BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi dan Farmakologi

Fakultas Kedokteran Hewan Kampus Dramaga Institut Pertanian Bogor selama 6

bulan mulai dari bulan Desember 2008 sampai bulan Mei 2009

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah

1 Hewan coba

Hewan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih jantan

(Rattus norvegicus L) strain Sprague-Dawley berumur delapan minggu dengan

berat badan plusmn 200 gr berasal dari bagian hewan percobaan FKH-IPB

2 Rokok

Rokok yang digunakan adalah rokok kretek (Gudang garam) dengan

kandungan seperti yang terlihat dalam tabel 2

Tabel 2 Kandungan asap rokok kretek gudang garam menurut Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional Jakarta

Jenis Rokok Kandungan (mgbatang)

Nikotin CO Tar Eugenol Gudang Garam

Merah 276 1666 4577 1470

Penetapan dosis ini ditentukan dengan melakukan percobaan pada 15

ekor tikus jantan yang dibagi menjadi tiga kelompok pemberian dosis yaitu

delapan batang rokok per enam puluh menithari enam batang rokok per enam

puluh menithari dan empat batang rokok per enam puluh menithari

pemberian dilakukan selama enam minggu (tiga puluh hari) Hewan yang mati

setiap hari dicatat sebagai tolak ukur untuk menentukan LD50 Hasil percobaan

tersaji pada (Tabel 3) Pada percobaan ini kematian tikus terjadi pada

kelompok perlakuan pemaparan delapan dan enam batang rokok Kematian

terjadi pada minggu kedua ketiga dan keempat pada dosis delapan batang

rokok dan dosis enam batang rokok terjadi pada minggu ketiga keempat dan

19

kelima Untuk dosis empat batang rokok per enam puluh menit tidak terjadi

kematian Dari hasil tersebut diatas ditetapkan bahwa pemberian empat batang

rokok per enam puluh menit aman Sehingga dosis pemaparan yang dipakai

untuk penelitian selanjutnya adalah empat batang rokok per enam puluh

menithari

Tabel 3 Jumlah tikus yang mati pada percobaan pendahuluan penentuan dosis pemaparan asap rokok

Kelompok Pemaparan Letalitas minggu ke-

0 1 2 3 4 5 6

Rokok

8 batang60 menithari

6 batang60 menithari

4 batang60 menithari

05 05 15 35 45 45 45

05 05 05 25 35 45 45

05 05 05 05 05 05 05

Letalitas Jumlah hewan yang matijumlah hewan uji

3 Vitamin C

Penetapan dosis ditentukan dengan melakukan percobaan pada lima belas

ekor tikus jantan yang dibagi menjadi tiga kelompok pemberian dosis yang

biasa digunakan oleh manusia Adapun dosis tersebut adalah 1500 mgkg

bbhari 3000 mgkg bbhari dan 4500 mgkg bbhari pemberian selama enam

minggu Sehingga konversi dosis vitamin C yang diberikan untuk tikus

mengikuti tabel 3 diatas Nilai konversi dosis diperoleh dengan rumus Berat

badan tikus (gr) berat badan manusia (gr) x dosis vitamin C yang diberikan

(Hariyatmi 2004)

Tabel 4 Nilai konversi berat badan manusia ke berat badan tikus

Dosis Manusia Dosis Tikus

1500 mgkgbbhari

3000 mgkgbbhari

4500 mgkgbbhari

427 mgkgbbhari

857 mgkgbbhari

1285 mgkgbbhari

Hasil yang didapatkan adalah jumlah hewan yang mati setiap hari dicatat

sebagai tolak ukur untuk menentukan LD50 (Tabel 4) Pada percobaan ini tikus

20

yang mati adalah tikus yang diberi vitamin C dengan dosis 4500 mgkg

bbhari untuk manusia atau 1285 mgkg bbhari untuk tikus Kematian tikus

tersebut terjadi pada minggu ketiga dan keempat dengan feases berbentuk

cairan Dengan demikian dosis yang dianggap aman untuk digunakan pada

penelitian ini adalah dosis 3000 mgkg bbhari untuk manusia atau 857 mgkg

bbhari untuk tikus

Tabel 5 Jumlah tikus yang mati pada percobaan penentuan dosis vitamin C

Kelompok tikus Letalitas minggu ke-

0 1 2 3 4 5 6

Kontrol

VitC 427 mgkgbbhari

857 mgkgbbhari

1285 mgkgbbhari

05 05 05 05 05 05 05

05 05 05 05 05 05 05

05 05 05 05 05 05 05

05 05 05 15 35 35 35

Letalitas Jumlah hewan yang matijumlah hewan uji

4 Bahan yang digunakan untuk analisis enzim SOD dan MDA adalah SOD

murni (Sigma USA) larutan cytochrom c (Sigma USA) larutan xantin

(Sigma USA) larutan xantin oksidase (Sigma USA) TBA BHT dan bahan-

bahan kimia lainnya seperti buffer potasium fosfat aquades dan

khloroformetanol serta bahan untuk mengukur hematologi seperti larutan

hayem larutan turk dan reagen drabkins

Alat utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah

Smoking chamber (Gambar 3) Smoking chamber merupakan alat untuk

memaparkan asap rokok pada hewan coba Alat ini dirancang khusus dalam

penelitian ini yang terbuat dari plastik dengan ukuran 385x285x225 cm yang

dilengkapi dengan ventilasi dua buah air pump dua buah pipa plastik tabung

kecil berbentuk gelas tabung oksigen dan tempat pembakaran rokok

d d

21

g c a

b

de f

A

CE

G

B

F

D

Gambar 3 Skema dan seperangkat Smoking chamber

Keterangan gambar

a Kotak plastik dengan ukuran 385x285x225 tempat tikus selama proses

pemaparan asap rokok

b Pipa plastik untuk mengalirkan asap rokok dari pembakaran rokok ke

chamber

c Tempat pembakaran rokok

d Pipa plastik untuk mengalirkan udara ke tempat pembakaran rokok

e air pump sebagai alat pemompa udara

f Pipa plastik untuk mengalirkan oksigen dari tabung oksigen ke chamber

g Tabung oksigen

Mekanisme kerja dari alat ini adalah rokok dibakar setelah itu ditempatkan

pada tempat pembakaran (c) secara terbalik dimana batang rokok yang dibakar

menghadap ke bawah dan batang rokok yang tidak terbakar menghadap ke atas

dan ditempatkan tepat pada pipa plastik (b) yang terhubung langsung dengan

Chamber kemudian dengan menggunakan air pump (e) untuk mengalirkan udara

agar terjadi pembakaran rokok dan mendorong asap rokok masuk ke dalam

chamber (a) melalui pipa plastik yang dihubungkan dengan chamber (b) Pada

saat asap rokok masuk ke dalam chamber oksigen dialirkan dari tabung oksigen

melalui pipa plastik yang dihubungkan dengan chamber (g) dengan tekanan 05

atmosfer Bila satu batang rokok telah habis terbakar dilanjutkan dengan rokok

kedua hingga semua rokok habis terbakar

Peralatan lain yang juga digunakan dalm penelitian ini adalah sonde

spektrofotometer digital double beam (Hitachi U-2001) jarum suntik

22

hemasitometer mikroskop seperangkat alat bedah lumpang kecil sentrifuse

inkubator dan hematokrit reader

Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap yaitu tahap persiapan hewan

coba tahap perlakuan dan tahap analisis

1 Tahap Persiapan

Dua puluh lima ekor tikus yang telah diadaptasikan selama satu minggu

ditempatkan pada kandang individual berukuran 34 x 25 x 12 cm yang beralas

sekam padi dengan penutup kawat ram (Gambar 3) Tikus diberi makan dan

minum ad libitum yang ditempatkan pada ruangan khusus dengan suhu 20-25

degC Penggantian sekam dan pencucian kandang dilakukan dua hari sekali setiap

pagi untuk setiap kandang Hal ini dilakukan agar tikus selalu dalam kondisi

bersih

Gambar 4 Lingkungan kandang tikus 2 Tahap perlakuan

Setelah masa adaptasi tikus tersebut dibagi menjadi lima kelompok yang

terdiri dari lima ekor Adapun kelompok tersebut adalah

1 P0 merupakan kelompok kontrol kelompok yang tidak dipapar rokok

dan tidak diberi vitamin C

2 P1 merupakan kelompok yang diberi vitamin C dan tidak dipapar asap

rokok

3 P2 merupakan kelompok yang dipapar asap rokok dan tidak diberi

vitamin C

4 P3 merupakan kelompok yang dipapar asap rokok dan diberi vitamin C

secara bersamaan

23

5 P4 merupakan kelompok yang dipapar asap rokok dan diberi vitamin C

secara tidak bersamaan

Setelah dibagi dalam lima kelompok perlakuan tikus-tikus tersebut

diberi perlakuan sesuai dengan rancangan yaitu

a Proses pemaparan

Proses pemaparan dilakukan dalam smoking chamber Tikus dalam

kandang individu dipindahkan ke dalam smoking chamber katup oksigen

dibuka dengan tekanan 05 atmosfer kemudian rokok dipasangkan pada

pipa yang dihubungkan dengan pompa selanjutnya rokok dibakar dan

pompa dinyalakan Biarkan asap rokok masuk kedalam chamber hingga

asap tersebut habis terhirup Pemberian dosis asap rokok adalah satu batang

rokok per lima belas menit selama enam puluh menit Pemaparan dilakukan

setiap pagi mulai dari pukul 0700 sampai 0800 untuk satu kelompok

pemaparan selama tiga puluh hari Perlakuan ini diberikan pada semua

kelompok perlakuan kecuali kelompok kontrol (P0) dan kelompok

perlakuan vitamin C (P1) Proses pemaparan terlihat pada (Gambar 4)

(a) (b) (c)

Gambar 5 Proses pemaparan dari awal hingga akhir (a Awal pemaparan) (b Selama pemaparan) (c Akhir pemaparan)

b Proses pemberian vitamin C

Proses pemberian vitamin C dengan cara pencekokan dengan

menggunakan sonde Vitamin C tersebut dilarutkan dalam 1 ml aquades

Dosis pemberian vitamin C adalah sebanyak 857 mgkg bbhari dan

diberikan setiap pagi pada jam sembilan untuk kelompok perlakuan P1 satu

24

jam setelah pemaparan untuk kelompok perlakuan P3 dan tiga puluh hari

setelah pemaparan asap rokok untuk kelompok perlakuan P4 Proses

pemberian vitamin C terlihat pada (Gambar 5)

Gambar 6 Pemberian vitamin C secara oral

Diagram perlakuan proses pemaparan asap rokok pemberian vitamin C

dan waktu pengambilan sampel tertuang pada (Gambar 6)

Hari Penelitian Perlakuan

1 30 31 60 61

P0

P1

Ket

P2

P3

P4

Gambar 7 Proses pemaparan asap rokok pemberian vitamin C dan waktu pengambilan sampel

Pemberian vitamin C

Hari pengambilan sampel

Pemaparan asap rokok

3 Tahap Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel dilakukan pada hari sesuai yang telah ditetapkan

pada gambar Ada pun parameter yang diukur adalah

1 Kinerja atau aktivitas antioksidan dari vitamin C yang meliputi

a Kadar malondialdehida (MDA)

b Aktivitas enzim superoksida dismutase (SOD)

25

2 Hematologi (gambaran darah) yang meliputi

a Jumlah butir darah merah (BDM)

b Jumlah butir darah putih (BDP)

c Jumlah hemoglobin (Hb)

d Jumlah hematokrit (PCV)

Pada akhir percobaan tikus dikorbankan dengan menggunakan eter

kemudian darahnya diambil secara intrakardial sebanyak 2 ml untuk

pemeriksaan gambaran darah (hematologi) Pembedahan segera dilakukan

untuk mengambil organ hati dan ginjal selanjutnya hati dan ginjal dicuci

dengan garam fisiologis 01 kemudian dibagi menjadi dua bagian Satu

bagian ditimbang dengan berat organ 06 gr lalu dibungkus dengan

aluminium foil dan disimpan difreezer pada suhu -20 degC yang nantinya

digunakan untuk analisis MDA Dan satu bagiannya lagi ditimbang dengan

berat organ 05 gr lalu digerus dengan menggunakan tumbukan dan lumpang

kemudian ditambahkan larutan buffer fosfat 1 ml lalu disentrifuse dengan

kecepatan 10000 rpm selama 20 menit diambil lisatnya lalu disimpan pada

suhu -20deg C dan siap dianalisi enzim SODnya

4 Tahapan Analisis

a Pengukuran kadar MDA (Malondialdehida) Hati dan Ginjal Tikus

(Conti dan Sutherland 1991)

1 Persiapan larutan standar

Larutan kerja 10 μM dibuat dengan mengencerkan stok standar 25

mM 1133 tetraetoksipropana (TEP) Kurva standar dibuat dengan

mengencerkan larutan standar hingga menghasilkan beberapa konsentrasi

yaitu 500 1000 2000 2500 3000 4000 dan 5000 pmol50microL (Lampiran

17)

2 Pengukuran Kadar MDA

Prinsip ini berdasarkan pada kemampuan pembentukan kompleks

berwarna merah muda antara MDA dan asam tiobarbiurat (TBA) Hati dan

ginjal yang telah disimpan dalam freezer -20ordmC dicairkan terlebih dahulu

sebelum dianalisis pada suhu ruang Hati dan ginjal digerus dengan

26

menggunakan lumpang (digerus dalam keadaan dingin) dengan

ditambahkan 125 ml buffer fosfat yang mengandung 115 gL kalium

klorida dalam kondisi dingin pH 74 (disimpan pada suhu 5ordmC) Campuran

ini disentrifuse 4000 rpm selama 10 menit diambil supernatan keruh dan

disentrifuse lagi 4000 rpm selama 10 menit sebanyak 1 ml supernatan

jernih diambil dan ditambahkan 1 ml campuran larutan asam klorida dingin

025 N (223 ml asam klorida pekat100 ml) yang mengandung 15 asam

trikloroasetat (wv)038 asam tiobarbiurat dan 05 butilat

hidroksitoluen) Campuran larutan asam klorida dan supernatan tersebut

dipanaskan 80ordmC (inkubator) selama 1 jam selanjutnya didinginkan dengan

air mengalir dan disentrifuse 3500 rpm selama 10 menit Supernatan hasil

sentifuse tersebut kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang

532 nm

MDA (μmolg protein)= A(μmolg) x 375 ml06 g (bb)

A= Kadar MDA yang diperoleh dari persamaan regresi kurva

standar

b Pengukuran aktivitas enzim SOD (Superoksida dismutase) Hati tikus

(Chen et al 1996)

1 Persiapan Larutan Standar

Larutan standar dibuat dengan melarutkan SOD (Sigma USA) murni

sehingga menghasilkan beberapa konsentrasi larutan yaitu 0 50 100 200

250 300 dan 500 unitml H2O dan larutan ini digunakan untuk membuat

kurva standar (Lampiran 18)

2 Pengukuran Aktivitas SOD

Pengukuran aktivitas enzim SOD (Superoksida dismutase)

ditentukan berdasarkan pengukuran enzim secara tidak langsung dengan

menggunakan spektrofotometer (Gambar 7) Untuk mengukur enzim ini

dipakai sistem xantinxantin (XO) yang menghasilkan anion superoksida

(O2) yang mereduksi ferrisitokrom c

Aktivitas enzim SOD diukur berdasarkan laju penghambatan

reduksi ferrisitokrom c oleh anion superoksida yang dihasilkan oleh

xantinxantin oksidase Oksidasi xantin menghasilkan asam urat dan anion

27

superoksida yang selanjutnya mereduksi ferrisitokrom c Reduksi

ferrisitokrom c diamati berdasarkan kenaikan absorbansi pada panjang

gelombang 550 nm

Reaksinya

Xantin + O2 XO O2˙ + asam urat

O2 + sitokrom c (Fe3+) O2 + sitokrom c

2O2 + 2H+ SOD H2O2 + O2

Gambar 8 Spectrofotometer digital double beam (Hitachi U-2001)

