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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E
SAÚDE PÚBLICA
MAYSA PAULA DA COSTA
Atividade biológica da seiva e de compostos extraídos da seiva de
Hymenaea courbaril sobre leveduras e fungos filamentosos
Goiânia
2012
TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E
DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás
(UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
1. Identificação do material bibliográfico: [x] Dissertação [ ] Tese
2. Identificação da Tese ou Dissertação
Autor (a): Maysa Paula da Costa
E-mail: [email protected]
Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [ x ]Sim [ ] Não
Vínculo empregatício do autor Não
Agência de fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
Sigla: CNPQ
País: Brasil UF: DF CNPJ: 00.889.834/0001-08
Título: Atividade biológica da seiva e de compostos extraídos da seiva de Hymenaea courbaril sobre leveduras e fungos filamentosos
Palavras-chave: Bioatividade. Hymenaea courbaril. Cryptococcus neoformans. Dermatófitos
Título em outra língua: Biological activity of the sap and compounds extracted from the sap of Hymenaea courbaril on yeast and filamentous fungi
Palavras-chave em outra língua: Bioactivity. Hymenaea courbaril. Cryptococcus neoformans.
Dermatophytes
Área de concentração: Microbiologia
Data defesa: (dd/mm/aaaa) 08/03/2012
Programa de Pós-Graduação: Programa de Pós-Graduação de Medicina Tropical e Saúde
Pública
Orientador (a): Dra. Maria do Rosário Rodrigues Silva
E-mail: [email protected]
Co-orientador (a):*
E-mail:
*Necessita do CPF quando não constar no SisPG 3. Informações de acesso ao documento:
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___________________________________ Data: 22/09/2014
Assinatura do (a) autor (a)
1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita
justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante o período de
embargo.
ii
MAYSA PAULA DA COSTA
Atividade biológica da seiva e de compostos extraídos da seiva de
Hymenaea courbaril sobre leveduras e fungos filamentosos
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública
da Universidade Federal de Goiás para obtenção do
Título de Mestre em Medicina Tropical e Saúde
Pública.
Orientadora: Drª Maria do Rosário Rodrigues Silva
Goiânia
2012
iii
iv
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública
da Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Aluna: Maysa Paula da Costa
Orientador: Profª. Drª. Maria do Rosário Rodrigues Silva
Membros:
1. Drª. Maria do Rosário Rodrigues Silva
2. Drª. Carolina Rodrigues Costa
3. Drª. Cecília Maria Alves de Oliveira
Data: 08/03/2012
v
“A glória de Deus está nas coisas encobertas, mas a honra do homem, em descobri-las”
Provérbios, 25:2
vi
Aos meus familiares.
Por me mostrarem a importância
e alegria de se ter uma família.
vii
AGRADECIMENTOS
À Deus, por esquecendo das minhas fraquezas e limitações, fazer de mim
instrumento de Seu projeto para a humanidade, por me dar a honra e o prazer de
desvendar um pouquinho do Seu mistério e de Sua grandeza, e encontrá-Lo na Ciência.
À Nossa Senhora por interceder por mim, me guiar e proteger em todos os dias da
minha vida.
Aos meus pais Mariana e Sebastião, pois todas as oportunidades que terei na vida
usarei para agradecer-lhes o caráter e os valores que imprimiram em mim. Se aqui
cheguei, foi por que me ajudaram a caminhar.
Às minhas irmãs Mônica, Mágda e Márcia pelas alegrias, amizade, estímulo e
ensinamentos partilhados e por compreenderem e perdoarem as ausências quando se
fizeram necessárias.
Aos meus mais que amados sobrinhos Rafael, Adrian, Júlia e Ana Clara. Vocês são
a minha alegria, presentes especiais dados pelo “Papai do céu” para a titia. O sorriso de
vocês apaga qualquer cansaço e angustia.
Aos meus demais familiares, tios, primos e padrinhos, a torcida de vocês me
abastece de força, ânimo e coragem para continuar.
À minha querida orientadora Professora Maria do Rosário Rodrigues Silva (Zaia),
pela oportunidade de realização desse estudo, pela confiança, paciência e carinho a mim
dedicados. Sua competência associada à disposição de auxiliar e ensinar é um constante
exemplo para minha vida pessoal e profissional, pois a senhora expressa a verdadeira
missão de um professor e orientador: incentivar, apoiar, auxiliar e se alegrar com as
conquistas de seus alunos.
Às professoras Carolina Rodrigues Costa e Orionalda de Fátima Lisboa Fernandes
pelo apoio e conhecimento transmitidos desde que ingressei no laboratório e pelas
sugestões e colaborações na elaboração deste trabalho.
À professora Cecília Maria Alves de Oliveira pelo material cedido para o
desenvolvimento deste trabalho, pela presteza e colaboração na execução deste projeto.
À professora Marize Campos Valadares Bozinis pela receptividade e por
disponibilizar o Laboratório de Farmacologia e Toxicologia Celular para a realização da
prática de citotoxicidade.
À todos os professores do PPGMT-IPTSP/UFG, pela dedicação, por oferecer
formação profissional e por nos ensinar a sermos profissionais de caráter ético.
viii
Aos alunos do laboratório de Farmacologia e Toxicologia Celular, em especial à
Wanessa Machado e Larissa Cleres pela amizade e por me auxiliarem imensamente na
realização dos testes citotoxicos.
Aos meus queridíssimos colegas do Laboratório de Micologia: Hildene Meneses,
Fábio Silvestre, Milton Camplesi, Núbia Pontes, Cícero Júnior, Flávio Ezzedinne, Alinne
Almeida, Murilo dos Santos, Franciele Pereira, Tayse Silva, Pedro Henrique e Thaísa
Cristina, e aos mais novos membros dessa família: Fernanda Almeida e Reginaldo
Teixeira, pelos bons momentos e trocas de experiência que me proporcionam a cada dia.
Às minhas amigas Alyne Melo, Wanessa Andrade e Camila Santos pela amizade
sincera, incentivo, companheirismo e todos os ótimos momentos que passamos juntas.
Aos servidores do PPGMT-IPTSP/UFG José Clementino de Oliveira Neto e Kariny
Vieira Soares pela atenção e disposição em auxiliar sempre que precisamos.
Ao Programa de Pós Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública do
IPTSP/UFG, pela oportunidade, por acreditar no projeto e permitir sua realização.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo
apoio financeiro.
A todos que de uma forma direta ou indireta colaboraram na realização e conclusão
desse trabalho, minha eterna gratidão e reconhecimento.
ix
SUMÁRIO
ESQUEMAS XI
FIGURAS XII
TABELAS XIV
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS XV
RESUMO XVI
ABSTRACT XVII
1. INTRODUÇÃO 1
1.1. Plantas Medicinais 1
1.2. Hymenaea courbaril 3
1.3. Complexo Cryptococcus neoformans 6
1.4. Dermatófitos 8 1.4.1. Manifestações Clínicas 8
1.5. Tratamento 12
1.6. Métodos de Suscetibilidade in vitro 14
1.7. Ensaios de Citotoxicidade 15
2. JUSTIFICATIVA 18
3. OBJETIVOS 19
3.1. Geral 19
3.2. Específicos 19
4. MATERIAL E MÉTODOS 20
4.1. Estudo químico de H. courbaril 20 4.1.1. Coleta do material 20 4.1.2. Preparo e fracionamento da seiva 20
4.2. Isolados 21
4.3. Teste de suscetibilidade in vitro 22 4.3.1. Preparo do inóculo 22 4.3.2. Preparo do meio de cultura 22 4.3.3. Procedimento do teste de microdiluição em caldo 22
x
4.3.4. Interpretação dos resultados 23
4.4. Ensaios de Concentração Fungicida Mínima (CFM) 23
4.5. Ensaios de Citotoxicidade in vitro 24 4.5.1. Cultura Celular 24 4.5.2. Ensaio de incorporação do Vermelho Neutro 25 4.5.3. Análise estatística 27
5. RESULTADOS 28
6. DISCUSSÃO 33
7. CONCLUSÕES 36
8. REFERÊNCIAS 37
9. ANEXOS 54
9.1. Anexo 1 – Parecer do Comitê de Ética – Hospital das Clínicas - UFG 54
9.2. Anexo 2 – Parecer do Comitê de Ética – Hospital de Doenças Tropicais de Goiás 55
9.3. Anexo 3 – Artigo 56
xi
ESQUEMAS
Esquema 1: Teste de microdiluição em caldo para fungos................................................23
Esquema 2: Incorporação do corante vermelho neutro na análise de citotoxicidade........26
Esquema 3: Teste de citotoxicidade celular usando o corante vermelho neutro...............27
xii
FIGURAS
Figura 1. Hymenaea courbaril – A- Árvore; B- Flor; C- Fruto; D- Polpa.......................04
Figura 2: Extração da seiva de jatobá: A-Trado furando o tronco; B-Seiva sendo
extraída............................................................................................................04
Figura 3: Metabólitos secundários isolados das cascas do tronco, dos galhos e das folhas
de H. courbaril..................................................................................................05
Figura 4: Cryptococcus neoformans. A- aspectos macroscópicos da colônia em ASD. B-
células arredondadas com cápsula, coradas com tinta nanquim (400x)............07
Figura 5: T. tonsurans. A - Aspecto macroscópico: colônias pregueadas, pulvurulentas
de coloração branca a amarelada. B - Aspecto microscópico: hifas septadas
hialinas e microconídios piriformes em talos (400x)........................................10
Figura 6: T. mentagrophytes var. mentagrophytes. A - Aspecto macroscópico: colônia
pulvurulenta branco-amarelada. B - Aspecto microscópico: hifas em espiral e
microconídios agrupados (400x).......................................................................10
Figura 7: M. gypseum. A - Aspecto macroscópico: colônia pulvurulenta com bordas
pregueadas. B - Aspecto microscópico: hifas septadas hialinas e macroconídios
fusiformes septados, parede rugosa e extremidade arredondada (400x)...........11
Figura 8: T. rubrum. A - Aspecto macroscópico: colônias algodonosas brancas de
pigmento avermelhado. B - Aspecto microscópico: hifas septadas hialinas e
microconídios dispostos em acladio (400x)......................................................11
Figura 9: E. floccosum. A - Aspecto macroscópico: colônias lisas, pulvurulentas, verde-
acastanhada. B - Aspecto microscópico: hifas septadas hialinas e
macroconídios dispostos em cachos (400x)....................................................11
Figura 10: Sítio de ação de diferentes antifúngicos sobre a célula fúngica..................... 13
Figura 11: Fluxograma representando a seiva, as frações e os compostos obtidos..........20
Figura 12: Estrutura dos compostos obtidos da seiva de Hymenaea courbaril...............21
Figura 13: A- Células da linhagem aderente Balb/c 3T3-A31 sem tratamento. B- Células
tratadas com a seiva em uma concentração de 64 µg/mL. C- Células tratadas
com o composto fisetina em uma concentração de 128 µg/mL.
