר הוא מזורחן הוא מונע את הקישור של

tRNAMetinitiator .זהו הגורם המגביל .

γ – קושר tRNAMetinitiator.

פרונים כדי לעזור 'התא עושה אינדוקציה של צ. נוצרת כמות עצומה של חלבונים שלא מקופלים– כאשר יש עקת חום

. וכן מקטין את עומס התרגום, לחלבונים להתקפל


197 2008' סמסטר ב

אלונגציה באאוקריוטים

:(בדומה לפרוקריוטים) eEFבהם משתתפים , שלבים3לאלונגציה

היבוא של . A לפי הקודון באתר A לאתר amino-acyl tRNAיבוא .1

amino-acyl tRNA מתבצע בהיותו חלק מקומפלקס טרנארי עם

GTP-eEF1A ( אנלוג שלGTP-EFTU) .ברירת ה-tRNA המתאים

י "נ ע"שמתבצעת ככה, GTP דורשים הידרוליזת Aוהקישור לאתר

eEF1B ( אנלוג שלEFTS.)

נ " אך ככה– peptidyl transferase- לא ברור מיהו ה– יצירת קשר פפטידי .2

(.S23- שם התפקיד היה שייך ל–בניגוד לפרוקריוטים )מדובר בחלבון

. Cyclohexamideי "התהליך מעוכב ע

והוא תלוי , פועל כטרנסלוקאז (EFGאנלוג של ) eEF2 – טרנסלוקציה .3

. ( שלו הוא לא יודע להביא לטרנסלוקציהGTP-בצורת ה) GTPבהידרוליזת

.GTP לריבוזום הוא שגורם להידרוליזת GTP-eEF2הקישור של

. fusidic acidי " מעוכבת עeEF2הפעילות של

eEF2הטוקסין מורכב . הינו היעד של טוקסין הדיפטריה

:משתי תת יחידות

תת יחידהB –נקשרת לרצפטור ממברנלי

תת היחידהA – טוקסין שעובד כמו אנזים והורס

י " שיש בתא עeEF2-תוך מספר שניות את כל ה

העברת : ADP ribosylationתיוון ראקציית

ADP-riboseמ +NADל -eEF2 ( מה שהופך

.( ללא פעילeEF2את

טרמינציה באאוקריוטים

. eRFבטרמינציה מעורבים הפקטורים החלבוניים

. STOP-מעורבת בזיהוי שלושת קודוני ה ( בשמריםSup45p )eRF1משפחת חלבוני

הקישור . STOP codon מצוי A כאשר באתר A נקשר לריבוזום סמוך לאתר eRF1החלבון

. בפרוקריוטיםRF3 אנלוג של – ( בשמריםSup35p )GTP-eRF3-מלווה ב

, tRNA-לשחרור ה, P באתר tRNA- הכרחית לשחרור הפפטיד מהeRF3 של GTPהידרוליזת

. ולדיסוציאציה של שתי תת היחידות של הריבוזום

.הוא הכרחי לטרמינציה RF3 – Sup35p( eRF3)-בשונה מ

. גורם לזירוז הטרמינציהsup35p וביטוי יתר של misreading- גורמות לSup35p- בdeletion –בדומה לפרוקיוטים


198 2008' סמסטר ב

פוליזומים מעגליים

מספר הריבוזמים המתרגמים . אאוקריוטי מתייעל בפוליזוםmRNAתרגום

.mRNAבו זמנית את אותו

הדבר מתמיה . Poly-A מצוי 3תאי מתייעל אם בקצה -התברר שתרגום אל

. mRNA של 5תחיל בקצה 100מפני שהתרגום מ

PAB1 – Poly-Aבכל האאוקריוטים נמצא בציטופלזמה החלבון

Binding protein מוטציות ב. 3 שקשר לקצה-PAB1 גורמות לתרגום

.(אדנילציה- ראינו בפוליPAB2נזכור שאת החלבון ). עלוב

בפוליזום מעגלי התרגום מתייעל כי תת היחידות של הריבוזום שזה עתה סיים

תרגום והשתחחר בטרמינציה ממוקמות בסמוך לאתר תחילת התרגום ופנוי

פוליציסטרוני התרגום מתייעל כי mRNA- ב–באנלוגיה ). למחזור תרגום חדש

. ( סמוךORF אחד חופפת את האיניציאציה של ORFהטרמינציה של

. אליוdownstream שנמצא ORF משפיע על התרגום של ORFכלומר

.קירבנו טרמינציה לאיניציאציה

3 שקשור לקצה PAB1 מעגלי בעקבות אינטרקציה בין mRNAלמעשה נוצר

הקשור לתת eIF3י "התיווך מתבצע ע. 5 בקצה cap-שקשורים ל (eIF4F-שניהם חלק מ) eIF4G- וeIF4Eלפקטורי

.היחידה הקטנה של הריבוזום

בקרת תרגום חשובה במיוחד במחזור חיי התא

RNAi = RNA interference

RNAiתרגום/ משתיק ביטוי של גנים ברמת החלבון.

