ĐỀ TÀI:

Sản xuất chế phẩm Trichoderma, Bacillus dùng kiểm soát sinh học Fusarium sp. và Pythium sp. và kích thích sinh trưởng ở cây đậu.

NHÓM 7

BÀI BÁO CÁO VI SINH ỨNG DỤNG

Tổng QuanBacillus.Là vi khuẩn hình que, Gram dương, có khả năng chuyển động.Phần lớn có lợi cho con người.Hiếu khí hoặc kị khí tùy nghiHình thành nội bào tử.Nhiệt độ tối ưu: 30 - 45 độ.pH: 2- 11Có khả năng gây bệnh cho côn trùng.

Trichoderma:Thuộc nghành nấm Mycota.Hiện diện nhiều trong đất.pH: 4- 8, hiếu khí.Sinh sản vô tính bằng bào tử, một số sinh sản hữu

tính.Tiêu diệt, khống chế, ngăn ngừa các loại nấm bệnh:

Fusarium, Pythium...Tạo điều kiện tốt cho vi sinh vật cố định đạm.kích thích tăng trưởng và phục hồi bộ rễ cây trồng.Phân giải tốt các chất xơ , chitin, lignin... giúp cho

cây hấp thụ dễ dàng.

Nấm Fusarium sp.

Là một trong những loại nấm gây hại nhiều nhất cho cây trồng.Sinh độc tố có tính độc cao.phổ biến trong đất, lưu tồn dạng bào tử hoặc khuẩn ty.Gây bệnh ngẽn mạch, thối rễ thối thân, thối hạt, trái.Tấn công vào bộ rễ. gây hại cho đậu, cà chua, cam quýt, khoai tây.

Pythium sp.

Là một vsv giống với nấm.Phổ ký chủ rộng.Sinh sản vô tính bằng bào tử động.Gây tàn lụi và chết rạp ở cây con( do ẩm

ướt).Gây thối củ ( khoai tây, cà rốt..).Gây thối củ và quả : là một bệnh chủ yếu ở

Lạc.

Nguyên tắc phân lập:

- Gieo cấy vi khuẩn đã pha loãng trên môi trường dinh dưỡng đặc trưng (2% thạch hay còn gọi là agar).

- Nuôi dưỡng trong điều kiện thích hợp cho mọc các khuẩn lạc tách biệt nhau.

- Cấy tách từ khuẩn lạc mọc tách biệt sang ống môi trường dinh dưỡng thạch nghiêng để thu nhận chủng vi khuẩn thuần khiết (do Robert Koch đề ra).

PHÂN LẬP

PHÂN LẬP BACILLUS

1. Mẫu:Nốt sần đậu phộng có kích thước lớn, có màu đỏ hống.Rửa sạch, ngâm cồn 5 phút, rửa nước, nghiền nát bằng kim mũi mác, bổ sung thêm 3ml nước cất ta thu được dung dịch chứa vi khuẩn trên.Đất: lấy đất gần tầng mặt, không lấy ở phần đất sâu. 2. Pha loãng mẫu:Cân 10g đất nghiền trong cối sứ (đã sấy tiệt trùng) hòa với 90ml nước muối sinh lý chứa sẵn trong bình tam giác 200ml vô trùng.Lắc đều trên máy lắc tốc độ 150v/p trong 30 phút.

Đun sôi cách thủy 15 phút thu được huyền dịch 10-1, Lắc đều huyền dịch rồi dùng micropipet hút vô trùng 1ml huyền dịch vào ống nghiệm chứa sẵn 90ml nước muối sinh lý đã tiệt trùng để được độ pha loãng 10-2, tương tự thu được các nồng độ 10-3, 10-4,…

3.Cấy phân lập:Cấy trang các dung dịch thu được trên thạch đĩa NA nuôi trong tủ ấm ở 370C trong 24h. Chọn khuẩn lạc nghi ngờ tiến hành nhuộm Gram và thử các phản ứng sinh hóa. 4. Xác định vi khuẩn Bacillus Đem khuẩn lạc nghi ngờ đi nhuộm Gram và xem dưới kính hiển vi.Nếu thấy có đặc điểm của Bacillus thì cấy truyền khuẩn lạc nghi ngờ vào môi trường thạch nghiêng NA để giữ giống thử test sinh hóa tiếp theo.Giám định đặc tính sinh hóa: catalaza (+), nitrate (+), VP (+), citrate (+), methyred (+), maltose (-).

PHÂN LẬP TRICHODERMA

1. Mẫu: Đất: lấy từ các ruộng trồng đậu.Làm mịn đất qua rây 1mm.

2. Pha loãng mẫu:Cân 1g đất mịn hòa vào 100ml nước sinh lý có 0,5% tween 80.

Đặt lên máy lắc trong 30 phút với tốc độ 110v/p.

Hòa loãng ở các nồng độ khác nhau.

3. Phân lập mẫu:

Đem các dung dịch được pha loãng ở các nồng độ khác nhau cấy trên mội trường thạch.

Phân lập các khuẩn lạc điển hình của Trichoderma, làm thuần các dòng Trichoderma.