Fotomicrografia em microscópio invertido (200x).........................................30
Figura 14: Placa de microtitulação mostrando a absorção do corante vermelho neutro por
células 3T3-A31 tratadas com seiva (A) e com o composto fisetina (B).......31
xiii
Figura 15: Curva da viabilidade celular de fibroblastos 3T3-A31 para a seiva de H.
courbaril, pela incorporação do vermelho neutro. IC=109 µg/mL..............31
Figura 16: Curva da viabilidade celular de fibroblastos 3T3-A31 para o composto
fisetina, pela incorporação do vermelho neutro. IC50= 158 µg/mL..............32
xiv
TABELAS
Tabela 1: Suscetibilidade in vitro da seiva e de três compostos isolados de Hymenaea
courbaril (triagem)..........................................................................................28
Tabela 2: Atividade antifúngica in vitro da seiva e do composto fisetina de H. courbaril
sobre isolados de C. neoformans e de dermatófitos........................................29
Tabela 3: Concentração Fungicida Mínima (CFM) in vitro apresentada pela seiva e pelo
composto fisetina de H. courbaril sobre isolados de Cryptococcus sp. e de
dermatófitos.......................................................................................................30
xv
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
ASD Ágar Sabouraud dextrose
ATCC American type culture colletion
CIM Concentração inibitória mínima
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
DMEM Dulbecco`s modified Eagle`s medium
DMSO Dimetilsulfóxido
MOPS Ácido morfolinopropanossulfônico
RPMI Meio Roswell Park Memorial Institute
SFB Soro Fetal Bovino
PBS Phosphate Buffer Saline
IC Indice de citotoxicidade
xvi
RESUMO
As plantas e seus metabólitos secundários são uma grande fonte de inovação de agentes
terapêuticos para inúmeras enfermidades, incluindo doenças infecciosas. Plantas de uso
popular apresentam atividade biológica em potencial, sendo que devem ser consideradas
a importância da aplicação clínica e a compatibilidade com o organismo humano.
Hymenaea courbaril Linnaeus var. stilbocarpa uma árvore conhecida como jatobá,
possui produtos químicos obtidos de suas folhas, tronco, frutos e sementes que são usadas
na medicina popular, no entanto atividade antifúngica e a citotoxicidade desta planta
ainda é pouco conhecida. Uma triagem inicial foi realizada para avaliação da
suscetibilidade in vitro com a seiva e compostos de H. courbaril sobre isolados de
dermatófitos e Cryptococcus. A seiva e o composto fisetina apresentaram-se mais ativos
e desta forma foram usados para determinar a suscetibilidade de dezoito isolados de
dermatófitos e vinte e seis de Cryptococcus. A seiva de H. courbaril apresentou
concentrações inibitórias mínima (CIMs) que variaram de 32 a 128 µg/mL para os
dermatófitos e de 8 a 256 µg/mL para as leveduras do complexo C. neoformans. O
composto fisetina foi capaz de inibir os dermatófitos em CIMs que variaram de 4 a
128µg/mL e as leveduras do complexo C. neoformans em CIMs que variaram de 8 a 128
µg/mL. A avaliação da citotoxicidade in vitro com fibroblastos 3T3-A31 foi realizada
para a seiva e o composto fisetina usando a técnica de absorção do corante vermelho
neutro. Por este método foi possível verificar que a seiva de H. courbaril apresentou um
IC50 de 109 µg/mL e o composto de 158µg/mL Os resultados encontrados neste estudo
são relevantes e promissores, pois mostram que esta planta apresenta uma boa atividade
biológica para fungos, além de possuir um composto isolado biocompatível com celulas
basais de mamíferos. Produtos com tais concentrações de CIM e IC50 podem ser
considerados de grande valor para posteriores estudos farmacológicos.
xvii
ABSTRACT
Secondary metabolites that have been discovered from the plant kingdom are major
sources of innovative therapeutic agents for infectious diseases. Plants have been
demonstrated to present important biological activities and are considered as potential
clinical application when show compatibility with the human organism. Hymenaea
courbaril Linnaeus var. stilbocarpa a tree known as jatoba, presents chemicals products
obtained from their leaves, stem, fruit and seeds that are used in folk medicine.
Antimicrobial and cytotoxic activity of this plant is little known. An initial screening was
performed to evaluate the in vitro susceptibility to sap and compounds of H. courbaril
against dermatophytes and Cryptococcus isolates. The sap and the compound fisetin were
more active and thus they were used to determine the in vitro susceptibility against
eighteen dermatophytes and twenty-six Cryptococcus isolates. The results of in vitro
susceptibility assay showed antifungal activity of H. courbaril against all fungi studied.
The sap of H. courbaril showed minimal inhibitory concentrations (MIC) ranging
between 32-128 µg/mL for dermatophytes and 8-256 µg/mL for complex C. neoformans
yeast. The compound of H. courbaril fisetin inhibited the growth of dermatophytes and
of Cryptococcus in concentration of 4-128 µg/ml, and of 8 a 128 µg/ml, respectively. In
vitro cytotoxicity assays of sap and compound were performed with fibroblast 3T3-A31
by using the technique of absorption of the dye neutral red. Cytotoxicity assays showed
that sap and compound have an low toxicity on these cells. The sap and the compound
showed IC50 values of 109 µg/mL of 158µg/mL, respectively. The results of this study
are relevant and promising because they show that the “fisetin” present a good biological
activity for fungi, and is a compound biocompatible with basal cells of mammals.
Products with such concentrations of MIC and IC50 can be considered of great value for
further pharmacological studies.
1. INTRODUÇÃO
1.1. Plantas Medicinais
O conhecimento acerca das plantas tem sido acumulado ao longo dos séculos e
transmitido através de gerações que buscam nas plantas a fonte de seu bem-estar, seja
como alimento, vestuário ou medicamento (Madia & Rodrigues 2009; Höfling et al.
2011). Pesquisas sobre a utilização de diferentes espécies botânicas são muito
importantes para o desenvolvimento da agricultura e de alguns importantes segmentos
da sociedade, principalmente a indústria farmacêutica para o desenvolvimento de novos
medicamentos (Costa et al. 2006).
Mesmo após o advento de modernas técnicas sintéticas de desenvolvimento de
novos fármacos, como a modelagem molecular, o homem não perdeu sua estreita
relação com os vegetais, pois os produtos naturais constituem ainda, fontes promissoras à
descoberta de novos medicamentos (Moreira et al. 2002; Kingston 2011). A ciência
tem buscado associar o progresso no desenvolvimento de medicamentos com aquilo que
a natureza oferece, respeitando o contexto social em que as plantas estão inseridas e a
cultura do povo em torno do uso de produtos ou ervas medicinais para curar os males. O
conhecimento e o uso popular de algumas espécies permitem muitas vezes a descoberta
de medicamentos importantes (Arnous et al. 2005; Souza & Felfili 2006; Klein et al.
2009; Melo et al. 2009; Kingston 2011).
Costa et al. (2006) afirmam que, embora haja um incentivo para o uso de plantas,
somente 1% das espécies vegetais conhecidas na Terra foi estudada e várias espécies
estão desaparecendo do planeta num ritmo sem precedentes. Com esta redução
progressiva de grande parte da biodiversidade, ocorrerá também uma enorme perda
científica, relacionada principalmente ao potencial terapêutico dos produtos naturais,
prejudicando o desenvolvimento nesta área. De acordo com Kingston (2011) atualmente
cerca de 50% de todos os medicamentos disponíveis como terapêutica são derivados de
produtos naturais (plantas, microrganismos e animais). Quando se trata de agentes
anticâncer e anti-infecciosos, a proporção é ainda maior, havendo uma estimativa que
quase dois terços de tais agentes são derivados de produtos naturais.
Os países da América Latina possuem grande parte da biodiversidade do mundo,
sendo que possuem diversas espécies de plantas medicinais, com possibilidade de
2
geração de uma relação custo-benefício bem menor para a população, promovendo
saúde a partir de plantas da flora local. A magnitude da biodiversidade brasileira não é
conhecida com precisão, estimando-se a existência de mais de 2 milhões de espécies
distintas de plantas. O Brasil é o país com maior diversidade genética vegetal do
mundo, sendo que mais de 55.000 espécies nativas são catalogadas e distribuídas nos
seis maiores biomas: Amazônia, Cerrado, Caatinga, Floresta Atlântica, Pantanal e
Floresta Subtropical (Vieira & Martins, 1998; Arnous et al. 2005; Calixto 2005), com
várias espécies utilizadas na medicina tradicional, para tratar doenças tropicais,
incluindo a esquistossomose, leishmaniose, malária, infecções fúngicas e bacterianas
(Alves et al. 2000; Rocha et al. 2007; Souza et al. 2010).
Durante as duas últimas décadas as infecções fúngicas invasivas têm assumido
uma maior importância, principalmente devido ao aumento da população
imunocomprometida, que possuem uma maior suscetibilidade às infecções. Estes
indivíduos apresentam um risco aumentado para desenvolvimento de infecções graves
como candidíase, aspergilose, criptococose e zigomicose (Pfaller & Diekema 2007;
Warnock 2007).
