BIOCATALISI

A.A.

2008 -2009

Dr. Davide Tessaro

Lezione 4:Enzimi redox: ossidasi ed ossigenasi

Enzimi redox

Le flavine

Sono un gruppo prostetico che conferisce all’enzima un colore giallo.

Le flavine sono solitamente strettamente legate (anche covalentemente) all’enzima.

Possono effettuare redox monoelettroniche (il radicale semichinonico è stabile). Questo permette loro di reagire con l’ossigeno (che è un diradicale).

Hanno bisogno di essere rigenerate dopo la reazione.

Rigenerazione con O2

Per esempio: D-ammino acido ossidasi (D-AAO)

R

NH2

COOH R

NH

COOHR

NH2

COOH R

O

COOH

O2 H2O2

+(L)D-AAO

D-AAOEnzima per detossificazione D-AA sia endogeni che esogeni

Utile per deracemizzazione AAs:

Ancora 7-ACA

Enzima: D-AAO da Trigonopsis variabilis, pH 7.3, 25°C200 t/annoTempo di residenza: 1.5 h

Il prodotto, in presenza del perossido di idrogeno prodotto, decarbossila spontaneamente dando glutaril-7-ACA

Ancora 7-ACA

Ad altra fase del processo

Ancora 7-ACA

Glutaril amidasi (o acilasi) da E. coli, pH 8.3, 30°C, immobilizzato su carrier sferico

200 t annueTempo di residenza 1.5 oreDownstream: cristallizzazione

Ancora 7-ACAVantaggi biocatalisi:• no metalli pesanti (Zn)• no solv. clorurati• no composti infiammabili• condizioni blande• emissione gas 7.5 kg 1.0 kg• smaltimento acque madri: 29 t 0.3 t• Costo ambientale ridotto del 90%

Le monoossigenasiCatalizzano reazioni del tipo:

Sub + DonH2 + O2 SubO + Don + H2O

È come se stabilizzassero e facessero reagire l’ossigeno monoatomico

MO: ossidazione eteroatomiPrendiamo, ad esempio, i solfossidi chirali

modafinil

MO tipo Baeyer-VilligerCatalizzano reazioni tipo Baeyer-Villiger su composti carbonilici, ne esistono di più tipi.Tipo 1: cofattore NADPH e gruppo prostetico FADH2

Intermedio tipo Criegee

BV-MOs: il processo

Due enzimi consecutivi con riciclo cofattori:

BV-MOs: prodotti

Lattoni “normali”

Lattoni “anormali”

BV-MOs: un esempio

25%e.e. 74%

30%e.e. 95%

MO per idrossilazione fenoli

OH OH

OH

E. coli JM101

30°C

Esempio: processo Fluka

Whole cells in ambiente acquoso

Substrato e prodotto sono molto tossici per le cellule: vanno mantenute basse conc. (processo fed-batch). Inoltre, il prodotto polimerizza spontaneamente.Si utilizza una resina adsorbente (XAD-4, polistirenica) in un “letto flluidizzato”.Il prodotto viene liberato dalla resina tramite lavaggio con etanolo acidificato per venire poi cristallizzato da n-esano.

Altri prodotti:

MO per idrossilazione fenoli

Conv. 97%, resa 83%, selettività 85%, purezza 77% (98% dopo XX)

Capacità: 300 LTempo di residenza: 10 hLoop: 10 (Vreatt/h)

STY: 8 g/(L*d)

Catecoli 3-sostituiti: intermedi per farmaceutici e chimica supramolecolare

MO CytP450 dipendentiCatalizzano C-H C-O-H

CytP450-MO: esempi

MO per epossidazione alcheni

R R

O*[O]

• Di solito non si usano enzimi isolati: sono delicati e richiedono NAD(P)H come cofattore (necessità riciclo)

• I prodotti sono altamente reattivi, e quindi tossici per la cellula

• La cellula, facilmente, esprime anche attività di epossido idrolasi

• È necessaria, quindi, molta accortezza nel design del sistema: si utilizza un’altra fase (solvente apolare) per mantenere basse le conc. delle sostanze e per controllare il decorso della reazione

MO per epox: esempiR

R

O

[O](R)

Processo Nippon mining

Catalizzatore: whole cells di Nocardia corallina B276, T = 30°C

Range substrati:

MO per epox: esempi

Conv: fino al 98%

Resa: fino al 92%

Selettività: fino al 94%

e.e.: 80-97%

STY: > 0.2 mol / (L*d)

Processo Nippon mining

Processo Nippon mining

MO per epox: esempi

Uso dei prodotti:

MO per epox: esempi

Processo Shell-BrocadesWhole cells di Pseudomonas oleovoransT = 37°CConc = 7 g/L

e.e.P > 99.9%

Precursori di beta bloccanti

Diossigenasi

È come se stabilizzassero e facessero reagire la molecola di O2 in stato di singoletto

Diossigenasi su aromatici

Pathway di degradazione aromatici nei procarioti. Gli eucarioti hanno monossigenasi seguita da epossido idrolasi (già visto).Per sfruttare il potenziale sintetico bisogna bloccare la deidrogenazione del diolo.

Diossigenasi: esempioEsempio: produzione indaco

Isatis tinctoria Murex trunculus Indigofera tinctoria

Diossigenasi: esempioIndaco: sintesi chimica

Diossigenasi: esempioIndaco: sintesi biocatalitica (Genencor)

Enzima da P. putida

Alternativa: enzima da P. mendocina