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<p>A melatonina e Doxorrubicina induzindo sinergicamente (agindo em conjunto) apoptose celular em linhas celulares de hepatoma humano Lu-Lu Fan, Guo-Ping Sun, Wei Wei, Zhang-Wang Gui, Lei Ge, Wei Zheng-Fu e Wang Hua. Informaes sobre o autor notas artigo Informaes de Copyright e Licena Este artigo foi citado por outros artigos PMC. Abstrato AIM: Para investigar se a melatonina tem efeitos sinrgicos com doxorrubicina na inibio do crescimento e apoptose por induo de linhas de clulas de hepatoma humano HepG2 e Bel-7402.</p> <p>MTODOS: O sinergismo da melatonina e Doxorrubicina inibiu o crescimento celular e apoptose celular induzida em clulas de hepatoma humano HepG2 e linhas de Bel7402. A viabilidade celular foi analisada pelo cido 3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5difenil-tetrazlio ensaio (MTT). Apoptose das clulas foi avaliada usando o mtodo de TUNEL e citometria de fluxo. Apoptose relacionada com protena Bax, Bcl-2 e caspase3 expresses foram medidos atravs de colorao imuno-histoqumica.</p> <p>RESULTADOS: O tratamento com melatonina (10 -8 -10 -5 mol / L) sozinho tinha um efeito relacionado com a dose inibitria sobre a proliferao celular, mas nenhum efeito citotxico em clulas de hepatoma HepG2 e linhas de Bel-7402. interessante notar que, quando combinado com doxorubicina, a melatonina aumentou significativamente os efeitos da inibio do crescimento celular e apoptose celular. Alm disso, a colorao de TUNEL e por citometria de fluxo revelou que a induo de apoptose cooperativo foi associado com expresso reduzida de protena Bcl-2, bem como o aumento da expresso do Bax e Caspase3. CONCLUSO: O sinergismo da melatonina e Doxorrubicina inibe o crescimento das clulas de hepatoma e induz a apoptose de clulas. Palavras-chave: Melatonina, doxorrubicina, a linha celular de hepatoma humano, a apoptose INTRODUO A melatonina, um produto secretrio-chefe da glndula pineal, tem diversas funes fisiolgicas. Ela desempenha um papel crucial na regulao do ritmo circadiano, e est envolvido na imunomodulao, a hematopoiese, e os processos de antioxidantes [1 - 5]. Um grande nmero de estudos demonstraram que a melatonina tem importantes</p> <p>propriedades oncostatic [ 6 , 7 ]. Inibe a proliferao de clulas nas linhas de clulas de cancro, incluindo vrios humanas B de linfoma de clulas-[8], clulas humanas de leucemia mielide HL-60 [9] e clulas cancerosas humanas de neuroblastoma [10]. A melatonina diminuiu a taxa de crescimento de tumores in vivo, tanto em modelos animais transplantveis e o modelo animal induzida pela administrao de agentes cancergenos [11, 12].</p> <p>O carcinoma hepatocelular (HCC) o quinto cncer mais comum em todo o mundo, e mais de meio milho de novos casos ocorrem anualmente [13]. Em algumas reas da sia e do Oriente Mdio, o HCC est classificada como a primeira causa de morte por cncer. A incidncia de carcinoma hepatocelular est tambm a aumentar, na Europa e nos Estados Unidos [ 14 ]. A quimioterapia uma das estratgias de tratamento comuns em HCC, especialmente para tumores irressecveis. Frmacos quimioteraputicos convencionais, tais como doxorrubicina, muitas vezes tm graves efeitos secundrios que limitam a sua eficcia. A terapia combinada com mltiplas drogas ou modalidades uma prtica comum no tratamento de cancro, o que pode conseguir um melhor efeito teraputico do que uma nica droga ou modalidade, e pode reduzir os efeitos colaterais e de resistncia s drogas tambm. Assim, imperativo desenvolver novos agentes que podem ajudar a aumentar a eficcia da droga, bem como reduzir a toxicidade.</p> <p>O presente estudo foi desenhado para investigar os efeitos inibidores do crescimento e apoptose de induo de melatonina sozinha ou combinada com doxorrubicina, a fim de desenvolver uma nova terapia adjuvante para o carcinoma hepatocelular.</p> <p>MATERIAIS E MTODOS Cultura celular Hepatoma humano clulas HepG2 e Bel-7402 foram adquiridos a partir de Xangai banco de clulas, da Academia Chinesa de Cincias, cultivadas em Dulbecco modificado por Eagles de mdio e meio RPMI-1640, respectivamente. Cada um deles foi suplementado com 10% (v / v) inactivado por calor soro bovino fetal e antibiticos, e incubado a 37 C em atmosfera hmida com 50 mL / L de CO2.