A falha nas defesas ou a evasão do patógeno às respostas do hospedeiro, leva à
necessidade da utilização de medicamentos fungicidas ou fungistáticos que atuem o
mais especificamente possível contra o agente agressor, de modo a evitar danos ao
hospedeiro. A especificidade de tratamento pode ser limitada devido aos fatores
responsáveis pela virulência e patogenicidade dos fungos, especialmente relacionados a
resistência aos antifúngicos disponíveis no mercado. Os antifúngicos têm como alvos
celulares, o ergosterol ou as enzimas que participam de sua síntese, ou podem atuar na
parede celular, na síntese de ácidos nucléicos e na formação de microtúbulos, levando a
efeitos colaterais como nefrotoxicidade e hepatotoxicidade, daí a necessidade da busca
de novas alternativas para o tratamento das infecções fúngicas (Martinez 2006;
Markman et al. 2009; Peres et al. 2010).
Dentro o gênero Hymenaea, a espécie courbaril Linnaeus (jatobá, jatobá-da-mata)
da família Fabaceae (Leguminosae), ordem Fabales apresenta propriedades
antimicrobianas (Simões et al. 2009; Martins et al. 2010) e constitui o objeto deste
trabalho na busca de um antifúngico para inibição de crescimento de leveduras do
complexo Cryptococcus neoformans e fungos filamentosos como os dermatófitos.
3
1.2. Hymenaea courbaril
O gênero Hymenaea possui 14 espécies, 13 das quais se encontram distribuídas
pela América Central, América do Sul, oeste das Índias e uma espécie de ocorrência no
leste da África (Lee e Langenheim 1975). No Brasil, H. courbaril pode ser encontrado
na bacia Amazônica e no cerrado de Minas Gerais, Bahia, Goiás e Tocantins (Souza &
Felfili 2006; Simões et al. 2009). H. courbaril apresenta-se sob a forma de diversas
variedades, sendo H. courbaril var. altissima, H. courbaril var. courbaril, H. courbaril
var. longifolia, H. courbaril var. stilbocarpa, H. courbaril var. subsessilis, H. courbaril
var. villosa (Lee e Langenheim 1975; Castellen 2005) as mais comuns. Aparece nas
matas de terra firme, sobre solos argilosos e em certas várzeas altas, sendo rara no
campo e nas capoeiras (Lee e Langenheim 1975; Campos e Uchida 2002).
H. courbaril é uma árvore de grande porte, com aproximadamente 30m de altura,
possuindo folhas compostas, inflorescência em panículas terminais e frutos em forma de
vagens indeiscentes, duros e pardo-escuros, apresentando de 2 a 6 sementes, envoltas
por uma farinha comestível de grande valor nutritivo, consumida pelo homem como
alimento e por animais, principalmente roedores (Prance e Silva 1975; Carvalho Filho et
al. 2003; Gorchov et al. 2004). A fruta desta árvore fornece uma grande quantidade de
farinha protéica que contem fibras solúveis e insolúveis, utilizadas no preparo de
lanches com alto teor de fibra (Nogueira et al. 2001; Guarim Neto & Morais 2003;
Araújo et al. 2007).
A casca de H. courbaril é popularmente utilizada para hematúria, diarréia,
disenteria, dispepsia, constipação e hemoptise, e a resina, para tratamento de problemas
do sistema respiratório superior, cardiovasculares e como tônico energético natural
(Gupta 1990). Segundo Martins (1989), na Amazônia, os nativos costumam retirar a
seiva dessa grande árvore e bebê-la para tratamento das afecções pulmonares, e da casca
do caule pode ser feito chá pelo método de decocção para lavar ferimentos e para
irrigações vaginais. Segundo Leonardi (2002), o chá da casca é bom medicamento para
a próstata, podendo ser ingerido várias vezes ao dia, e a resina pode ser aplicada em
forma de emplastro sobre as partes doloridas do corpo.
A resina, a polpa dos frutos e as sementes do jatobá, são usadas em medicina
popular para tratamento de feridas, afecções das vias aéreas superiores, vias urinárias e
do aparelho digestivo e no tratamento de verminoses e anemia (Imai et al. 2008, Simões
4
et al. 2009). As folhas, tronco, frutos e sementes de vagens de H. courbaril são
apresentados na figura 1.
Figura 1: Hymenaea courbaril – A- Árvore; B- Flor; C- Fruto; D- Polpa
A seiva de Jatobá é obtida com o uso de trado, mangueira, cano de PVC e
vasilhame para a sua coleta. É um método de fácil aplicação, simples, eficiente e de
baixo custo. Para a extração da seiva é feito um orifício no tronco da árvore (pelo trado
de ferro), no qual será inserido o cano e a mangueira que será encaixada na abertura de
uma vasilha para a coleta da seiva (figura 2). O orifício do tronco deixado pelo trado
deve ser devidamente fechado com o auxílio de cano de PVC (Alechandre et al. 2011)
C D
A B
A B
5
Figura 2: Extração da seiva de jatobá: A-Trado furando o tronco; B-Seiva sendo
extraída.
A atividade antimicrobiana de H. courbaril tem sido descrita por Gonçalves et
al. (2005), que verificaram que esta planta apresenta atividade contra Proteus mirabilis
e Staphylococcus aureus. Fernandes et al. (2005) descreveram que o extrato da
entrecasca, o extrato hidroalcóolico, as soluções aquosas dos extratos e a seiva
liofilizada de H. courbaril, apresentam atividade antimicrobiana contra Bacillus
stearothermophylus, Escherichia coli, Micrococcus luteus, S. aureus. Estudos
fitoquimicos, demonstram que esta planta possui metabólitos secundários (figura 3),
ricos em triterpenos, diterpenos, flavonóides e compostos fenólicos os quais
provavelmente sejam os responsáveis pelas suas características antimicrobianas.
Figura 3: Metabólitos secundários isolados das cascas do tronco, dos galhos e das
folhas da H. courbaril.
6
1.3. Complexo Cryptococcus neoformans
Leveduras do complexo Cryptococcus (figura 4) são consideradas como
pertencentes ao subfilo Basidiomycota. Estes fungos são encapsulados, ubíquos na
natureza, relacionados com processos infecciosos que acometem humanos e animais
como cães e gatos. Atualmente, este complexo é dividido em duas espécies distintas:
Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. Com base na reatividade da cápsula,
cinco diferentes sorotipos têm sido classificados: a espécie neoformans, compreende os
sorotipos A (var. grubii), D (var. neoformans) e o híbrido AD que apresentam
características de ambos os sorotipos A e D, já a espécie C. gattii abrange os sorotipos
B e C De todos os sorotipos, o A é predominante entre amostras clínicas responsável
por mais de 95% dos casos de criptococose em todo o mundo (Barth et al. 2008;
Campos et al. 2009; Lin 2009).
A espécie C. neoformans possui uma distribuição universal, acomete indivíduos
imunologicamente comprometidos e é encontrada em ambientes urbanos ricos em fezes
de aves. C. gattii prevalece em regiões tropicais e subtropicais, acometendo indivíduos
imunologicamente competentes das áreas rurais, onde o fungo é encontrado em árvores,
principalmente de Eucalyptus spp (Lin 2009).
As leveduras ou os basidiósporos de Cryptococcus entram no hospedeiro por via
inalatória, atingindo os pulmões, a partir daí podem se disseminar por via hematogênica,
causando infecções sistêmicas envolvendo órgãos como a pele, olhos, ossos, pulmões,
sistema nervoso central (SNC), próstata ou trato urinário (Trope et al. 2008; Lin 2009).
C. neoformans tem um tropismo pelo SNC causando meningite criptocócica e
meningoencefalite. O acentuado tropismo para o sistema nervoso central apresentado
pelo Cryptococcus neoformans é justificado pela presença de concentração de tiamina,
carboidratos, minerais e nutrientes assimiláveis pelo fungo, assim como pela presença
de precursores da melanina, como dopamina e laccase (Ikeda et al. 2002).
Este fungo resiste fortemente à fagócitos presentes no SNC e alguns fatores, como
a capacidade de células de C. neoformans crescerem à temperatura do corpo do
hospedeiro e a produção de melanina foram identificados como sendo necessários para
promover a doença (Del Poeta 2004). Cryptococcus neoformans é responsável por
várias infecções em indivíduos imunocomprometidos, incluindo pacientes com AIDS,
receptores de transplante ou outros pacientes recebendo medicações imunossupressivas
7
e pacientes com doenças hematológicas (Frigeri et al. 2001; Pagano et al. 2006;
Tsuchida et al. 2007; Moosbrugger et al. 2008).
A presença da cápsula, capacidade de aderência, produção de uréase, capacidade
de crescer a 37ºC, produção de manitol e melanina e de enzimas pelo microrganismo
são fatores de virulência considerados essenciais para o estabelecimento da infecção e
sobrevivência do fungo no hospedeiro (Casadevall & Perfect 1998; Bose et al. 2003;
Idnurm et al. 2005; Bien et al. 2009).
A estrutura da cápsula é altamente variável, apresenta alterações no tamanho e se
reorganiza durante brotamento e crescimento (McFadden et al. 2006; Zaragoza et al.
2009). De acordo com Feldmesser et al. 2001e Maxson et al. 2007, há uma alteração
morfológica específica associada com a infecção criptocócica que envolve um aumento
significativo do volume da cápsula. Enquanto o tamanho da cápsula é relativamente
pequeno em colônias mantidas em meio de cultura padrão e no ambiente, esta sofre um
grande aumento no tamanho durante a infecção pulmonar, o que pode incluir
aproximadamente 85% do volume total da célula.
Acredita-se que este alargamento capsular ocorra para conferir uma vantagem
para o microrganismo durante sua interação com o hospedeiro, já que o crescimento da
cápsula interfere na fagocitose mediada pelo sistema complemento e protege a levedura
contra os radicais livres e agentes antimicrobianos (Zaragoza et al. 2010).
