19

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

2.1Sonneratia albaSonneratia alba adalah sejenispohonpenyusunhutan bakau. Pohon berbatang besar ini sering didapati di bagian hutan yang dasarnya berbatu karang atau berpasir, langsung berhadapan denganlautterbuka. Hidup menyebar mulai dariAfrikatimur, KepulauanSeychelledanMadagaskar,Asia Tenggara, hingga keAustraliatropis,Kaledonia Baru, kepulauan diPasifikbarat danOseaniabarat daya.

Gambar 2. Sonneratia albaSumber : : Wibowo Jatmiko 2011

Klasifikasi ilmiah meurut J.E. Smith :Kerajaan : plantaeDivisi: MagnoliophytaKelas : MagnoliopsidaOrdo : MyrtalesFamily : LythraceaeGenus : SonneratiaSpesies : Sonneratia alba

Sonneratia merupakan jenis pionir, berupa pohon berukuran sedang hingga besar. Sonneratia atau lebih dikenal dengan nama daerah pedada atau bogem, adalah jenis mangrove yang buahnya bisa dimakan. Kadang-kadang daun-daun muda tersebut dapat disayur dan atau dimakan mentah sebagai lalap. Sonneratia alba mengandung senyawa silitol, polyol, sukrosa, fruktosa, tannin, mineral dan nukleotida (Bandaranayake 2002). Beberapa konstituen bioaktif teridentifikasi dari ekstrak diklorometan batang Sonneratia alba. Senyawa tersebut yaitu triterpenoid pentasiklik (lupeol, asam oleanolat dan asam betulinat), 2,6-dimethoxy-p-benzoquinone, stigmasterol dan -sitosterol. Asam oleanolat dan asam betulinat aktif sebagai anti mikobakteri. 2,6-dimethoxy-p-benzoquinone aktif sebagai anti malaria. (Chaiyadej et al 2004)

Gambar 3. Senyawa bioaktif pada ekstrak diklorometan batang S. Alba Sumber : Kanchuree Chaiyadej et al 2004

Bagian daun dan batang Sonneratia alba mengandung asam-asam lemak non trans, terutama asam gamma linolenat (GLA). Pada daun terdapat GLA sebanyak 36,20% sementara pada batang sebanyak 11 % (Patil et.al 2012). Asam gamma linolenat merupakan senyawa antiinflamasi alami dan imunomodulator melalui mekanisme penghambatan leukotrien B4 pada jalur siklooksigenase (COX) dan lipooksigenase (LOX) (Kapoor 2006).

Tabel 1: Asam lemak pada batang Sonneratia alba (Patil et al 2012).

2.2Ikan Nila Ikannilaadalahjenisikankonsumsi air tawar. Ikanini diintroduksi dari Afrika, tepatnya Afrika bagian timur, pada tahun 1969. Nama ilmiahnyaadalah Oreochromis niloticus, dan dalam bahasa Inggris dikenal sebagaiNile Tilapia. Ikannila dapat berkembang dengan baik pada suhu air yang hangat dan tidak produktif di suhu yang dingin. Ikannila dikenal denganikantropis karena memang hanya ada di daerah tropis seperti indonesia. Adapun klasifikasi lengkap ikn nila menurut Trewas (1982) dalam susyanto (1994) adalah sebagai berikut :Filum : chordataSub filum: vertebrataKelas: OsteichthyesSub kelas: AcanthopterigiiOrdo: PerchomorphiFamili: CichlidaeGenus: OreochromisSpesies: Oreochromis niloticus