4. Thử ảnh hưởng độc tố trên cây trồng:

Tẩm hạt và phun lên cây, khi thấy không có ảnh hưởng xấu với cây mới, thực hiện các thí nghiệm tiếp theo như định danh, xác định khả năng ức chế phát triển các vi sinh vật gây bệnh cây.

ĐỊNH TÍNH

Các bước thực hiện:Chuẩn bị dịch khuẩn: Vi khuẩn được hòa vào nước muối sinh lý nồng độ 0,85% để có mật độ khoảng: 1-2.108 CFU/ml).Chuẩn bị dịch nấm (Fusarium sp, Pythium sp, Trichoderma): Nấm mốc được pha trong nước muối sinh lý 0,85% để có mật độ 1 - 2.106 tb/ml (đếm bằng buồng đếm hồng cầu).

Môi trường thử định tính: NA 37oC/24h.Nấm gây bệnh được hoạt hóa trên môi

trường PDA (Potato dextrose agra) 37oC/3 ngày (ống thạch nghiêng).

1. Thử khả năng đối kháng nấm gây bệnh của các chủng Bacillus.Nhằmchọn ra chủng có hoạt tính mạnh nhất. Tiến hành thử nghiệm đối kháng:Hút 10µl dịch nấm (Fusarium sp và Pythium sp) và dịch khuẩn (Bacillus) cấy đối xứng nhau qua đường kính đĩa môi trường PGA.Khoảng cách giữa chúng là 3cm.Tiến hành lập lại thí nghiệm nhiều lần để cho kết quả chính xác.

Sau khi cấy: Ủ ở 37oC trong 3 ngày.Đánh giá kết quả: xem chủng Bacillus

nào kháng nấm mạnh nhất, chọn chủng Bacillus đó.

2. Thử khả năng kháng nấm của Trichoderma.

Môi trường thử đối kháng: SA( Sabouraud agar).

Nấm gây bệnh cũng được nuôi trên môi trường thích hợp để chúng phát triển tốt.

Tiến hành thử nghiệm đối kháng:Hút 10µl dịch nấm Trichoderma và 10µl dịch nấm gây bệnh (Fusarium sp. và Pythium sp.) cấy đối xứng nhau qua đường kính đĩa, cách mép đĩa petri 1-1.5cm.Tiến hành lập lại thí nghiệm nhiều lần.Thí nghiệm được quan sát 2 ngày 1 lần, sau 3 ngày tiến hành chọn lọc các chủng kháng bệnh mạnh nhất.

Trichoderma kháng Fusaryum sp.

a. Đánh giá khả năng kháng nấm:

•Phần nấm Trichoderma phát triển bao phủ qua phần nấm gây hại.

•Phần nấm gây hại bị bào mòn dần ở mép khuẩn lạc.

•Phần nấm Trichoderma phát triển và khống chế làm cho nấm gây hại không phát triển được.

b. Đánh giá mức đối kháng của nấm:•Kháng mạnh: Nấm Trichoderma tấn công và phá hủy hoàn toàn nấm gây hại, kí hiệu: +++

•Kháng trung bình: Nấm Trichoderma tấn công và phá hủy một phần nấm gây hại, kí hiệu: ++

•Kháng yếu: Nấm Trichoderma ngăn chặn sự phát triển của nấm gây hại, kí hiệu: +

•Không kháng: nấm gây hại gần như phát triển bình thường, xâm nhập vào vùng phát triển của nấm, kí hiệu: Chọn chủng Trichoderma kháng nấm mạnh nhất.

3. Thử khả năng kết hợp của nấm Trichoderma với chủng Bacillus đã được chọn qua định tính.

•Từ chủng nấm Trichoderma và chủng Bacillus đã được chọn ra sau khi định tính ta tiến hành thử khả năng kết hợp giữa chúng.•Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: PGA.•Trichoderma và Bacillus được cấy đối xứng nhau qua đường kính đĩa petri, khoảng cách giữa chúng là 3cm .•Quan sát khả năng kết hợp giữa chúng:Trichoderma và Bacillus cùng mọc được trên cùng môi trường: không ức chế lẫn nhau.Trichoderma mọc lấn ác Bacillus hoặc ngược lại.Ức chế lẫn nhau.•Chọn ra chủng nấm Trichoderma và chủng Bacillus có khả năng kết hợp nhau tốt nhất.

ĐỊNH LƯỢNG

Khảo sát phần trăm ức chế:

Công thức tính phần trăm ức chế:

Đường kính đĩa đối chứng - Đường kính đĩa cấy x 100%

Đường kính đĩa đối chứng

Nếu % ức chế càng lớn thì khả năng ức chế của Trichoderma và Bacillus càng mạnh. Người ta sẽ chọn những nấm có % ức chế lớn nhất đem thử nghiệm Invivo.

III. THỬ NGHIỆM INVIVO Bước 1: Chuẩn bị. Vi khuẩn và nấm: Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường Mật rỉ. Đo OD Lựa chọn mật độ 1 - 2.108 CFU/ml. Nấm tăng sinh trong môi trường cám, mạt cưa, sau đó đem pha với nước muối sinh lý 0,85% để đạt mật độ 1 - 2.106 tb/ml. Đất đã khử trùng.