Pengukuran aktivitas enzim ini berlangsung pada suhu 25 ordmC larutan

oksidase harus tetap dalam keadaan dingin (didinginkan selama 15 menit)

sebelum digunakan Medium reaksi segera dipersiapkan sebelum

pengukuran dengan memasukan 29 ml larutan A (campuran larutan xantin

dan larutan sitokrom c) ke dalam tabung reaksi 3 ml Selanjutnya

ditambahkan 50 μl larutan baku (kontrol) atau sampellisat lalu divorteks

secara perlahan Reaksi dimulai dengan larutan B (xantin oksidase) dan

divorteks secara perlahan Kemudian diamati perubahan absorbansi yang

terjadi pada spektrofotometer Untuk blanko digunakan buffer fosfat

sebagai pengganti sampel dan sebagai kontrol digunakan air destilasi

Untuk mengambalikan ke konsentrasi awal yaitu dalam (gr) maka

dikonversi dengan rumus

SOD (Ug) = A (microml) x 06705 g (bb)

A= Aktivitas SOD yang diperoleh dari persamaan regresi kurva

standar

28

c Pengukuran Hematologi

a Pengukuran jumlah butir darah merah dengan metode Cuonting chamber-

burker dan neubauer

Darah diambil dengan menggunakan pipet eritrosit yang telah

dihubungkan dengan aspirometer sampai menunjukkan angka 05

kemudian ditambahkan larutan Hayem sampai menunjukkan angka 101 lalu

dikocok dengan gerakan seperti angka delapan setelah itu sebagian cairan

pada ujung pipet dibuang dan sebagian larutan diteteskan ke dalam kamar

hitung kemudian hitung butir darah merah pada kotak R

b Pengukuran jumlah butir darah putih dengan metode Cuonting chamber-

burker dan neubauer

Untuk mengukur butir darah putih prosedur kerjanya sama dengan

mengukur butir darah merah yang berbeda hanyalah pada larutan yaitu

menggunakan larutan turk sebagai pengencer dan aspirometer menunjukkan

angka 11 serta menghitungnya pada kotak W

c Pengukuran jumlah Hb dengan metode Cyan-methemoglobin

Untuk mengukur hemoglobin digunakan reagen drabkins Reagen

drabkins dipipet sebanyak 50 ml dan masukkan kedalam tabung reaksi 1 dan

2 kemudian ditambahkan 002 ml darah ke tabung reaksi ke 2 dengan

menggunakan pipet sahli atau pipet lain yang bervolume 002 ml lalu

dicampur dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar agar terbentuk

sianmethemoglobin lalu dibaca transmittannya dengan spektrofotometer λ

540 nm

d Pengukuran jumlah hematokrit dengan metode Microhematokrit

Darah diambil dengan menggunakan mikrokapiler yang ujung

disumbat dengan crestaseal kemudian disentrifuse dengan kecepatan 11500

ndash 15000 rpm selama 5 menit Nilai hematokrit ditentukan dengan mengukur

volume eritrosit (lapisan yang berwarna merah) dan dibaca dengan

hematokrit reader

29

Analisis Data

Rancangan percobaan yang digunakan dalam penentuan kadar

malondialdehida (MDA) aktivitas enzim superoksida dismutase (SOD) jumlah

butir darah merah jumlah butir darah putih jumlah hemoglobin dan jumlah

hematokrit adalah rancangan acak lengkap Hasil yang diperoleh akan dianalisis

dengan menggunakan ANOVA dan apabila terdapat perbedaan yang nyata antara

perlakuan maka dilanjutkan dengan uji Duncan

Model persamaan matematik dari percobaan ini adalah sebagai berikut

Yij =μ + Ti +sumij (Mattjik amp Sumertajaya 2006) dimana

I = Banyaknya perlakuan

J = Banyaknya ulangan dari setiap perlakuan

μ = Pengaruh rata-rata pengamatan

Ti = Pengaruh adanya perlakuan ke-I

sum ij= Random error dari percobaan

19

kelima Untuk dosis empat batang rokok per enam puluh menit tidak terjadi

kematian Dari hasil tersebut diatas ditetapkan bahwa pemberian empat batang

rokok per enam puluh menit aman Sehingga dosis pemaparan yang dipakai

untuk penelitian selanjutnya adalah empat batang rokok per enam puluh

menithari

Tabel 3 Jumlah tikus yang mati pada percobaan pendahuluan penentuan dosis pemaparan asap rokok

Kelompok Pemaparan Letalitas minggu ke-

0 1 2 3 4 5 6

Rokok

8 batang60 menithari

6 batang60 menithari

4 batang60 menithari

05 05 15 35 45 45 45

05 05 05 25 35 45 45

05 05 05 05 05 05 05

Letalitas Jumlah hewan yang matijumlah hewan uji

3 Vitamin C

Penetapan dosis ditentukan dengan melakukan percobaan pada lima belas

ekor tikus jantan yang dibagi menjadi tiga kelompok pemberian dosis yang

biasa digunakan oleh manusia Adapun dosis tersebut adalah 1500 mgkg

bbhari 3000 mgkg bbhari dan 4500 mgkg bbhari pemberian selama enam

minggu Sehingga konversi dosis vitamin C yang diberikan untuk tikus

mengikuti tabel 3 diatas Nilai konversi dosis diperoleh dengan rumus Berat

badan tikus (gr) berat badan manusia (gr) x dosis vitamin C yang diberikan

(Hariyatmi 2004)

Tabel 4 Nilai konversi berat badan manusia ke berat badan tikus

Dosis Manusia Dosis Tikus

1500 mgkgbbhari

3000 mgkgbbhari

4500 mgkgbbhari

427 mgkgbbhari

857 mgkgbbhari

1285 mgkgbbhari

Hasil yang didapatkan adalah jumlah hewan yang mati setiap hari dicatat

sebagai tolak ukur untuk menentukan LD50 (Tabel 4) Pada percobaan ini tikus

20

yang mati adalah tikus yang diberi vitamin C dengan dosis 4500 mgkg

bbhari untuk manusia atau 1285 mgkg bbhari untuk tikus Kematian tikus

tersebut terjadi pada minggu ketiga dan keempat dengan feases berbentuk

cairan Dengan demikian dosis yang dianggap aman untuk digunakan pada

penelitian ini adalah dosis 3000 mgkg bbhari untuk manusia atau 857 mgkg

bbhari untuk tikus

Tabel 5 Jumlah tikus yang mati pada percobaan penentuan dosis vitamin C

Kelompok tikus Letalitas minggu ke-

0 1 2 3 4 5 6

Kontrol

VitC 427 mgkgbbhari

857 mgkgbbhari

1285 mgkgbbhari

05 05 05 05 05 05 05

05 05 05 05 05 05 05

05 05 05 05 05 05 05

05 05 05 15 35 35 35

Letalitas Jumlah hewan yang matijumlah hewan uji

4 Bahan yang digunakan untuk analisis enzim SOD dan MDA adalah SOD

murni (Sigma USA) larutan cytochrom c (Sigma USA) larutan xantin

(Sigma USA) larutan xantin oksidase (Sigma USA) TBA BHT dan bahan-

bahan kimia lainnya seperti buffer potasium fosfat aquades dan

khloroformetanol serta bahan untuk mengukur hematologi seperti larutan

hayem larutan turk dan reagen drabkins

Alat utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah

Smoking chamber (Gambar 3) Smoking chamber merupakan alat untuk

memaparkan asap rokok pada hewan coba Alat ini dirancang khusus dalam

penelitian ini yang terbuat dari plastik dengan ukuran 385x285x225 cm yang

dilengkapi dengan ventilasi dua buah air pump dua buah pipa plastik tabung

kecil berbentuk gelas tabung oksigen dan tempat pembakaran rokok

d d

21

g c a

b

de f

A

CE

G

B

F

D

Gambar 3 Skema dan seperangkat Smoking chamber

Keterangan gambar

a Kotak plastik dengan ukuran 385x285x225 tempat tikus selama proses

pemaparan asap rokok

b Pipa plastik untuk mengalirkan asap rokok dari pembakaran rokok ke

chamber

c Tempat pembakaran rokok

d Pipa plastik untuk mengalirkan udara ke tempat pembakaran rokok

e air pump sebagai alat pemompa udara

f Pipa plastik untuk mengalirkan oksigen dari tabung oksigen ke chamber

g Tabung oksigen

Mekanisme kerja dari alat ini adalah rokok dibakar setelah itu ditempatkan

pada tempat pembakaran (c) secara terbalik dimana batang rokok yang dibakar

menghadap ke bawah dan batang rokok yang tidak terbakar menghadap ke atas

dan ditempatkan tepat pada pipa plastik (b) yang terhubung langsung dengan

Chamber kemudian dengan menggunakan air pump (e) untuk mengalirkan udara

agar terjadi pembakaran rokok dan mendorong asap rokok masuk ke dalam

chamber (a) melalui pipa plastik yang dihubungkan dengan chamber (b) Pada

saat asap rokok masuk ke dalam chamber oksigen dialirkan dari tabung oksigen

melalui pipa plastik yang dihubungkan dengan chamber (g) dengan tekanan 05

atmosfer Bila satu batang rokok telah habis terbakar dilanjutkan dengan rokok

kedua hingga semua rokok habis terbakar

Peralatan lain yang juga digunakan dalm penelitian ini adalah sonde

spektrofotometer digital double beam (Hitachi U-2001) jarum suntik

22

hemasitometer mikroskop seperangkat alat bedah lumpang kecil sentrifuse

inkubator dan hematokrit reader

Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap yaitu tahap persiapan hewan

coba tahap perlakuan dan tahap analisis

1 Tahap Persiapan

Dua puluh lima ekor tikus yang telah diadaptasikan selama satu minggu

ditempatkan pada kandang individual berukuran 34 x 25 x 12 cm yang beralas

sekam padi dengan penutup kawat ram (Gambar 3) Tikus diberi makan dan

minum ad libitum yang ditempatkan pada ruangan khusus dengan suhu 20-25

degC Penggantian sekam dan pencucian kandang dilakukan dua hari sekali setiap

pagi untuk setiap kandang Hal ini dilakukan agar tikus selalu dalam kondisi

bersih

Gambar 4 Lingkungan kandang tikus 2 Tahap perlakuan

Setelah masa adaptasi tikus tersebut dibagi menjadi lima kelompok yang

terdiri dari lima ekor Adapun kelompok tersebut adalah

1 P0 merupakan kelompok kontrol kelompok yang tidak dipapar rokok

dan tidak diberi vitamin C

2 P1 merupakan kelompok yang diberi vitamin C dan tidak dipapar asap

rokok

3 P2 merupakan kelompok yang dipapar asap rokok dan tidak diberi

vitamin C

4 P3 merupakan kelompok yang dipapar asap rokok dan diberi vitamin C

secara bersamaan

23

5 P4 merupakan kelompok yang dipapar asap rokok dan diberi vitamin C

secara tidak bersamaan

Setelah dibagi dalam lima kelompok perlakuan tikus-tikus tersebut

diberi perlakuan sesuai dengan rancangan yaitu

a Proses pemaparan

Proses pemaparan dilakukan dalam smoking chamber Tikus dalam

kandang individu dipindahkan ke dalam smoking chamber katup oksigen

dibuka dengan tekanan 05 atmosfer kemudian rokok dipasangkan pada

pipa yang dihubungkan dengan pompa selanjutnya rokok dibakar dan

pompa dinyalakan Biarkan asap rokok masuk kedalam chamber hingga

asap tersebut habis terhirup Pemberian dosis asap rokok adalah satu batang

rokok per lima belas menit selama enam puluh menit Pemaparan dilakukan

setiap pagi mulai dari pukul 0700 sampai 0800 untuk satu kelompok

pemaparan selama tiga puluh hari Perlakuan ini diberikan pada semua

kelompok perlakuan kecuali kelompok kontrol (P0) dan kelompok

perlakuan vitamin C (P1) Proses pemaparan terlihat pada (Gambar 4)

(a) (b) (c)

Gambar 5 Proses pemaparan dari awal hingga akhir (a Awal pemaparan) (b Selama pemaparan) (c Akhir pemaparan)

b Proses pemberian vitamin C

Proses pemberian vitamin C dengan cara pencekokan dengan

menggunakan sonde Vitamin C tersebut dilarutkan dalam 1 ml aquades

Dosis pemberian vitamin C adalah sebanyak 857 mgkg bbhari dan

diberikan setiap pagi pada jam sembilan untuk kelompok perlakuan P1 satu

24

jam setelah pemaparan untuk kelompok perlakuan P3 dan tiga puluh hari

setelah pemaparan asap rokok untuk kelompok perlakuan P4 Proses

pemberian vitamin C terlihat pada (Gambar 5)

Gambar 6 Pemberian vitamin C secara oral

Diagram perlakuan proses pemaparan asap rokok pemberian vitamin C

dan waktu pengambilan sampel tertuang pada (Gambar 6)

Hari Penelitian Perlakuan

1 30 31 60 61

P0

P1

Ket

P2

P3

P4

Gambar 7 Proses pemaparan asap rokok pemberian vitamin C dan waktu pengambilan sampel

Pemberian vitamin C

Hari pengambilan sampel

Pemaparan asap rokok

3 Tahap Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel dilakukan pada hari sesuai yang telah ditetapkan

pada gambar Ada pun parameter yang diukur adalah

1 Kinerja atau aktivitas antioksidan dari vitamin C yang meliputi

a Kadar malondialdehida (MDA)

b Aktivitas enzim superoksida dismutase (SOD)

25

2 Hematologi (gambaran darah) yang meliputi

a Jumlah butir darah merah (BDM)

b Jumlah butir darah putih (BDP)

c Jumlah hemoglobin (Hb)

d Jumlah hematokrit (PCV)

Pada akhir percobaan tikus dikorbankan dengan menggunakan eter

kemudian darahnya diambil secara intrakardial sebanyak 2 ml untuk

pemeriksaan gambaran darah (hematologi) Pembedahan segera dilakukan

untuk mengambil organ hati dan ginjal selanjutnya hati dan ginjal dicuci

dengan garam fisiologis 01 kemudian dibagi menjadi dua bagian Satu

bagian ditimbang dengan berat organ 06 gr lalu dibungkus dengan

aluminium foil dan disimpan difreezer pada suhu -20 degC yang nantinya

digunakan untuk analisis MDA Dan satu bagiannya lagi ditimbang dengan

berat organ 05 gr lalu digerus dengan menggunakan tumbukan dan lumpang

kemudian ditambahkan larutan buffer fosfat 1 ml lalu disentrifuse dengan

kecepatan 10000 rpm selama 20 menit diambil lisatnya lalu disimpan pada

suhu -20deg C dan siap dianalisi enzim SODnya

4 Tahapan Analisis

a Pengukuran kadar MDA (Malondialdehida) Hati dan Ginjal Tikus

(Conti dan Sutherland 1991)

1 Persiapan larutan standar

Larutan kerja 10 μM dibuat dengan mengencerkan stok standar 25

mM 1133 tetraetoksipropana (TEP) Kurva standar dibuat dengan

mengencerkan larutan standar hingga menghasilkan beberapa konsentrasi

yaitu 500 1000 2000 2500 3000 4000 dan 5000 pmol50microL (Lampiran

17)

