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Beitr~ige zur Frage der Kollagendifferenzierung R i i n t g e n - u n d U l t r a v i o l e t t - s p e k t r o g r a p h i s c h e A n a l y s e

e m b r y o n a t e m m e n s e h l i e h e n Se l~ l~enko t l ages~ 0 ~

Von

O. Kratky, M. Ratzenhofer und E. Sehauenstein (Aus dem Institut fiir theoretisehe und physikalische Chemie nnd dem pathologisdl~

analomisehen Institut der Universit~t Graz)

(Eingelangt am 6. Juli 195o)

Die Entstehungsweise des Kollagens ist ein heute nur zum Teit iiber- bliekbares histogenetisches und bioehemisehes Problem. W~ihrend die n~iehstliegende Frage des En t s tehungsor t es der Fibri l len (intra- oder extra- zellular) dureh vergleiehende* und exper imentel le ~ Untersuehungen und bestimmte Er fah rungen aus der Pathologiea offenbar zugunsten der extra- zel lularen Theorie entsehieden ist, ist die F r a g e d e r D i f f e r e n z i e r u u g . d. h. der qual i ta t iven Ausgestal tung (,r R a i z e n h o f e r [ 4 ] ) der reifen Kollagenfasern, bis heute noeh nieht aufgekl~irt.

Die Sdmlmeinung ( S c h a f f e r [2]) geht dahin, dal~ zuniiehs* eine Yore re i fen Kollagen quali tat iv versehiedene Vorstufe, das sogenam~te P r ~ - k o 11 a g e n, entsteht, aus welehem sodann dureh einen Umbildungsvorgang das reife Kollagen hervorgeht.

Untersueht man niimlieh embryoaale mensehliehe Sehnen, so finden sieh bereits im zweiien Lunarmona t deutliehe Fibri l len [21. Die fiir r.eifes Kollagen typisehe tlotf~irbung der Fibr i l len mit Pikrofuehsin ( v a n - G i e - son-F~irbung) l~if]t sieh, wie histologische Untersuehungen des e inen vo.n uns TM ml mens.ehliehen Aehillessehnen ergab,en, dagegen erst sehr viel spiiter erzielen: mit vier Monaten (16,5 em langer Embryo) ist eine eben er- kennbare zarte r~itliehe T(i.nung einiger Fibrillenziige, im f i inf ten Monat (bet 21 und 26em langen Embryonen) eine sehwaehe, im seehsten Monat

1 Intussuzeptionelle, ans&einend se]bst~ndige Vermehrung din' leimgebendea Fibrillen in der Chordasdmide yon Ammocoetes welt ab yon der n~ehsten als BiIdner in Frage kommenden Zellsehidlt (Chordaepithel) (v. E b n e r [ 1 ] , S e h a f f e r [ 2 ] ) .

e D o l j a n s k y u. P tonle t t3] gelang es bekanntlich in vitro, in zellfreiem ge- ronnenem Plasma fibrilKire Strukturen zu erzeugen, welehe yon Bindegewebsfasern nicht zu unterscheiden sind.

a Bet vielen Careinomen finder sich als u der fokalen und perifokalen Stromasklerose, gewhhnlieh am Rande des Krebsepithelherdes ein eiweifireiches Exsudat. Dutch Gerinnung und Umkristallisierung entstehen sodann fibrill~ire his hyaline, bet v a n - G i e s o n s F~irbung leuchtend rot darstellbare Strukturen, in welchen auf grofie Streeken iiberhaupt keine Zellen nachzuweisen sind (Ratzen- h o f e r [4]).

