assemblage des protéines de réserve par coacervation simple … · ¾Échelle colloïdale...
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Assemblage des protéines de réservepar coacervation simple(ou désolvatation)D. RENARD - L. LAVENANTURBIA-Équipe APR-INRA Nantes
Institut National de la Recherche Agronomique
Coacervation : séparation d’un système colloïdal en deux phases liquides. Laphase la plus concentrée en colloïdes est la phase coacervée, l’autre phase étant la solution d’équilibre. Terminologie voisine : désolvatation (drawning-out precipitation, salting-out)(Source : IUPAC Compendium of Chemical Technology 2nd Edition 1997) N.B. Dans le cas d’une précipitation, la phase concentrée est solide ou vitreuse.
Contexte biologique de notre étudeVue très partielle du physico-chimiste
Contrôle-qualité dansla sécrétion et le routagedes protéines de réserve
Soluble : diffuse au sein du REet incorporable dans les vésiculesde transport
Mécanismes de rétentionau sein du réticulum
(nécessité d’un domainerépété riche en proline)
BiP Maïs, riz
Blé
Assemblage des protéinesest un processus
concentration-dépendant
A. Vitale, A. Ceriotti. Plant Physiol. 2004 136 pp. 1-7
Lumen RERoutage des protéinessolubles correctement repliées
Cytosol
COPII
Vacuole(PSV)
Vacuole(PSV)
dégradationrapide
Pas de dégradation
Pourquoi s'intéresser à la genèsedes corpuscules protéiques ?Point de vue du physico-chimiste
L’objectif général est l’établissement des relations structures-fonctions dans les organisations supra-moléculaires.
compréhension du “ packing ” de ces protéinesdégager des voies de recherche en ingénierie
supra-moléculaire pour générer des assemblages de biopolymères possédant des propriétés nouvelles
Déficits de connaissances
structure des protéines de réserve des graines : absence de structures cristallines et polymorphisme
intervention d’autres protéines (cargos, chaperones, glycosidases, kinases, ...) dans le repliement et le transport des protéines de réserve
Quels systèmes modèles oubio-mimétiques pour l’étude des phénomènes d’agrégation, de condensation et de micro-compartimentationdes protéines de réserve ?
Système biomimétique : reproduit in vitro les interactions et les mécanismes hiérarchiques d’association entre biopolymères pour conduire à la formation d’édifices supramoléculaires d’ordre et de mobilité déterminés Système modèle : reproduit in vitro les associations des biopolymères conduisant à la formation d’entités supra-moléculaires en ignorant le contexte biologique
Démarche générale de nos travaux
Approche mécanistique des processus d'agrégation oud'assemblage aux différentes échelles d'observation
Échelle moléculaire (UV-Vis, IRTF, DC, fluorescence)Échelle colloïdale (diffusion du rayonnement, cryo-TEM)Échelle microscopique (microscopies optiques)Échelle macroscopique (diagramme de phases,rhéologie)
Approche cinétique des processus d'agrégation oud'assemblage
Moléculairecolloïdale microscopique macroscopique
0.1-500nm ≥ 1µm > 100µm
Systèmes modèlesLes objets d’étude
Protéines de gluten de blé(prolamines)
Pauvre en S Riche en S HMW
Gliadines ω-gliadines γ-gliadines α-gliadines
Gluténines LMW LMW LMW LMW HMWSous-unités type D type C type C type B sous-unités
Classification et nomenclature des protéines de gluten de blé
Schéma d’une séquence de HMW
DomaineN-terminal
DomaineC-terminalDomaine répétitif
SHSHSHSH
SHSH SH SH
LMW : low molecular weightHMW : high molecular weightS : soufreSH : groupement thiol porté par le résidu Cystéine
5-6 COO-/molécule
LMW, γ-gliadines (riche en Pro, Gln) LMW, γ-gliadines (riche en S-S)
6.4% 39.9% 53.7%
Régionsresponsables
de l’assemblage
Kasarda, 1994
Gluténine HMW(domaine répété)
50 x 2 nm
Gliadine10 x 3 nm
Représentation en volume (rayons de van der Waals)de prolamines de blé par modélisation moléculaire
Cystéine 295
Cystéine 43
Cystéine 295
Residue 200
Residue 369(C-terminal)
C(220)-C(240)
C(248)-C(345)
C(212)-C(247)
Gluténine LMW