Bước 2: Thử nghiệm.

Phương pháp thực hiện thử nghiệm Invivo.

Số nghiệm thức: Thực hiện 15 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần (tổng cộng có 45 nghiệm thức).

Pythium sp Fusarium sp Pythium sp + Fusarium sp

Không cấy Không cấy Không cấy

Cấy Trichoderma Cấy trichoderma Cấy Trichoderma

Cấy cùng lúc Ttrichoderma và Bacillus

Cấy cùng lúc Ttrichoderma và Bacillus

Cấy cùng lúc Ttrichoderma và Bacillus

Cấy Trichoderma trước, Bacillus sau.

Cấy Trichoderma trước, Bacillus sau.

Cấy Trichoderma trước, Bacillus sau.

Cấy Bacillus Cấy Bacillus Cấy Bacillus

Bảng: Các lô thí nghiệm

Phương pháp trồng thử nghiệm:• Mỗi chậu cho vào 1kg đất (đã vô trùng), trộn đều với dịch khoáng.• Bổ sung nấm, vi khuẩn vào chậu (2ml) như các lô thí nghiệm.• Trồng ở mỗi chậu 10 hạt đậu, quan sát tỉ lệ nảy mầm (đếm hạt nảy mầm) và mức độ cố định đạm (số nốt sần).• Đánh giá kết quả thử nghiệm: đánh giá mức độ kháng Fusaium sp. và Pythium sp. dựa vào số hạt tỉ lệ hạt nảy mầm và số nốt sần trên rễ cây.

LÊN MEN

CÁC BƯỚC LÊN MEN

Bước 1: Thiết lập môi trường dùng trong tăng sinh giống sản xuất.

Sử dụng phương pháp lên men bề mặt( lên men nổi)

MÔI TRƯỜNG LÊN MEN TỐI ƯU HÓA CHO TRICHODESMA

Tạo môi trường hiếu khí.Tạo môi trường có pH 2-6( pH thích hợp cho nấm Trichoderma tiết ra Enzyme).Môi trường có độ ẩm cao.pH thích hợp để hình thành bào tử là 5-5,8 tùy từng mức pH mà cho các loại bào tử khác nhauNhiệt độ tối ưu là 25-300CNhiệt độ thích hợp tiết Chitinase là 400C, Glucanase ở 350C.Nguồn cacbon chủ yếu là D-glucose, D-galatose, D-mantose, D-fructose.

MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU HÓA BACILLUS

Sử dụng phương pháp lêm men chìm( Lên men bề sâu)Nhiệt độ tối ưu : 550CPH tối ưu: 7-8.Môi trường hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi.

Bước 2: Thanh trùng môi trường, nồi lên men và các thiết bị kèm theo.

Bước 3: Nhân sinh khối đủ lớn, mạnh và thuần để cung cấp cho các bồn lên men trong quá trình sản xuất.

Bước 4: Cung cấp các điều kiện tối ưu cho sự phát triển của giống để giống sản sinh sản phẩm.

QUÁ TRÌNH XỬ LÍ SAU LÊN MEN

• Bao gồm: Tách chiết và tinh chế sản phẩm thành dạng thích hợp cho mục đích nhất định.

• Các loại sản phẩm: Toàn bộ tế bào, Vaccine, Protein trị liệu, Kháng thể đơn dòng..Các sản phẩm khác nhau đáng kể về kích thước phân tử, thành phần hóa học, yêu cầu về độ tinh sạch...

• Cần các phương pháp khác nhau để thu hồi và tinh sạch.

• Bước 7: Sấy cả 2 sản phẩm ở: 180oC/30 phút, sau đó phối trộn 2 sản phẩm Trichoderma Và Bacillus lại với nhau.

• Bước 8: Xử lý những chất thải tạo ra trong qui trình.

Điều kiện bảo quản chế phẩm

Khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm( thường là 6 tháng đối với 2 chủng trên).

Với điều kiện nhiệt độ 25 - 30oC (bao bì tốt, nơi thoáng mát).

Bào tử( của Bacillus) bền nhiệt (8000C) và sản phẩm được bào chế dưới dạng bào tử tinh khiết 100% (>99,99%)

Sản phẩm chứa bào tử có thể bảo quản vô thời hạn ở nhiệt độ phòng trong điều kiện đóng gói kín hoàn toàn.

• Điều này không thể có được ở sản phẩm probiotic của sinh vật không có khả năng tạo bào tử, ví dụ như các Lactobacillus đang sử dụng khá phổ biến hiện nay.

• Tìm hiểu trên thị trường xem đã có sản phẩm nào tương tự không nếu chưa có sản phẩm nào tương tự thì ta đăng ký bản quyền cho sản phẩm.

• Nếu Sản phẩm sản xuất ra được chứng nhận bản quyền thì chúng ta sẽ đưa vào sản xuất công nghiệp với quy mô lớn để bán trên thị trường.