O. Kratky, M. Ratzenhofer u. E. Sdlauen'stein: Beitr. z. Frage d. Kollagendiff. 685

(51 era) eine deutliche, allerdings ungleichmii~ige Rotfhrbung zu vermerken. Dieser letzte Befund spricht dafiir, daft fibrillhre u yon Kollagen versehiedener Differenzierungsh6he vorliegen, wobei man vermuten k6nnte, daft den verschieden gelblich bis r6tlich gef~irbten Fibrillen zwisehendurch auch rote, d. h. mehr weniger ausdifferenzierte Kollagenfasern beigemengt sind, ohne da~ jedoch eine sichere Unterseheidung der dicht aneinander- schliei~enden Farbqualitiiten im Lichtmikroskop m6glich ist. Der f~irberische Befund besagt also nut so viel, daft eine yore Kollagen versehiedene, dabei qualitativ vermutlich nicht einheitliehe Vorstufe zwisehen den S.ehnen- zellen vorliegt, ant welche eben der einstweilen mehr unverbindliche Name Prhkollagen anzuwenden ist. - - Auch beim reifen Neugeborenen liegt often- bar noch n ieht jene leuchtende Roffhrbung bet ~an-Gieson-F: , i rbung vor wie beim Sehnenkollagen des Erwaehsenen.

Da heute tiber die Molekularstruktur des reifen Kotlagens mittels phy- sikalischer Methoden (vgl. B e a r [51 sowie Kra tky[6 ] , S e h a u e n - s t e i n [7, 8, 91 und ihre Mitarbeiter) bestimmte Aussagen m/Sglich sind, lag es sehr nahe, das Problem der Kollagendifferenzierung einmal ndt Hilfe RiSnt- gen- und Ultraviolett-spektralanalytiseher Methoden zu studieren. Bet beiden Verfahren ergaben sich iibereinstimmend mit den gesehilder~en f~rberisehen, d. h. histoehemisehen Verschiedenheiten U n t e r s c h i e d e z w i s c h e n Ko l [ag . en u n d P r h k o l l a g e n . Das Rtintgenverfahren lieI] erkennen, dab die gittermhfiig geordneten Al~teile der beiclen Substanzen bisher nieht identisch gebaut sind und die mit dem UV-Verfahren ge- wonnenen Befunde erlauben, einen versehiedenen Bindungszustand der Polypeptidketten untereinander festzustellen.

R{tntgenographische Analyse yon embryonalem mensehliehen Sehnenkollagen

Zur Untersuchung gelangten Achillessetmen mensehlicher Embryonen yon 15,5 und 26cm grSfiter L~inge, entsprechend einem Alter yon rund vier, bzw. flint Lunarmonaten. Als Kontrolle diente die Achillessehne eines zwei Tage alten reifen menschlichen Neugeborenen. Das Material wurde ausnamslos unfixiert untersucM. Zur Herstellung der Pr~iparate wurden die Sehnen nach ihrer Darstellung VOln umgebenden zarten Hiillgewebe befreit, hierauf wurde im Fersenbein, bzw. in der Wadenmuskulatur durdl- schnitten, die so gewonnenen Pr~ipaxate an den Enden fixiert, in diesem Zustande getrocknet und sodann in ether RSntgenkamera mit Rundblende aufgenommen, die eine Vermessung his zu Absthnden yon etwa 80A er- mSgliehte. Das reife Kollagen liefi under den gegebenen Aufnahmebedin- gungen im inneren Teil der Aufnahme am Aquator den Seitenkettenreflex yon 11,2 A sowie einen schwachen Reflex yon 37 A erkennen, wahrend am Meridian nut die 20. Ordnung der grol3en Periode yon 640A [5,6] ent- sprechend einem Netzebenenabstand yon 32A gut vermefibar war und die niedrigeren Ordnungen ab 58 A zu einem kontinuierlichen Untergrund zu- sammenflossen.