Figura 4: Cryptococcus neoformans. A- aspectos macroscópicos da colônia em ASD.
B- células arredondadas com cápsula, coradas com tinta nanquim (400x).
A B
8
1.4. Dermatófitos
Os dermatófitos são importantes agentes zoonóticos e constituem um grupo de
fungos que, em vida parasitária, têm a capacidade de invadir tecidos queratinizados tais
como cabelos, unhas e células epiteliais de humanos e outros animais, causando
infecções denominadas dermatofitoses, infecções fúngicas muito frequente na
população. Os agentes etiológicos destas infecções pertencem aos gêneros
Trichophyton, Microsporum e Epidermophyton da família Moniliaceae, classe
Euascomycetes do subfilo Deuteromycota. Dentre as características morfológicas após o
cultivo destes fungos, macroscopicamente os dermatófitos se apresentam como colônias
algodonosas e pulvurulentas de cores variadas e microscopicamente mostram-se
filamentosos apresentando hifas finas septadas, hialinas e macroconídios ou
microconídios como elementos de frutificação de acordo com a espécie (Siqueira et al.
2006; Rezende et al. 2008; White et al. 2008).
As espécies de dermatófitos podem também ser classificadas de acordo com o
habitat natural: antropofílico (parasitas exclusivos da espécie humana), zoofílicos
(próprios de animais domésticos ou silvestres) e geofílicos (têm o solo como
reservatório). As espécies zoofílicas e geofílicas apresentam infecção inflamatória mais
grave, resistindo aos tratamentos instituídos e com grande tendência à recidiva,
enquanto as antropofílicas são responsáveis pela maior quantidade das dermatofitoses
humanas notificadas, totalizando cerca de 70% do total (White et al. 2008).
1.4.1. Manifestações Clínicas
A infecção por dermatófitos ocorre pela produção de enzimas proteolíticas
secretoras que promovem uma resposta inflamatória no hospedeiro e resulta em uma
série de sintomas clínicos, característicos das dermatofitoses (Liu et al. 2001). Enzimas
dermatofíticas têm sido caracterizadas bioquimicamente e molecularmente a partir de
várias espécies de dermatófitos capaz de infectar o hospedeiro. Algumas enzimas
específicas tais como queratinase, elastase, desoxirribonuclease, colagenase e lípase são
produzidas por dermatófitos e espécies de leveduras (Toprak et al. 2005; Monod 2008)
O quadro clínico da doença varia conforme o sítio anatômico acometido podendo
ocorrer em vários locais (Aquino & Lima 2002; White et al. 2008; Metkar et al. 2010).
As dermatofitoses recebem a denominação genérica de tinea, acrescido da região do
9
corpo acometida (Santos et al. 2002). Tinea capitis é caracterizada pela invasão do
couro cabeludo, usualmente causada por espécies dos gêneros Microsporum e
Trichophyton (Aquino & Lima 2002; Komaid & Kestelman 2002). As lesões
produzidas por estes dois gêneros podem variar desde a formação de eritema, com
poucas áreas descamativas, à formação de reações inflamatórias e, ainda, produção de
lesões extensas de descamação e alopécia, acompanhadas por febre e linfadenopatia
(Ghannoum et al. 2002). Nas lesões descamativas, onde o folículo piloso é tonsurado, os
gêneros de dermatófitos mostram quadros clínicos diferentes. Nas tineas produzidas por
Microsporum, as lesões são únicas, enquanto naquelas causadas por Trichophyton,
observa-se a formação de múltiplas áreas de alopécia (Aquino & Lima 2002). M. canis,
M. audouinii e T. tonsurans (figura 5) são comumente responsáveis por este tipo de
lesão. Nas lesões denominadas Kerion Celsi, há um processo inflamatório intenso, com
pústulas, secreção purulenta e formação de cicatrizes (Aquino & Lima 2002). Esta
foliculite supurativa tem como agentes fungos zoofílicos, como T. mentagrophytes
(figura 6) e T. verrucosum e, ainda fungos geofílicos, como M. gypseum (figura 7) e M.
fulvum. Uma forma clínica grave, denominada tinea favosa, pode ocorrer quando
algumas espécies de dermatófitos, como T. schoenleinii e M. gypseum, invadem o couro
cabeludo, levando à formação de uma crosta em forma de favo de mel, decorrente de
uma massa densa de micélio e restos de tecido epitelial, com atrofia da pele e alopécia
cicatricial (Aquino & Lima 2002).
A tinea corporis é infecção fúngica que tem localização em pele glabra,
preferencialmente nos braços, face e tronco (Goldstein et al. 2000). Causa lesões
eritematodescamativas, circinadas, isoladas ou confluentes, de crescimento centrífugo,
onde observa-se vesículas ou pústulas em sua borda (Weinstein & Berman 2002). T.
rubrum (figura 8) e T. mentagrophytes têm sido descritos como os principais agentes de
tinea corporis (Santos et al. 2002).
Características semelhantes ao quadro de tinea corporis são encontradas quando
os dermatófitos atingem a região crural (coxas, períneo, nádegas e região pubiana),
sendo nestes casos denominadas de tinea cruris. Estes locais são propícios à infecção
por fungos, devido a constante maceração da pele, pela transpiração ou por banhos
prolongados, favorecendo a implantação destes microrganismos (Hainer 2003). O
agente mais comumente identificado nos casos de tinea cruris é o fungo antropofílico,
E. floccosum (figura 9) (Santos et al. 2002).
10
Tinea pedis ou pé-de-atleta é a forma clínica mais frequentemente observada em
todo mundo (Goldstein et al. 2000; Korting et al. 2001; Ogasawara et al. 2003). A
sudação, umidade, calçados não higienizados adequadamente e o descuido na higiene da
pele, constituem fatores que auxiliam a implantação e o crescimento dos fungos
(Goldstein et al. 2000). A forma inflamatória, geralmente causada por T.
mentagrophytes, é caracterizada por numerosas vesículas plantares e interdigitais (Zaias
& Rebell 2003). Nos espaços interdigitais formam-se fissuras e a pele macerada
predispõe às infecções secundárias, acentuando o caráter inflamatório das lesões. Na
forma crônica, produzida por T. rubrum, as lesões aparecem na planta e nas bordas dos
pés, sob a forma eritematodescamativa (Hainer 2003).
A invasão das unhas por dermatófitos, denominada tinea unguium, se caracteriza
por ser uma infecção normalmente crônica. A sua manifestação clínica pode ser
superficial, formando manchas na placa das unhas, ou invasiva, onde há o
acometimento das margens lateral e distal, caracterizando-se por uma unha opaca,
esbranquiçada e espessa, com acúmulo de queratina subungueal. As unhas das mãos são
comumente parasitadas por T. rubrum, enquanto nas unhas dos pés, T. rubrum, T.
mentagrophytes e E. floccosum são frequentemente observados (Huang et al. 2004).
A dificuldade de cura, necessidade de um tempo prolongado de tratamento para as
infecções fúngicas, as constantes recidivas, associadas ao alto custo dos medicamentos
são fatores que propiciam o aumento das infecções fúngicas. Desta forma, é de grande
importância a realização de testes de suscetibilidade antifúngica para estabelecer o
fármaco adequado para o tratamento e cura da infecção.
Figura 5: T. tonsurans. A - Aspecto macroscópico: colônias pregueadas, pulvurulentas
de coloração branca a amarelada. B - Aspecto microscópico: hifas septadas
hialinas e microconídios piriformes em talos (400x).
A B
11
Figura 6: T. mentagrophytes var. mentagrophytes. A - Aspecto macroscópico: colônia
pulvurulenta branco-amarelada. B - Aspecto microscópico: hifas em espiral e
microconídios agrupados (400x).
Figura 7: M. gypseum. A - Aspecto macroscópico: colônia pulvurulenta com bordas
pregueadas. B-Aspecto microscópico: hifas septadas hialinas e macroconídios
fusiformes septados, parede rugosa e extremidade arredondada (400x).
Figura 8: T. rubrum. A - Aspecto macroscópico: colônias algodonosas brancas de
pigmento avermelhado. B - Aspecto microscópico: hifas septadas hialinas e
microconídios dispostos em acladio (400x).
12
Figura 9: E. floccosum. A - Aspecto macroscópico: colônias lisas, pulvurulentas, verde-
acastanhada. B - Aspecto microscópico: hifas septadas hialinas e
macroconídios dispostos em cachos (400x).
1.5. Tratamento
Antifúngicos com diferente espectro de atividade têm sido utilizados para a
terapia das infecções fúngicas (Khan et al. 2006).