Gambar 4. Ikan NilaSumber : http://rustadhieperikanan.blogspot.com

Ikan nila merupakan spesies ikan tropis yang lebih suka hidup di air dangkal (Trewavas 1982). Susantyo (1994) menyatakan bahwa ciri-ciri dari nila adalah terdapat garis vertical yang berwarna gelap pada sirip ekor sebanyak enam buah, garis seperti ini juga terdapat pada sirip punggung dan srip dubur . sisik berbentuk stenoid berukuran besar dan tersusun rapih. Kadar oksigen yang baik untuk ikan nila berkisar 3-5 mgL-1, sedangkan derajat keasamannya (pH) adalah 6,6-8,5. Keadaan konsentrSI CO2 yang masih ditoleris oleh ikan nila adalah 15-30 mgL-1, sedangkan untuk NH3 dan H2S tidak lebih dari 2 mgL-1. Suhu air yang optimal untuk ikan nila 25-28OC. Kehidupan ikan nila mulai terganggu pada suhu dibawah 14oC ataupun diatas 38oC. Fluktuasi suhu harian yang cukup baik untuk ikan nila adalah kurang dari 15oC. Keadaan ini masih juga dianggap baik untuk semua jenis ikan nila (Rukmana 1992) dalam donny abidin (2013)Ikan nila dapat dapat menyesuaikan diri terhadap perairan yang kadar garamnya ting gi dan dapat hidup pada perairan yang kadar garamnya 35 ppt. Tetapi kadar garam yang optimal untu budidaya ikan nila adalah 0-10 mgL-1 (Amri dan khairuman 2003)

2.3Senyawa Fitokimia Analisis fitokimia dilakukan dengan tujuan untuk menentukan ciri senyawa aktif penyebab efek racun atau efek yang bermanfaat yang ditunjukkan oleh ekstrak tumbuhan kasar bila diujikan dengan sistem biologi. Idealnya untuk analisis fitokimia harus digunakan jaringan tumbuhan segar. Cara lain, tumbuhan dapat dikeringkan, pengeringan harus dilakuan secepatnya tanpa menggunakan suhu tinggi, lebih baik dengan aliran udara yang baik untuk mencegah perubahan kimia yang terlalu banyak (Harborne 1987). Alkaloid adalah senyawa alami, baik pada tanaman, hewan, ataupun jamur dan merupakan produk yang dihasilkan dari proses metabolisme sekunder, saat ini diketahui sebanyak 5.500 jenis alkaloid (Harborne 1987). Alkaloid sebagian besar terdiri dari komponen ammonia berbasis nitrogen yang disintesis dari asam amino. Senyawa ini bersifat basa karena adanya atom nitrogen. Sebagian besar alkaloid terdapat pada padatan yaitu atropine, beberapa berbentuk cairan berisi karbon, hidrogen dan nitrogen (Doughari 2012). Bandaranayake (2002) mengemukakan bahwa alkaloid memiliki banyak aktivitas farmakologi. Triterpenoid adalah senyawa yang kerangka karbonnya berasal dari enam satuan isoprena dan secara biosintesis diturunkan dari skualena. Senyawa ini berstruktur siklik yaitu nisbi rumit, kebanyakan berupa alkohol, aldehida atau asam karboksilat. Triterpenoid berupa senyawa tidak berwarna, berbentuk kristal, seringkali bertitik leleh tinggi dan aktif optik yang umumnya sukar dicirikan karena tidak ada kereaktifan kimianya (Harborne 1987). Hasil penelitian yang dilakukan Ravikumar et al. (2011) menunjukkan bahwa senyawa terpenoid terkandung dalam jumlah banyak pada ekstrak A. marina, sedangkan jumlahnya sedikit pada ekstrak Ceriops decandra dan Bruguiera cylindrica. Senyawa fenol meliputi aneka ragam senyawa yang berasal dari tumbuhan, mempunyai ciri yang sama yaitu cincin aromatik yang mengandung satu atau dua penyulih hidroksil (Harborne 1987). Michalowicz (2007) dalam M.I.T Arifin (2013) mengemukakan bahwa senyawa fenol tidak berwarna, mengkristal, larut dalam air dan pelarut organik. Ravikumar et al. (2011) menemukan bahwa senyawa polifenol terkandung pada A. marina dalam jumlah kecil. Flavonoid merupakan golongan terbesar dari ribuan senyawa fenol, tapi fenol monosiklik sederhana, fenilpropanoid dan kuinon fenolik juga terdapat dalam jumlah besar. Flavonoid terutama berupa senyawa yang larut dalam air (Harborne 1987). Penelitian yang dilakukan oleh Prabhu dan Guruvayoorappan (2012) menunjukkan bahwa ekstrak metanol A. marina mengandung senyawa flavonoid antara lain luteolin 7-o-methylether, galactoside analogue, quercetin dan kaempferol.Saponin adalah molekul gula yang tergabung dengan aglikon triterpenoid atau steroid. Saponin terbagi menjadi dua kelompok utama yaitu saponin steroid dan saponin triterpenoid. Saponin larut dlam air namun tidak larut dalam eter, serta menghasilkan aglikon (Doughari 2012). Hasil penelitian Ravikumar et al. (2011) menunjukkan saponin terkandung dalam jumlah sedikit pada ekstrak daun A. marina. Tanin terdapat luas dalam tumbuhan berpembuluh khususnya dalam jaringan kayu. Tanin dapat bereaksi dengan protein membentuk kopolimer mantap yang tidak larut dalam air (Harborne 1987). Menurut Clinton (2009) dalam Elfa Mufida (2013) tanin dibagi menjadi dua kelompok yaitu tanin kondensasi dan tanin hidrolisis. Tanin hidrolisis terbentuk dari unit asam galat atau asam epigalat yang terkondensasi pada molekul gula. Tanin kondensasi adalah dimer atau oligomer dari katekin, epikatekin dan unit sejenisnya.

