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BASE ESTRUCTURAL PARA LA NEUTRALIZACIÓN POTENCIAL DE
BETA-CORONAVIRUS POR ANTICUERPOS DE CAMÉLIDOS DE
DOMINIO ÚNICO
Daniel Wrapp, Dorien De Vlieger, Kizzmekia S. Corbett, Bert Schepens,Xavier Saelens, Jason S. McLellan
Cell 181, 1–12- 8 de Mayo de 2020.
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.04.031
INTRODUCCIÓN Los coronavirus son virus con ARN de sentido positivo envueltos, que se dividen en cuatro géneros (alfa,
beta, gamma y delta) e infectan una amplia variedad de organismos hospedadores (Woo et al., 2009). Hay
por lo menos siete coronavirus que pueden causar enfermedades en humanos, y cuatro de estos virus
(HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63, y HCoV-229E) circulan estacionalmente en todo el mundo,
causando en la mayoría de los pacientes, una enfermedad respiratoria leve (Gaunt et al., 2010). Los tres
virus restantes, SARS-CoV-1, MERS-CoV y SARS-CoV-2, son patógenos zoonóticos que han causado
después de emerger en la población humana, epidemias o pandemias graves con síntomas a menudo
fatales, (Chan et al., 2020; Huang et al., 2020; Ksiazek et al., 2003; Lu et al., 2020; Zaki et al., 2012). Para
estos beta-coronavirus altamente patógenos, son necesarias intervenciones profilácticas y terapéuticas.
Las superficies de los coronavirus muestran una glicoproteína de la espiga (S), que es una proteína de
fusión clase I (Bosch et al., 2003). La proteína S forma un complejo trimérico, que puede ser
funcionalmente categorizado en dos subunidades distintas, S1 y S2, que están separadas por un sitio de
escisión de la proteasa. La subunidad S1 contiene el dominio de unión al receptor (RBD), que interactúa
con la proteína receptora de una célula hospedadora para desencadenar la fusión de la membrana. La
subunidad S2, contiene la maquinaria de fusión de membrana, incluido el péptido de fusión hidrofóbico y
una zona alfa-helicoidal que se repite. Los receptores de las células hospedadoras funcionales para SARS-
CoV-1 y MERS-CoV, son la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) y la dipeptidil peptidasa 4
(DPP4), respectivamente (Li et al., 2003; Raj et al., 2013). Las interacciones entre estos receptores y los
dominios de unión al receptor (RBD) respectivos se han caracterizado a fondo, tanto desde el punto de
vista estructural como biofísicamente (Li et al., 2005; Wang et al., 2013). Recientemente, se ha informado
que el SARS-CoV-2, también hace uso del ACE2 como un receptor funcional de la célula hospedadora y
varias estructuras de este complejo (Hoffmann et al., 2020; Lan et al., 2020; Wan et al., 2020; Yan et al.,
2020; Zhou et al., 2020). Los avances recientes en microscopía crioelectrónica (Crio-EM) han permitido a
los investigadores determinar estructuras de alta resolución de los ectodominios de la proteína S y permite
entender cómo funciona esta máquina macromolecular (Kirchdoerfer et al., 2016; Li et al., 2005; Walls et
al., 2016; Wang et al., 2013). La caracterización inicial de la proteína de la espiga del SARS-CoV-1 reveló
que los RBD adoptaron al menos dos conformaciones distintas. En la conformación denominada ‘‘arriba’’,
los RBD sobresalen del resto de la espiga, para poder enganchar fácilmente al ACE2 sin que se produzca
un choque estérico. En la conformación denominada "abajo", los RBD están comprimidos contra la parte
superior de la subunidad S2, evitando la unión al ACE2 (Gui et al., 2017). Experimentos posteriores han
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corroborado este fenómeno y se han observado dinámicas similares en la espiga del MERS-CoV, del
SARS-CoV-2, y otros alfa-coronavirus (Kirchdoerfer et al., 2018; Pallesen et al., 2017; Walls et al., 2020;
Wrapp y McLellan, 2019; Wrapp et al., 2020; Yuan et al., 2017). Debido a la abundancia relativamente baja
de partículas, puede ser observado por cryo-EM con tres RBD en la conformación “arriba”, se cree que
esta conformación puede corresponder a un estado energéticamente inestable (Kirchdoerfer et al., 2018;
Pallesen et al., 2017). Estas observaciones han llevado a la hipótesis de que los RBD de los CoV, podrían
actuar como un trinquete (mecanismo que permite la rotación de un eje en un sentido, pero lo imposibilita
en sentido contrario) molecular: un evento de unión al receptor atraparía a la RBD en la conformación
menos estable, lo que lleva a la desestabilización gradual de S1, hasta que S2 es finalmente
desencadenado, para iniciar la fusión de la membrana. Experimentos recientes caracterizaron los
anticuerpos anti-SARS-CoV-1 dirigidos al RBD que atrapa al SARS-CoV-1 en la conformación “arriba” y
conduce a la desestabilización de la prefusión (Walls et al., 2019). Han sido reportados numerosos
anticuerpos anti-SARS-CoV-1 RBD y anti-MERS-CoV RBD, y sus mecanismos de neutralización pueden
atribuirse a la oclusión de la unión al receptor y para atrapar el RBD en la conformación inestable, actuando
efectivamente como un imitador simil receptor, que desencadena una transición de la conformación de
prefusión a postfusión (Hwang et al., 2006; Walls et al., 2019; Wang et al., 2018; Wang et al., 2015).