2 Pengukuran Kadar MDA

Prinsip ini berdasarkan pada kemampuan pembentukan kompleks

berwarna merah muda antara MDA dan asam tiobarbiurat (TBA) Hati dan

ginjal yang telah disimpan dalam freezer -20ordmC dicairkan terlebih dahulu

sebelum dianalisis pada suhu ruang Hati dan ginjal digerus dengan

26

menggunakan lumpang (digerus dalam keadaan dingin) dengan

ditambahkan 125 ml buffer fosfat yang mengandung 115 gL kalium

klorida dalam kondisi dingin pH 74 (disimpan pada suhu 5ordmC) Campuran

ini disentrifuse 4000 rpm selama 10 menit diambil supernatan keruh dan

disentrifuse lagi 4000 rpm selama 10 menit sebanyak 1 ml supernatan

jernih diambil dan ditambahkan 1 ml campuran larutan asam klorida dingin

025 N (223 ml asam klorida pekat100 ml) yang mengandung 15 asam

trikloroasetat (wv)038 asam tiobarbiurat dan 05 butilat

hidroksitoluen) Campuran larutan asam klorida dan supernatan tersebut

dipanaskan 80ordmC (inkubator) selama 1 jam selanjutnya didinginkan dengan

air mengalir dan disentrifuse 3500 rpm selama 10 menit Supernatan hasil

sentifuse tersebut kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang

532 nm

MDA (μmolg protein)= A(μmolg) x 375 ml06 g (bb)

A= Kadar MDA yang diperoleh dari persamaan regresi kurva

standar

b Pengukuran aktivitas enzim SOD (Superoksida dismutase) Hati tikus

(Chen et al 1996)

1 Persiapan Larutan Standar

Larutan standar dibuat dengan melarutkan SOD (Sigma USA) murni

sehingga menghasilkan beberapa konsentrasi larutan yaitu 0 50 100 200

250 300 dan 500 unitml H2O dan larutan ini digunakan untuk membuat

kurva standar (Lampiran 18)

2 Pengukuran Aktivitas SOD

Pengukuran aktivitas enzim SOD (Superoksida dismutase)

ditentukan berdasarkan pengukuran enzim secara tidak langsung dengan

menggunakan spektrofotometer (Gambar 7) Untuk mengukur enzim ini

dipakai sistem xantinxantin (XO) yang menghasilkan anion superoksida

(O2) yang mereduksi ferrisitokrom c

Aktivitas enzim SOD diukur berdasarkan laju penghambatan

reduksi ferrisitokrom c oleh anion superoksida yang dihasilkan oleh

xantinxantin oksidase Oksidasi xantin menghasilkan asam urat dan anion

27

superoksida yang selanjutnya mereduksi ferrisitokrom c Reduksi

ferrisitokrom c diamati berdasarkan kenaikan absorbansi pada panjang

gelombang 550 nm

Reaksinya

Xantin + O2 XO O2˙ + asam urat

O2 + sitokrom c (Fe3+) O2 + sitokrom c

2O2 + 2H+ SOD H2O2 + O2

Gambar 8 Spectrofotometer digital double beam (Hitachi U-2001)

Pengukuran aktivitas enzim ini berlangsung pada suhu 25 ordmC larutan

oksidase harus tetap dalam keadaan dingin (didinginkan selama 15 menit)

sebelum digunakan Medium reaksi segera dipersiapkan sebelum

pengukuran dengan memasukan 29 ml larutan A (campuran larutan xantin

dan larutan sitokrom c) ke dalam tabung reaksi 3 ml Selanjutnya

ditambahkan 50 μl larutan baku (kontrol) atau sampellisat lalu divorteks

secara perlahan Reaksi dimulai dengan larutan B (xantin oksidase) dan

divorteks secara perlahan Kemudian diamati perubahan absorbansi yang

terjadi pada spektrofotometer Untuk blanko digunakan buffer fosfat

sebagai pengganti sampel dan sebagai kontrol digunakan air destilasi

Untuk mengambalikan ke konsentrasi awal yaitu dalam (gr) maka

dikonversi dengan rumus

SOD (Ug) = A (microml) x 06705 g (bb)

A= Aktivitas SOD yang diperoleh dari persamaan regresi kurva

standar

28

c Pengukuran Hematologi

a Pengukuran jumlah butir darah merah dengan metode Cuonting chamber-

burker dan neubauer

Darah diambil dengan menggunakan pipet eritrosit yang telah

dihubungkan dengan aspirometer sampai menunjukkan angka 05

kemudian ditambahkan larutan Hayem sampai menunjukkan angka 101 lalu

dikocok dengan gerakan seperti angka delapan setelah itu sebagian cairan

pada ujung pipet dibuang dan sebagian larutan diteteskan ke dalam kamar

hitung kemudian hitung butir darah merah pada kotak R

b Pengukuran jumlah butir darah putih dengan metode Cuonting chamber-

burker dan neubauer

Untuk mengukur butir darah putih prosedur kerjanya sama dengan

mengukur butir darah merah yang berbeda hanyalah pada larutan yaitu

menggunakan larutan turk sebagai pengencer dan aspirometer menunjukkan

angka 11 serta menghitungnya pada kotak W

c Pengukuran jumlah Hb dengan metode Cyan-methemoglobin

Untuk mengukur hemoglobin digunakan reagen drabkins Reagen

drabkins dipipet sebanyak 50 ml dan masukkan kedalam tabung reaksi 1 dan

2 kemudian ditambahkan 002 ml darah ke tabung reaksi ke 2 dengan

menggunakan pipet sahli atau pipet lain yang bervolume 002 ml lalu

dicampur dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar agar terbentuk

sianmethemoglobin lalu dibaca transmittannya dengan spektrofotometer λ

540 nm

d Pengukuran jumlah hematokrit dengan metode Microhematokrit

Darah diambil dengan menggunakan mikrokapiler yang ujung

disumbat dengan crestaseal kemudian disentrifuse dengan kecepatan 11500

ndash 15000 rpm selama 5 menit Nilai hematokrit ditentukan dengan mengukur

volume eritrosit (lapisan yang berwarna merah) dan dibaca dengan

hematokrit reader

29

Analisis Data

Rancangan percobaan yang digunakan dalam penentuan kadar

malondialdehida (MDA) aktivitas enzim superoksida dismutase (SOD) jumlah

butir darah merah jumlah butir darah putih jumlah hemoglobin dan jumlah

hematokrit adalah rancangan acak lengkap Hasil yang diperoleh akan dianalisis

dengan menggunakan ANOVA dan apabila terdapat perbedaan yang nyata antara

perlakuan maka dilanjutkan dengan uji Duncan

Model persamaan matematik dari percobaan ini adalah sebagai berikut

Yij =μ + Ti +sumij (Mattjik amp Sumertajaya 2006) dimana

I = Banyaknya perlakuan

J = Banyaknya ulangan dari setiap perlakuan

μ = Pengaruh rata-rata pengamatan

Ti = Pengaruh adanya perlakuan ke-I

sum ij= Random error dari percobaan

20

yang mati adalah tikus yang diberi vitamin C dengan dosis 4500 mgkg

bbhari untuk manusia atau 1285 mgkg bbhari untuk tikus Kematian tikus

tersebut terjadi pada minggu ketiga dan keempat dengan feases berbentuk

cairan Dengan demikian dosis yang dianggap aman untuk digunakan pada

penelitian ini adalah dosis 3000 mgkg bbhari untuk manusia atau 857 mgkg

bbhari untuk tikus

Tabel 5 Jumlah tikus yang mati pada percobaan penentuan dosis vitamin C

Kelompok tikus Letalitas minggu ke-

0 1 2 3 4 5 6

Kontrol

VitC 427 mgkgbbhari

857 mgkgbbhari

1285 mgkgbbhari

05 05 05 05 05 05 05

05 05 05 05 05 05 05

05 05 05 05 05 05 05

05 05 05 15 35 35 35

Letalitas Jumlah hewan yang matijumlah hewan uji

4 Bahan yang digunakan untuk analisis enzim SOD dan MDA adalah SOD

murni (Sigma USA) larutan cytochrom c (Sigma USA) larutan xantin

(Sigma USA) larutan xantin oksidase (Sigma USA) TBA BHT dan bahan-

bahan kimia lainnya seperti buffer potasium fosfat aquades dan

khloroformetanol serta bahan untuk mengukur hematologi seperti larutan

hayem larutan turk dan reagen drabkins

Alat utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah

Smoking chamber (Gambar 3) Smoking chamber merupakan alat untuk

memaparkan asap rokok pada hewan coba Alat ini dirancang khusus dalam

penelitian ini yang terbuat dari plastik dengan ukuran 385x285x225 cm yang

dilengkapi dengan ventilasi dua buah air pump dua buah pipa plastik tabung

kecil berbentuk gelas tabung oksigen dan tempat pembakaran rokok

d d

21

g c a

b

de f

A

CE

G

B

F

D

Gambar 3 Skema dan seperangkat Smoking chamber

Keterangan gambar

a Kotak plastik dengan ukuran 385x285x225 tempat tikus selama proses

pemaparan asap rokok

b Pipa plastik untuk mengalirkan asap rokok dari pembakaran rokok ke

chamber

c Tempat pembakaran rokok

d Pipa plastik untuk mengalirkan udara ke tempat pembakaran rokok

e air pump sebagai alat pemompa udara

f Pipa plastik untuk mengalirkan oksigen dari tabung oksigen ke chamber

g Tabung oksigen

Mekanisme kerja dari alat ini adalah rokok dibakar setelah itu ditempatkan

pada tempat pembakaran (c) secara terbalik dimana batang rokok yang dibakar

menghadap ke bawah dan batang rokok yang tidak terbakar menghadap ke atas

dan ditempatkan tepat pada pipa plastik (b) yang terhubung langsung dengan

Chamber kemudian dengan menggunakan air pump (e) untuk mengalirkan udara

agar terjadi pembakaran rokok dan mendorong asap rokok masuk ke dalam

chamber (a) melalui pipa plastik yang dihubungkan dengan chamber (b) Pada

saat asap rokok masuk ke dalam chamber oksigen dialirkan dari tabung oksigen

melalui pipa plastik yang dihubungkan dengan chamber (g) dengan tekanan 05

atmosfer Bila satu batang rokok telah habis terbakar dilanjutkan dengan rokok

kedua hingga semua rokok habis terbakar

Peralatan lain yang juga digunakan dalm penelitian ini adalah sonde

spektrofotometer digital double beam (Hitachi U-2001) jarum suntik

22

hemasitometer mikroskop seperangkat alat bedah lumpang kecil sentrifuse

inkubator dan hematokrit reader

Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap yaitu tahap persiapan hewan

coba tahap perlakuan dan tahap analisis

1 Tahap Persiapan

Dua puluh lima ekor tikus yang telah diadaptasikan selama satu minggu

ditempatkan pada kandang individual berukuran 34 x 25 x 12 cm yang beralas

sekam padi dengan penutup kawat ram (Gambar 3) Tikus diberi makan dan

minum ad libitum yang ditempatkan pada ruangan khusus dengan suhu 20-25

degC Penggantian sekam dan pencucian kandang dilakukan dua hari sekali setiap

pagi untuk setiap kandang Hal ini dilakukan agar tikus selalu dalam kondisi

bersih

Gambar 4 Lingkungan kandang tikus 2 Tahap perlakuan

Setelah masa adaptasi tikus tersebut dibagi menjadi lima kelompok yang

terdiri dari lima ekor Adapun kelompok tersebut adalah

1 P0 merupakan kelompok kontrol kelompok yang tidak dipapar rokok

dan tidak diberi vitamin C

2 P1 merupakan kelompok yang diberi vitamin C dan tidak dipapar asap

rokok

3 P2 merupakan kelompok yang dipapar asap rokok dan tidak diberi

vitamin C

4 P3 merupakan kelompok yang dipapar asap rokok dan diberi vitamin C

secara bersamaan

23

5 P4 merupakan kelompok yang dipapar asap rokok dan diberi vitamin C

secara tidak bersamaan

Setelah dibagi dalam lima kelompok perlakuan tikus-tikus tersebut

diberi perlakuan sesuai dengan rancangan yaitu

a Proses pemaparan

Proses pemaparan dilakukan dalam smoking chamber Tikus dalam

kandang individu dipindahkan ke dalam smoking chamber katup oksigen

dibuka dengan tekanan 05 atmosfer kemudian rokok dipasangkan pada

pipa yang dihubungkan dengan pompa selanjutnya rokok dibakar dan

pompa dinyalakan Biarkan asap rokok masuk kedalam chamber hingga

asap tersebut habis terhirup Pemberian dosis asap rokok adalah satu batang

rokok per lima belas menit selama enam puluh menit Pemaparan dilakukan

setiap pagi mulai dari pukul 0700 sampai 0800 untuk satu kelompok

pemaparan selama tiga puluh hari Perlakuan ini diberikan pada semua

kelompok perlakuan kecuali kelompok kontrol (P0) dan kelompok

perlakuan vitamin C (P1) Proses pemaparan terlihat pada (Gambar 4)

(a) (b) (c)

Gambar 5 Proses pemaparan dari awal hingga akhir (a Awal pemaparan) (b Selama pemaparan) (c Akhir pemaparan)

b Proses pemberian vitamin C

Proses pemberian vitamin C dengan cara pencekokan dengan

menggunakan sonde Vitamin C tersebut dilarutkan dalam 1 ml aquades

Dosis pemberian vitamin C adalah sebanyak 857 mgkg bbhari dan

diberikan setiap pagi pada jam sembilan untuk kelompok perlakuan P1 satu

24

jam setelah pemaparan untuk kelompok perlakuan P3 dan tiga puluh hari

setelah pemaparan asap rokok untuk kelompok perlakuan P4 Proses

pemberian vitamin C terlihat pada (Gambar 5)

Gambar 6 Pemberian vitamin C secara oral

Diagram perlakuan proses pemaparan asap rokok pemberian vitamin C

dan waktu pengambilan sampel tertuang pada (Gambar 6)

Hari Penelitian Perlakuan

1 30 31 60 61

P0

P1

Ket

P2

P3

P4

Gambar 7 Proses pemaparan asap rokok pemberian vitamin C dan waktu pengambilan sampel

Pemberian vitamin C

Hari pengambilan sampel

Pemaparan asap rokok

3 Tahap Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel dilakukan pada hari sesuai yang telah ditetapkan

pada gambar Ada pun parameter yang diukur adalah

1 Kinerja atau aktivitas antioksidan dari vitamin C yang meliputi

a Kadar malondialdehida (MDA)

b Aktivitas enzim superoksida dismutase (SOD)

25

2 Hematologi (gambaran darah) yang meliputi

a Jumlah butir darah merah (BDM)

b Jumlah butir darah putih (BDP)

c Jumlah hemoglobin (Hb)

d Jumlah hematokrit (PCV)

Pada akhir percobaan tikus dikorbankan dengan menggunakan eter

kemudian darahnya diambil secara intrakardial sebanyak 2 ml untuk

pemeriksaan gambaran darah (hematologi) Pembedahan segera dilakukan

untuk mengambil organ hati dan ginjal selanjutnya hati dan ginjal dicuci

dengan garam fisiologis 01 kemudian dibagi menjadi dua bagian Satu

bagian ditimbang dengan berat organ 06 gr lalu dibungkus dengan

aluminium foil dan disimpan difreezer pada suhu -20 degC yang nantinya

digunakan untuk analisis MDA Dan satu bagiannya lagi ditimbang dengan

berat organ 05 gr lalu digerus dengan menggunakan tumbukan dan lumpang

kemudian ditambahkan larutan buffer fosfat 1 ml lalu disentrifuse dengan

kecepatan 10000 rpm selama 20 menit diambil lisatnya lalu disimpan pada

suhu -20deg C dan siap dianalisi enzim SODnya

4 Tahapan Analisis

a Pengukuran kadar MDA (Malondialdehida) Hati dan Ginjal Tikus

(Conti dan Sutherland 1991)