2.4Senyawa antimikroba Senyawa antimikroba didefinisikan sebagai senyawa biologis atau kimia yang dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Senyawa antimikroba dapat dibedakan menjadi mikrosidal (bakterisidal) dan mikrostatik (bakteriostatik). Senyawa yang bersifat bakterisidal mampu membunuh bakteri sedangkan senyawa yang bersifat bakteriostatik dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Senyawa yang bersifat membunuh lebih baik daipada yang hanya bersifat menghambat (Fardiaz 1989) dalam Dewi Rahmawati (2004). Respon setiap mikroorganisme terhadap antimikroba berbeda-beda. Bakteri Gram-positif lebih rentan dibandingkan bakteri Gram-negatif yang secara alami lebih resisten (Madigan 2009). Antimikroba bisa dibedakan menurut toksisitasnya yaitu selektif dan non-selektif. Senyawa non-selektif punya efek sama pada semua sel sedangkan senyawa selektif lebih beracun terhadap mikroorganisme daripada jaringan tubuh hewan atau manusia (Madigan 2009). Senyawa antibakteri yang digunakan dalam pengobatan pada manusia harus memiliki sifat toksisitas selektif artinya senyawa tersebut harus mampu menghambat dan membunuh mikroba tanpa merugikan inang (manusia) (Greenwood et al. 1992). Antibiotik merupakan zat yang dihasilkan dari mikroorganisme, yang memiliki sifat menghambat pertumbuhan mikroorganisme lain. Sifat antibiotik menurut Waluyo (2008) adalah sebagai berikut: 1. Menghambat atau membunuh patogen tanpa merusak inang 2. Bersifat bakterisidal, bukan bakteriostatik 3. Tidak menyebabkan resistensi pada kuman 4. Berspektrum luas (efektif digunakan bagi banyak spesies bakteri) 5. Tidak bersifat alergenik atau menimbulkan efek samping bila dipergunakan dalam waktu lama 6. Tetap aktif dalam plasma, cairan badan atau eksudat 7. Larut dalam air serta stabil 8. Jika bersifat bakterisidal, cepat dicapai dan bertahan untuk waktu lama di dalam tubuhBeberapa penelitian telah menunjukkan bahwa tumbuhan mangrove mengandung senyawa bioaktif yang bersifat antimikroba. Penelitian yang dilakukan Saad et al. (2012) menunjukkan tanin yang terdapat pada Soneratia telah dibuktikan memiliki aktivitas antibakteri. Hasil serupa dinyatakan oleh Haq et al. (2011) menemukan bahwa senyawa fenolik yang diekstrak dari Bruguiera gymnorrhiza efektif menghambat pertumbuhan beberapa bakteri gram positif dan Gram-negatif.