Im Gegensatz zu diesem Verhalten trat bet den beiden Pr~iparaten von Pr~ikollagen aul]er dem Seitenkettenabstand yon 11,2 A nut ein Reflex bet 39 A auf, der beim Kollagen sicher nicht vorhanden ist. Sowohl der Seiten- kettenreflex als auch der neue 39-A-RefLex geben einen vollstandigen Kreis, es tritt abet in beiden Fhllen in der Gegend der Normalen zur Prhparat- achse eine leichteVerst[irkung auf. Der neue Reflex gehSrt also hSehstwahr-

Protoplasma, Bd. XXX1X[4. 48

686 (). Kratky, M. Ratzenhofer u. E. Schauenstein

~eheinlich dem Xquator des Diagramms an. In unmittelbarer Niihe des Durehstofipunktes beobaehtet man au& hier eine stiirkere Sehw~irzung, die vorliiufig nicht n~iher untersu&t werden konnte. MSglieherweise l~i[~.t sie sieh wie beim Kollagen noeh in Kleinwinkelreflexe auflSsen.

Die bisherigen Befunde stellen somit sicher, dal~ hinsichtlich der Kristall- gitterstruktur wesentliehe Untersehiede zwischen Kollagen trod Prtikollagen bestehen.

Ultraviolet t - lbsorpt ion yon embryonalem mensehl ichen Sehnenkol lagen

Zur Untersuchung gelangte (lie Achil[esschne eines 21 cm Iangen mensch- lichen Embryos entsprechend einem Alter yon 4'/_, Lunarmonaien. Das Material wurde der L~ingsrichtung der Sehne enisprechend am Gefrier- mikrotom unfixiert geschnitten, die 20 bis 40# dicken Schnitte in Wasser gequollen, zwischen zwei Quarzglaspl~ittchen au[ eine Dicke yon etwa 16--20 # zusammengedriickt und spektographierf.

Das Absorptionsspektrum zeigt zwischen 2000 und 3250mm -1 einen flach ansteigenden Ast, der auch bei reifem Kollagen auftritf, sowie ein deufliches Maximum bei 3850 mm -1 und ein Minimum bei 4100 mm -1. Das Maximum daft im Hinblick auf" seine Freqnenzlage der Nukleinsiiure- absorption zugeordnet werden [103. Da diese aber zwischen 2000 und 3250mm -1 steil abftillt, ist in diesem Gebiet mit einer mefibaren Beein- flul]ung der Priikollagenabsorption dutch die Nukleinsiiuren nicht mehr zu rechnen. Dies bedentet, da[] wires bier prakfisch mit der reinen Eigen- absorption des embryonalen Kollagens zn tun haben.

Bezieht man auf die Schichtdickeneinheit und vergleicht lnit der (pH- abh~ingigen) Absorption des reifen Kollagens ~91, so ergibt sich, da~ die Ab- sorption des ~assergequol lenen Pr~ikollagens der des reifen Kollagens bei p H ~ 1 entspricht.

Nun wurde die mit steigendem pH zunehmende Absorption des reifen Kollagens im fraglichen Spektralbereich den unter Mitwirkung ausgedehn- tcr H-Briickensysieme bei pH-ErhShmlg sich ausbildenden .,Pepfenol"-

N

Gruppen C- -O H. . . zugeschrieben [7. s] 1

Es ergibt sich somit, dal~ das wassergequollene Priikollagen weuiger C = N ; G r u p p e n aufweist als das reife Kollagen, was darauf hindeutet, (ial~ (las erste auch viel weniger zwischenmolekulare Wassers/offbrLieken besitzt.

Damit ist yon der Seite der UV-Spektrographie ein eindeutiger Naeh,veis [iir einen qualitativen Unterschied zwisehen r eifem und Pr~ikollagen hin- siehtlieh des zwisehenmolekularen u erbraehf. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der Ausbildung der meehanisehen F estigkeit, die ja beim reifen Kollagen sieher hSher ist als bei der embr-yonalen u

Das Pr:,ikollagenspektrum zwischen 5250 und 4100 mm -1 stellt eine (~'ber- ]agernng der Prgtkollagen-Eigenabsorption (entspreehend reifem Kollagel~ bei pH J) m i f d e r Nukleins~iurebande dar, was au[ Grund des in histolo- gisehen Sehnittpr~iparaten dieser Entwic-klungsstnfe (21 era) ca. ~/4--~/:, der Sehnemnasse betragenden Anteils an Kernen aneh durehans zu erwarten stand.