Os antifúngicos são agrupados de acordo com a sua composição química em:
1-Poliênicos (anfotericina B e nistatina) que interagem com ergosterol na
membrana celular produzindo poros ou canais, que aumentam a permeabilidade da
membrana, gerando uma grande perda de eletrólitos, principalmente potássio,
determinando assim a lise e morte da célula (Groll & Kolve 2004);
2- Azólicos (fluconazol, itraconazol, cetoconazol e voriconazol) e outros, em
desenvolvimento (posaconazol e ravuconazol), que inibem especificamente a
biossíntese do ergosterol, principal constituinte da membrana citoplasmática, através do
bloqueio da enzima 14-α-demetilase, presente no citocromo P-450 da célula fúngica
(Sanglard 2002);
3- Alilaminas (terbinafina e naftina), que também interferem na biossíntese do
ergosterol, mas através da inibição da enzima esqualeno epoxidase que também é
responsável pela produção do ergosterol (Favre & Ryder 1996; Espinel-Ingrof 2008);
4- Derivados morfolínicos (amorolfina), que atuam bloqueando duas etapas
sucessivas da biossíntese do ergosterol, mediadas pelas enzimas ∆14-redutase e ∆7-∆
8
isomerase (Favre & Ryder 1996);
5- Equinocandinas (caspofungina, anidulafungina e micafungina), antifúngicos
inibidores específicos da síntese de polímeros de glucana, constituinte da parede celular
A B
13
fúngica. Estes antifúngicos inibem a ação da enzima -1,3 glucano-sintase o que resulta
em depleção de polímeros de glucano (Kurtz & Douglas 1997; Martinez 2006);
6- Pirimidinas, representada pela flucitosina ou 5-fluorcitosina que atua inibindo a
síntese de DNA e RNA dos fungos (Sanglard & Odds 2002; Deresinski & Stevens 2003;
Kauffman 2006). O antifúngico é transportado para a célula fúngica por uma enzima
denominada citosina permease (não encontrada em células de mamíferos) e convertida
para 5-fluorouracil (5-FU) no citoplasma por outra enzima denominada citosina
deaminase. A 5-FU após fosforilada pode incorporar no RNA causando erro na síntese de
proteína ou é convertida em um deoxinucleotídeo, o que faz com que haja inibição da
síntese de DNA;
7- Derivados hidroxipiridona (ciclopirox), atuam na quelação de cátions
polivalentes, tais como (Fe3+
) com a inibição de enzimas metal-dependentes responsáveis
pela degradação de peróxidos tóxicos na célula fúngica (Gupta et al. 2000);
8- Polioxinas, atuam inibindo a incorporação de 14
C-glucosamina em na parede
celular fungica (Endo et al. 1970);
9- Antibióticos (griseofulvina) atuam na síntese do ácido nucléico, inibindo a
mitose de células fúngicas produzindo ruptura da estrutura do fuso acromático mitótico
(Nobre et al. 2002; Rathinasamy et al. 2010).
A figura 10 mostra os diferentes antifúngicos e os seus mecanismos de ação.
Figura 10: Sítio de ação de diferentes antifúngicos sobre a célula fúngica (Bohn &
Kraemer 2000, com modificações).
As dermatofitoses são infecções fúngicas superficiais de difícil tratamento e,
mesmo nos casos em que a medicação é adequada ao agente etiológico identificado,
14
nem sempre se obtêm cura, sendo freqüentes as recidivas (Joish & Armstrong 2002;
Colella et al. 2006). Para o tratamento das dermatofitoses são utilizados procedimentos
terapêuticos tópicos e orais (Gupta & Tu 2006; Garmendia et al. 2008; Kaur et al.
2008).
Os principais medicamentos tópicos utilizados são ciclopirox e amorolfina (Gupta
et al. 2004; Finch & Warshaw 2007; Shirwaikar et al. 2008). Os antifúngicos de uso
oral promoveram grandes avanços ao tratamento das dermatofitoses. Com o
desenvolvimento de compostos do grupo das alilaminas, como a terbinafina, e dos
triazois, como itraconazol e fluconazol, melhores resultados foram observados em um
menor período de duração do tratamento, levando um aumento dos índices de cura e da
diminuição das recorrências (Gupta et al. 1997; Rosso 2000; Ballesté et al. 2003; Gupta
et al. 2004; Finch & Warshaw 2007; Seebacher et al. 2007; Kaur et al. 2008; Negroni
2008).
De acordo com o Guidelines da Sociedade de Doenças Infecciosas da América
(IDSA), a prescrição para o tratamento da criptococose varia, de acordo com o local da
infecção, gravidade da doença e imunidade do hospedeiro (Saag et al. 2000; Perfect et
al. 2010).
A terapia ideal para a meningite criptocócica permanece indefinida, embora o
tratamento inicial com anfotericina B associado à fluorcitosina, seguida de uma
terapêutica de manutenção com fluconazol, parece promissor. Esta associação tem
demonstrado menos efeitos colaterais e desaparecimento mais rápido do fungo do
liquido cefalorraquidiano, do que quando o fluconazol é administrado isoladamente
(Ampel 2006; Brouwer et al. 2004). Anfotericina B em associação com 5-fluorcitosina é
utilizada no tratamento de infecções criptocócicas disseminadas, enquanto o fluconazol
e itraconazol são administrados normalmente quando as lesões são cutâneas. Este
tratamento é indicado tanto em indivíduos imunocompetentes como
imunocomprometidos (Bivanco et al. 2006).
1.6. Métodos de Suscetibilidade in vitro
Considerando a resistência intrínseca e adquirida de algumas espécies de fungos
aos antifúngicos utilizados no tratamento, torna-se evidente a necessidade de métodos
de referência, devidamente padronizados e validados, para que os testes de
suscetibilidade sejam amplamente utilizados na prática clínica (Almeida et al. 2009).
15
Nos últimos anos têm-se padronizado várias técnicas para detecção de resistência
in vitro de fungos envolvidos em infecções. As provas de suscetibilidade aos
antifúngicos têm usado a técnica de diluição em caldo, padronizada pelo Clinical and
Laboratory Standards Institute (CLSI 2008a; 2008b). Esta técnica é a mais utilizada por
ser rápida, de fácil execução e menos honerosa comparada à macrodiluição. Os
documentos M27-A3(28) e M38-A2, descritos pelo CLSI, padronizam o teste de
suscetibilidade antifúngica, para leveduras dos gêneros Candida e Cryptococcus e para
alguns fungos filamentosos, como Aspergillus spp, Fusarium spp, Pseudallescheria
boydii, Sporotrix schenckii e Rhizopus spp, respectivamente. Estes documentos
estabelecem a padronização de diluições do antifúngico, o meio de cultura utilizado
para crescimento e estimulação da esporulação do fungo (ágar batata dextrose), tamanho
e a diluição do inóculo, meio de cultura para o teste de suscetibilidade (RPMI 1640),
período e temperatura de incubação, leitura e interpretação dos resultados para a
determinação da concentração inibitória mínima (CIM). Para dermatófitos não há ainda
uma padronização, mas alguns pesquisadores têm encontrado boa reprodutibilidade dos
resultados utilizando o documento M38-A2 com algumas modificações segundo outros
pesquisadores, onde são estabelecidos o tamanho do inóculo, o período de incubação e a
interpretação dos resultados (Barros et al. 2006; Fernández-Torres et al. 2006;
Sarifakioglu et al. 2007; Santos & Hamdan 2007; Siqueira et al. 2008; Araújo et al.
2009).
A suscetibilidade aos antifúngicos é determinada através da CIM, em que o
crescimento de um microrganismo, na presença de uma sequencia de concentrações do
antimicrobiano, é medida durante um tempo definido de acordo com a metodologia
preconizada. A determinação da CIM para um microrganismo representa uma medida
para prever o resultado clínico (Kanafani & Perfect 2008; Perlin 2009; Lass-Flörl et al.
2010).
Diante da comprovada eficácia de várias plantas medicinais no tratamento de
doenças fúngicas, estas e seus compostos podem representar um recurso terapêutico
alternativo eficaz.
1.7. Ensaios de Citotoxicidade
Citotoxicidade foi definida por Ekwall (1983) como efeitos adversos resultado da
interferência em estruturas e/ou processos essenciais para a sobrevivência, proliferação
16
e/ou funções celulares. Ensaios de citotoxicidade são amplamente utilizados em estudos
de toxicologia in vitro. Eles são úteis para avaliar a biocompatibilidade e para a
avaliação da potencialidade de aplicação clínica. Depois de comprovada a sua não
toxicidade é que o estudo da compatibilidade biológica do produto pode ter
continuidade realizando os ensaios necessários em animais de laboratório (Rogero et al.
2003; Castro et al. 2004; Fotakis & Timbrell 2006).
Para o desenvolvimento de novos medicamentos são seguidos alguns passos para
a segurança das substâncias, sendo os testes in vitro o primeiro passo, podendo ser
excluído os compostos muito tóxicos. Após esta triagem são realizados os testes em
animais que são chamados testes pré-clínicos e quando os dados são satisfatórios quanto
à segurança das substâncias é que são realizados os testes clínicos (Spielmann et al.
2008).
Testes de citotoxicidade basal devem ser considerados como prioridade antes de
qualquer teste in vivo (Eisenbrand et al. 2002). Estes testes in vitro permitem reduzir o
número de animais que são utilizados in vivo. A comparação de toxicidade in vitro e a
in vivo com modelos animais, mostra correlação positiva para a estimativa de risco para
o ser humano (Pool-Zobel et al. 1994).
Os testes in vitro apresentam, entretanto, uma limitação quando comparado com
os in vivo, pois não se consegue determinar a metabolização dos compostos originais
que ocorre nos organismos vivos (Coecke et al. 2006). Desta forma, o conhecimento da
ação dos metabólitos no início dos testes toxicológicos é considerado um passo
fundamental para a determinação do perfil farmacológico e toxicológico de novos
xenobióticos (Zucco et al. 2004). Os metabólitos podem ser mais tóxicos que o próprio
composto, assim testes in vitro complementares devem ser realizados para caracterizar o
perfil de absorção, distribuição, metabolismo e excreção da substância em estudo
(Botham 2002). Ainda não existem testes in vitro que substituam os sistemas biológicos
como um todo.
Os métodos in vitro geralmente utilizam linhagens celulares. Os testes de
citotoxicidade basal in vitro são bastante vantajosos, pois sua validação e aplicação
oferecem melhor controle sobre as condições experimentais, permitindo uma melhor
apresentação dos resultados, rapidez na execução, baixo custo relativo, além de ser uma
importante ferramenta na redução do número de animais numa avaliação de toxicidade
aguda sistêmica (Melo et al. 2000; Valadares 2006).
17
Dentre os diversos ensaios de citotoxicidade existentes, o teste de absorção do
vermelho neutro é um dos mais comumente aplicados para a detecção de citotoxicidade
ou a viabilidade celular após a exposição a substâncias avaliadas. O vermelho neutro é
um corante vital que impregna nos lisossomos de células viáveis penetrando na
membrana celular por difusão passiva não-iônica (Melo et al. 2000; Fotakis & Timbrell
2006).
Avaliar a citoxicidade de um produto é de grande valia na descoberta de novas
substâncias que poderão ser usadas como antifúngicas.