2.5Sifat Antimikroba Bahan PengawetBahan pengawet mempunyai pengruh terhadapa aktivitas mikroba. Faktor- faktor yang mempengaruhi aktivitas mikroba oleh bahan pengawet meliputi beberapa hal antara lain: jenis bahan kimia dan konsetrasinya, banyaknya mikroorganisme, komposisi bahan pangan, keasaman bahan pangan, dan suhu penyimpanan (Wisnu Cahyadi 2005)Pertumbuhan kultur mikroba secara aktif mudah diserang oleh bahan pengawet. Semakin tua umur bakteri dan menjadi semakin aktif, maka sel-selnya cenderung lebih tahan terhadap kondisi pengawet. Mekanisme bahan pengawet untuk menghambat pertumbuhan mikroba bahkan mematikannya, diataranya sebagai berikut :1. Gangguan sistem genetikDalam hal ini bahan kimia masuk kedalam sel. Beberapa bahan kimia dapat berkombinasi atau meyerang ribosoma dan menghambat sinpengujiana protein. Jika gen-gen dipengaruhi oleh bahan kimia maka sipengujiana enzim yang mengontrol gen akan dihambat.2. Menghambat sinpengujiana dinding sel atau membranBahan kimia tidak perlu masuk ke dalam sel untuk menghambat pertumbuhan, reaksi yang terjadi pada dinding sel atau membran dapat mengubah permeabilitas sel. Hal ini dapat menggangu atau menghalangi jalannya nutrien masuk ke dalam sel, dan mengganggu keluarnya zat-zat penyusun sel dan metabolit dari dalam sel. Kerusakan membran sel dapat terjadi karena reaksi antara bahan pengawet dengan sisi aktif atau larutannya semyawa lipid. Dinding sel merupakan senyawa yang komples, oleh sebab itu bahan kimia dapat ercampur dengan peyusun dinding sel sehingga akan mempengaruhi dinding sel dengan jalan mempengaruu sinpengujiana komponen sederhana, penghambatan polimerisasi penyusun dinding sel. Apabila hal ini berkembang lebih lanjut maka akibatnya kebutuhan sel tidak dapat terpeuhi dengan baik.

3. Penghambat enzimPerubahan pH yang mencolok, pH naik turun, akan menghambat kerja enzim dan mencegah perkembangbiakan mikroorganisme.4. Peningkatan nutrien esensialMikroorganisme mempunyai kebutuhan nutrien yang berbeda-beda, oleh sebab itu pengiktan nutrien tertentu akan mempengaruhi organisme yang berbeda pula. Apabila suatu organisme membutuhkan hanya sedikit nutrien dan apabila nutren tersebut diika, akan lebih sedikit berpengaruh pada organisme dibanding dengan organisme lain yang memerlukan nutrien tersebut dalam jumlah banyak (Wisnu Cahyadi 2005)

2. 6Mikroba Patogen dan Perusak Bahan PanganKeberadaan mikroba di alam tersebar luas sehingga produk pangan jarang sekali yang steril dan umumnya tercemar oleh berbagai jenis mikroba. Mikroba pada bahan pangan dapat menyebabkan kerusakan, yang dapat berupa kebusukan dan keracunan. Kebusukan disebabkan oleh aktivitas mikroba pembusuk, sedangkan keracunan disebabkan oleh adanya mikroba patogen atau racun yang dihasilkan oleh mikroba patogen. Contoh beberapa mikroba patogen yaitu :2.6.1 Staphylococcus aureus

Gambar 5. Staphylococcus aureus Sumber : Todar 2011

Staphylococcus merupakan bakteri berbentuk bulat yang terdapat dalam bentuk tunggal, berpasangan atau berkelompok seperti buah anggur. Bakteri ini termasuk dalam kelompok bakteri kokus Gram-positif. Staphylococcus aureus memproduksi pigmen berwarna kuning sampai jingga. Kebanyakan galur S. aureus bersifat patogen dan memproduksi enterotoksin yang tahan panas (Fardiaz 1989). Mikrorganisme ini tidak menghasilkan spora, non-motil dan biasanya tidak menghasilkan kapsul. Kenampakan individual bakteri ini bundar dengan permukaan yang halus dan berkilau sedangkan kenampakan koloni buram dan menghasilkan pigmen secara berkala. Bakteri ini memproduksi nukleus tahan panas yang dapat memecah Deoxyribose Nucleid Acid (DNA) sel (Greenwood et al. 1992). Bakteri S. aureus dapat menimbulkan penyakit yang disebabkan infeksi pada manusia dan hewan seperti misalnya bisul dan luka (Greenwood et al. 1992). S. aureus merupakan organisme penyebab keracunan makanan karena dapat melepas enterotoksin pada makanan yang terkontaminasi. Makanan yang mengandung toksin jika masuk ke sistem pencernaan manusia akan menimbulkan efek muntah-muntah, mual dan diare setelah 6 jam (Madigan 2009).