Además de los anticuerpos convencionales, los camélidos también producen cadenas pesadas de
anticuerpos (HCAbs), que contienen solamente un dominio variable (VHH) en lugar de dos dominios (VH
y VL) que forman la unión del antígeno en forma equivalente al fragmento (Fab) de anticuerpos
convencionales de inmunoglobulina G (IgG) (Hamers-Casterman y otros, 1993). Este dominio variable, en
ausencia de un dominio efector, se conoce como un anticuerpo de dominio único, VHH o Nanobody y
típicamente puede adquirir afinidades y especificidades por antígenos comparables a anticuerpos
convencionales. Los VHH se pueden construir fácilmente en formatos multivalentes y tienen mayor
estabilidad térmica y quimioestabilidad que la mayoría de los anticuerpos (De Vlieger et al., 2018; Dumoulin
et al., 2002; Govaert et al., 2012; Laursen et al., 2018; Rotman et al., 2015; Van der Linden y col., 1999).
Los VHH también se sabe que son menos susceptibles a los impedimentos estéricos que podrían prevenir
la unión de anticuerpos convencionales más grandes (Forsman et al., 2008). Sus propiedades biofísicas
ventajosas, condujeron a la evaluación de varios VHH como terapéutica contra patógenos respiratorios
comunes, como el virus sincitial respiratorio (RSV) (Detalle et al., 2015; Rossey et al., 2017). El uso de
VHH como anticuerpos biológicos en el contexto de una infección respiratoria, es una aplicación
particularmente atractiva, porque la alta estabilidad de los VHH hace que se puedan nebulizar y administrar
directamente a través de un inhalador al sitio de la infección (Respaud et al., 2015). Por otra parte, dada
su estabilidad después de un almacenamiento prolongado, los VHH podrían almacenarse como opciones
de tratamiento terapéutico en caso de epidemia. Aunque son muy necesarias las terapéuticas contra
MERS-CoV y SARS-CoV-2, la viabilidad de usar VHH para este propósito, aún no ha sido explorada
adecuadamente. Varios VHH dirigidos a la espiga del MERS-CoV se han informado como resultado de la
inmunización de camélidos, pero sus epitopes permanecen en gran medida indefinidos (Stalin Raj et al.,
2018; Zhao et al., 2018). Aquí, informamos el aislamiento de dos VHH neutralizantes potentes dirigidos
contra los SARS-CoV-1 RBD y MERS-CoV RBD, respectivamente. Estos VHH se obtuvieron en respuesta
a la inmunización de una llama con SARS-CoV-1 estabilizado por prefusión y la proteína S de MERS-CoV.
Resolvimos las estructuras cristalinas de estos dos VHH en complejos con sus respectivos epitopes virales.
Los mecanismos probables de neutralización sugeridos fueron la oclusión de la interfaz de unión al
receptor y la captura de los RBD en la conformación “arriba”. También mostramos que los VHH contra el
SARS-CoV-1 RBD reacciona de forma cruzada con el SARS-CoV-2 RBD y puede bloquear la interfaz de
unión al receptor. Después de diseñar este VHH en una Fc-fusión bivalente, mostramos que esta reacción
cruzada VHH también puede neutralizar la espiga de los seudovirus SARS-CoV-2. Además, demostramos
que la fusión VHH-Fc se puede producir con altos rendimientos en un sistema de células CHO (células de
ovario de hámster chino) estándar de la industria, lo que sugiere que merece más investigación como una
potencial terapia para la actual pandemia de COVID-19.
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RESULTADOS
Aislamiento de VHH dirigidos contra la proteína de la espiga de betacoronavirus Nuestro objetivo inicial fue aislar los VHH que podían neutralizar potentemente al MERS-CoV y SARS-
CoV-1. Por lo tanto, inmunizamos secuencialmente una llama por vía subcutánea dos veces con la proteína
de la espiga de SARS-CoV-1, dos veces con proteína de la espiga de MERS-CoV, una vez más con
proteína S de SARS-CoV-1, y finalmente con la proteína S de SARS-CoV-1 y MERS-CoV (Figura S1A).
Para obtener VHH dirigidos contra estas proteínas S, fueron realizadas dos rondas consecutivas de paneos
por fagos para visualizarlos, usando proteína S de SARS-CoV-1 o S de MERS-CoV. Se secuenciaron los
clones positivos y se alineó la secuencia múltiple y el análisis filogenético utilizando la unión de vecinos.
El método reveló siete únicos anticuerpos contra la proteína S del MERS-CoV y cinco contra la S de SARS-
CoV-1 (Figura S1B). Estos VHH y un control negativo (RSV F-VHH, dirigido contra la proteína F del virus
sincitial respiratorio humano) fueron subsecuentemente expresados en Pichia pastoris (levadura) y
purificado del medio con la levadura (Rossey et al., 2017) La unión de los VHH purificados contra la S de
MERS-CoV estabilizado por prefusión y la S de SARS-CoV-1, fue confirmado por ELISA (Figura S1C).
Como era de esperar, el control no tenía unión detectable a la S de MERS-CoV y la S de SARSCoV-1.
Cuatro clones (MERS VHH-55, -12, -34 y -40), obtenidos después de obtener la proteína S de MERS-CoV,
unida con alta afinidad a la S de MERS-CoV estabilizado por prefusión, mientras que las afinidades de
VHH-2, -20 y -15 fueron de 100 a 1000 veces más débil. De los cinco clones aislados después de obtener
la proteína S del SARS-CoV-1, tres clones de VHH (SARS VHH-72, -1 y -6) interactuaron fuertemente con
el complejo de prefusión de la proteína S estabilizada de SARS-CoV-1. No observamos reactividad
cruzada de MERS VHH, con SARS-CoV-1 S, ni viceversa (datos no mostrados).