1 Persiapan larutan standar

Larutan kerja 10 μM dibuat dengan mengencerkan stok standar 25

mM 1133 tetraetoksipropana (TEP) Kurva standar dibuat dengan

mengencerkan larutan standar hingga menghasilkan beberapa konsentrasi

yaitu 500 1000 2000 2500 3000 4000 dan 5000 pmol50microL (Lampiran

17)

2 Pengukuran Kadar MDA

Prinsip ini berdasarkan pada kemampuan pembentukan kompleks

berwarna merah muda antara MDA dan asam tiobarbiurat (TBA) Hati dan

ginjal yang telah disimpan dalam freezer -20ordmC dicairkan terlebih dahulu

sebelum dianalisis pada suhu ruang Hati dan ginjal digerus dengan

26

menggunakan lumpang (digerus dalam keadaan dingin) dengan

ditambahkan 125 ml buffer fosfat yang mengandung 115 gL kalium

klorida dalam kondisi dingin pH 74 (disimpan pada suhu 5ordmC) Campuran

ini disentrifuse 4000 rpm selama 10 menit diambil supernatan keruh dan

disentrifuse lagi 4000 rpm selama 10 menit sebanyak 1 ml supernatan

jernih diambil dan ditambahkan 1 ml campuran larutan asam klorida dingin

025 N (223 ml asam klorida pekat100 ml) yang mengandung 15 asam

trikloroasetat (wv)038 asam tiobarbiurat dan 05 butilat

hidroksitoluen) Campuran larutan asam klorida dan supernatan tersebut

dipanaskan 80ordmC (inkubator) selama 1 jam selanjutnya didinginkan dengan

air mengalir dan disentrifuse 3500 rpm selama 10 menit Supernatan hasil

sentifuse tersebut kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang

532 nm

MDA (μmolg protein)= A(μmolg) x 375 ml06 g (bb)

A= Kadar MDA yang diperoleh dari persamaan regresi kurva

standar

b Pengukuran aktivitas enzim SOD (Superoksida dismutase) Hati tikus

(Chen et al 1996)

1 Persiapan Larutan Standar

Larutan standar dibuat dengan melarutkan SOD (Sigma USA) murni

sehingga menghasilkan beberapa konsentrasi larutan yaitu 0 50 100 200

250 300 dan 500 unitml H2O dan larutan ini digunakan untuk membuat

kurva standar (Lampiran 18)

2 Pengukuran Aktivitas SOD

Pengukuran aktivitas enzim SOD (Superoksida dismutase)

ditentukan berdasarkan pengukuran enzim secara tidak langsung dengan

menggunakan spektrofotometer (Gambar 7) Untuk mengukur enzim ini

dipakai sistem xantinxantin (XO) yang menghasilkan anion superoksida

(O2) yang mereduksi ferrisitokrom c

Aktivitas enzim SOD diukur berdasarkan laju penghambatan

reduksi ferrisitokrom c oleh anion superoksida yang dihasilkan oleh

xantinxantin oksidase Oksidasi xantin menghasilkan asam urat dan anion

27

superoksida yang selanjutnya mereduksi ferrisitokrom c Reduksi

ferrisitokrom c diamati berdasarkan kenaikan absorbansi pada panjang

gelombang 550 nm

Reaksinya

Xantin + O2 XO O2˙ + asam urat

O2 + sitokrom c (Fe3+) O2 + sitokrom c

2O2 + 2H+ SOD H2O2 + O2

Gambar 8 Spectrofotometer digital double beam (Hitachi U-2001)

Pengukuran aktivitas enzim ini berlangsung pada suhu 25 ordmC larutan

oksidase harus tetap dalam keadaan dingin (didinginkan selama 15 menit)

sebelum digunakan Medium reaksi segera dipersiapkan sebelum

pengukuran dengan memasukan 29 ml larutan A (campuran larutan xantin

dan larutan sitokrom c) ke dalam tabung reaksi 3 ml Selanjutnya

ditambahkan 50 μl larutan baku (kontrol) atau sampellisat lalu divorteks

secara perlahan Reaksi dimulai dengan larutan B (xantin oksidase) dan

divorteks secara perlahan Kemudian diamati perubahan absorbansi yang

terjadi pada spektrofotometer Untuk blanko digunakan buffer fosfat

sebagai pengganti sampel dan sebagai kontrol digunakan air destilasi

Untuk mengambalikan ke konsentrasi awal yaitu dalam (gr) maka

dikonversi dengan rumus

SOD (Ug) = A (microml) x 06705 g (bb)

A= Aktivitas SOD yang diperoleh dari persamaan regresi kurva

standar

28

c Pengukuran Hematologi

a Pengukuran jumlah butir darah merah dengan metode Cuonting chamber-

burker dan neubauer

Darah diambil dengan menggunakan pipet eritrosit yang telah

dihubungkan dengan aspirometer sampai menunjukkan angka 05

kemudian ditambahkan larutan Hayem sampai menunjukkan angka 101 lalu

dikocok dengan gerakan seperti angka delapan setelah itu sebagian cairan

pada ujung pipet dibuang dan sebagian larutan diteteskan ke dalam kamar

hitung kemudian hitung butir darah merah pada kotak R

b Pengukuran jumlah butir darah putih dengan metode Cuonting chamber-

burker dan neubauer

Untuk mengukur butir darah putih prosedur kerjanya sama dengan

mengukur butir darah merah yang berbeda hanyalah pada larutan yaitu

menggunakan larutan turk sebagai pengencer dan aspirometer menunjukkan

angka 11 serta menghitungnya pada kotak W

c Pengukuran jumlah Hb dengan metode Cyan-methemoglobin

Untuk mengukur hemoglobin digunakan reagen drabkins Reagen

drabkins dipipet sebanyak 50 ml dan masukkan kedalam tabung reaksi 1 dan

2 kemudian ditambahkan 002 ml darah ke tabung reaksi ke 2 dengan

menggunakan pipet sahli atau pipet lain yang bervolume 002 ml lalu

dicampur dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar agar terbentuk

sianmethemoglobin lalu dibaca transmittannya dengan spektrofotometer λ

540 nm

d Pengukuran jumlah hematokrit dengan metode Microhematokrit

Darah diambil dengan menggunakan mikrokapiler yang ujung

disumbat dengan crestaseal kemudian disentrifuse dengan kecepatan 11500

ndash 15000 rpm selama 5 menit Nilai hematokrit ditentukan dengan mengukur

volume eritrosit (lapisan yang berwarna merah) dan dibaca dengan

hematokrit reader

29

Analisis Data

Rancangan percobaan yang digunakan dalam penentuan kadar

malondialdehida (MDA) aktivitas enzim superoksida dismutase (SOD) jumlah

butir darah merah jumlah butir darah putih jumlah hemoglobin dan jumlah

hematokrit adalah rancangan acak lengkap Hasil yang diperoleh akan dianalisis

dengan menggunakan ANOVA dan apabila terdapat perbedaan yang nyata antara

perlakuan maka dilanjutkan dengan uji Duncan

Model persamaan matematik dari percobaan ini adalah sebagai berikut

Yij =μ + Ti +sumij (Mattjik amp Sumertajaya 2006) dimana

I = Banyaknya perlakuan

J = Banyaknya ulangan dari setiap perlakuan

μ = Pengaruh rata-rata pengamatan

Ti = Pengaruh adanya perlakuan ke-I

sum ij= Random error dari percobaan

21

g c a

b

de f

A

CE

G

B

F

D

Gambar 3 Skema dan seperangkat Smoking chamber

Keterangan gambar

a Kotak plastik dengan ukuran 385x285x225 tempat tikus selama proses

pemaparan asap rokok

b Pipa plastik untuk mengalirkan asap rokok dari pembakaran rokok ke

chamber

c Tempat pembakaran rokok

d Pipa plastik untuk mengalirkan udara ke tempat pembakaran rokok

e air pump sebagai alat pemompa udara

f Pipa plastik untuk mengalirkan oksigen dari tabung oksigen ke chamber

g Tabung oksigen

Mekanisme kerja dari alat ini adalah rokok dibakar setelah itu ditempatkan

pada tempat pembakaran (c) secara terbalik dimana batang rokok yang dibakar

menghadap ke bawah dan batang rokok yang tidak terbakar menghadap ke atas

dan ditempatkan tepat pada pipa plastik (b) yang terhubung langsung dengan

Chamber kemudian dengan menggunakan air pump (e) untuk mengalirkan udara

agar terjadi pembakaran rokok dan mendorong asap rokok masuk ke dalam

chamber (a) melalui pipa plastik yang dihubungkan dengan chamber (b) Pada

saat asap rokok masuk ke dalam chamber oksigen dialirkan dari tabung oksigen

melalui pipa plastik yang dihubungkan dengan chamber (g) dengan tekanan 05

atmosfer Bila satu batang rokok telah habis terbakar dilanjutkan dengan rokok

kedua hingga semua rokok habis terbakar

Peralatan lain yang juga digunakan dalm penelitian ini adalah sonde

spektrofotometer digital double beam (Hitachi U-2001) jarum suntik

22

hemasitometer mikroskop seperangkat alat bedah lumpang kecil sentrifuse

inkubator dan hematokrit reader

Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap yaitu tahap persiapan hewan

coba tahap perlakuan dan tahap analisis

1 Tahap Persiapan

Dua puluh lima ekor tikus yang telah diadaptasikan selama satu minggu

ditempatkan pada kandang individual berukuran 34 x 25 x 12 cm yang beralas

sekam padi dengan penutup kawat ram (Gambar 3) Tikus diberi makan dan

minum ad libitum yang ditempatkan pada ruangan khusus dengan suhu 20-25

degC Penggantian sekam dan pencucian kandang dilakukan dua hari sekali setiap

pagi untuk setiap kandang Hal ini dilakukan agar tikus selalu dalam kondisi

bersih

Gambar 4 Lingkungan kandang tikus 2 Tahap perlakuan

Setelah masa adaptasi tikus tersebut dibagi menjadi lima kelompok yang

terdiri dari lima ekor Adapun kelompok tersebut adalah

1 P0 merupakan kelompok kontrol kelompok yang tidak dipapar rokok

dan tidak diberi vitamin C

2 P1 merupakan kelompok yang diberi vitamin C dan tidak dipapar asap

rokok

3 P2 merupakan kelompok yang dipapar asap rokok dan tidak diberi

vitamin C

4 P3 merupakan kelompok yang dipapar asap rokok dan diberi vitamin C

secara bersamaan

23

5 P4 merupakan kelompok yang dipapar asap rokok dan diberi vitamin C

secara tidak bersamaan

Setelah dibagi dalam lima kelompok perlakuan tikus-tikus tersebut

diberi perlakuan sesuai dengan rancangan yaitu

a Proses pemaparan

Proses pemaparan dilakukan dalam smoking chamber Tikus dalam

kandang individu dipindahkan ke dalam smoking chamber katup oksigen

dibuka dengan tekanan 05 atmosfer kemudian rokok dipasangkan pada

pipa yang dihubungkan dengan pompa selanjutnya rokok dibakar dan

pompa dinyalakan Biarkan asap rokok masuk kedalam chamber hingga

asap tersebut habis terhirup Pemberian dosis asap rokok adalah satu batang

rokok per lima belas menit selama enam puluh menit Pemaparan dilakukan

setiap pagi mulai dari pukul 0700 sampai 0800 untuk satu kelompok

pemaparan selama tiga puluh hari Perlakuan ini diberikan pada semua

kelompok perlakuan kecuali kelompok kontrol (P0) dan kelompok

perlakuan vitamin C (P1) Proses pemaparan terlihat pada (Gambar 4)

(a) (b) (c)

Gambar 5 Proses pemaparan dari awal hingga akhir (a Awal pemaparan) (b Selama pemaparan) (c Akhir pemaparan)

b Proses pemberian vitamin C

Proses pemberian vitamin C dengan cara pencekokan dengan

menggunakan sonde Vitamin C tersebut dilarutkan dalam 1 ml aquades

Dosis pemberian vitamin C adalah sebanyak 857 mgkg bbhari dan

diberikan setiap pagi pada jam sembilan untuk kelompok perlakuan P1 satu

24

jam setelah pemaparan untuk kelompok perlakuan P3 dan tiga puluh hari

setelah pemaparan asap rokok untuk kelompok perlakuan P4 Proses

pemberian vitamin C terlihat pada (Gambar 5)

Gambar 6 Pemberian vitamin C secara oral

Diagram perlakuan proses pemaparan asap rokok pemberian vitamin C

dan waktu pengambilan sampel tertuang pada (Gambar 6)

Hari Penelitian Perlakuan

1 30 31 60 61

P0

P1

Ket

P2

P3

P4

Gambar 7 Proses pemaparan asap rokok pemberian vitamin C dan waktu pengambilan sampel

Pemberian vitamin C

Hari pengambilan sampel

Pemaparan asap rokok

3 Tahap Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel dilakukan pada hari sesuai yang telah ditetapkan

pada gambar Ada pun parameter yang diukur adalah

1 Kinerja atau aktivitas antioksidan dari vitamin C yang meliputi

a Kadar malondialdehida (MDA)

b Aktivitas enzim superoksida dismutase (SOD)

25

2 Hematologi (gambaran darah) yang meliputi

a Jumlah butir darah merah (BDM)

b Jumlah butir darah putih (BDP)

c Jumlah hemoglobin (Hb)

d Jumlah hematokrit (PCV)

Pada akhir percobaan tikus dikorbankan dengan menggunakan eter

kemudian darahnya diambil secara intrakardial sebanyak 2 ml untuk

pemeriksaan gambaran darah (hematologi) Pembedahan segera dilakukan

untuk mengambil organ hati dan ginjal selanjutnya hati dan ginjal dicuci

dengan garam fisiologis 01 kemudian dibagi menjadi dua bagian Satu

bagian ditimbang dengan berat organ 06 gr lalu dibungkus dengan

aluminium foil dan disimpan difreezer pada suhu -20 degC yang nantinya

digunakan untuk analisis MDA Dan satu bagiannya lagi ditimbang dengan

berat organ 05 gr lalu digerus dengan menggunakan tumbukan dan lumpang

kemudian ditambahkan larutan buffer fosfat 1 ml lalu disentrifuse dengan

kecepatan 10000 rpm selama 20 menit diambil lisatnya lalu disimpan pada

suhu -20deg C dan siap dianalisi enzim SODnya

4 Tahapan Analisis

a Pengukuran kadar MDA (Malondialdehida) Hati dan Ginjal Tikus

(Conti dan Sutherland 1991)

1 Persiapan larutan standar

Larutan kerja 10 μM dibuat dengan mengencerkan stok standar 25

mM 1133 tetraetoksipropana (TEP) Kurva standar dibuat dengan

mengencerkan larutan standar hingga menghasilkan beberapa konsentrasi

yaitu 500 1000 2000 2500 3000 4000 dan 5000 pmol50microL (Lampiran

17)

2 Pengukuran Kadar MDA

Prinsip ini berdasarkan pada kemampuan pembentukan kompleks

berwarna merah muda antara MDA dan asam tiobarbiurat (TBA) Hati dan

ginjal yang telah disimpan dalam freezer -20ordmC dicairkan terlebih dahulu

sebelum dianalisis pada suhu ruang Hati dan ginjal digerus dengan

26

menggunakan lumpang (digerus dalam keadaan dingin) dengan

ditambahkan 125 ml buffer fosfat yang mengandung 115 gL kalium

klorida dalam kondisi dingin pH 74 (disimpan pada suhu 5ordmC) Campuran

ini disentrifuse 4000 rpm selama 10 menit diambil supernatan keruh dan

disentrifuse lagi 4000 rpm selama 10 menit sebanyak 1 ml supernatan

jernih diambil dan ditambahkan 1 ml campuran larutan asam klorida dingin

025 N (223 ml asam klorida pekat100 ml) yang mengandung 15 asam

trikloroasetat (wv)038 asam tiobarbiurat dan 05 butilat

hidroksitoluen) Campuran larutan asam klorida dan supernatan tersebut

dipanaskan 80ordmC (inkubator) selama 1 jam selanjutnya didinginkan dengan

air mengalir dan disentrifuse 3500 rpm selama 10 menit Supernatan hasil

sentifuse tersebut kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang

532 nm

MDA (μmolg protein)= A(μmolg) x 375 ml06 g (bb)