18
2. JUSTIFICATIVA
As plantas e seus metabólitos secundários são uma grande fonte de inovação de
agentes terapêuticos para inúmeras enfermidades, incluindo doenças infecciosas
(Scorzoni et al. 2007; Silva et al. 2009). Algumas plantas possuem propriedades
reconhecidas de cura, prevenção ou de tratamento sintomático, validadas em estudos
etnofarmacológicos, em documentações tecnocientíficas ou em ensaios clínicos (Brasil
2004; Agra et al. 2007).
O Brasil é um dos países com maior diversidade de plantas, sendo o cerrado o
segundo bioma mais importante, com mais de 6000 espécies vegetais catalogadas e com
diversas espécies utilizadas para o tratamento de enfermidades. Estudos baseados no uso
popular das plantas do cerrado mostram extratos e compostos com atividade biológica
em potencial, incluindo atividade antifúngica (Silva et al. 2009). Hymenaea courbaril,
apresenta produtos extraídos da seiva, folhas, tronco, frutos e sementes de vagens com
uso medicinal, especialmente ligados a ação antimicrobiana (Simões et al. 2009).
Dentre os fungos causadores de patologia humana, aqueles pertencentes ao
complexo Cryptococcus e os dermatófitos são responsáveis por importantes infecções
tanto em pacientes imunocomprometidos quanto em imunocompetentes. Estas infecções
fúngicas são recidivantes e nem sempre a terapêutica usada, apresenta resposta eficaz,
sendo que algumas vezes a criptococose pode ser fatal (Chen & Sorrei 2007).
Diante desta exposição, o trabalho se propôs a verificar a atividade biológica da
seiva e de compostos isolados da seiva da espécie Hymenaea courbaril Linnaeus var.
stilbocarpa, conhecida popularmente como jatobá, sobre leveduras do gênero
Cryptococcus e fungos filamentosos como os dermatófitos, buscando desta forma
descobrir compostos que sejam possíveis alternativas para o tratamento das infecções
causadas por estas espécies.
19
3. OBJETIVOS
3.1. Geral
1- Verificar a atividade biológica da seiva de H. courbaril e de seus compostos.
3.2. Específicos
1- Determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) da seiva e dos compostos
obtidos da seiva de H. courbaril sobre isolados do complexo Cryptococcus neoformans
e de dermatófitos.
2- Determinar a Concentração Fungicida Mínima (CFM) da seiva e do composto
fisetina obtido da seiva sobre leveduras do complexo Cryptococcus neoformans e
dermatófitos.
3- Verificar a citotoxicidade in vitro da seiva e do composto fisetina.
20
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Estudo químico de H. courbaril
4.1.1. Coleta do material
A seiva de H. courbaril foi adquirida do Santuário de Vida Silvestre Vagafogo,
Pirenópolis/GO em junho de 2009, em frascos de aproximadamente 200mL.
4.1.2. Preparo e fracionamento da seiva
O preparo, fracionamento e identificação dos compostos isolados a partir da seiva
de H. courbaril foram realizados sob a supervisão da profa. Dra. Cecília Maria Alves de
Oliveira, no Laboratório de Produtos Naturais e Síntese Orgânica do Instituto de
Química da Universidade Federal de Goiás. O fracionamento da seiva resultou em
diferentes compostos representados na figura abaixo:
Figura 11: Fluxograma representando a seiva, as frações e os compostos obtidos.
21
α,3,4,2’,4’,tetrahidroxidihidrochalcona
As estruturas químicas dos compostos utilizados no estudo da seiva encontram-se
na figura 12.
O
OH
HO
OH
OH
O
Fisetina
HO OH
1,3 benzenediol
APJ-02 ACP-15
O
OH
OH
HOOH
Fisitinidol
O
OH
OH
OH
HO
O
Fustin
O
OH
OH
OH
HO
OOH
Taxifolin
OH
OH
OH
HO
OOH
Mistura de compostos (ALSJ-120)
Figura 12: Estrutura dos compostos obtidos da seiva de Hymenaea courbaril
4.2. Isolados
Este trabalho foi realizado com 44 isolados, sendo 26 de Cryptococcus
procedentes de material de líquido céfalo raquidiano de pacientes do Hospital de
Doenças Tropicais de Goiás, e 18 de dermatófitos obtidos de pacientes do Hospital das
Clínicas da Universidade Federal de Goiás.
Estes isolados foram provenientes de trabalhos anteriormente realizados no
Hospital de Doenças Tropicais e no Hospital das Clínicas com aprovação do comitê de
ética destes hospitais como protocolos 007/2004, 065/2008, respectivamente. Candida
parapsilosis ATCC 22019 e C. neoformans sorotipo D ATCC 28957 foram utilizadas
como controle.
Os isolados do complexo Cryptococcus neoformans foram identificados segundo
Kurtzman e Fell (1998), enquanto os dermatófitos foram submetidos a cultivo em ágar
sabouraud dextrose, ágar batata dextrose e microcultivo em lâmina para identificação.
22
4.3. Teste de suscetibilidade in vitro
O teste de suscetibilidade in vitro foi realizado por microdiluição em caldo usando
a metodologia descrita nos documentos M27-A3 e M38-A2 propostos pelo CLSI (2008
a;b) que padronizam a metodologia para leveduras e para fungos filamentosos,
respectivamente. Como para dermatófitos não há um método devidamente padronizado,
a microdiluição em caldo foi feita para fungos filamentosos, mas com modificações
propostas por Santos et al. (2006).
4.3.1. Preparo do inóculo
As células de C. neoformans foram suspensas em solução salina 0,85% medidas
no espectrofotômetro a uma transmitância de 85% em comprimento de onda (λ) de
530nm que corresponde a aproximadamente a 1x106 UFC/mL (CLSI 2008a).
Para dermatófitos, as suspensões foram feitas, acrescentando-se 5 ml de solução
salina estéril (0,85%), ao tubo de ensaio contendo a colônia do fungo. A superfície da
colônia foi raspada com a ponta de uma pipeta Pasteur, gerando uma mistura de
fragmentos de conídios e hifas foi separada em um tubo de ensaio para inóculo (Santos
et al. 2006). A densidade da suspensão foi ajustada com espectrofotômetro em λ de 520
nm até um nível de transmissão de 70 a 72% que corresponde a aproximadamente 4
x106 UFC/mL (CLSI 2008b).
4.3.2. Preparo do meio de cultura
O meio de cultura utilizado no teste foi o meio RPMI 1640, tamponado com
ácido 3-[N-morfolino]-propanossulfônico (MOPS) 0,165M pH 7,0. O meio de RPMI
foi esterilizado por filtração a vácuo com membrana estéril de celulose branca lisa 0,22
µm de poro e mantido a aproximadamente 6oC até o momento do uso.
4.3.3. Procedimento do teste de microdiluição em caldo
Triagem inicial foi realizada com 6 isolados de dermatófitos e 6 de Cryptococcus
para a seiva e compostos extraídos da seiva denominados APJ-02, ACF-15 e ALSJ-120
de H. courbaril com concentrações variáveis a partir de 256 µg/mL. Posteriormente de
acordo com os resultados obtidos procedeu-se o teste de suscetibilidade para 18 isolados
23
de dermatófitos e 26 de Cryptococcus utilizando-se concentrações que variaram de 256
a 0,25 µg/mL para a seiva e de 128 a 0,125 µg/mL para o composto APJ-02
denominado fisetina. Itraconazol foi utilizado como controle positivo.
Foram distribuídos 100 µL do meio RPMI nos poços de uma microplaca de 96
poços de fundo chato, a partir da segunda coluna. Posteriormente foram distribuídos 200
µL das amostras (seiva ou composto) nos poços da primeira coluna da placa e diluições
seriadas foram realizadas. Em seguida 100 µL do inoculo foi adicionado em cada
poço. Estas placas foram incubadas por 72 horas a 37ºC para Cryptococcus e por 5
dias a temperatura ambiente para dermatófitos. O esquema do teste de
suscetibilidade in vitro encontra-se abaixo.
Esquema 1:Etapas de procedimento do teste de microdiluição em caldo para fungos.
4.3.4. Interpretação dos resultados
A determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi verificada pela
menor concentração da seiva da planta e de seus compostos capazes de inibir o
crescimento total do microrganismo
4.4. Ensaios de Concentração Fungicida Mínima (CFM)
Para a determinação da CFM, um inóculo de 100 µL da CIM da planta e quatro
concentrações imediatamente superiores foi semeado em placas de Petri contendo ágar
24
sabouraud dextrose. As placas foram incubadas por 72 horas a 35ºC para Cryptococcus
sp e 5 dias para dermatófitos. A CFM foi definida como a menor concentração da planta
que resultou no crescimento de menos de duas colônias que representam a morte de
mais de 99% do inóculo inicial (Yadegarinia et al. 2006).
4.5. Ensaios de Citotoxicidade in vitro
4.5.1. Cultura Celular
Células de fibroblastos Balb/c 3T3-A31 foram cultivadas em Dulbecco`s modified
Eagle`s medium (DMEM – 1640 Sigma™, St. Louis, MO) suplementado com 10% de
Soro Fetal Bovino (SFB - Cultilab™), e mantidas em frascos de cultura de células a
37ºC em estufa de CO2 a 5%. Após o meio de cultura ser retirado dos frascos, as células
foram lavadas com PBS e retiradas do frasco, realizando-se tripsinização (solução de
tripsina 0,025%), sendo que ao observar a confluência de células livres em um
percentual de 50% a 80%, inativou-se a tripsina com uma solução de neutralização
(10% de SFB e 90% de DMEM). O conteúdo da garrafa foi transferido para um tubo
Falcon e centrifugado por 10 minutos a 1500 rpm a 35ºC. Descartado o sobrenadante, o
botão celular foi ressuspendido com 1 mL de meio DMEM (ICCVAM 2006).