Figura 1- Determinación de epitopes y caracterización biofísica de MERS VHH-55 y SARS VHH-72 (A) Reactividad de los VHH dirigidos contra RBD MERS-CoV y SARS-CoV, frente a los RBD MERS-CoV y SARS-CoV-1,
respectivamente. Un VHH contra un antígeno irrelevante (F-VHH) se incluyó como control. Los puntos de datos representan la media
de tres réplicas y las barras de error representan los errores estándar de la media. (B) Sensorgramas SPR que muestran la unión
entre MERS-CoV RBD y MERS VHH-55 (izquierda) y SARS-CoV-1 RBD y SARS VHH-72 (derecha). Curvas de unión
son de color negro, y el ajuste de los datos a un modelo de enlace 1: 1 es de color rojo.
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Los VHH neutralizan los virus seudotipados del coronavirus S Para evaluar la actividad antiviral de los VHH dirigidos a la proteína S del MERS-CoV y el SARS-CoV,
realizamos ensayos de neutralización in vitro utilizando MERS-CoV Inglaterra1 S y SARS-CoV-1 Urbani S
lentivirus seudotipado. El MERS de alta afinidad VHH-55, -12, -34 y -40 virus pseudotipado MERS-CoV S
neutralizado con valores IC50 que van desde 0.014 a 2.9 mg / mL (0.9 nM a 193.3 nM), mientras que los
VHH específicos de MERS-CoV- o SARS-CoV-1 de menor afinidad no tuvieron efecto inhibitorio (Tabla
S1). Los SARS VHH-72 y -44 neutralizados por lentivirus seudotipados con SARS-CoV-1 S con valores de
CI50 de 0.14 (9 nM) y 5.5 mg / mL (355 nM), respectivamente. No se observó unión para el SARS VHH-
44 al complejo estabilizado por la prefusión Proteína SARS-CoV-1 S en el ensayo ELISA. El análisis de la
secuencia reveló que los VHHs neutralizantes específicos de MERS-CoV -12, -40 y -55, tienen una
determinación de regiones (CDR) de complementariedad muy similar lo que indica que probablemente
pertenecen a la misma familia clonal y pueden unirse al mismo epitope (Figura S2). En contraste, los CDR
de del SARS-CoV S-específico VHHs -44 y -72 son muy diferentes.
Mapeo de la especificidad del dominio del betacoronavirus VHHs S-Dirigidos Para mapear los epitopes dirigidos por los VHH neutralizantes, probamos la unión a MERS-CoV-1 S RBD
y el extremo N-terminal dominio recombinante (NTD) y SARS-CoV-1 RBD y NTD por ELISA (Figura 1A;
Figura S3). Los VHH específicos contra S de MERS-CoV se unen fuerte a MERS-CoV-1 S RBD, en una
concentración dependiente manera y no pudo unirse al MERS-CoV NTD. Del mismo modo, se observó
una unión fuerte de SARS VHH-72 a la proteína RBD SARS-CoV-1, pero no se observó lo mismo con la
proteína NTD SARS-CoV-1. No se detectó unión del SARS VHH-44 a la proteína SARS-CoV-1 S o NTD,
dejando el dominio que este VHH reconoce indeterminado. Estos datos demuestran que el SARS
neutralizante VHH-72 y MERS VHH-55 apuntan a los RBD. Basado en la especificidad y potente capacidad
neutralizante de SARS VHH-72 y MERS VHH-55, medimos las afinidades de estos VHH inmovilizando
VHH expresado recombinantemente a una resonancia de plasmón superficial (SPR) sensorchip y se
determinó la cinética de unión para sus respectivos RBDs. Descubrimos que ambos VHH mostraban
afinidad contra sus objetivos. Los SARS VHH-72 se unían con una afinidad de 1.2 nM y MERS VHH-55
unido a su objetivo con una afinidad de 79.2 pM, en parte debido a una muy lenta constante de velocidad
(kd = 8.2 x10 5 s 1) (Figura 1B).
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FIGURA 2- La estructura cristalina de MERS VHH-55 vinculado al MERS-CoV RBD (A) MERS VHH-55 se muestra como cintas azules y el MERS-CoV RBD se muestra como un color canela superficie molecular La
interfaz de enlace DPP4 en El MERS-CoV RBD es de color rojo. (B) La estructura de DPP4 unida al MERS-CoV RBD (PDB ID: 4L72)
está alineado con el cristal estructura de MERS VHH-55 unida al MERS-CoV RBD. Un monómero único de DPP4 se muestra como
Una superficie molecular roja y transparente. (C) Una vista ampliada del panel desde (A), con el MERS-CoV RBD ahora se muestra
como color canela cintas Los residuos que forman interacciones son se muestran como palos, con átomos de nitrógeno de color
oscuro átomos azules y de oxígeno de color rojo. Enlaces de hidrógeno y puentes de sal entre MERS VHH-55 y el MERS-CoV RBD
se muestran como puntos negros. (D) La misma vista desde (C) ha sido activada por aproximadamente 90 para mostrar contactos
adicionales. Los residuos que forman interacciones se muestran como palos, con átomos de nitrógeno de color azul oscuro y átomos
de oxígeno de color rojo. Enlaces de hidrógeno y puentes de sal entre MERS VHH-55 y el MERS-CoV RBD se muestran como puntos
negros.