A= Kadar MDA yang diperoleh dari persamaan regresi kurva

standar

b Pengukuran aktivitas enzim SOD (Superoksida dismutase) Hati tikus

(Chen et al 1996)

1 Persiapan Larutan Standar

Larutan standar dibuat dengan melarutkan SOD (Sigma USA) murni

sehingga menghasilkan beberapa konsentrasi larutan yaitu 0 50 100 200

250 300 dan 500 unitml H2O dan larutan ini digunakan untuk membuat

kurva standar (Lampiran 18)

2 Pengukuran Aktivitas SOD

Pengukuran aktivitas enzim SOD (Superoksida dismutase)

ditentukan berdasarkan pengukuran enzim secara tidak langsung dengan

menggunakan spektrofotometer (Gambar 7) Untuk mengukur enzim ini

dipakai sistem xantinxantin (XO) yang menghasilkan anion superoksida

(O2) yang mereduksi ferrisitokrom c

Aktivitas enzim SOD diukur berdasarkan laju penghambatan

reduksi ferrisitokrom c oleh anion superoksida yang dihasilkan oleh

xantinxantin oksidase Oksidasi xantin menghasilkan asam urat dan anion

27

superoksida yang selanjutnya mereduksi ferrisitokrom c Reduksi

ferrisitokrom c diamati berdasarkan kenaikan absorbansi pada panjang

gelombang 550 nm

Reaksinya

Xantin + O2 XO O2˙ + asam urat

O2 + sitokrom c (Fe3+) O2 + sitokrom c

2O2 + 2H+ SOD H2O2 + O2

Gambar 8 Spectrofotometer digital double beam (Hitachi U-2001)

Pengukuran aktivitas enzim ini berlangsung pada suhu 25 ordmC larutan

oksidase harus tetap dalam keadaan dingin (didinginkan selama 15 menit)

sebelum digunakan Medium reaksi segera dipersiapkan sebelum

pengukuran dengan memasukan 29 ml larutan A (campuran larutan xantin

dan larutan sitokrom c) ke dalam tabung reaksi 3 ml Selanjutnya

ditambahkan 50 μl larutan baku (kontrol) atau sampellisat lalu divorteks

secara perlahan Reaksi dimulai dengan larutan B (xantin oksidase) dan

divorteks secara perlahan Kemudian diamati perubahan absorbansi yang

terjadi pada spektrofotometer Untuk blanko digunakan buffer fosfat

sebagai pengganti sampel dan sebagai kontrol digunakan air destilasi

Untuk mengambalikan ke konsentrasi awal yaitu dalam (gr) maka

dikonversi dengan rumus

SOD (Ug) = A (microml) x 06705 g (bb)

A= Aktivitas SOD yang diperoleh dari persamaan regresi kurva

standar

28

c Pengukuran Hematologi

a Pengukuran jumlah butir darah merah dengan metode Cuonting chamber-

burker dan neubauer

Darah diambil dengan menggunakan pipet eritrosit yang telah

dihubungkan dengan aspirometer sampai menunjukkan angka 05

kemudian ditambahkan larutan Hayem sampai menunjukkan angka 101 lalu

dikocok dengan gerakan seperti angka delapan setelah itu sebagian cairan

pada ujung pipet dibuang dan sebagian larutan diteteskan ke dalam kamar

hitung kemudian hitung butir darah merah pada kotak R

b Pengukuran jumlah butir darah putih dengan metode Cuonting chamber-

burker dan neubauer

Untuk mengukur butir darah putih prosedur kerjanya sama dengan

mengukur butir darah merah yang berbeda hanyalah pada larutan yaitu

menggunakan larutan turk sebagai pengencer dan aspirometer menunjukkan

angka 11 serta menghitungnya pada kotak W

c Pengukuran jumlah Hb dengan metode Cyan-methemoglobin

Untuk mengukur hemoglobin digunakan reagen drabkins Reagen

drabkins dipipet sebanyak 50 ml dan masukkan kedalam tabung reaksi 1 dan

2 kemudian ditambahkan 002 ml darah ke tabung reaksi ke 2 dengan

menggunakan pipet sahli atau pipet lain yang bervolume 002 ml lalu

dicampur dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar agar terbentuk

sianmethemoglobin lalu dibaca transmittannya dengan spektrofotometer λ

540 nm

d Pengukuran jumlah hematokrit dengan metode Microhematokrit

Darah diambil dengan menggunakan mikrokapiler yang ujung

disumbat dengan crestaseal kemudian disentrifuse dengan kecepatan 11500

ndash 15000 rpm selama 5 menit Nilai hematokrit ditentukan dengan mengukur

volume eritrosit (lapisan yang berwarna merah) dan dibaca dengan

hematokrit reader

29

Analisis Data

Rancangan percobaan yang digunakan dalam penentuan kadar

malondialdehida (MDA) aktivitas enzim superoksida dismutase (SOD) jumlah

butir darah merah jumlah butir darah putih jumlah hemoglobin dan jumlah

hematokrit adalah rancangan acak lengkap Hasil yang diperoleh akan dianalisis

dengan menggunakan ANOVA dan apabila terdapat perbedaan yang nyata antara

perlakuan maka dilanjutkan dengan uji Duncan

Model persamaan matematik dari percobaan ini adalah sebagai berikut

Yij =μ + Ti +sumij (Mattjik amp Sumertajaya 2006) dimana

I = Banyaknya perlakuan

J = Banyaknya ulangan dari setiap perlakuan

μ = Pengaruh rata-rata pengamatan

Ti = Pengaruh adanya perlakuan ke-I

sum ij= Random error dari percobaan

22

hemasitometer mikroskop seperangkat alat bedah lumpang kecil sentrifuse

inkubator dan hematokrit reader

Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap yaitu tahap persiapan hewan

coba tahap perlakuan dan tahap analisis

1 Tahap Persiapan

Dua puluh lima ekor tikus yang telah diadaptasikan selama satu minggu

ditempatkan pada kandang individual berukuran 34 x 25 x 12 cm yang beralas

sekam padi dengan penutup kawat ram (Gambar 3) Tikus diberi makan dan

minum ad libitum yang ditempatkan pada ruangan khusus dengan suhu 20-25

degC Penggantian sekam dan pencucian kandang dilakukan dua hari sekali setiap

pagi untuk setiap kandang Hal ini dilakukan agar tikus selalu dalam kondisi

bersih

Gambar 4 Lingkungan kandang tikus 2 Tahap perlakuan

Setelah masa adaptasi tikus tersebut dibagi menjadi lima kelompok yang

terdiri dari lima ekor Adapun kelompok tersebut adalah

1 P0 merupakan kelompok kontrol kelompok yang tidak dipapar rokok

dan tidak diberi vitamin C

2 P1 merupakan kelompok yang diberi vitamin C dan tidak dipapar asap

rokok

3 P2 merupakan kelompok yang dipapar asap rokok dan tidak diberi

vitamin C

4 P3 merupakan kelompok yang dipapar asap rokok dan diberi vitamin C

secara bersamaan

23

5 P4 merupakan kelompok yang dipapar asap rokok dan diberi vitamin C

secara tidak bersamaan

Setelah dibagi dalam lima kelompok perlakuan tikus-tikus tersebut

diberi perlakuan sesuai dengan rancangan yaitu

a Proses pemaparan

Proses pemaparan dilakukan dalam smoking chamber Tikus dalam

kandang individu dipindahkan ke dalam smoking chamber katup oksigen

dibuka dengan tekanan 05 atmosfer kemudian rokok dipasangkan pada

pipa yang dihubungkan dengan pompa selanjutnya rokok dibakar dan

pompa dinyalakan Biarkan asap rokok masuk kedalam chamber hingga

asap tersebut habis terhirup Pemberian dosis asap rokok adalah satu batang

rokok per lima belas menit selama enam puluh menit Pemaparan dilakukan

setiap pagi mulai dari pukul 0700 sampai 0800 untuk satu kelompok

pemaparan selama tiga puluh hari Perlakuan ini diberikan pada semua

kelompok perlakuan kecuali kelompok kontrol (P0) dan kelompok

perlakuan vitamin C (P1) Proses pemaparan terlihat pada (Gambar 4)

(a) (b) (c)

Gambar 5 Proses pemaparan dari awal hingga akhir (a Awal pemaparan) (b Selama pemaparan) (c Akhir pemaparan)

b Proses pemberian vitamin C

Proses pemberian vitamin C dengan cara pencekokan dengan

menggunakan sonde Vitamin C tersebut dilarutkan dalam 1 ml aquades

Dosis pemberian vitamin C adalah sebanyak 857 mgkg bbhari dan

diberikan setiap pagi pada jam sembilan untuk kelompok perlakuan P1 satu

24

jam setelah pemaparan untuk kelompok perlakuan P3 dan tiga puluh hari

setelah pemaparan asap rokok untuk kelompok perlakuan P4 Proses

pemberian vitamin C terlihat pada (Gambar 5)

Gambar 6 Pemberian vitamin C secara oral

Diagram perlakuan proses pemaparan asap rokok pemberian vitamin C

dan waktu pengambilan sampel tertuang pada (Gambar 6)

Hari Penelitian Perlakuan

1 30 31 60 61

P0

P1

Ket

P2

P3

P4

Gambar 7 Proses pemaparan asap rokok pemberian vitamin C dan waktu pengambilan sampel

Pemberian vitamin C

Hari pengambilan sampel

Pemaparan asap rokok

3 Tahap Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel dilakukan pada hari sesuai yang telah ditetapkan

pada gambar Ada pun parameter yang diukur adalah

1 Kinerja atau aktivitas antioksidan dari vitamin C yang meliputi

a Kadar malondialdehida (MDA)

b Aktivitas enzim superoksida dismutase (SOD)

25

2 Hematologi (gambaran darah) yang meliputi

a Jumlah butir darah merah (BDM)

b Jumlah butir darah putih (BDP)

c Jumlah hemoglobin (Hb)

d Jumlah hematokrit (PCV)

Pada akhir percobaan tikus dikorbankan dengan menggunakan eter

kemudian darahnya diambil secara intrakardial sebanyak 2 ml untuk

pemeriksaan gambaran darah (hematologi) Pembedahan segera dilakukan

untuk mengambil organ hati dan ginjal selanjutnya hati dan ginjal dicuci

dengan garam fisiologis 01 kemudian dibagi menjadi dua bagian Satu

bagian ditimbang dengan berat organ 06 gr lalu dibungkus dengan

aluminium foil dan disimpan difreezer pada suhu -20 degC yang nantinya

digunakan untuk analisis MDA Dan satu bagiannya lagi ditimbang dengan

berat organ 05 gr lalu digerus dengan menggunakan tumbukan dan lumpang

kemudian ditambahkan larutan buffer fosfat 1 ml lalu disentrifuse dengan

kecepatan 10000 rpm selama 20 menit diambil lisatnya lalu disimpan pada

suhu -20deg C dan siap dianalisi enzim SODnya

4 Tahapan Analisis

a Pengukuran kadar MDA (Malondialdehida) Hati dan Ginjal Tikus

(Conti dan Sutherland 1991)

1 Persiapan larutan standar

Larutan kerja 10 μM dibuat dengan mengencerkan stok standar 25

mM 1133 tetraetoksipropana (TEP) Kurva standar dibuat dengan

mengencerkan larutan standar hingga menghasilkan beberapa konsentrasi

yaitu 500 1000 2000 2500 3000 4000 dan 5000 pmol50microL (Lampiran

17)

2 Pengukuran Kadar MDA

Prinsip ini berdasarkan pada kemampuan pembentukan kompleks

berwarna merah muda antara MDA dan asam tiobarbiurat (TBA) Hati dan

ginjal yang telah disimpan dalam freezer -20ordmC dicairkan terlebih dahulu

sebelum dianalisis pada suhu ruang Hati dan ginjal digerus dengan

26

menggunakan lumpang (digerus dalam keadaan dingin) dengan

ditambahkan 125 ml buffer fosfat yang mengandung 115 gL kalium

klorida dalam kondisi dingin pH 74 (disimpan pada suhu 5ordmC) Campuran

ini disentrifuse 4000 rpm selama 10 menit diambil supernatan keruh dan

disentrifuse lagi 4000 rpm selama 10 menit sebanyak 1 ml supernatan

jernih diambil dan ditambahkan 1 ml campuran larutan asam klorida dingin

025 N (223 ml asam klorida pekat100 ml) yang mengandung 15 asam

trikloroasetat (wv)038 asam tiobarbiurat dan 05 butilat

hidroksitoluen) Campuran larutan asam klorida dan supernatan tersebut

dipanaskan 80ordmC (inkubator) selama 1 jam selanjutnya didinginkan dengan

air mengalir dan disentrifuse 3500 rpm selama 10 menit Supernatan hasil

sentifuse tersebut kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang

532 nm

MDA (μmolg protein)= A(μmolg) x 375 ml06 g (bb)

A= Kadar MDA yang diperoleh dari persamaan regresi kurva

standar

b Pengukuran aktivitas enzim SOD (Superoksida dismutase) Hati tikus

(Chen et al 1996)

1 Persiapan Larutan Standar

Larutan standar dibuat dengan melarutkan SOD (Sigma USA) murni

sehingga menghasilkan beberapa konsentrasi larutan yaitu 0 50 100 200

250 300 dan 500 unitml H2O dan larutan ini digunakan untuk membuat

kurva standar (Lampiran 18)

2 Pengukuran Aktivitas SOD

Pengukuran aktivitas enzim SOD (Superoksida dismutase)

ditentukan berdasarkan pengukuran enzim secara tidak langsung dengan

menggunakan spektrofotometer (Gambar 7) Untuk mengukur enzim ini

dipakai sistem xantinxantin (XO) yang menghasilkan anion superoksida

(O2) yang mereduksi ferrisitokrom c

Aktivitas enzim SOD diukur berdasarkan laju penghambatan

reduksi ferrisitokrom c oleh anion superoksida yang dihasilkan oleh

xantinxantin oksidase Oksidasi xantin menghasilkan asam urat dan anion

27

superoksida yang selanjutnya mereduksi ferrisitokrom c Reduksi

ferrisitokrom c diamati berdasarkan kenaikan absorbansi pada panjang

gelombang 550 nm

Reaksinya

Xantin + O2 XO O2˙ + asam urat

O2 + sitokrom c (Fe3+) O2 + sitokrom c

2O2 + 2H+ SOD H2O2 + O2

Gambar 8 Spectrofotometer digital double beam (Hitachi U-2001)

Pengukuran aktivitas enzim ini berlangsung pada suhu 25 ordmC larutan

oksidase harus tetap dalam keadaan dingin (didinginkan selama 15 menit)

sebelum digunakan Medium reaksi segera dipersiapkan sebelum

pengukuran dengan memasukan 29 ml larutan A (campuran larutan xantin

dan larutan sitokrom c) ke dalam tabung reaksi 3 ml Selanjutnya

ditambahkan 50 μl larutan baku (kontrol) atau sampellisat lalu divorteks

secara perlahan Reaksi dimulai dengan larutan B (xantin oksidase) dan

divorteks secara perlahan Kemudian diamati perubahan absorbansi yang

terjadi pada spektrofotometer Untuk blanko digunakan buffer fosfat

sebagai pengganti sampel dan sebagai kontrol digunakan air destilasi

Untuk mengambalikan ke konsentrasi awal yaitu dalam (gr) maka

dikonversi dengan rumus

SOD (Ug) = A (microml) x 06705 g (bb)