2.6.2Escherichia coli Escherichia coli termasuk dalam kelompok bakteri anaerobik fakultatif Gram-negatif. Bakteri ini merupakan penghuni normal dalam saluran pencernaan manusia dan hewan (Pelczar dan Chan 1986) dalam Dewi Rahmawati (2004). Bakteri E. coli tersebar luas sebagai parasit pada mamalia dan burung. (Greenwood et al. 1992). Jenis bakteri ini bersifat motil dan dapat tumbuh pada kisaran suhu yang luas yaitu 15-45 C.

Gambar 6. Escherichia coliSumber : Todar 2011

Bakteri E. coli menyebabkan penyakit diare, infeksi saluran urin dan sepsis (Cowan dan Talaro 2009). Penyakit lain yang ditimbulkan dari kontaminasi E. coli yaitu pneumonia, endokarditis, meningitis pada bayi yang baru lahir. Mekanismenya adalah melekatkan dirinya pada sel mukosa usus kecil dan membentuk filamentous actin pedestal sehingga menyebabkan diare cair. Bakteri ini secara alami sensitif terhadap antibiotik, salah satunya yaitu kloramfenikol (Greenwood et al. 1992).

2.7Proses Penurunan Mutu IkanIkan merupakan produk yang mudah busuk. Setelah ikan ditangkap dan mati akan terjadi proses kemunduran mutu (deteriosasi) yang disebabkan oleh faktor intenal maupun eksternal yang mengarah pada proses pembusukan sampai akhirya ikan menjadi busuk. Faktor internal peyebab penurunan mutu adalah akibat aktivitas enzim dan bakteri dalam ikan yang tidak terkendali segera setelah ikan mati. Faktor eksternal yang mendorong penuruna mutu ikan adalah suhu lingkungan yang tinggi, penanganan ikan yang kasar, dan terjadinya luka pada ikan ketika ditangkap (Gill 1992)Tahap-tahap kemunduran kesegaran ikan adalah pre-rigor, rigor mortis, dan post rigor (autolisis dan penyerangan bakteri. Tahap pre-rigor yaitu saat terjadinya peristiwa pelepasan lendir dan kelenjar dibawah kulit ikan yang akan membentuk lapisan bening tebal disekeliling tubuh ikan. Keadaan pre-rigor terjadi saat jaringan otot masih lembut dan lentur serta secara biokimia ditandai dengan menurunnya kadar adenosin trifosfat (ATP) dan kreatin fosfat.Tahap rigor mortis ditandai dengan keadaan otot yang kaku dan keras. Hilangnya kelenturan ikan berhubungan dengan terbentuknya aktomiosin, yang berlangsung lambat pada tahap awal dan kemudin menjadi cepat pada tahap selanjutnya. Rigor mortis dianggap penting dalam industri perikanan, selain dapat memperlambat pembusukan oleh mikroba juga sebagai petunjuk bahwa ikan masih dala keadaan sangat segar (Eskin 1990)Setelah tingkat tigor berahir, maka terjadi tingkat post tigor yaitu kembali melunaknya tekstur daging ikan (Eskin 1990). Tingkat post tigor merupakan permulaan dari proses pembusukan yang meliputi autolisis serta pembusukan oleh bakteri. Proses autolisis adalah terjadinya penguraian daging ikan sebagai akibat dari getah-getah pencernaan ikan. Ciri terjadinya autolisis adalah adanya amoniak, karena amoniak tidak ada sebelum tingkat post rigor.Proses autolisis akan menyebabkan penguraian protein menjadi senyawa yang lebih sedehana yaitu menjadi peptida, asam amino, dan amoniak yang dapat meningkatkan pH jaringan ikan. Pembusukan yang disebabkan oleh aktivitas bakteri tidak akan terjadi sebelum masa rigor mortis berakhir. Senyawa-senyawa yang dihasilkan dalam dekomposisi bakteri dapat digunakan sebagai indikator tingkat kesegaran ikan atau kebusukan ikan.Untuk mengetahui kesegaran ikan secara kimiawi, salah satu parameter yang dapat digunakan adalah mengukur kandungan senyawa volatil total didalamnya. Senyawa volatil yang terdapat pada hasil laut, seperti ikan dan kerang-kerangan meliputi Total Volatil Bases (TVB), Total Volatil Subtances (TVS) dan Total Volatile Nitrogen (TVN). TVN meliputi TVB dan senyawa nitrogen lainnya yang didapat dari hasil destilasi uap sampel. Sedangkan TVB meliput amonia, dimetilamin, dan trimetilamin (TMA)Trimetilamin (TMA) merupakan hasil reduksi dari trimetilaminoksida (TMAO) oleh bakteri fakultatif seperti Psedomonas putrefaciens yang akan memberikan bau khas ikan busuk. Pada ikan air tawar kandungan TMAO sedikit sekali atau bahkan tidak ada, sedangkan pada air laut TMAO yang terdapat pada ikan berfungsi sebagai bagian dari sistem buffer. Adanya bahan pengawet seperti EDTA menjaga produks TMA tetap rendah dengan menghambat pertumbuhan Psedomonas putrefaciens selama proses pembusukan terjadi. Connel (1980) menyatakan standar untuk ikan laut segar yang baik mutunya mempunyai nilai TVN tidak lebih dari 30 mg persen dan TMA tidak lebih dari 15 mg persen.