Para a realização dos experimentos de citotoxicidade e para a manutenção das
células viáveis em estoque, foi estimado o número de células viáveis com o uso do
corante azul de tripano. Esta metodologia baseia-se na observação de que células
viáveis são impermeáveis ao referido corante, ao passo que as células não viáveis
apresentam permeabilidade, devido à formação de poros na membrana, o que permite a
penetração do corante exibindo coloração azul após tratamento (Konopka et al. 1996).
Para a contagem das células viáveis alíquota de 20 µL foi colocada em 180 µL de
azul de tripano, homogeneizadas e contadas em Câmara de Neubauer. A viabilidade
celular foi calculada através da seguinte fórmula:
Número de células contadas x 10* x 10
4** x Volume celular/mL
*=fator de diluição;
**=Fator de correção da câmara de Neubauer (10
3) x Espessura da lamínula (10)
25
4.5.2. Ensaio de incorporação do Vermelho Neutro
O ensaio de incorporação do corante vermelho neutro (2-amino-3-metil-7-dimetil-
amino-cloreto de fenzina) foi realizado de acordo com os procedimentos do protocolo
de Borenfreund e Puerner (1984) modificado pelo Interagency Coordenation Commitee
on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM 2006).
Suspensões de células contendo 3x104 células/mL foram adicionadas de meio de
DMEM suplementado com 10% SFB que foram distribuídas nos poços centrais da placa
de microtitulação. Os poços periféricos da placa foram semeados com 100 µL do
mesmo meio para garantir umidade. As placas foram incubadas por 24h a 37ºC em
estufa de CO2 a 5% para que as células pudessem formar uma monocamada celular.
Este período de incubação é importante para assegurar a recuperação das células, sua
aderência e progressão para a fase de crescimento exponencial.
Após este período de incubação, desprezou-se a solução sobrenadante do poço e
para verificar a citoxicidade da planta acrescentou-se 50µL de oito diferentes
concentrações (obtidas por diluições seriadas preparadas em meio DMEM) da seiva
(1024, 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8 µg/mL) e do composto fisetina (256, 128, 64, 32, 16,
8, 4, 2 µg/mL), determinadas a partir dos valores de CIM dos testes de atividade
antifúngica. As placas foram incubadas por 48h a 37ºC em estufa de CO2 a 5%. O teste
foi realizado em sextuplicata em três experimentos independentes (esquema 2). Após
este período, as soluções foram retiradas dos poços que foram adicionados de
250µL/poço contendo 1% do corante vermelho neutro a 0.3% (Sigma), 5% de SFB e
meio DMEM - 1640, incluindo os poços em branco. A incubação foi realizada por 3h a
37oC e em estufa de CO2 a 5%. A solução contendo vermelho neutro foi removida e as
células cuidadosamente lavadas com 250µL/poço de PBS pré-aquecido.
O PBS foi decantado da placa e adicionou-se 100µl da solução reveladora contendo
1% de ácido acético glacial (Vetec, Rio de Janeiro, RJ, Brasil), 50% de etanol P.A
(Vetec, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) e 49% de água deionizada em cada poço. As placas
foram submetidas a agitação por 20 min para extração do vermelho neutro. A leitura da
absorção do vermelho neutro foi medida em espectrofotometria (Start fax 2100,
Awareness Technology, Dusseldorf, Germany) usando um comprimento de onda de
540nm (esquema 3).
26
Esquema 2: Representação esquemática dos poços da placa de microtitulação após
formação de monocamada de células 3T3-A31 e adição de
concentrações crescentes da seiva ou do composto fisetina para o
ensaio de incorporação do corante vermelho neutro.
27
Esquema 3: Representação esquemática dos procedimentos realizados para avaliar a
citotoxicidade celular utilizando a metodologia de incorporação do corante
vermelho neutro.
4.5.3. Análise estatística
Foi calculada a média das leituras de densidade óptica de cada diluição e realizada
a comparação com a média do controle de células (100%), obtendo-se a porcentagem de
sobrevida das células em cada diluição.
Os dados foram analisados estatisticamente e graficamente usando software
GraphPad Prism 4.0 obtendo uma curva, na qual pode ser encontrado o índice de
citotoxicidade (IC50%) do material. IC50% significa a concentração do extrato que
mata metade da população celular.
28
5. RESULTADOS
A triagem realizada com seis isolados de dermatófitos e seis do complexo C.
neoformans para avaliar a suscetibilidade in vitro da seiva e de três compostos isolados
da seiva de H. courbaril mostrou que os fungos foram mais suscetíveis à seiva e ao
composto APJ-02 (fisetina) do que aos outros compostos como ACP-15 e ALSJ-120. A
concentração de 32 µg/mL do composto fisetina inibiu o crescimento de três isolados de
dermatófitos e a concentração de 128 µg/mL do mesmo composto inibiu os seis isolados
de Cryptococcus sp avaliados. Os resultados de concentrações inibitórias obtidos para
todos os isolados (12) estudados frente à seiva e aos três compostos são apresentados na
tabela 1.
Tabela 1: Suscetibilidade in vitro da seiva e de três compostos isolados de Hymenaea
courbaril (triagem) sobre isolados de dermatófitos e de Cryptococcus sp.
Como a seiva e o composto fisetina apresentaram os melhores resultados de
suscetibilidade, estes foram a partir daí usados para determinar a suscetibilidade de um
maior número de isolados de dermatófitos (total de 18) e de Cryptococcus (total de 26).
Fungos/número
Concentração Inibitória Mínima (µg/mL)
Seiva
Compostos
ALSJ-
120
ACP-15 APJ-02
Dermatófitos
T. mentagrophytes (28-60/409) 64 >128 128 32
T. mentagrophytes var. interdigitale (10) 64 128 64 32
T. mentagrophytes var. interdigitale (23) 128 >128 128 128
T. mentagrophytes var. mentagrophytes (22) 64 >128 >128 64
T. mentagrophytes var. mentagrophytes (28) 128 >128 128 64
T. mentagrophytes var. mentagrophytes (43) 32 >128 128 32
Leveduras
C. gattii (L1) 128 >128 128 128
C. neoformans (L7) 256 128 >128 128
C. neoformans (L11) >256 >128 128 128
C. neoformans (L16) 256 64 128 128
C. neoformans (L17) 256 128 >128 128
C. neoformans (L19) 256 128 64 128
29
A seiva de H. courbaril apresentou concentrações inibitórias de 32 a 128 µg/mL
para os dermatófitos e de 8 a 256 µg/mL para as leveduras do complexo C. neoformans.
O composto fisetina foi capaz de inibir os dermatófitos em CIMs que variaram de 4 a
128 µg/mL e em CIMs que variaram de 8 a 128 µg/mL para as leveduras do complexo
C. neoformans. O controle, realizado com itraconazol, mostrou para todos os
dermatófitos estudados, valores de CIM de 0,5 µg/mL e para todos os isolados de
Cryptococcus neoformans uma variação de 0,125 a 0,250 µg/mL. A tabela 2 mostra os
resultados da variação da CIM, os valores de CIM50, de CIM90 e a média geométrica da
atividade antifúngica da seiva e do composto fisetina sobre os fungos avaliados.
Tabela 2: Atividade antifúngica in vitro da seiva e do composto fisetina de H. courbaril
sobre isolados de C. neoformans e de dermatófitos.
Isolados
Concentração Inibitória Mínima (µg/mL)
Seiva Composto fisetina
Variação CIM50 CIM90 MG Variação CIM50 CIM90 MG
Dermatófitos (n)
M. gypseum (2) 64-128 128 128 90,5 64-128 128 128 90,5
T. mentagrophytes (8) 32-128 64 128 83 32-128 64 128 69,8
T. rubrum (7) 32-128 64 128 64 4-64 32 64 21,5
T. tonsurans (1) 128 128 128 128 128 128 128 128
Leveduras (n)
C. gattii (4) 128-256 128 256 181 128 128 128 128
C. neoformans (22) 8 - 256 64 256 68,2 8-128 64 128 48,2
MG = Média Geométrica
CIM50- Concentração inibitória mínima capaz de inibir o crescimento de 50% dos isolados
CIM90- Concentração inibitória mínima capaz de inibir o crescimento de 90% dos isolados
A CFM realizada para os 44 isolados, mostrou que a seiva e o composto fisetina
apresentaram valores maiores do que os obtido no teste de suscetibilidade in vitro para
obtenção da concentração inibitória mínima dos isolados estudados. T. rubrum mostrou-
se o fungo mais suscetível à atuação da planta, sendo que a seiva apresentou CFM de 32
µg/mL e o composto presentou CFM de 16 µg/mL. A variação de CFM da seiva e do
composto fisetina é mostrada na tabela 3.
30
Tabela 3: Concentração Fungicida Mínima (CFM) in vitro apresentada pela seiva e
pelo composto fisetina de H. courbaril sobre isolados de Cryptococcus sp. e
de dermatófitos.
Isolados
Concentração Fungicida Mínima (µg/mL)
Seiva Composto fisetina Itraconazol
Variação Variação Variação
M. gypseum 64-128 128 - >128 1
T. mentagrophytes 64->256 64->128 1
T. rubrum 32-128 16 - >128 1
T. tonsurans >256 >128 1
C. gattii >256 128->128 0.5-1
C. neoformans 256->256 128->128 0.25-1
No teste de citotoxicidade realizado, verificou-se que as células de fibroblastos
3T3-A31 tratadas com a seiva e com fisetina apresentavam-se com um número reduzido
quando visualizadas através de microscopia óptica invertida como verificado na figura
13.
Figura 13: A- Células de fibroblastos de Balb/c 3T3-A31 sem tratamento. B- Células
tratadas com a seiva em uma concentração de 64 µg/mL. C- Células tratadas
com o composto fisetina em uma concentração de 128 µg/mL. Fotomicrografia
em microscópio invertido 200x.
A observação macroscópica das placas de microtitulação, após o tratamento das
células de fibroblastos Balb/c 3T3-A31 com fisetina, mostrou uma maior absorção do
vermelho neutro quando comparadas com as que foram tratadas com a seiva de H.
courbaril (figura 14).