A= Aktivitas SOD yang diperoleh dari persamaan regresi kurva

standar

28

c Pengukuran Hematologi

a Pengukuran jumlah butir darah merah dengan metode Cuonting chamber-

burker dan neubauer

Darah diambil dengan menggunakan pipet eritrosit yang telah

dihubungkan dengan aspirometer sampai menunjukkan angka 05

kemudian ditambahkan larutan Hayem sampai menunjukkan angka 101 lalu

dikocok dengan gerakan seperti angka delapan setelah itu sebagian cairan

pada ujung pipet dibuang dan sebagian larutan diteteskan ke dalam kamar

hitung kemudian hitung butir darah merah pada kotak R

b Pengukuran jumlah butir darah putih dengan metode Cuonting chamber-

burker dan neubauer

Untuk mengukur butir darah putih prosedur kerjanya sama dengan

mengukur butir darah merah yang berbeda hanyalah pada larutan yaitu

menggunakan larutan turk sebagai pengencer dan aspirometer menunjukkan

angka 11 serta menghitungnya pada kotak W

c Pengukuran jumlah Hb dengan metode Cyan-methemoglobin

Untuk mengukur hemoglobin digunakan reagen drabkins Reagen

drabkins dipipet sebanyak 50 ml dan masukkan kedalam tabung reaksi 1 dan

2 kemudian ditambahkan 002 ml darah ke tabung reaksi ke 2 dengan

menggunakan pipet sahli atau pipet lain yang bervolume 002 ml lalu

dicampur dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar agar terbentuk

sianmethemoglobin lalu dibaca transmittannya dengan spektrofotometer λ

540 nm

d Pengukuran jumlah hematokrit dengan metode Microhematokrit

Darah diambil dengan menggunakan mikrokapiler yang ujung

disumbat dengan crestaseal kemudian disentrifuse dengan kecepatan 11500

ndash 15000 rpm selama 5 menit Nilai hematokrit ditentukan dengan mengukur

volume eritrosit (lapisan yang berwarna merah) dan dibaca dengan

hematokrit reader

29

Analisis Data

Rancangan percobaan yang digunakan dalam penentuan kadar

malondialdehida (MDA) aktivitas enzim superoksida dismutase (SOD) jumlah

butir darah merah jumlah butir darah putih jumlah hemoglobin dan jumlah

hematokrit adalah rancangan acak lengkap Hasil yang diperoleh akan dianalisis

dengan menggunakan ANOVA dan apabila terdapat perbedaan yang nyata antara

perlakuan maka dilanjutkan dengan uji Duncan

Model persamaan matematik dari percobaan ini adalah sebagai berikut

Yij =μ + Ti +sumij (Mattjik amp Sumertajaya 2006) dimana

I = Banyaknya perlakuan

J = Banyaknya ulangan dari setiap perlakuan

μ = Pengaruh rata-rata pengamatan

Ti = Pengaruh adanya perlakuan ke-I

sum ij= Random error dari percobaan

23

5 P4 merupakan kelompok yang dipapar asap rokok dan diberi vitamin C

secara tidak bersamaan

Setelah dibagi dalam lima kelompok perlakuan tikus-tikus tersebut

diberi perlakuan sesuai dengan rancangan yaitu

a Proses pemaparan

Proses pemaparan dilakukan dalam smoking chamber Tikus dalam

kandang individu dipindahkan ke dalam smoking chamber katup oksigen

dibuka dengan tekanan 05 atmosfer kemudian rokok dipasangkan pada

pipa yang dihubungkan dengan pompa selanjutnya rokok dibakar dan

pompa dinyalakan Biarkan asap rokok masuk kedalam chamber hingga

asap tersebut habis terhirup Pemberian dosis asap rokok adalah satu batang

rokok per lima belas menit selama enam puluh menit Pemaparan dilakukan

setiap pagi mulai dari pukul 0700 sampai 0800 untuk satu kelompok

pemaparan selama tiga puluh hari Perlakuan ini diberikan pada semua

kelompok perlakuan kecuali kelompok kontrol (P0) dan kelompok

perlakuan vitamin C (P1) Proses pemaparan terlihat pada (Gambar 4)

(a) (b) (c)

Gambar 5 Proses pemaparan dari awal hingga akhir (a Awal pemaparan) (b Selama pemaparan) (c Akhir pemaparan)

b Proses pemberian vitamin C

Proses pemberian vitamin C dengan cara pencekokan dengan

menggunakan sonde Vitamin C tersebut dilarutkan dalam 1 ml aquades

Dosis pemberian vitamin C adalah sebanyak 857 mgkg bbhari dan

diberikan setiap pagi pada jam sembilan untuk kelompok perlakuan P1 satu

24

jam setelah pemaparan untuk kelompok perlakuan P3 dan tiga puluh hari

setelah pemaparan asap rokok untuk kelompok perlakuan P4 Proses

pemberian vitamin C terlihat pada (Gambar 5)

Gambar 6 Pemberian vitamin C secara oral

Diagram perlakuan proses pemaparan asap rokok pemberian vitamin C

dan waktu pengambilan sampel tertuang pada (Gambar 6)

Hari Penelitian Perlakuan

1 30 31 60 61

P0

P1

Ket

P2

P3

P4

Gambar 7 Proses pemaparan asap rokok pemberian vitamin C dan waktu pengambilan sampel

Pemberian vitamin C

Hari pengambilan sampel

Pemaparan asap rokok

3 Tahap Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel dilakukan pada hari sesuai yang telah ditetapkan

pada gambar Ada pun parameter yang diukur adalah

1 Kinerja atau aktivitas antioksidan dari vitamin C yang meliputi

a Kadar malondialdehida (MDA)

b Aktivitas enzim superoksida dismutase (SOD)

25

2 Hematologi (gambaran darah) yang meliputi

a Jumlah butir darah merah (BDM)

b Jumlah butir darah putih (BDP)

c Jumlah hemoglobin (Hb)

d Jumlah hematokrit (PCV)

Pada akhir percobaan tikus dikorbankan dengan menggunakan eter

kemudian darahnya diambil secara intrakardial sebanyak 2 ml untuk

pemeriksaan gambaran darah (hematologi) Pembedahan segera dilakukan

untuk mengambil organ hati dan ginjal selanjutnya hati dan ginjal dicuci

dengan garam fisiologis 01 kemudian dibagi menjadi dua bagian Satu

bagian ditimbang dengan berat organ 06 gr lalu dibungkus dengan

aluminium foil dan disimpan difreezer pada suhu -20 degC yang nantinya

digunakan untuk analisis MDA Dan satu bagiannya lagi ditimbang dengan

berat organ 05 gr lalu digerus dengan menggunakan tumbukan dan lumpang

kemudian ditambahkan larutan buffer fosfat 1 ml lalu disentrifuse dengan

kecepatan 10000 rpm selama 20 menit diambil lisatnya lalu disimpan pada

suhu -20deg C dan siap dianalisi enzim SODnya

4 Tahapan Analisis

a Pengukuran kadar MDA (Malondialdehida) Hati dan Ginjal Tikus

(Conti dan Sutherland 1991)

1 Persiapan larutan standar

Larutan kerja 10 μM dibuat dengan mengencerkan stok standar 25

mM 1133 tetraetoksipropana (TEP) Kurva standar dibuat dengan

mengencerkan larutan standar hingga menghasilkan beberapa konsentrasi

yaitu 500 1000 2000 2500 3000 4000 dan 5000 pmol50microL (Lampiran

17)

2 Pengukuran Kadar MDA

Prinsip ini berdasarkan pada kemampuan pembentukan kompleks

berwarna merah muda antara MDA dan asam tiobarbiurat (TBA) Hati dan

ginjal yang telah disimpan dalam freezer -20ordmC dicairkan terlebih dahulu

sebelum dianalisis pada suhu ruang Hati dan ginjal digerus dengan

26

menggunakan lumpang (digerus dalam keadaan dingin) dengan

ditambahkan 125 ml buffer fosfat yang mengandung 115 gL kalium

klorida dalam kondisi dingin pH 74 (disimpan pada suhu 5ordmC) Campuran

ini disentrifuse 4000 rpm selama 10 menit diambil supernatan keruh dan

disentrifuse lagi 4000 rpm selama 10 menit sebanyak 1 ml supernatan

jernih diambil dan ditambahkan 1 ml campuran larutan asam klorida dingin

025 N (223 ml asam klorida pekat100 ml) yang mengandung 15 asam

trikloroasetat (wv)038 asam tiobarbiurat dan 05 butilat

hidroksitoluen) Campuran larutan asam klorida dan supernatan tersebut

dipanaskan 80ordmC (inkubator) selama 1 jam selanjutnya didinginkan dengan

air mengalir dan disentrifuse 3500 rpm selama 10 menit Supernatan hasil

sentifuse tersebut kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang

532 nm

MDA (μmolg protein)= A(μmolg) x 375 ml06 g (bb)

A= Kadar MDA yang diperoleh dari persamaan regresi kurva

standar

b Pengukuran aktivitas enzim SOD (Superoksida dismutase) Hati tikus

(Chen et al 1996)

1 Persiapan Larutan Standar

Larutan standar dibuat dengan melarutkan SOD (Sigma USA) murni

sehingga menghasilkan beberapa konsentrasi larutan yaitu 0 50 100 200

250 300 dan 500 unitml H2O dan larutan ini digunakan untuk membuat

kurva standar (Lampiran 18)

2 Pengukuran Aktivitas SOD

Pengukuran aktivitas enzim SOD (Superoksida dismutase)

ditentukan berdasarkan pengukuran enzim secara tidak langsung dengan

menggunakan spektrofotometer (Gambar 7) Untuk mengukur enzim ini

dipakai sistem xantinxantin (XO) yang menghasilkan anion superoksida

(O2) yang mereduksi ferrisitokrom c

Aktivitas enzim SOD diukur berdasarkan laju penghambatan

reduksi ferrisitokrom c oleh anion superoksida yang dihasilkan oleh

xantinxantin oksidase Oksidasi xantin menghasilkan asam urat dan anion

27

superoksida yang selanjutnya mereduksi ferrisitokrom c Reduksi

ferrisitokrom c diamati berdasarkan kenaikan absorbansi pada panjang

gelombang 550 nm

Reaksinya

Xantin + O2 XO O2˙ + asam urat

O2 + sitokrom c (Fe3+) O2 + sitokrom c

2O2 + 2H+ SOD H2O2 + O2

Gambar 8 Spectrofotometer digital double beam (Hitachi U-2001)

Pengukuran aktivitas enzim ini berlangsung pada suhu 25 ordmC larutan

oksidase harus tetap dalam keadaan dingin (didinginkan selama 15 menit)

sebelum digunakan Medium reaksi segera dipersiapkan sebelum

pengukuran dengan memasukan 29 ml larutan A (campuran larutan xantin

dan larutan sitokrom c) ke dalam tabung reaksi 3 ml Selanjutnya

ditambahkan 50 μl larutan baku (kontrol) atau sampellisat lalu divorteks

secara perlahan Reaksi dimulai dengan larutan B (xantin oksidase) dan

divorteks secara perlahan Kemudian diamati perubahan absorbansi yang

terjadi pada spektrofotometer Untuk blanko digunakan buffer fosfat

sebagai pengganti sampel dan sebagai kontrol digunakan air destilasi

Untuk mengambalikan ke konsentrasi awal yaitu dalam (gr) maka

dikonversi dengan rumus

SOD (Ug) = A (microml) x 06705 g (bb)

A= Aktivitas SOD yang diperoleh dari persamaan regresi kurva

standar

28

c Pengukuran Hematologi

a Pengukuran jumlah butir darah merah dengan metode Cuonting chamber-

burker dan neubauer

Darah diambil dengan menggunakan pipet eritrosit yang telah

dihubungkan dengan aspirometer sampai menunjukkan angka 05

kemudian ditambahkan larutan Hayem sampai menunjukkan angka 101 lalu

dikocok dengan gerakan seperti angka delapan setelah itu sebagian cairan

pada ujung pipet dibuang dan sebagian larutan diteteskan ke dalam kamar

hitung kemudian hitung butir darah merah pada kotak R

b Pengukuran jumlah butir darah putih dengan metode Cuonting chamber-

burker dan neubauer

Untuk mengukur butir darah putih prosedur kerjanya sama dengan

mengukur butir darah merah yang berbeda hanyalah pada larutan yaitu

menggunakan larutan turk sebagai pengencer dan aspirometer menunjukkan

angka 11 serta menghitungnya pada kotak W

c Pengukuran jumlah Hb dengan metode Cyan-methemoglobin

Untuk mengukur hemoglobin digunakan reagen drabkins Reagen

drabkins dipipet sebanyak 50 ml dan masukkan kedalam tabung reaksi 1 dan

2 kemudian ditambahkan 002 ml darah ke tabung reaksi ke 2 dengan

menggunakan pipet sahli atau pipet lain yang bervolume 002 ml lalu

dicampur dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar agar terbentuk

sianmethemoglobin lalu dibaca transmittannya dengan spektrofotometer λ

540 nm

d Pengukuran jumlah hematokrit dengan metode Microhematokrit

Darah diambil dengan menggunakan mikrokapiler yang ujung

disumbat dengan crestaseal kemudian disentrifuse dengan kecepatan 11500

ndash 15000 rpm selama 5 menit Nilai hematokrit ditentukan dengan mengukur

volume eritrosit (lapisan yang berwarna merah) dan dibaca dengan

hematokrit reader

29

Analisis Data

Rancangan percobaan yang digunakan dalam penentuan kadar

malondialdehida (MDA) aktivitas enzim superoksida dismutase (SOD) jumlah

butir darah merah jumlah butir darah putih jumlah hemoglobin dan jumlah

hematokrit adalah rancangan acak lengkap Hasil yang diperoleh akan dianalisis

dengan menggunakan ANOVA dan apabila terdapat perbedaan yang nyata antara

perlakuan maka dilanjutkan dengan uji Duncan

Model persamaan matematik dari percobaan ini adalah sebagai berikut

Yij =μ + Ti +sumij (Mattjik amp Sumertajaya 2006) dimana

I = Banyaknya perlakuan

J = Banyaknya ulangan dari setiap perlakuan

μ = Pengaruh rata-rata pengamatan

Ti = Pengaruh adanya perlakuan ke-I

sum ij= Random error dari percobaan

24

jam setelah pemaparan untuk kelompok perlakuan P3 dan tiga puluh hari

setelah pemaparan asap rokok untuk kelompok perlakuan P4 Proses

pemberian vitamin C terlihat pada (Gambar 5)

Gambar 6 Pemberian vitamin C secara oral

Diagram perlakuan proses pemaparan asap rokok pemberian vitamin C

dan waktu pengambilan sampel tertuang pada (Gambar 6)

Hari Penelitian Perlakuan

1 30 31 60 61

P0

P1

Ket

P2

P3

P4

Gambar 7 Proses pemaparan asap rokok pemberian vitamin C dan waktu pengambilan sampel

Pemberian vitamin C

Hari pengambilan sampel

Pemaparan asap rokok

3 Tahap Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel dilakukan pada hari sesuai yang telah ditetapkan

pada gambar Ada pun parameter yang diukur adalah

1 Kinerja atau aktivitas antioksidan dari vitamin C yang meliputi

a Kadar malondialdehida (MDA)

b Aktivitas enzim superoksida dismutase (SOD)

25

2 Hematologi (gambaran darah) yang meliputi

a Jumlah butir darah merah (BDM)

b Jumlah butir darah putih (BDP)

c Jumlah hemoglobin (Hb)

d Jumlah hematokrit (PCV)