(. anti-sense-שכזכור משועתק קומפלמנטרית ל) mRNA-מקבלים גדיל קומפלמנטרי ל - sense-אם משעתקים את ה

:RNAiקיימים שני סוגי

siRNA – Small Interfering RNA –י ביקוע של ה" מורידים את רמת הביטוי ע-mRNA .מעורב הוא

. ברמת התרגום וברמת יציבות החלבון, mRNAביציבות , בשעתוק

.(שעתוק-הקטנת הביטוי ברמת פוסט/הפחתה)דאון מלאכותי -מדובר בכלי חשוב לנוק

miRNA – Micro RNA –ל. מעכב תרגום חלבונים-miRNAמהגנים30%- תפקידי בקרה חשובים במעל ל .

miRNA

.שנמצאות בכל היצורים הרב תאיים ( נוקאלוטידים בלבד22)משפחה גדולה של מולקולות רגולטוריות קצרות

mRNA-ומדכאות יצירת חלבון מה, שעתוק-הן מבקרות במנגנון של בקרה שלילית את ביטוי גני המטרה ברמת הפוסט

.אך המספר המשוער גדול בהרבה, miRNA 460-עד כה ידועים מעל ל. אותו הן מבקרות

.חשיבותם רבה בהתפתחות ואפיון סרטן


199 2008' סמסטר ב

miRNAיצירת

לפעמים הם ממוקמים במקום אחר מגן המטרה )הם מקודדים בגנום

לפעמים אפילו יש ). RNA polymerase2י "ומשועתקים ע (שלהם

.stem&loopהשעתוק יוצר מבנה של . (poly-Aלהם

Droscha RNAse3חותך את ה -stem&loop משאר המולקולה

(. dsRNA חותך Droscha )dsRNAהמשועתקת שיוצרת מקטע

לאחר מכן ה-pre-miRNA יוצר מהגרעין בעזרת Exp5

Dicerגדילי - חותך את הלולאה ומותיר רק את המקטע הדו

.הקומפלמנטרי

הגדיל שקומפלמנטרי ל- נותרים שני גדילים-mRNA נקשר לחלבון

RISC –ואז ה -mRNAיכול להיקשר ל -miRNA.

אם . תתרחש דגרדציה–אם הקומפמנטריות מושלמת

. יתרחש עיכוב תרגום בלבד–הקומפלמנטריות לא מלאה

:תפקידיהן החשובים שמתחילים להתברר מציעים מעורבות במגוון תהלכים

תזמון במהלך התפתחות

בקרת גידול

התמיינות

ידן- מן הגנים מבוקרים על30%- נראה שלמעלה מ .

miRNAמזהים את ה -mRNAכאשר ה -miRNA בקומפלקס עם חלבונים כדוגמת (RISC) כ-miRNP . הזיהוי מבוסס

. mRNA של UTR-3 לרצפים בקצה miRNAעל קומפלמנטריות בין

:אך הוצעו שני מנגנונים אפשרים, המנגנון המדויק של פעולתן לא ידוע

direct

o עיכוב איניציאצית תרגום ומניעת קישור ריבוזומים

o גורמים לריבוזומים ליפול טרם זמנם

o האטת האלונגציה /עיכוב

o מעורבות בדגרדציה של החלבון עם היווצרותו .

Indirect

o אדנילציה -דה( הורדתPoly-A) וזירוז פירוקmRNA

o מעורבות בדגרדציה שלmRNA בגופיפי Pשעשירים ב -RNAse .מכניסים את ה-mRNA לגופיף P שם

ולכן אם נזדקק , לאו דווקא מפורקmRNA- ה– Pבגופיפי . הוא לא עובר תרגום כי הוא לא נגיש לריבוזום

. הוא יוכל לצאת החוצה לציטופלזמה ולעבור תרגום–לו


200 2008' סמסטר ב

תפקידי הריבוזום בבקרת תרגום

-וה, קבורים בתוך הריבוזוםpeptidyl tansferase-וה (decoding center)מרכז הפענוח

mRNAבעוד שהחלבון צריך להתחמק מה, צריך להשתחל דרך מרכז הפענוח-peptidyl

transferase.

התעלה כה צרה . mRNA תעלות צרות לכניסה ויציאה של 2בתת היחידה הקטנה יש

. שהוא לא פרוש לחלוטיןmRNAשאינה מאפשרת כניסה של

וקיים כיפוף בין שני האתרים המסייע , P- וAבין תעלת הכניסה והיציאה מצויים אתרי

(.P- וAאלה שנמצאים באתרי , רק שני קודונים נמצאים במצב מכופף)למהימנות התרגום

אך הרוחב המינימלי של התעלה מונע את קיפול החלבון , בתת היחידה הגדולה מצויה תעלת יציאה לפפטיד הצומח

בחוץ הוא - כך שהמבנה השלישוני נוצר רק כשהחלבון מבצבץ מתת היחידה הגדולה , (α-helixלמעט למבנה של )

. פרונים'יתקפל בעזרת צ

בתרגום בפרוקריוטיםrRNA-תפקידי ה

י "תחילה סברו שהריבוזום הינו אוסף חלבונים בעלי פעילויות קטליטיות שונות המוחזקים ע

rRNA (הפיגום) .אך משהתגלו הריבוזימים סברו של-rRNAושהחלבונים , תפקיד קטליטי

.rRNA-אחראיים על המבנה הקטליטי של ה

rRNA נמצא באינטרקציה עם mRNAו -tRNAבכל שלבי התרגום .

. rRNA-סוגי אנטיביוטיקה רבים מכוונים דווקא ל

S16 –תת היחידה הקטנה

של ה3הקצה -S16נמצא בקשר עם רצף ה -SDשל ה -mRNAבעת האיניציאציה ואחראי לבחירת ה -ORF .

שני שיירי –תורם למהימנות התרגום Aשל ה -S16נמצאים במגע ישיר עם ה -minor groove שנוצר ביזווג

.כשנפגשים קודון ואנטיקודון (בלבד)בסיסים נכון

S23 –תת היחידה הגדולה

S23 אחראי לפעילות הקטליטית של peptidyl tranferase.

נוגע ומכוון את הקצוותCCA של שני tRNA באתרי Pו -A .

שניהם (S23ו -S16) מעורבים בקשר בין שתי תת היחידות של הריבוזום בקשרRNA-RNAו -RNA-חלבון .

biochem b - molecular biology

Documents