(A) gluténine LMW entière(B) modèle simplifié de la région encerclée ( Cys 295)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.00.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
I/I0
q (nm-1)
L=16; d=3.6 nm2a=22; 2b=3.8 nm
0.0 0.5 1.0 1.5 2.00.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
I/I0
q (nm-1)
L=16; d=3.6 nm2a=22; 2b=3.8 nm
0.0 0.5 1.0 1.5 2.00.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
I/I0
q (nm-1)
L=16; d=3.6 nm2a=22; 2b=3.8 nm
0.0 0.5 1.0 1.5 2.00.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.00.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
I/I0
q (nm-1)
L=16; d=3.6 nm2a=22; 2b=3.8 nm
Structure :Cylindre L=16nm, d=3.6nm ouEllipsoïde 2a=22nm, 2b=3.8nm
Polymorphisme :Miscibilité totale ( γ-ω et γ-LMWG) 0.1 1
0.01
0.1
1
10
EtOD/D2O 62/38
I/C (g
-1.c
m2)
q (nm-1)
γ-gliadineω-gliadineω - γ 1:1ω - γ 1:3ω - γ 3:1L=18.5 nm; d=3.5 nm
0.1 1
0.01
0.1
1
10
0.1 1
0.01
0.1
1
10
EtOD/D2O 62/38
I/C (g
-1.c
m2)
q (nm-1)
γ-gliadineω-gliadineω - γ 1:1ω - γ 1:3ω - γ 3:1L=18.5 nm; d=3.5 nm
1. Facteur de forme d’une protéine végétale en solution
1ère étapeLn(qI)=f(q2) —> Rc (rayon de section)avec R=Rc(2)1/2 —> d2ème étapeLn(I)=f(q2) —> Rg (rayon de giration)avec Rg
2=(L2/12)+(R2/2) —> LAvec la connaissance de L et d, calculde l’intensité diffusée
γ-gliadine
Systèmes modèlesApproche expérimentaleRésultats
Approche expérimentale in vitro : principe de la coacervation
Polymère Complexes Coacervats Séparationen bon solvant soluble/insoluble (gouttelettes) de phases
Mauvais solvant temps à l’équilibre
Phase richeen polymère
Phase richeen solvant
Coacervat I
Coacervat II
Coacervat III
Vacuole dansle Coacervat II
Vacuole dansle coacervat I
5µm
Taille minimale de particules au maximum de solubilité du polymère
Fusion des coacervats et vacuolisation
Approche expérimentale in vitro :mauvais solvant et/ou choc osmotique
«Solution»de
Gliadines*(10 mg/mL; 20mL)
EtOH:H2O52:48
1
2
3interneexterne
Mauvais solvantEtOH:H2O 45:55
35:6525:75
Choc osmotiquePEG 35000 ≠ Conc.EtOH:H2O 52:48
Mauvais solvant+ choc osmotique
1 2+
Objectifs : création de particules denses mimant lescorpuscules protéiques – approche cinétique des phénomènes d’agrégation/condensation
200mL* Centrifugation 30min 11000g
% EtOH final45.636.527.5
Approche expérimentale in vitro : mauvais solvant et/ou choc osmotique
Mauvaissolvant
Choc osmotiqueen bonsolvant
Choc osmotiqueen mauvaissolvant
Perte en protéines liée à la séparation de phases
Concentration de la solution de protéines
Concentration et séparation de phases
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000
10
20
30
40
50
60 45/55 + PEG (15%) 35/65 + PEG (15%) 25/75 + PEG (15%)
48/52 + PEG (5%) + PEG (10%) + PEG (15%)
45/55 EtOH/H2O 35/65 25/75
2
3
1
Cgl
iadi
nes (g
.l-1)
temps (h)
C0
123
Approche expérimentale in vitro : mauvais solvant EtOH:H2O 25:75
Contraste de phases (+) ( )
Contraste interférentiel ( ) Épi-fluorescence ( )
Contraste de phases (-) ( )5µm
5µm
5µm
5µm
Approche expérimentale in vitro : mauvais solvant
t=0 ou condition 2
Condition 1 : t=4HEtOH/H2O 45/55 ou 40/60 Condition 1 :
EtOH/H2O 35/65 ou 25/75
1HΦ≤1µm
4H1≤Φ≤1.5µm
7H1≤Φ<2µm Cinétique de croissance
des particules : processus auto-limitant régi par :•Rapport bon/mauvais solvant•Vitesse d’ajout du mauvaissolvant
•Concentration en protéines
24H1≤Φ<3µm
48H1≤Φ<3µm
5µm
Approche expérimentale in vitro :mauvais solvant mauvais solvantà l’équilibre +choc osmotique
Phase inférieure
Phase supérieure
5µm 1HΦ≤1µm
4H1≤Φ≤2µm
7H1≤Φ<5µm
7HFusion-vacuolisation
24H1≤Φ<5µm
30H1≤Φ<5µm
ConclusionApproche de la coacervation / biologie :•Mauvais solvant / irréaliste (C ∼ 0.3mM)•Mauvais solvant+PEG / réaliste (C ∼ 1.7mM)
PerspectivesPrise en compte des conditions biologiquespH (pHcyt ∼ 7,2), ions calcium ([Ca++]libre ∼ 10µM à 1mM), co-solutés C en protéines dans le réticulum (C∼1mM)
Prise en compte du confinementInteractions avec les membranes du réticulum (∼1-10µm2/µm3)Composition membrane(thèse GDR Amélie Banc)
Merci pour votre attention…