Pada akhir percobaan tikus dikorbankan dengan menggunakan eter

kemudian darahnya diambil secara intrakardial sebanyak 2 ml untuk

pemeriksaan gambaran darah (hematologi) Pembedahan segera dilakukan

untuk mengambil organ hati dan ginjal selanjutnya hati dan ginjal dicuci

dengan garam fisiologis 01 kemudian dibagi menjadi dua bagian Satu

bagian ditimbang dengan berat organ 06 gr lalu dibungkus dengan

aluminium foil dan disimpan difreezer pada suhu -20 degC yang nantinya

digunakan untuk analisis MDA Dan satu bagiannya lagi ditimbang dengan

berat organ 05 gr lalu digerus dengan menggunakan tumbukan dan lumpang

kemudian ditambahkan larutan buffer fosfat 1 ml lalu disentrifuse dengan

kecepatan 10000 rpm selama 20 menit diambil lisatnya lalu disimpan pada

suhu -20deg C dan siap dianalisi enzim SODnya

4 Tahapan Analisis

a Pengukuran kadar MDA (Malondialdehida) Hati dan Ginjal Tikus

(Conti dan Sutherland 1991)

1 Persiapan larutan standar

Larutan kerja 10 μM dibuat dengan mengencerkan stok standar 25

mM 1133 tetraetoksipropana (TEP) Kurva standar dibuat dengan

mengencerkan larutan standar hingga menghasilkan beberapa konsentrasi

yaitu 500 1000 2000 2500 3000 4000 dan 5000 pmol50microL (Lampiran

17)

2 Pengukuran Kadar MDA

Prinsip ini berdasarkan pada kemampuan pembentukan kompleks

berwarna merah muda antara MDA dan asam tiobarbiurat (TBA) Hati dan

ginjal yang telah disimpan dalam freezer -20ordmC dicairkan terlebih dahulu

sebelum dianalisis pada suhu ruang Hati dan ginjal digerus dengan

26

menggunakan lumpang (digerus dalam keadaan dingin) dengan

ditambahkan 125 ml buffer fosfat yang mengandung 115 gL kalium

klorida dalam kondisi dingin pH 74 (disimpan pada suhu 5ordmC) Campuran

ini disentrifuse 4000 rpm selama 10 menit diambil supernatan keruh dan

disentrifuse lagi 4000 rpm selama 10 menit sebanyak 1 ml supernatan

jernih diambil dan ditambahkan 1 ml campuran larutan asam klorida dingin

025 N (223 ml asam klorida pekat100 ml) yang mengandung 15 asam

trikloroasetat (wv)038 asam tiobarbiurat dan 05 butilat

hidroksitoluen) Campuran larutan asam klorida dan supernatan tersebut

dipanaskan 80ordmC (inkubator) selama 1 jam selanjutnya didinginkan dengan

air mengalir dan disentrifuse 3500 rpm selama 10 menit Supernatan hasil

sentifuse tersebut kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang

532 nm

MDA (μmolg protein)= A(μmolg) x 375 ml06 g (bb)

A= Kadar MDA yang diperoleh dari persamaan regresi kurva

standar

b Pengukuran aktivitas enzim SOD (Superoksida dismutase) Hati tikus

(Chen et al 1996)

1 Persiapan Larutan Standar

Larutan standar dibuat dengan melarutkan SOD (Sigma USA) murni

sehingga menghasilkan beberapa konsentrasi larutan yaitu 0 50 100 200

250 300 dan 500 unitml H2O dan larutan ini digunakan untuk membuat

kurva standar (Lampiran 18)

2 Pengukuran Aktivitas SOD

Pengukuran aktivitas enzim SOD (Superoksida dismutase)

ditentukan berdasarkan pengukuran enzim secara tidak langsung dengan

menggunakan spektrofotometer (Gambar 7) Untuk mengukur enzim ini

dipakai sistem xantinxantin (XO) yang menghasilkan anion superoksida

(O2) yang mereduksi ferrisitokrom c

Aktivitas enzim SOD diukur berdasarkan laju penghambatan

reduksi ferrisitokrom c oleh anion superoksida yang dihasilkan oleh

xantinxantin oksidase Oksidasi xantin menghasilkan asam urat dan anion

27

superoksida yang selanjutnya mereduksi ferrisitokrom c Reduksi

ferrisitokrom c diamati berdasarkan kenaikan absorbansi pada panjang

gelombang 550 nm

Reaksinya

Xantin + O2 XO O2˙ + asam urat

O2 + sitokrom c (Fe3+) O2 + sitokrom c

2O2 + 2H+ SOD H2O2 + O2

Gambar 8 Spectrofotometer digital double beam (Hitachi U-2001)

Pengukuran aktivitas enzim ini berlangsung pada suhu 25 ordmC larutan

oksidase harus tetap dalam keadaan dingin (didinginkan selama 15 menit)

sebelum digunakan Medium reaksi segera dipersiapkan sebelum

pengukuran dengan memasukan 29 ml larutan A (campuran larutan xantin

dan larutan sitokrom c) ke dalam tabung reaksi 3 ml Selanjutnya

ditambahkan 50 μl larutan baku (kontrol) atau sampellisat lalu divorteks

secara perlahan Reaksi dimulai dengan larutan B (xantin oksidase) dan

divorteks secara perlahan Kemudian diamati perubahan absorbansi yang

terjadi pada spektrofotometer Untuk blanko digunakan buffer fosfat

sebagai pengganti sampel dan sebagai kontrol digunakan air destilasi

Untuk mengambalikan ke konsentrasi awal yaitu dalam (gr) maka

dikonversi dengan rumus

SOD (Ug) = A (microml) x 06705 g (bb)

A= Aktivitas SOD yang diperoleh dari persamaan regresi kurva

standar

28

c Pengukuran Hematologi

a Pengukuran jumlah butir darah merah dengan metode Cuonting chamber-

burker dan neubauer

Darah diambil dengan menggunakan pipet eritrosit yang telah

dihubungkan dengan aspirometer sampai menunjukkan angka 05

kemudian ditambahkan larutan Hayem sampai menunjukkan angka 101 lalu

dikocok dengan gerakan seperti angka delapan setelah itu sebagian cairan

pada ujung pipet dibuang dan sebagian larutan diteteskan ke dalam kamar

hitung kemudian hitung butir darah merah pada kotak R

b Pengukuran jumlah butir darah putih dengan metode Cuonting chamber-

burker dan neubauer

Untuk mengukur butir darah putih prosedur kerjanya sama dengan

mengukur butir darah merah yang berbeda hanyalah pada larutan yaitu

menggunakan larutan turk sebagai pengencer dan aspirometer menunjukkan

angka 11 serta menghitungnya pada kotak W

c Pengukuran jumlah Hb dengan metode Cyan-methemoglobin

Untuk mengukur hemoglobin digunakan reagen drabkins Reagen

drabkins dipipet sebanyak 50 ml dan masukkan kedalam tabung reaksi 1 dan

2 kemudian ditambahkan 002 ml darah ke tabung reaksi ke 2 dengan

menggunakan pipet sahli atau pipet lain yang bervolume 002 ml lalu

dicampur dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar agar terbentuk

sianmethemoglobin lalu dibaca transmittannya dengan spektrofotometer λ

540 nm

d Pengukuran jumlah hematokrit dengan metode Microhematokrit

Darah diambil dengan menggunakan mikrokapiler yang ujung

disumbat dengan crestaseal kemudian disentrifuse dengan kecepatan 11500

ndash 15000 rpm selama 5 menit Nilai hematokrit ditentukan dengan mengukur

volume eritrosit (lapisan yang berwarna merah) dan dibaca dengan

hematokrit reader

29

Analisis Data

Rancangan percobaan yang digunakan dalam penentuan kadar

malondialdehida (MDA) aktivitas enzim superoksida dismutase (SOD) jumlah

butir darah merah jumlah butir darah putih jumlah hemoglobin dan jumlah

hematokrit adalah rancangan acak lengkap Hasil yang diperoleh akan dianalisis

dengan menggunakan ANOVA dan apabila terdapat perbedaan yang nyata antara

perlakuan maka dilanjutkan dengan uji Duncan

Model persamaan matematik dari percobaan ini adalah sebagai berikut

Yij =μ + Ti +sumij (Mattjik amp Sumertajaya 2006) dimana

I = Banyaknya perlakuan

J = Banyaknya ulangan dari setiap perlakuan

μ = Pengaruh rata-rata pengamatan

Ti = Pengaruh adanya perlakuan ke-I

sum ij= Random error dari percobaan

25

2 Hematologi (gambaran darah) yang meliputi

a Jumlah butir darah merah (BDM)

b Jumlah butir darah putih (BDP)

c Jumlah hemoglobin (Hb)

d Jumlah hematokrit (PCV)

Pada akhir percobaan tikus dikorbankan dengan menggunakan eter

kemudian darahnya diambil secara intrakardial sebanyak 2 ml untuk

pemeriksaan gambaran darah (hematologi) Pembedahan segera dilakukan

untuk mengambil organ hati dan ginjal selanjutnya hati dan ginjal dicuci

dengan garam fisiologis 01 kemudian dibagi menjadi dua bagian Satu

bagian ditimbang dengan berat organ 06 gr lalu dibungkus dengan

aluminium foil dan disimpan difreezer pada suhu -20 degC yang nantinya

digunakan untuk analisis MDA Dan satu bagiannya lagi ditimbang dengan

berat organ 05 gr lalu digerus dengan menggunakan tumbukan dan lumpang

kemudian ditambahkan larutan buffer fosfat 1 ml lalu disentrifuse dengan

kecepatan 10000 rpm selama 20 menit diambil lisatnya lalu disimpan pada

suhu -20deg C dan siap dianalisi enzim SODnya

4 Tahapan Analisis

a Pengukuran kadar MDA (Malondialdehida) Hati dan Ginjal Tikus

(Conti dan Sutherland 1991)

1 Persiapan larutan standar

Larutan kerja 10 μM dibuat dengan mengencerkan stok standar 25

mM 1133 tetraetoksipropana (TEP) Kurva standar dibuat dengan

mengencerkan larutan standar hingga menghasilkan beberapa konsentrasi

yaitu 500 1000 2000 2500 3000 4000 dan 5000 pmol50microL (Lampiran

17)

2 Pengukuran Kadar MDA

Prinsip ini berdasarkan pada kemampuan pembentukan kompleks

berwarna merah muda antara MDA dan asam tiobarbiurat (TBA) Hati dan

ginjal yang telah disimpan dalam freezer -20ordmC dicairkan terlebih dahulu

sebelum dianalisis pada suhu ruang Hati dan ginjal digerus dengan

26

menggunakan lumpang (digerus dalam keadaan dingin) dengan

ditambahkan 125 ml buffer fosfat yang mengandung 115 gL kalium

klorida dalam kondisi dingin pH 74 (disimpan pada suhu 5ordmC) Campuran

ini disentrifuse 4000 rpm selama 10 menit diambil supernatan keruh dan

disentrifuse lagi 4000 rpm selama 10 menit sebanyak 1 ml supernatan

jernih diambil dan ditambahkan 1 ml campuran larutan asam klorida dingin

025 N (223 ml asam klorida pekat100 ml) yang mengandung 15 asam

trikloroasetat (wv)038 asam tiobarbiurat dan 05 butilat

hidroksitoluen) Campuran larutan asam klorida dan supernatan tersebut

dipanaskan 80ordmC (inkubator) selama 1 jam selanjutnya didinginkan dengan

air mengalir dan disentrifuse 3500 rpm selama 10 menit Supernatan hasil

sentifuse tersebut kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang

532 nm

MDA (μmolg protein)= A(μmolg) x 375 ml06 g (bb)

A= Kadar MDA yang diperoleh dari persamaan regresi kurva

standar

b Pengukuran aktivitas enzim SOD (Superoksida dismutase) Hati tikus

(Chen et al 1996)

1 Persiapan Larutan Standar

Larutan standar dibuat dengan melarutkan SOD (Sigma USA) murni

sehingga menghasilkan beberapa konsentrasi larutan yaitu 0 50 100 200

250 300 dan 500 unitml H2O dan larutan ini digunakan untuk membuat

kurva standar (Lampiran 18)

2 Pengukuran Aktivitas SOD

Pengukuran aktivitas enzim SOD (Superoksida dismutase)

ditentukan berdasarkan pengukuran enzim secara tidak langsung dengan

menggunakan spektrofotometer (Gambar 7) Untuk mengukur enzim ini

dipakai sistem xantinxantin (XO) yang menghasilkan anion superoksida

(O2) yang mereduksi ferrisitokrom c

Aktivitas enzim SOD diukur berdasarkan laju penghambatan

reduksi ferrisitokrom c oleh anion superoksida yang dihasilkan oleh

xantinxantin oksidase Oksidasi xantin menghasilkan asam urat dan anion

27

superoksida yang selanjutnya mereduksi ferrisitokrom c Reduksi

ferrisitokrom c diamati berdasarkan kenaikan absorbansi pada panjang

gelombang 550 nm

Reaksinya

Xantin + O2 XO O2˙ + asam urat

O2 + sitokrom c (Fe3+) O2 + sitokrom c

2O2 + 2H+ SOD H2O2 + O2

Gambar 8 Spectrofotometer digital double beam (Hitachi U-2001)

Pengukuran aktivitas enzim ini berlangsung pada suhu 25 ordmC larutan

oksidase harus tetap dalam keadaan dingin (didinginkan selama 15 menit)

sebelum digunakan Medium reaksi segera dipersiapkan sebelum

pengukuran dengan memasukan 29 ml larutan A (campuran larutan xantin

dan larutan sitokrom c) ke dalam tabung reaksi 3 ml Selanjutnya

ditambahkan 50 μl larutan baku (kontrol) atau sampellisat lalu divorteks

secara perlahan Reaksi dimulai dengan larutan B (xantin oksidase) dan

divorteks secara perlahan Kemudian diamati perubahan absorbansi yang

terjadi pada spektrofotometer Untuk blanko digunakan buffer fosfat

sebagai pengganti sampel dan sebagai kontrol digunakan air destilasi

Untuk mengambalikan ke konsentrasi awal yaitu dalam (gr) maka

dikonversi dengan rumus

SOD (Ug) = A (microml) x 06705 g (bb)