Tres CDR forman amplios contactos de unión con el RBD, con una penetración de 716 A °2 del área de la
superficie del RBD entre el CDR2 y CDR3. El CDR3 del MERS VHH-55 es en bucle sobre la interfaz de
unión DPP4, ocluyendo DPP4 para comprometer productivamente el MERS-CoV RBD (Figuras 2A y 2B).
Existen numerosos contactos entre los CDR de MERS VHH-55 y el MERS-CoV RBD; la mayoría están
confinados a CDR 2 y 3. Una red de interacciones de los tres CDR (Figuras 2C y 2D) sugiere que el residuo
de RBD Arg542 tiene una importancia crítica papel en la unión de MERS VHH-55. Esta arginina
previamente ha sido identificada como uno de los 12 residuos conservados, que son cruciales para el
compromiso DPP4 de alta afinidad (Figura S4A) (Wang et al., 2013; 2014).
Además de formar un puente salino con la Glu513 de la MERS-CoV RBD, Trp99 del MERS VHH-55 CDR3
está posicionado cerca de un centro hidrofóbico formado por la Phe506 (Figura S4B). Este residuo exhibe
variación de la secuencia natural en varios genomas de MERS-CoV, de modo que ocasionalmente se
observa una Leu en esta posición. Para evaluar en qué medida impacta esta sustitución en el enlace MERS
VHH-55, generamos una sustitución F506L y la unión medida por SPR (Figura S4C). Esta sustitución
resultó en una reducción de aproximadamente 200 veces en la afinidad de unión de MERS VHH-55. A
pesar de esta reducción sustancial, la afinidad de MERS VHH-55 a MERS-CoV RBD F506L se mantuvo
alta, con un KD =16,5 nM. Aparte de la variabilidad que se observa en la posición 506 del MERS-CoV
RBD, el resto del MERS VHH-55 el epitope está altamente conservado en las 863 cepas que están en
vigilancia en la base de datos de variación de virus MERS-CoV (Figura S4A). A pesar de este amplio
reconocimiento previsto de las cepas MERS-CoV, la identidad de secuencia promedio del 24% entre el
MERS-CoV RBD y los RBD de los coronavirus estacionales HCoVHKU1, HCoV-OC43, HCoV-229E y
HCoV-NL63, hacen poco probable que MERS VHH-55 reaccione de forma cruzada con cualquiera de
estas proteínas S más lejanamente relacionadas. También buscamos descubrir los determinantes de unión
moleculares entre SARS VHH-72 y el SARS-CoV-1 RBD, determinando la estructura cristalina de este
complejo. Los cristales crecieron en el grupo espacial P3121 y los rayos X difractados a una resolución de
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2.2 A °. Obtuvimos una solución de reemplazo molecular y se refinó la estructura a un Rwork / Rfree de
20.3% / 23.6% a través de la construcción iterativa y refinamiento (Tabla S2). Nuestra estructura revela
que las CDR 2 y 3 contribuyen a la mayoría de los 834 A °2 de superficie de penetración en la interfaz del
enlace (Figura 3A). Este epitope sin embargo, no se superpone con la ACE2 en el SARS-CoV-1 RBD, más
bien, ACE2 chocaría con el CDR distal. El marco del SARS VHH-72, en oposición al clásico bloqueo del
receptor en el que las CDR ocuparían el ACE2 interfaz de enlace (Figura 3B). El ACE2 también lleva una
modificación N-glucano en la posición Asn322 (Yan et al., 2020). Cuando está unido al RBD, este N-
glucano apunta al espacio que está ocupado por el SARS VHH-72, formando un choque aún mayor (Figura
3C). El SARS VHH-72 se une al SARS-CoV-1 RBD a través de una red de puentes de hidrógeno que
involucra las CDR 2 y 3, en las cuales la columna vertebral de los grupos que participan ampliamente
(Figuras 3D y 3E). Esta red probablemente explica el enlace de alta afinidad que nosotros observado para
estas dos moléculas.
El SARS VHH-72 reacciona de forma cruzada con WIV1-CoV y SARSCoV-2 El análisis de 10 secuencias disponibles de SARS-CoV-1 reveló un alto grado de conservación en los
residuos que forman el epitope VHH-72SARS, que nos invita a explorar la amplitud del SARS Unión VHH-
72 (Figura S5A). El WIV1-CoV es un betacoronavirus encontrado en murciélagos que está estrechamente
relacionado con el SARS-CoV-1 y también utiliza ACE2 como receptor de la célula huésped (Ge et al.,
2013). Porque el grado relativamente alto de conservación de secuencia entre SARS-CoV-1 y WIV1-CoV,
expresamos el WIV1-CoV RBD y unión medida al SARS VHH-72 por SPR (Figura S5B). El SARS VHH-72
exhibió unión de alta afinidad con el WIV1-CoV RBD (7.4 nM), lo que demuestra que reacciona de forma
cruzada con estos dos coronavirus estrechamente relacionados (Figura S5C). Basado en el alto grado de
homología estructural que tiene se ha informado entre SARS-CoV-1 S y SARS-CoV-2 S (Walls et al., 2020;
Wrapp et al., 2020), también probamos el SARS VHH-72 para reactividad cruzada contra el SARS-CoV-2
RBD y subdominio 1 (SARS-CoV-2 RBD-SD1) por SPR (Figura 4). La constante de disociación de
equilibrio de SARS VHH-72 para el SARS-CoV-2 RBD-SD1 fue de aproximadamente 39 nM,
sustancialmente más alto que para el SARS-CoV-1 RBD. La unión más débil puede ser principalmente
atribuida a un aumento en la tasa de disociación constante (Figura 4A). El único residuo variante en el
SARS-CoV-1 RBD que hace contacto directo con SARS VHH-72 es Arg426, que es Asn439 en el SARS-
CoV-2 RBD (Figura 3C). Esta mutación evita la formación de un puente salino con Asp61 del SARS VHH-
72, lo que probablemente contribuye al aumento de la tasa de la constante de disociación. Debido a una
identidad de secuencia promedio de solo 25% entre el SARS-CoV-1 RBD y los RBD del coronavirus
estacional, predecimos que la reactividad cruzada del SARS VHH-72 es probable que esté limitado al RBD
por SARS-CoV-2 y estrechamente en betacoronavirus relacionados como WIV1-CoV.