Beitr/ige zur Frage der Kollagendifferenziertmg 687

Fiir die vorl iegenden Untersuehungsergebnisse sind weiter aueh elek- tronenmikroskopisehe Befunde yon Bedeutung ( W o l p e r s [11]), wonach die Aehillessehnenfibrillen Neugeborener noch nieht das , ,Seheibenstadium" der t ra in ier ten Kollagenfasern, sondern das , ,Lamellenstadium" zeigen, was yon W o l p e r s als Symptom der Struktursehw~iehe und der unvollkomme- hen Leistungsfiihigkei~ g edeute~ wird. In diesem Zusammenhang erseheint daher das elektronenoptisehe u embryonaler Sehnenfibri l len von besonde~em Intere:sse, Arb.eiten, die wir aus ~iul~.eren Gri inden aber derzeit nieht ausfi ihren kiSnnen.

Die R/Sntgen- und UV-spektrographisehen Untersuehungen werden fort- gesetzt.

Wir danken F rau Dr. A. Sekora und Frl. Dr . .D. Stanke fiir wertvolle exper imente l le Hilfe.

Zusammenfassung In ~bere ins t immung mit den fiirberischen Verschiedenheiten ergibt so-

wohl das R~Sntgen- als das UV-spektrographisehe Verfahren Unterschiede zwisehen embryonalem $ehnenkol lagen (Priikollagen) und reifem Kollagen. Das RSntgenver fahren ergab bei e twa gleiehen Weitwinkelref lexen wesent- liehe Untersehiede im Kleinwinkelgebiet . Die UV-Methode er laubt die Fest- stellung, daft bei den embryona len pri ikollagenen Fibr i l len mit weniger zwisehenmolekularen Wasserstoff~riicken zu reehnen is~ als beim re i fen Kollagen.

Li teratur

[1] v. E b n e r , V., cir. bei S e h a f f e r . [21 S c h a f f e r , J., Lehrbud~ der Histologie u. Histogenese. 3. Aufl. Berlin und

Wien 1933. [3] D o l j a n s k y , L., u. Fr. Rou l e t , Virdlows Arch. 291, 260 (1933). [~] R a t z e n h o f e r , M., 2. 5stern Krebstagung Graz: 1950, in ,,Der Krebsarzt" 5,

172 (1950). -- Zur Frage der Abgrenzung yon Wa&stum und Differenzie- l'ung. Schweiz. Z. Path. u. Bakter. 13, Nr. 4 (1950).

[51 Bear , R. S., Journ. Amer. Chem. Soc. 64, 727 (1942); 66, 1297 (1944). Orv i l , B o l d n a n u.. R. S. Bear, Journ. Polym. Sci. 5, 159 0950).

~61 K r a t k y ' O., u. A. S e k o r a , J. makrom. Chem. 1, 113 (1943). -- Monatsh. Chem. 77, 224 (1946); J. Polym. Sci. 3, 195 (1948).

LT] F ix l , J. 0., O. K r a t k y u. E. S c h a u e n s t e i n , Mh. Chem. 80, 439 (1949). Scha l~ens t e in ; E., Mh. Chem. 80, 843, 870 (1949).

[87 S c h a u e n s t e i n , E., u. D. S t a n k e , Mh. Chem. 80, 870 (1949). [9] S t a n k e , D., Diss. Graz 1950.

[10~ B u t e n a n d t , A., H. F r i e d r i c h - F r e k s a , St. H a r t w i g u. G. S c h w a l b e , Z. physiol. Chem. 274, 276 (1942).

~11] W o l p e r s , C., D. makromolek. Chem. 2, 37 (1948).