A= Aktivitas SOD yang diperoleh dari persamaan regresi kurva

standar

28

c Pengukuran Hematologi

a Pengukuran jumlah butir darah merah dengan metode Cuonting chamber-

burker dan neubauer

Darah diambil dengan menggunakan pipet eritrosit yang telah

dihubungkan dengan aspirometer sampai menunjukkan angka 05

kemudian ditambahkan larutan Hayem sampai menunjukkan angka 101 lalu

dikocok dengan gerakan seperti angka delapan setelah itu sebagian cairan

pada ujung pipet dibuang dan sebagian larutan diteteskan ke dalam kamar

hitung kemudian hitung butir darah merah pada kotak R

b Pengukuran jumlah butir darah putih dengan metode Cuonting chamber-

burker dan neubauer

Untuk mengukur butir darah putih prosedur kerjanya sama dengan

mengukur butir darah merah yang berbeda hanyalah pada larutan yaitu

menggunakan larutan turk sebagai pengencer dan aspirometer menunjukkan

angka 11 serta menghitungnya pada kotak W

c Pengukuran jumlah Hb dengan metode Cyan-methemoglobin

Untuk mengukur hemoglobin digunakan reagen drabkins Reagen

drabkins dipipet sebanyak 50 ml dan masukkan kedalam tabung reaksi 1 dan

2 kemudian ditambahkan 002 ml darah ke tabung reaksi ke 2 dengan

menggunakan pipet sahli atau pipet lain yang bervolume 002 ml lalu

dicampur dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar agar terbentuk

sianmethemoglobin lalu dibaca transmittannya dengan spektrofotometer λ

540 nm

d Pengukuran jumlah hematokrit dengan metode Microhematokrit

Darah diambil dengan menggunakan mikrokapiler yang ujung

disumbat dengan crestaseal kemudian disentrifuse dengan kecepatan 11500

ndash 15000 rpm selama 5 menit Nilai hematokrit ditentukan dengan mengukur

volume eritrosit (lapisan yang berwarna merah) dan dibaca dengan

hematokrit reader

29

Analisis Data

Rancangan percobaan yang digunakan dalam penentuan kadar

malondialdehida (MDA) aktivitas enzim superoksida dismutase (SOD) jumlah

butir darah merah jumlah butir darah putih jumlah hemoglobin dan jumlah

hematokrit adalah rancangan acak lengkap Hasil yang diperoleh akan dianalisis

dengan menggunakan ANOVA dan apabila terdapat perbedaan yang nyata antara

perlakuan maka dilanjutkan dengan uji Duncan

Model persamaan matematik dari percobaan ini adalah sebagai berikut

Yij =μ + Ti +sumij (Mattjik amp Sumertajaya 2006) dimana

I = Banyaknya perlakuan

J = Banyaknya ulangan dari setiap perlakuan

μ = Pengaruh rata-rata pengamatan

Ti = Pengaruh adanya perlakuan ke-I

sum ij= Random error dari percobaan

26

menggunakan lumpang (digerus dalam keadaan dingin) dengan

ditambahkan 125 ml buffer fosfat yang mengandung 115 gL kalium

klorida dalam kondisi dingin pH 74 (disimpan pada suhu 5ordmC) Campuran

ini disentrifuse 4000 rpm selama 10 menit diambil supernatan keruh dan

disentrifuse lagi 4000 rpm selama 10 menit sebanyak 1 ml supernatan

jernih diambil dan ditambahkan 1 ml campuran larutan asam klorida dingin

025 N (223 ml asam klorida pekat100 ml) yang mengandung 15 asam

trikloroasetat (wv)038 asam tiobarbiurat dan 05 butilat

hidroksitoluen) Campuran larutan asam klorida dan supernatan tersebut

dipanaskan 80ordmC (inkubator) selama 1 jam selanjutnya didinginkan dengan

air mengalir dan disentrifuse 3500 rpm selama 10 menit Supernatan hasil

sentifuse tersebut kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang

532 nm

MDA (μmolg protein)= A(μmolg) x 375 ml06 g (bb)

A= Kadar MDA yang diperoleh dari persamaan regresi kurva

standar

b Pengukuran aktivitas enzim SOD (Superoksida dismutase) Hati tikus

(Chen et al 1996)

1 Persiapan Larutan Standar

Larutan standar dibuat dengan melarutkan SOD (Sigma USA) murni

sehingga menghasilkan beberapa konsentrasi larutan yaitu 0 50 100 200

250 300 dan 500 unitml H2O dan larutan ini digunakan untuk membuat

kurva standar (Lampiran 18)

2 Pengukuran Aktivitas SOD

Pengukuran aktivitas enzim SOD (Superoksida dismutase)

ditentukan berdasarkan pengukuran enzim secara tidak langsung dengan

menggunakan spektrofotometer (Gambar 7) Untuk mengukur enzim ini

dipakai sistem xantinxantin (XO) yang menghasilkan anion superoksida

(O2) yang mereduksi ferrisitokrom c

Aktivitas enzim SOD diukur berdasarkan laju penghambatan

reduksi ferrisitokrom c oleh anion superoksida yang dihasilkan oleh

xantinxantin oksidase Oksidasi xantin menghasilkan asam urat dan anion

27

superoksida yang selanjutnya mereduksi ferrisitokrom c Reduksi

ferrisitokrom c diamati berdasarkan kenaikan absorbansi pada panjang

gelombang 550 nm

Reaksinya

Xantin + O2 XO O2˙ + asam urat

O2 + sitokrom c (Fe3+) O2 + sitokrom c

2O2 + 2H+ SOD H2O2 + O2

Gambar 8 Spectrofotometer digital double beam (Hitachi U-2001)

Pengukuran aktivitas enzim ini berlangsung pada suhu 25 ordmC larutan

oksidase harus tetap dalam keadaan dingin (didinginkan selama 15 menit)

sebelum digunakan Medium reaksi segera dipersiapkan sebelum

pengukuran dengan memasukan 29 ml larutan A (campuran larutan xantin

dan larutan sitokrom c) ke dalam tabung reaksi 3 ml Selanjutnya

ditambahkan 50 μl larutan baku (kontrol) atau sampellisat lalu divorteks

secara perlahan Reaksi dimulai dengan larutan B (xantin oksidase) dan

divorteks secara perlahan Kemudian diamati perubahan absorbansi yang

terjadi pada spektrofotometer Untuk blanko digunakan buffer fosfat

sebagai pengganti sampel dan sebagai kontrol digunakan air destilasi

Untuk mengambalikan ke konsentrasi awal yaitu dalam (gr) maka

dikonversi dengan rumus

SOD (Ug) = A (microml) x 06705 g (bb)

A= Aktivitas SOD yang diperoleh dari persamaan regresi kurva

standar

28

c Pengukuran Hematologi

a Pengukuran jumlah butir darah merah dengan metode Cuonting chamber-

burker dan neubauer

Darah diambil dengan menggunakan pipet eritrosit yang telah

dihubungkan dengan aspirometer sampai menunjukkan angka 05

kemudian ditambahkan larutan Hayem sampai menunjukkan angka 101 lalu

dikocok dengan gerakan seperti angka delapan setelah itu sebagian cairan

pada ujung pipet dibuang dan sebagian larutan diteteskan ke dalam kamar

hitung kemudian hitung butir darah merah pada kotak R

b Pengukuran jumlah butir darah putih dengan metode Cuonting chamber-

burker dan neubauer

Untuk mengukur butir darah putih prosedur kerjanya sama dengan

mengukur butir darah merah yang berbeda hanyalah pada larutan yaitu

menggunakan larutan turk sebagai pengencer dan aspirometer menunjukkan

angka 11 serta menghitungnya pada kotak W

c Pengukuran jumlah Hb dengan metode Cyan-methemoglobin

Untuk mengukur hemoglobin digunakan reagen drabkins Reagen

drabkins dipipet sebanyak 50 ml dan masukkan kedalam tabung reaksi 1 dan

2 kemudian ditambahkan 002 ml darah ke tabung reaksi ke 2 dengan

menggunakan pipet sahli atau pipet lain yang bervolume 002 ml lalu

dicampur dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar agar terbentuk

sianmethemoglobin lalu dibaca transmittannya dengan spektrofotometer λ

540 nm

d Pengukuran jumlah hematokrit dengan metode Microhematokrit

Darah diambil dengan menggunakan mikrokapiler yang ujung

disumbat dengan crestaseal kemudian disentrifuse dengan kecepatan 11500

ndash 15000 rpm selama 5 menit Nilai hematokrit ditentukan dengan mengukur

volume eritrosit (lapisan yang berwarna merah) dan dibaca dengan

hematokrit reader

29

Analisis Data

Rancangan percobaan yang digunakan dalam penentuan kadar

malondialdehida (MDA) aktivitas enzim superoksida dismutase (SOD) jumlah

butir darah merah jumlah butir darah putih jumlah hemoglobin dan jumlah

hematokrit adalah rancangan acak lengkap Hasil yang diperoleh akan dianalisis

dengan menggunakan ANOVA dan apabila terdapat perbedaan yang nyata antara

perlakuan maka dilanjutkan dengan uji Duncan

Model persamaan matematik dari percobaan ini adalah sebagai berikut

Yij =μ + Ti +sumij (Mattjik amp Sumertajaya 2006) dimana

I = Banyaknya perlakuan

J = Banyaknya ulangan dari setiap perlakuan

μ = Pengaruh rata-rata pengamatan

Ti = Pengaruh adanya perlakuan ke-I

sum ij= Random error dari percobaan

27

superoksida yang selanjutnya mereduksi ferrisitokrom c Reduksi

ferrisitokrom c diamati berdasarkan kenaikan absorbansi pada panjang

gelombang 550 nm

Reaksinya

Xantin + O2 XO O2˙ + asam urat

O2 + sitokrom c (Fe3+) O2 + sitokrom c

2O2 + 2H+ SOD H2O2 + O2

Gambar 8 Spectrofotometer digital double beam (Hitachi U-2001)

Pengukuran aktivitas enzim ini berlangsung pada suhu 25 ordmC larutan

oksidase harus tetap dalam keadaan dingin (didinginkan selama 15 menit)

sebelum digunakan Medium reaksi segera dipersiapkan sebelum

pengukuran dengan memasukan 29 ml larutan A (campuran larutan xantin

dan larutan sitokrom c) ke dalam tabung reaksi 3 ml Selanjutnya

ditambahkan 50 μl larutan baku (kontrol) atau sampellisat lalu divorteks

secara perlahan Reaksi dimulai dengan larutan B (xantin oksidase) dan

divorteks secara perlahan Kemudian diamati perubahan absorbansi yang

terjadi pada spektrofotometer Untuk blanko digunakan buffer fosfat

sebagai pengganti sampel dan sebagai kontrol digunakan air destilasi

Untuk mengambalikan ke konsentrasi awal yaitu dalam (gr) maka

dikonversi dengan rumus

SOD (Ug) = A (microml) x 06705 g (bb)

A= Aktivitas SOD yang diperoleh dari persamaan regresi kurva

standar

28

c Pengukuran Hematologi

a Pengukuran jumlah butir darah merah dengan metode Cuonting chamber-

burker dan neubauer

Darah diambil dengan menggunakan pipet eritrosit yang telah

dihubungkan dengan aspirometer sampai menunjukkan angka 05

kemudian ditambahkan larutan Hayem sampai menunjukkan angka 101 lalu

dikocok dengan gerakan seperti angka delapan setelah itu sebagian cairan

pada ujung pipet dibuang dan sebagian larutan diteteskan ke dalam kamar

hitung kemudian hitung butir darah merah pada kotak R

b Pengukuran jumlah butir darah putih dengan metode Cuonting chamber-

burker dan neubauer

Untuk mengukur butir darah putih prosedur kerjanya sama dengan

mengukur butir darah merah yang berbeda hanyalah pada larutan yaitu

menggunakan larutan turk sebagai pengencer dan aspirometer menunjukkan

angka 11 serta menghitungnya pada kotak W

c Pengukuran jumlah Hb dengan metode Cyan-methemoglobin

Untuk mengukur hemoglobin digunakan reagen drabkins Reagen

drabkins dipipet sebanyak 50 ml dan masukkan kedalam tabung reaksi 1 dan

2 kemudian ditambahkan 002 ml darah ke tabung reaksi ke 2 dengan

menggunakan pipet sahli atau pipet lain yang bervolume 002 ml lalu

dicampur dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar agar terbentuk

sianmethemoglobin lalu dibaca transmittannya dengan spektrofotometer λ

540 nm

d Pengukuran jumlah hematokrit dengan metode Microhematokrit

Darah diambil dengan menggunakan mikrokapiler yang ujung

disumbat dengan crestaseal kemudian disentrifuse dengan kecepatan 11500

ndash 15000 rpm selama 5 menit Nilai hematokrit ditentukan dengan mengukur

volume eritrosit (lapisan yang berwarna merah) dan dibaca dengan

hematokrit reader

29

Analisis Data

Rancangan percobaan yang digunakan dalam penentuan kadar

malondialdehida (MDA) aktivitas enzim superoksida dismutase (SOD) jumlah

butir darah merah jumlah butir darah putih jumlah hemoglobin dan jumlah

hematokrit adalah rancangan acak lengkap Hasil yang diperoleh akan dianalisis

dengan menggunakan ANOVA dan apabila terdapat perbedaan yang nyata antara

perlakuan maka dilanjutkan dengan uji Duncan

Model persamaan matematik dari percobaan ini adalah sebagai berikut

Yij =μ + Ti +sumij (Mattjik amp Sumertajaya 2006) dimana

I = Banyaknya perlakuan

J = Banyaknya ulangan dari setiap perlakuan

μ = Pengaruh rata-rata pengamatan

Ti = Pengaruh adanya perlakuan ke-I

sum ij= Random error dari percobaan

28

c Pengukuran Hematologi

a Pengukuran jumlah butir darah merah dengan metode Cuonting chamber-

burker dan neubauer

Darah diambil dengan menggunakan pipet eritrosit yang telah

dihubungkan dengan aspirometer sampai menunjukkan angka 05

kemudian ditambahkan larutan Hayem sampai menunjukkan angka 101 lalu

dikocok dengan gerakan seperti angka delapan setelah itu sebagian cairan

pada ujung pipet dibuang dan sebagian larutan diteteskan ke dalam kamar

hitung kemudian hitung butir darah merah pada kotak R

b Pengukuran jumlah butir darah putih dengan metode Cuonting chamber-

burker dan neubauer

Untuk mengukur butir darah putih prosedur kerjanya sama dengan

mengukur butir darah merah yang berbeda hanyalah pada larutan yaitu

menggunakan larutan turk sebagai pengencer dan aspirometer menunjukkan

angka 11 serta menghitungnya pada kotak W

c Pengukuran jumlah Hb dengan metode Cyan-methemoglobin

Untuk mengukur hemoglobin digunakan reagen drabkins Reagen

drabkins dipipet sebanyak 50 ml dan masukkan kedalam tabung reaksi 1 dan

2 kemudian ditambahkan 002 ml darah ke tabung reaksi ke 2 dengan

menggunakan pipet sahli atau pipet lain yang bervolume 002 ml lalu

dicampur dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar agar terbentuk

sianmethemoglobin lalu dibaca transmittannya dengan spektrofotometer λ

540 nm

d Pengukuran jumlah hematokrit dengan metode Microhematokrit

Darah diambil dengan menggunakan mikrokapiler yang ujung

disumbat dengan crestaseal kemudian disentrifuse dengan kecepatan 11500

ndash 15000 rpm selama 5 menit Nilai hematokrit ditentukan dengan mengukur

volume eritrosit (lapisan yang berwarna merah) dan dibaca dengan

hematokrit reader

29

Analisis Data

Rancangan percobaan yang digunakan dalam penentuan kadar

malondialdehida (MDA) aktivitas enzim superoksida dismutase (SOD) jumlah

butir darah merah jumlah butir darah putih jumlah hemoglobin dan jumlah

hematokrit adalah rancangan acak lengkap Hasil yang diperoleh akan dianalisis

dengan menggunakan ANOVA dan apabila terdapat perbedaan yang nyata antara

perlakuan maka dilanjutkan dengan uji Duncan

Model persamaan matematik dari percobaan ini adalah sebagai berikut

Yij =μ + Ti +sumij (Mattjik amp Sumertajaya 2006) dimana

I = Banyaknya perlakuan

J = Banyaknya ulangan dari setiap perlakuan

μ = Pengaruh rata-rata pengamatan

Ti = Pengaruh adanya perlakuan ke-I

sum ij= Random error dari percobaan

29

Analisis Data

Rancangan percobaan yang digunakan dalam penentuan kadar

malondialdehida (MDA) aktivitas enzim superoksida dismutase (SOD) jumlah

butir darah merah jumlah butir darah putih jumlah hemoglobin dan jumlah

hematokrit adalah rancangan acak lengkap Hasil yang diperoleh akan dianalisis

dengan menggunakan ANOVA dan apabila terdapat perbedaan yang nyata antara

perlakuan maka dilanjutkan dengan uji Duncan

Model persamaan matematik dari percobaan ini adalah sebagai berikut

Yij =μ + Ti +sumij (Mattjik amp Sumertajaya 2006) dimana

I = Banyaknya perlakuan

J = Banyaknya ulangan dari setiap perlakuan

μ = Pengaruh rata-rata pengamatan

Ti = Pengaruh adanya perlakuan ke-I

sum ij= Random error dari percobaan