Los VHH interrumpen la dinámica de RBD y la unión al receptor Los RBD de MERS-CoV S, SARS-CoV-1 S y SARS-CoV-2 S, someterse a reordenamientos
conformacionales dinámicos que alternativamente enmascaran y presentan sus interfaces de unión al
receptor y epitopes neutralizantes potenciales a las moléculas hospedadoras. Alineando las estructuras
cristalinas del MERS VHH-55 y SARS VHH-72 complejos a las estructuras cryo-EM del MERS-CoV, SARS-
CoV-1, y SARS-CoV-2 S , podemos comenzar a entender cómo podrían funcionar estas moléculas en el
contexto de estos reordenamientos dinámicos. Cuando los RBD MERS-CoV están todos en la
conformación hacia abajo o todos en la conformación hacia arriba, MERS VHH-55 podría unir a los tres
protómeros formando el trímero de la espiga funcional sin formar ningún choque estérico. Sin embargo, si
un protómero descendente estaba vinculado por MERS VHH-55 y el protómero vecino tomaron muestras
de la conformación arriba, este RBD quedaría atrapado en este estado por la presencia de la molécula
vecina MERS VHH-55 (Figura 5A). Esta trampa conformacional sería aún más pronunciada tras la unión
del SARS VHH-72 a la proteína S del SARS-CoV-1 o la proteína SARS-CoV-2 S Debido al ángulo de unión
de SARS VHH-72, cuando un SARS-CoV-1 o SARS-CoV-2 vinculado a RBD muestrea la conformación
hacia abajo, chocaría con la subunidad de fusión S2, independientemente de las conformaciones de la
vecina RBD (Figuras 5B y 5C). Por lo tanto, una vez que un solo SARS produjo el evento de unión VHH-
72, el protómero unido sería atrapado en la conformación hasta que el SARS VHH-72 fuera liberado o
hasta que se active la proteína S para experimentar la prefusión y la transición a postfusión. Basado en
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los ángulos de unión de MERS VHH-55 y SARS VHH-72, podemos concluir que estas las moléculas
probablemente interrumpirían la dinámica de RBD en el contexto de una proteína S trimérica, atrapando
la conformación arriba. Porque esta conformación es inestable y conduce a la activación de la proteína S,
es posible que esta trampa conformacional al menos contribuir parcialmente a los mecanismos de
neutralización de estos VHHs. Para investigar la capacidad de bloqueo del receptor de los VHH, realizamos
un ensayo basado en interferometría de biocapa (BLI) en el que se inmovilizaron los RBD SARS-CoV-1,
SARS-CoV-2 y MERS-CoV a puntas de biosensor, sumergidas en VHH y luego sumergidas en pocillos
que contienen los receptores recombinantes solubles de la célula huésped. Descubrimos que cuando las
puntas recubiertas con el MERS-CoV RBD fueron sumergidos en MERS VHH55 antes de ser sumergidos
en DPP4, no hubo aumento en la respuesta que podría atribuirse a la unión al receptor. Cuando las puntas
recubiertas con el MERS-CoV RBD fueron sumergidos en SARS VHH-72 y luego DPP4, se observó una
señal robusta de respuesta, como se esperaba. Resultados similares se observaron cuando se realizaron
los experimentos análogos, utilizando los SARS-CoV-1 o SARS-CoV-2 RBD, SARS VHH-72 y ACE2
(Figura 5D). Estos resultados son consistentes con conclusiones de nuestro análisis estructural de que
estos VHH puede neutralizar sus objetivos virales respectivos al interferir directamente con unión al
receptor de la célula huésped.
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Figura 3. La estructura cristalina del anticuerpo SARS VHH-72 unida al SARS-CoV-1 RBD (A) SARS VHH-72 se muestra como cintas de color azul oscuro y el SARS-CoV-1 RBD se muestra como una superficie
molecular de color rosa. La interfaz de enlace ACE2 en el SARS-CoV-1 RBD es de color rojo. (B) La estructura de ACE2
unida al SARS-CoV-1 RBD (PDB ID: 2AJF) está alineada con la estructura cristalina del SARS VHH-72 unida al SARS-
CoV-1 RBD. ACE2 se muestra como una superficie molecular transparente roja. (C) Un glucano ligado a N simulado que
contiene un núcleo de trimannosilo de energía minimizada (derivado de PDB ID: 1HD4) se modela como barras rojas,
provenientes de Asn322 en ACE2. ACE2 se muestra como una superficie molecular roja, el SARS-CoV-1 RBD se muestra
como cintas de color rosa y el SARS VHH-72 se muestra como un azul oscuro, transparente superficie molecular (D) Se
muestra una vista ampliada del panel desde (A), con el SARS-CoV-1 RBD ahora mostrado como cintas de color rosa. Los
residuos que forman interacciones se muestran como barras, con átomos de nitrógeno de color azul oscuro y átomos de
oxígeno de color rojo. Enlaces de hidrógeno y puentes salinos entre el SARS VHH-72 y el SARSCoV-1 RBD se muestran
como puntos negros. (E) La misma vista desde (D) ha sido cambiada por 60 para mostrar contactos adicionales. Los
residuos que forman interacciones se muestran como barras, con átomos de nitrógeno coloreados. azul oscuro y átomos
de oxígeno de color rojo. Las interacciones entre el SARS VHH-72 y el SARS-CoV-1 RBD se muestran como puntos
negros.