2.8Minimum Inhibitory Concentration (MIC) Aktivitas antimikroba diukur berdasarkan jumlah terkecil senyawa yang dibutuhkan untuk menghambat pertumbuhan dari mikroorganisme yang diuji dengan nilai yang disebut MIC (Madigan 2009). Minimum Inhibitory Concentration (MIC) adalah konsentrasi terendah dari senyawa antimikroba yang dapat mencegah pertumbuhan mikroba secara kasat mata. Luasan dari masing-masing dari zona hambat merupakan ukuran langsung dari tingkat sensitivitas senyawa (Greenwood et al. 1992). Menurut Wiegand et al. (2008) penentuan MIC dapat digunakan untuk mengevaluasi perkembangan daya tahan obat antibiotik. Ada 2 metode yang digunakan dalam pengujian MIC, yaitu teknik tabung pengenceran (tube dillution technique) dan metode difusi agar (agar diffusion method). Teknik tabung pengenceran dilakukan dengan menginokulasikan bakteri uji ke dalam beberapa tabung reaksi yang telah diisi medium dengan konsentrasi senyawa antimikroba berbeda. Tabung diinkubasi, setelah itu ditentukan MIC nya berdasarkan kekeruhannya (Madigan 2009). Wiegand et al. (2008) menyatakan bahwa metode difusi agar dilakukan dengan menaruh sejumlah bakteri dalam cakram nutrient agar yang telah diisi dengan zat antimikroba dengan konsentrasi berbeda. Adanya koloni bakteri pada cakram setelah inkubasi menunjukkan pertumbuhan mikroba. Menurut Wiegand et al. (2008) dilusi cair menggunakan media cair untuk pertumbuhan yang berisi senyawa antimikroba dengan konsentrasi yang meningkat secara berurutan, dan diinokulasi sejumlah sel bakteri. Volume yang digunakan menentukan jenis metode termasuk makrodilusi atau mikrodilusi. Jika volume yang digunakan sebanyak 2 mL maka disebut makrodilusi sedangkan mikrodilusi menggunakan microtiter plate dengan volume sebanyak 500 L per sumur. Penampakan kekeruhan atau endapan setelah inkubasi menunjukkan pertumbuhan mikroba. Nilai MIC ditunjukkan dengan konsentrasi terendah (dalam mg/L) senyawa antimikroba yang mencegah pertumbuhan mikroorganisme secara kasat mata dibawah kondisi tersebut. Minimum Inhibitory Concentration (MIC) tidak sama untuk setiap senyawa antibakteri, tetapi dipengaruhi oleh jenis organisme, ukuran inokulum, komponen media kultur, waktu inkubasi, serta kondisi inkubasi berupa suhu, pH atau aerasi (Madigan 2009). Menurut Davis dan Stout (1971), ketentuan kekuatan antibiotik-antibakteri sebagai berikut: daerah hambatan 20 mm atau lebih berarti sangat kuat, daerah hambatan 10-20 mm (kuat), daerah hambatan 5-10 mm (sedang), dan daerah hambatan 5 mm atau kurang (lemah). Faktor yang mempengaruhi ukuran daerah penghambatan, yaitu sensitivitas organisme, medium kultur, kondisi inkubasi, dan kecepatan difusi agar.6