Ergtinzung Die in unserer Arbei t unlersuchten Faserprote ine wurden mit Absicht

P r h k o l l a g e n genannt: ihr d i rekter genetiseher {SVbergang in Kollagen ist eine ebenso fe,ststehende Tatsaehe wie etwa d.er L}bergang yon embryonalem Vorknorpel in Kno.rpel. Man kSnnte nun entgegenhalteh, daf~ die Bezeieh- nung Prgtkollagen bereits fiir die Gi t ter fasern (argyropbile Fibril len, Reti-

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688 H. Drawert

kulinfasern, ,,pr~kollage Fas.ern". , ,unausgereifte Kollagenfasern", M a x i - m o w ) v.ergeBen ist. Diese Fibr i l len sind abet bekanntl ieh zum Untersehied yon den ko,llagenen Fasern ve,rzweig't, sie b i lden meist Netze, aueh verhal ten sie sieh physikaliseh anders als embryonMes bzw. reifes Sehnenkollagen (Gitterfasern sind zug- und biegungselastiseh, s. B a r g m an n). Im iibrigen weist ihr zmn Teil versehiedenes Verhal ten gegeniiber F~irbemethoden (sic lassen sieh unter Umsti inden mit saurem Orcein seharf f:~irben, P le nk) au[ Umersehiede in ihrem phvsikaliseh-ehemiehen Aufbau bin, doch ist iiber ihre submikroskopisehe St ruktur im einzelnen niehts bekannt . Die Um- wandlung der Gi t ter fasern in Kollagenfibri l len wird jedoeh yon den Auto- ten teils [iir wahrseheinlieh gehaltert (z. B. S c h a f f e r , B a r g m a n n), teils als [e.ststehend angeno,mmen (z. B. P a t ze 1 t). Es bedarf weiterer eingehen- der Studien, um aufzukl~iren, ein,e:rseits, inwieferne (lie Gi t ter fasern zu den Faserstoffen des embryonalen Sehnenkollagens physikaliseh-chemisdl in Beziehung stehen, und anderereits, auf welehe Weise sieh eine yon den Autoren angeno,mmene i2be,rfiihrung der Gi t terfasern in Kollagenfasern ~ollziehen kann.

Literatur

B a r g m a n n , W., Histoh)gie und mikL'oskopische Anatomie des MertscheJ/, [. B(t. Stuttgart 1948.

Maximov , A., In v. MiSl lendorff , Handbu& d. mikrosk. Anatomie des Men- sdlen, II. Bd., 1. T1. Berlin 1927.

P a t z e 1 t, V., Histologie, 2. Aufl. Wien 1946. P l enk , H-, s. S e h a f f e r , J. ['-'I.

M. R a t z e n h o f e r .

Das Sulfonamid Prontosil solubile als Vitalfarbstoff Yon

Horst Orawert (Aus dem Institut fiir allgemeine Bofanik der Universit~it Jena)

(Eingelaugt am 19. September t950)

Das Eindr ingen yon Pro.ntosi[ so|ubile in Bakter ien and in die Ober- epigermiszellen der Sehnppenbl~itter yon Allium Cepa konnte S t r u g g e r (1942) indirekt naehweisen. In vitro vermag das Prontosil die Fhloreszenz ether Akridinorangeliisung viillig zu lSsehen. Dementspreehend sehw~ieht eine Prontosil-Naehbehandlung die Griinfluoereszenz d e r m i t Akridinorange vitalgefi irbten Allium-Zellen and eine Prontosi l -Vorbehandlung setzt die Vitalf~irbbarkeit des Cytoplasmas mit Akridinorange sehr stark herab. In diesen Versuchen S t r u g g e r s kann das Prontosil n u t in s.ehr geringen Mengen in die Zellen eingedrungen sei~, da S t r u g g e r nirgends eine Speieherung des Sulfonamids erw~ihnt, die bet der intensiven g igen[a rbe des Prontosils unbedingt h~itte zu sehen sein mtissen.

Im Zusammenhang mit die.sere yon S t r u g g e r beobaehteten Antagonis- mus zwisehen Pronlosil und Akridinorange sind die Angaben yon B a u e h (1946, J949) tiber den Antagonismus yon Promosil solubile und Colehicin