Figura 4- El SARS VHH-72 reacciona de forma cruzada con SARS-CoV-2
El SARS bivalente VHH-72 neutraliza el seudovirus SARS-CoV-2 S A pesar de la afinidad relativamente alta determinada por SPR del SARS VHH-72 para el SARS-CoV-2
RBD, no pudimos detectar la interacción por ELISA. Además, el SARS VHH-72 no neutralizó el seudovirus
de la estomatitis vesicular (VSV) SARS-CoV-2 S, posiblemente debido a la alta tasa de la constante de
disociación, aunque neutralizó fácilmente el virus seudotipado SARS-CoV-1 (Figuras 6A – 6D). En un
intento de compensar esta rápida disociación, diseñamos dos variantes bivalentes del SARS VHH-72.
Estos incluyeron una fusión de punta a punta dos moléculas de SARS VHH-72 conectadas por un conector
(GGGGS) 3 (VHH-72-VHH-72) y una fusión genética de SARS VHH-72 al Dominio Fc de IgG1 humana
(VHH-72-Fc) (Figuras S6A-S6C). Estas construcciones bivalentes de SARS VHH-72 unidas a ambas
prefusiones
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SARS-CoV-1 S y SARS-CoV-2 RBD-SD1 como se demostró por ELISA y por una reducción dependiente
de la dosis en la unión de SARS-CoV-2 RBD-SD1 al receptor ACE2 en Vero E6 células (Figuras 6C – 6D;
Figuras S6B y S6C). También detectamos unión de ambas construcciones a SARS-CoV- 1 S de longitud
completa y SARS-CoV-2 S expresados en la superficie de mamíferos células (Figuras S6D y S6E).
Sobrenadantes de células HEK293S transfectado transitoriamente con VHH-72-Fc exhibió actividad
neutralizante contra SARS-CoV-1 y SARS-CoV-2 S VSV seudovirus en el mismo ensayo, que no mostró
tal neutralización de reacción cruzada para el SARS monovalente VHH-72 (Figuras 6E y 6F). Un
experimento BLI que mide la unión de VHH-72-Fc a SARS-CoV-2 inmovilizado RBD-SD1 confirmó además
que la bivalencia pudo compensar la alta constante de disociación del monómero (Figura 7A). Además, la
neutralización cruzada de VHH-72-Fc alcanzó niveles de expresión de aproximadamente 300 mg / L en
células ExpiCHO (Figura 7B). Usando VHH-72-Fc purificado de células ExpiCHO y un VSV seudotipado
SARS-CoV-2 S. Con un revelado de luciferasa, evaluamos la capacidad de neutralización de VHH-72-Fc
y descubrió que neutralizaba el seudovirus con una IC50 de aproximadamente 0.2 mg / mL (Figura 7C).
DISCUSIÓN Informamos el aislamiento y caracterización de dos potentes anticuerpos neutralizantes de un solo dominio
de una llama inmunizada con espigas MERS-CoV y SARS-CoV-1 estabilizadas por prefusión. Estos VHH
se unen a los RBD de la espiga con alta afinidad y son capaz de neutralizar los virus pseudotipados S in
vitro. Para nuestro conocimiento, aislamiento y caracterización de SARS-CoV-1 VHH dirigidos contra la
proteína S no se han descrito antes. Varios VHH específicos de S de MERS-CoV se han descrito, todos
los han sido dirigidos contra el RBD. Varios de estos VHH también se ha informado que bloquea la unión
de DPP4, al igual que MERS VHH-55 (Stalin Raj et al., 2018; Zhao et al., 2018). Resolviendo las estructuras
cristalinas de estos VHH recientemente aislados en complejos con sus respectivos objetivos virales,
proporcionamos información detallada del epitope vinculante y sus mecanismos de neutralización.
Han sido descrito una serie de anticuerpos convencionales dirigidos a RBD que son capaces de neutralizar
SARS-CoV-1 o MERS-CoV. El epitope de MERS VHH-55 se superpone con los epitopes de varios de
estos anticuerpos dirigidos contra RBD MERS-CoV incluyendo C2, MCA1, m336, JC57-14, D12, 4C2 y
MERS-27
(Chen et al., 2017; Li et al., 2015; Wang et al., 2015; 2018; Ying et al., 2015; Yu et al., 2015) (Figura S7A).
El epitope del SARS VHH-72 no se superpone significativamente con los epitopes de cualquier anticuerpo
descrito anteriormente que no sean los de CR3022, que también puede unirse a los RBD de ambos SARS-
CoV-1 y SARS-CoV-2 S (Hwang et al., 2006; Pak et al., 2009; Prabakaran et al., 2006; Walls et al., 2019;
Yuan et al., 2020) (Figura S7B). Sin embargo, a diferencia del SARS VHH-72, CR3022 no impide la unión
de ACE2 y carece de actividad neutralizante contra el SARS-CoV-2 (Tian et al., 2020; Yuan et al., 2020).
