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  • 1. Texto adicional Texto adicional Texto adicional texto adicional Texto adicional texto adicional In Vitro Culture Conditions for Maintaining a Complex Population of Human Gastrointestinal Tract Microbiota. Bong-Soo Kim, Jong Nam Kim, and Carl E. Cerniglia. Presented by: Mariluz Laverde Manrique. ID: 000151156 Maria Camila Pelaez. ID:000172706 Students 3rd semester Medicine -UPB

2. MICROBIOTA: Set of organismsthat aregenerally associated withhealthy tissues(skin, mucous membranes,etc.).The human body. Microorganismsliving in these placesmore orless permanentand in some casesperform specific functions. The termflorashould be abandonedbecause itrefersto plantsand microorganismsbelong to theprotista. Is more appropiate to use the term microbiota such as skin or intestinal microbiota. 3. INTESTINAL MICROBIOTA :The humanintestinal microbiota is a complex community composed of at least several hundred different species of bacteria.

  • Plays a critical role in human health, is very important in:
  • Colonization resistance.
  • Nutrition.
  • Proliferation and differentiation ofintestinal mucosal epithelial cells.
  • Homeostasis of the immune system.

4.

  • GROWING CONDITIONS:
  • Here, is compared the bacterialcommunity in three culture media with different growth supplements:
  • Brain heart infusion broth (BHI).
  • High-Carbohydrate medium (HCM).
  • Low- Carbohydrate (LCM).

5. GENERAL OBJECTIVE The aim of this study is to compare the culture conditions for maintainig a community of fecal microbiota, compared with the development of intestinal microbiota. 6. MATERIALES Y MTODOS

  • MUESTRA
  • Cada muestra fecal fue designada con una letra A- B-C-D

MUESTRAS FECALES 4hombres EDAD: 50-60 aos Tiempo utilizado:1semana 7.

  • EXTRACCION DE ADN : se basa en cuatro pasos
  • Procedimiento de purificacin que se da por medio de la lisis celular de glbulos rojos y nuclear de glbulos blancos.
  • Aislamiento de ADN a partir de glbulos blancos se utiliza una solucin de lisis nuclear.
  • Las protenas celulares son removidas por precipitacin de sales.
  • El ADN genmico es concentrado y desalinizado por adicin de isopropanol.
  • Nota:muchas veces se necesita una RNAasa para procedimientos donde se debe eliminar el ARN

MATERIALES Y MTODOS 8.

  • REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA(PCR )
  • Consiste en aumentar un segmento especifico de ADN, donde se utiliza:
  • Polimerasas
  • Dos cebadores o iniciadores (primers)
  • Los DNTps (Dexosirribonucleotido trifosfato)
  • Se debe tomar en cuenta las variaciones de la temperatura en la incubacin.

MATERIALES Y MTODOS 9.

  • ELECTROFORESIS EN GEL CON GRADIENTE DE DESNATURALIZACIN (DGGE):
  • Tcnica de electroforesis que se utiliza en muestras de ADN, utilizando un gel como la urea.

MATERIALES Y MTODOS

  • Se emplea para la identificacin de mutaciones en la doble cadena.
  • La mutacin es detectada mediante la comparacin entre el patrn electrofortico (desnaturalizado) y la muestra original.

10. PIROSECUENCIA

  • Est basada en la secuenciacin por sntesis, acoplando la sntesis de DNA a una reaccin quimioluminiscente, lo que permite una rpida determinacin de secuencias en tiempo real.
  • La tcnica utiliza cuatro reacciones enzimticas que tienen lugar en un nico tubo en el que se monitoriza la sntesis de la cadena complementaria de DNA, usando como molde DNA de cadena simple.

MATERIALES Y MTODOS 11. UTLIDAD DE LAS TECNICAS EN EL ESTUDIO: DGGE:Fue utilizado para monitorear los cambios y diferencias en la comunidad de bacterias tomadas de las muestras fecales. PCR : Este proporciono los datos numricos de abundancia para la microbiota fecal. PIROSECUENCIA:Este fue usado para determinar la abundancia y biodiversidad de la comunidad bacteriana en la muestra fecaly como fue su desarrollo bajo diversas condiciones. EXTRACCIN DE ADN:Para la separacin de DNA genmico y adems de estoobtener una muestra suficiente de las heces fecales. 12. RESULTADOS

  • El crecimiento de la microbiota intestinal mostr OD mxima a las 18 horas en LCM, BHI; mientras que el mximo OD en el medio BHI fue antes en el perodo de incubacin. El total de gen bacteriano 16rRNA aument con el tiempo.
  • El nmero de bandas y grupos dominantes eran diferentes en cada medio: en BHI y LCM haba un nmero relativamente similar de bandas (20-22) y en HCM haban menos bandas (14).

A.Comparacin de los distintos medios y el efecto del sobrenadante fecal :

  • LosBacteroidesfueron ms dominantes que losfirmicutesen el cultivoin vitrodespus de 18 horas que en el tiempo cero (el predominio deBacterioidespodra afectar el crecimiento de otros phyla).

13. RESULTADOS B.Optimizacin de la concentracin del inculo:

  • La concentracin del inculo de las heces es un factor significativo en las condiciones de cultivoin vitro , porque el nmero y la diversidad de las bacterias pueden afectar el crecimiento.
  • Los anlisis de los perfiles, muestran que el 1%, 2% o 3% de las culturas inoculadas son las ms similares a las del inculo original en los individuos C y B.
  • La composicin de las diferentes comunidades afectan el crecimiento de cada phylum en la microbiota fecal.

14. RESULTADOS C.La composicin de la comunidad microbiana de inculo fecal:

  • Los phylum dominantes de las muestras de heces de cada persona se mantuvieron en condiciones de cultivo mejoradas; y la abundancia deFirmicutesdisminuy despus de 18 horas (72.39%- 44.95%), mientras que losBacterioidesincrementaron (17.14%- 39.11%)
  • Los cambios generales en las muestras cultivadas fueron relativamente similares en todas las muestras; los perfiles de la comunidad de la microbiota del individuo A y C son ms similares entre s que a la del individuo B, tanto en el tiempo cero como despus de 18 horas

15. RESULTADOS Individuo A 16. 17. RESULTADOS Individuo B Individuo C 18. DISCUSSION 19. DISCUSSION 20. CONCLUSIONS

  • The DGGE profiles of culture sample from individual A, shows that the 16srRNA genes of cultural bacteria in low concentration carbohydrate (LCM) increased his proliferation compared with high concentration carbohydrate (HCM) and brain heart infusion (BHI) at 18 hours.
  • The inoculum with different concentrations of fecal supernatant and without fecal supernatant didn't present a big difference on metabolic activity of microbiota or on their proliferation.

21. CONCLUSIONS

  • Different numbers of bacteriaBacteroidesandFirmicuteswere found in different concentrations of inoculum, and growth was different in the same medium; this shows that individuals are unique in their fecal microbiota.
  • The culture conditions developed in this investigation, are very important because it opens a new avenue for finding drugs and treatments to regulate and control the composition of our microorganisms.

22. MARIA CAMILA PELAEZ 23. MARILUZ LAVERDE MANRIQUE 24.