A B C
31
Figura 14: Placa de microtitulação mostrando a absorção do corante vermelho neutro
por células 3T3-A31 tratadas com seiva (A) e com o composto fisetina (B).
A atividade citotóxica da seiva e do composto fisetina mostrou que o composto é
menos citotóxico que a seiva de H. courbaril. A análise dos dados expostos
graficamente usando o software GraphPad Prism 4.0 mostrou uma curva, com IC
(índice de citotoxicidade, ou seja, morte de 50% de fibroblastos de mamíferos) de 158
µg/mL para o composto e de 109 µg/mL para a seiva. A curva da viabilidade celular
obtida para o composto e para a seiva encontram-se nas figuras 15 e 16.
Figura 15: Curva da viabilidade celular de fibroblastos 3T3-A31 no teste de
citotoxicidade após 48h de exposição à diferentes concentrações da seiva
de H. courbaril, pela incorporação do vermelho neutro. IC50=109 µg/mL.
A B
32
Figura 16: Curva da viabilidade celular de fibroblastos 3T3-A31 no teste de
citotoxicidade após 48h de exposição à diferentes concentrações do
composto fisetina de H. courbaril, pela incorporação do vermelho neutro.
IC50= 158 µg/mL.
33
6. DISCUSSÃO
O número de medicamentos de ação antifúngica é ainda restrito quando
comparado ao de inúmeros antibacterianos existentes. Isto se deve ao fato de que os
antibióticos descobertos há milhões de anos eram usados especificamente para o
tratamento de bactérias. Além disso, há fatores ligados à estrutura dos fungos, que
dificultam a descoberta de substâncias antifúngicas com poucos efeitos tóxicos. Os
fungos possuem núcleo e membrana nuclear bem definida, sendo então semelhantes ao
organismo animal. Estas características morfológicas favorecem a produção de efeitos
colaterais nas células animais, que ocorrem principalmente no fígado e baço. Além de
toxicidade existem outros fatores inerentes aos antifúngicos como baixa eficácia, custos
elevados e ainda a resistência dos fungos a estas terapias que têm promovido o
incentivo por novos fármacos. Desta forma, a pesquisa de substâncias derivadas dos
diferentes extratos das plantas como caule, folhas, flores, frutos e seiva tem sido
considerada uma fonte promissora de agentes antimicrobianos, com o intuito de
descobrir compostos mais efetivos e menos tóxicos (Nobre et al. 2002; Passos et al.
2002; Bergold & Georgiadis 2004; Ayres et al. 2008; Sharma & Kumar 2009).
Atividade antimicrobiana de várias espécies de plantas de uso na medicina
popular tem sido observada para os fungos como os dermatófitos e para as leveduras do
gênero Cryptococus. Passos et al. (2002) mostraram que a cera epicuticular retirada da
folha de Caryocar brasiliensis inibiu o crescimento de 91,3% (21/23) dos isolados de C.
neoformans em concentração ≤ 250 μg/mL, enquanto Costa et al. (2000) mostraram que
o óleo da folha de Eugenia dysenterica apresenta atividade inibitória sobre este fungo,
em uma concentração <250 μg/mL. Souza et al. (2003) verificaram que o óleo essencial
de Hyptis ovalifolia foi capaz de inibir o crescimento de T. rubrum em concentração de
7,8 μg/mL, Silva et al. (2005) verificaram que a fração hexânica de Ocimum
gratissimum inibiam os dermatófitos em concentrações de 125 μg/mL.
O gênero Hymenaea, estudado neste trabalho já demonstrou atividade antifúngica
como determinada por alguns pesquisadores. Souza et al. (2009) avaliando extratos e
frações hidroalcoólicas de H. martiana sobre fungos do gênero Cryptococcus e sobre
dermatófitos verificaram que o extrato bruto desta planta foi capaz de inibir o
crescimento de Cryptococcus neoformans em concentração de 2 μg/mL, e uma fração
desta planta mostrou inibição de crescimento de T. rubrum em concentração de 8
34
μg/mL. Resultados semelhantes foram observados em nossos experimentos de triagem
de atividade in vitro da seiva e de compostos de H. courbaril que foram capazes de
inibir o crescimento de alguns isolados de dermatófitos em concentrações de 32 g/mL.
Os experimentos realizados posteriormente, onde se usou um grande número de
isolados foram capazes de confirmar a atividade da seiva e da fisetina de H. courbaril,
sendo que a suscetibilidade das espécies de dermatófitos ao composto fisetina, foi muito
elevada, visto que este composto inibiu o crescimento de T. rubrum em concentração de
4 g/mL. A atividade antimicrobiana detectada deve-se provavelmente aos constituintes
fitoquímicos desta planta. Metabólitos secundários ricos em triterpenos, diterpenos,
flavonóides e fenóis largamente encontrados em H. courbaril são compostos conhecidos
como bioativos. O composto fisetina é um flavonóide explicando, portanto, a sua alta
atividade antifúngica.
A atividade biológica dos compostos e da seiva embora capazes de inibir o
crescimento dos microrganismos em baixas concentrações mostrou maiores valores de
concentração fungicida, verificando-se, portanto que a maioria das vezes o efeito nos
fungos é fungistático, não sendo capaz de destruir o microrganismo. Alguns
antifúngicos como os derivados azólicos usados para o tratamento de várias infecções
fúngicas são considerados como fungistáticos (Martinez 2006). Neste trabalho,
observou-se que a CFM para os isolados de dermatófitos e de Cryptococcus foi de pelo
menos duas vezes superiores aos da CIM. CFM de valores superiores ao CIM de
algumas plantas sobre fungos também têm sido observadas. Pereira et al. (2011)
verificaram que CIM de óleo essencial de Cymbopogon winterianus era oito vezes mais
baixos que a CFM para isolados de T. mentagrophytes. Da mesma forma Pinto et al.
(2009) mostraram que as CIMs do óleo esencial de Syzygium aromaticum apresentaram-
se duas vezes inferiores a CFM para várias espécies de dermatófitos. Segundo Agüero et
al. (2010), o extrato metanólico de própolis de Zuccagnia punctata foi capaz de inibir o
crescimento de C. neoformans em concentração de 125 g/mL, enquanto a CFM foi de
250 g/mL, ou seja duas vezes superior a CIM.
Os fitoterápicos são comumente utilizados pela população nos tratamentos de
diversas enfermidades. Além da boa aceitação, o baixo custo no preparo e na aquisição
são os principais motivos do sucesso dos fitoterápicos (Martins et al. 2009).
A avaliação da toxicidade pode fornecer informações valiosas, indicando fontes
vegetais com importantes atividades biológicas sem prejuízo para o organismo do
35
hospedeiro. A análise de citotoxicidade usando vermelho neutro realizada neste
trabalho, encontra respaldo nas análises químicas recomendadas pelo ICCVAM (2006),
mostrando que os resultados obtidos são capazes de predizer o efeito citotóxico de uma
determinada substância. Em nosso trabalho, a seiva e o composto fisetina de H.
courbaril mostraram efeito nos fibroblastos 3T3 de camundongos com uma correlação
direta, sendo que o aumento da concentração da seiva ou composto mostrava
diminuição da concentração celular. A determinação de IC50 de 109 g/mL para a seiva
e de 158 g/mL para o composto, com CIM50 da seiva e do composto com valor de 128
g/mL para todos os fungos testados mostra que o efeito citotóxico do composto é
menor do que da seiva, portanto concentrações menores do composto são capazes de
impedir o desenvolvimento do fungo sem danos às células animais 3T3. O fato de ser
um produto natural e a possível ausência de toxicidade da fisetina sobre as células
animais mostra uma grande vantagem sobre os antifúngicos usados comercialmente. A
ausência de efeitos tóxicos nas células animais pode representar seguramente um
potencial terapêutico contra as infecções fúngicas.
Diante destes resultados que indicaram um efeito antimicrobiano combinado com
efeito inibitório de células de fibroblastos de camundongos, a possibilidade de usar a
fisetina para tratamento de infecções fúngicas pode ser explorada em futuros
experimentos.
36
7. Conclusões
1. Os resultados prévios obtidos com a suscetibilidade in vitro em uma triagem
inicial, realizada com seis isolados de dermatófitos e seis de leveduras,
mostraram que a seiva e o composto fisetina apresentaram melhor atividade do
que os compostos ALSJ-120 e ACP-15.
2. A suscetibilidade in vitro do composto fisetina e da seiva mostrou variações de
CIM menores do que 256µg/mL para todos os dermatófitos (18) e leveduras (26)
testadas, verificando-se que estes produtos são ativos para estes fungos.
3. Entre os fungos testados, merece destaque os isolados de T. rubrum que se
apresentaram mais suscetíveis a ação da seiva e do composto fisetina. Esta
espécie produz infecções altamente recidivantes.
4. Apesar dos bons resultados de atividade biológica da seiva e do composto
fisetina, a concentração fungicida destes foi pelo menos duas vezes superior à
CIM encontrada para as leveduras e os dermatófitos.
5. Os valores de IC50 possíveis de serem detectados após o teste de citotoxicidade
permitiu verificar que o composto fisetina é dotado de menor citotoxicidade do
que da seiva.
6. O efeito antimicrobiano combinado com baixo efeito tóxico nas células animais
observado para a fisetina pode demonstrar seguramente um potencial
terapêutico, possibilitando a exploração em futuros experimentos do uso de
fisetina para tratamento de infecções fúngicas.
37
8. REFERÊNCIAS
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54
9. ANEXOS
9.1. Anexo 1 – Parecer do Comitê de Ética – Hospital das Clínicas - UFG
55
9.2. Anexo 2 – Parecer do Comitê de Ética – Hospital de Doenças Tropicais de
Goiás
56
9.3. Anexo 3 – Artigo
Structural and Functional Characterization of a Multifunctional Alanine-
Rich Peptide Analogue from Pleuronectes americanus