Esta discrepancia en la función, a pesar del epitope parcialmente superpuesto, probablemente debido a
los diferentes ángulos de enfoque que adoptan estos dos anticuerpos (Figura S7C). Porque el SARS VHH-
72 se une con un Kd nanomolar al SARS-CoV-1 S RBD que exhibe una variación de secuencia baja, como
lo demuestra su reactividad cruzada con el WIV1-CoV y SARB-CoV-2 RBD, puede unirse ampliamente a
las proteínas S de otros virus similares al SARS-CoV. Mostramos que al diseñar una construcción bivalente
VHH-72-Fc, podemos compensar la relativamente alta constante, fuera de la tasa de SARS monovalente
VHH-72. Esta molécula bivalente se expresa bien en transfectados transitoriamente ExpiCHO células
(aproximadamente de 300 mg / L) y puede neutralizar SARS-CoV-2 S seudovirus in vitro. Futuros
esfuerzos de ampliar este panorama utilizando bibliotecas existentes y SARS-CoV-2 S puede producir aún
neutralizadores más potentes Debido a la termoestabilidad inherente y la quimioestabilidad de los VHH,
han sido investigados como potenciales terapias contra varias enfermedades. Los VHHs dirigidos por el
VIH y la influenza, han sido reportados previamente, y hay múltiples RSV dirigidos VHH que han sido
evaluados (Detalle et al., 2015; Iban˜ ez et al., 2011; Koch et al., 2017; Rossey et al., 2017). La posibilidad
de administrar estas moléculas a través de un nebulizado, es particularmente atractivo en el caso de
patógenos respiratorios porque los VHH teóricamente podrían inhalarse directamente al sitio de la
infección en un esfuerzo por maximizar la biodisponibilidad y función (Larios Mora et al., 2018). La falta de
tratamientos para MERS, SARS y COVID-19 y los efectos devastadores asociados con brotes de
coronavirus pandémicos, son necesarias las intervenciones profilácticas como una posible terapia. Nuestra
esperanza, radica en que debido a sus favorables propiedades biofísicas y su potente capacidad de
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neutralización, MERS VHH-55, SARS VHH-72 y VHH-72-Fc pueden servir como soluciones útiles para
investigadores por su potencial efecto terapéutico.
Figura 5- Mecanismos de
neutralización de MERS VHH-55
y SARS VHH-72 (A) La espiga MERS-CoV (PDB ID: 5W9H) blanco
y el RBD bronceado vecino se destaca por
La elipse roja. (B) La espiga de SARS-CoV-1 (ID
de PDB: 5X58) se muestra como una superficie
molecular transparente, con cada protómero de
color blanco, gris o rosa. Cada monómero es
obligado por una copia de SARS VHH-72, que se
muestra como cintas azul oscuro. Los
enfrentamientos entre las copias del SARS VHH-
72 y los dos monómeros de espigas vecinos son
resaltado por el círculo rojo.
(C) El pico de SARS-CoV-2 (PDB ID: 6VXX) se
muestra como una superficie molecular
transparente, con cada protómero de color blanco,
gris o verde. Cada monómero está sujeto a una copia del SARS VHH-72, que se muestra como cintas azul oscuro. Los
enfrentamientos entre las copias del SARS VHH-72 y los dos monómeros de espigas vecinos son resaltado por el círculo rojo. El
trímero SARS-CoV-2 parece más pequeño que el SARS-CoV-1 S debido a la ausencia de bucles distales NTD flexibles, que no
pudieron ser construido durante el análisis cryo-EM. (D) Los CoH VHH impiden que MERS-CoV RBD, SARS-CoV-1 RBD y SARS-
CoV-2 RBD-SD1 interactúen con sus receptores. Los resultados dese muestra como una superficie molecular transparente, con
cada monómero de color blanco, gris o tostado. Cada monómero es obligado por MERS VHH-55, que se muestra como cintas
azules. El choque entre MERS VHH-55 unido al monómero basado en BLI. Se muestran los experimentos de bloqueo del receptor.
La leyenda enumera los RBD inmovilizados y los VHH o receptores que corresponden a cada curva.
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Figura 7- VHH-72-Fc neutraliza los seudovirus SARS-CoV-2 S
A) Sensorgrama BLI que mide la afinidad de unión aparente de VHH-72-Fc a SARS-CoV-2 RBD-Fc inmovilizado. Las curvas de
unión son de color negro, solo espacios en blanco son de color gris y el ajuste de los datos a una curva de enlace 1: 1 es de color
rojo. (B) Análisis del curso temporal de la expresión de VHH-72-Fc en células ExpiCHO. Sobrenadantes de cultivo celular de células
ExpiCHO transfectadas transitoriamente se eliminaron en días 3–7 después de la transfección (o hasta que la viabilidad celular cayó
por debajo del 75%), como se indica. Se incluyeron dos mAbs de control para comparación, junto con las cantidades indicadas
de GBP-Fc purificado como control de carga. (C) SARS-CoV-2 S ensayo de neutralización de VSV seudotipado. Las monocapas de
células Vero E6 se infectaron con seudovirus que habían sido preincubados con mezclas indicadas por la leyenda. El VHH-72-Fc
utilizado en este ensayo se purificó después de la expresión en células ExpiCHO (n = 4). VHH-23-Fc es un control irrelevante
VHH-Fc (n = 3). NI, las células no estaban infectadas. La actividad de luciferasa se informa en recuentos por segundo (c.p.s.) ± SEM.
RESUMEN GRÁFICO
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BIBLIOGRAFÍA Adams, P.D., Grosse-Kunstleve, R.W., Hung, L.W., Ioerger, T.R., McCoy, A.J., Moriarty, N.W., Read, R.J., Sacchettini, J.C., Sauter, N.K., and Terwilliger, T.C. (2002). PHENIX: building new software for automated crystallographic structure determination. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 58, 1948–1954. Afonine, P.V., Poon, B.K., Read, R.J., Sobolev, O.V., Terwilliger, T.C., Urzhumtsev, A., and Adams, P.D. (2018). Real-space refinement in PHENIX for cryo-EM and crystallography. Acta Crystallogr D. Struct. Biol. 74, 531–544. Battye, T.G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H.R., and Leslie, A.G. (2011). iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing Mwith MOSFLM. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 67, 271–281. Berger Rentsch, M., and Zimmer, G. (2011). A vesicular stomatitis virus replicon- based bioassay for the rapid and sensitive determination of multi-species type I interferon. PLoS ONE 6, e25858. Bosch, B.J., van der Zee, R., de Haan, C.A., and Rottier, P.J. (2003). The coronavirus spike protein is a class I virus fusion protein: structural and functional characterization of the fusion core complex. J. Virol. 77, 8801–8811. Chan, J.F., Yuan, S., Kok, K.H., To, K.K., Chu, H., Yang, J., Xing, F., Liu, J., Yip, C.C., Poon, R.W., et al. (2020). A familial cluster of pneumonia associated with the 2019 novel coronavirus indicating person-to-person transmission: a study of a family cluster. Lancet 395, 514–523. Chen, Z., Bao, L., Chen, C., Zou, T., Xue, Y., Li, F., Lv, Q., Gu, S., Gao, X., Cui, S., et al. (2017). Human Neutralizing Monoclonal Antibody Inhibition of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus Replication in the Common Marmoset. J. Infect. Dis. 215, 1807–1815. Croll, T.I. (2018). ISOLDE: a physically realistic environment for model building into low-resolution electron-density maps. Acta Crystallogr. D Struct. Biol. 74, 519–530. De Vlieger, D., Ballegeer, M., Rossey, I., Schepens, B., and Saelens, X. (2018). Single-Domain Antibodies and Their Formatting to Combat Viral Infections. Antibodies (Basel) 8, 1. Detalle, L., Stohr, T., Palomo, C., Piedra, P.A., Gilbert, B.E., Mas, V., Millar, A., Power, U.F., Stortelers, C., Allosery, K., et al. (2015). Generation and Characterization of ALX-0171, a Potent Novel Therapeutic Nanobody for the Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection. Antimicrob. Agents Chemother. 60, 6–13. Dumoulin, M., Conrath, K., Van Meirhaeghe, A., Meersman, F., Heremans, K., Frenken, L.G., Muyldermans, S., Wyns, L., and Matagne, A. (2002). Singledomain antibody fragments with high conformational stability. Protein Sci. 11, 500–515. Emsley, P., and Cowtan, K. (2004). Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 2126–2132. Evans, P.R., and Murshudov, G.N. (2013). How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 69, 1204–1214. Forsman, A., Beirnaert, E., Aasa-Chapman, M.M., Hoorelbeke, B., Hijazi, K., Koh, W., Tack, V., Szynol, A., Kelly, C., McKnight, A., et al. (2008). Llama antibody fragments with cross-subtype human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-neutralizing properties and high affinity for HIV-1 gp120. J. Virol. 82, 12069–12081. Gaunt, E.R., Hardie, A., Claas, E.C., Simmonds, P., and Templeton, K.E. (2010). Epidemiology and clinical presentations of the four human coronaviruses 229E, HKU1, NL63, and OC43 detected over 3 years using a novel multiplex real-time PCR method. J. Clin. Microbiol. 48, 2940–2947. Ge, X.Y., Li, J.L., Yang, X.L., Chmura, A.A., Zhu, G., Epstein, J.H., Mazet, J.K., Hu, B., Zhang, W., Peng, C., et al. (2013). Isolation and characterizationof a bat SARS-like coronavirus that uses the ACE2 receptor. Nature 503, 535–538 Goddard, T.D., Huang, C.C., Meng, E.C., Pettersen, E.F., Couch, G.S., Morris, J.H., and Ferrin, T.E. (2018). UCSF ChimeraX: Meeting modern challenges in visualization and analysis. Protein Sci. 27, 14–25. Govaert, J., Pellis, M., Deschacht, N., Vincke, C., Conrath, K., Muyldermans, S., and Saerens, D. (2012). Dual beneficial effect of interloop disulfide bond for single domain antibody fragments. J. Biol. Chem. 287, 1970–1979. Gui, M., Song, W., Zhou, H., Xu, J., Chen, S., Xiang, Y., and Wang, X. (2017). Cryo-electron microscopy structures of the SARS-CoV spike glycoprotein reveal a prerequisite conformational state for receptor binding. Cell Res. 27, 119–129. Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, E.B., Bendahman, N., and Hamers, R. (1993). Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature 363, 446–448. Hoffmann, M., Kleine-Weber, H., Kru¨ ger, N., Mu¨ ller, M., Drosten, C., and Po¨ hlmann, S. (2020). The novel coronavirus 2019 (2019-nCoV) uses the SARS-coronavirus receptor ACE2 and the cellular protease TMPRSS2 for entry into target cells. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/2020.01.31.929042.