</p> <p>Drogas e produtos qumicos A injeco de doxorrubicina foi adquirido a partir de Shenzhen principal Sorte pharmceuticals Inc. (Shenzhen, China, CatNO0407E1, 10 mg ampola /); melatonina, 3 (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-diphenyltetra zolium-brometo ( MTT) e RNase A era da Sigma (St Louis, MO, EUA). Meio DMEM e meio RPMI-1640 foi de Gibco BRL Life</p> <p>Technologies Inc. (Grand Island, Nova Iorque, EUA); anticorpos policlonais de coelho contra a protena Bcl-2 humana, Bax e caspase-3 foram todos adquiridos a partir de Lab Vision Corporation (Fremont, Califrnia, EUA) e a estreptavidina-biotina-peroxidase (SP) foi obtido kit de reagentes de Fuzhou Maxim Biotech, Ltd. (Fuzhou, China). A apoptose de clulas Kit de Deteco PI foi fornecido pela Nanjing KeyGen Biotech Co. Ltd. (Nanjing, China). Deadend TM Colorimetric TUNEL System foi da Promega Biotech Co. Ltd. (Madison, WI, EUA).</p> <p>In vitro a citotoxicidade exame A citotoxicidade foi medida utilizando o ensaio MTT. HepG2 e Bel-7402 clulas em fase exponencial de crescimento foram cultivados a uma densidade de 1 x 10 4 clulas / poo numa placa de 96 poos. Aps o tratamento com vrias concentraes de droga durante 48 h, uma soluo de MTT (5,0 mg / mL em salino tamponado com fosfato) foi adicionado (20,0 uL / poo) e as placas foram incubadas durante mais 4 horas a 37 C. Os cristais prpura de formazan foram dissolvidos em 150,0 mL de DMSO Sulfxido de dimetilo por poo. Aps 10 min, as placas foram lidas no leitor de microplacas (American Bio-Tek) a 490 nm. As clulas sem drogas foram usadas como controle. Os ensaios foram realizados em trs experincias independentes. A percentagem de citotoxicidade foi calculada como se segue: A citotoxicidade (%) = (1 A 490 de experimental bem) / A 490, de controle do poo. A concentrao mediana de inibio (IC50) (definido como a concentrao de frmaco qual o crescimento da clula foi inibido em 50%) foi avaliada a partir das curvas de dose-resposta.</p> <p>Anlise in vitro de interaco medicamentosa</p> <p>O coeficiente de interaco frmaco (CDI) foi utilizado para analisar o efeito inibitrio synergistical de combinao de drogas. CDI calculada como se segue: CDI = AB / (A x B). De acordo com a absorvncia de cada grupo, AB a razo entre os grupos de combinao para controlar o grupo A em 490; A ou B a relao entre os grupos de agente nico para controlar o grupo A, em 490. Assim CDI valor menor que, igual a ou maior do que 1 indica que as drogas so aditivas, sinrgica ou antagonista, respectivamente. Menos do que 0,7 CDI indica que as drogas so significativamente sinrgico.</p> <p>TUNEL ensaio As clulas foram cultivadas em placas de 6 poos contendo lamelas durante a noite. Aps o tratamento com vrias concentraes de melatonina ou doxorrubicina ou em</p> <p>combinao de 48 h, as lamelas foram lavadas duas vezes com PBS e fixadas em soluo de paraformaldedo a 4% durante 25 min temperatura ambiente. As clulas apoptticas foram detectadas por terminal de desoxinucleotidil-transferase dUTP mediada por nick end-rotulagem (TUNEL) ensaio colorimtrico utilizando deadend Kit Sistema TUNEL da Promega (Madison, WI), seguindo as instrues do fabricante. Os resultados do ensaio de TUNEL foram analisadas quantitativamente por anlise de imagem do sistema biolgico que consiste em microscpio Nikon Eclipse 80i biologia, Nikon Digital Camera DXM 1200F, ACT-1 verso 2,63 software (Japan).</p> <p>Imunocitoqumica</p> <p>As clulas foram semeadas em lamelas de vidro durante a noite. Depois da incubao com diversas concentraes dos frmacos de 48 h, as lamelas foram lavadas duas vezes com PBS e adicionou-se soluo de paraformaldedo a 4% durante 30 min temperatura ambiente. A colorao imuno-histoqumica para a protena Bax, Bcl-2 e caspase-3 foi medido utilizando o mtodo padro de SP. A manipulao detalhada foi conduzida de acordo com as instrues do fabricante. Como controlo negativo, o PBS foi usado em vez do anticorpo primrio, e outros passos foram seguidos da mesma maneira. Os resultados imunocitoqumicos foram quantitativamente analisados pelo sistema biolgico de anlise de imagem que consiste em microscpio Nikon ECLIPSE biologia 80i, cmera digital Nikon DXM 1200F, ACT-1 verso de software 2,63 (Japo), e 801D JEOA morfolgica biolgica imagem da verso do software de anlise 6.0 (Da Jie Technologies . Inc., China). O valor de absorbncia mdia foi analisado por cinco selecionados aleatoriamente campos pticos em microscopia ( 400).</p> <p>A citometria de fluxo</p> <p>As clulas foram cultivadas em placas de 6 poos e, em seguida, tratados com melatonina e / ou de doxorrubicina com as concentraes desejadas. Aps a exposio droga durante 48 h, as clulas foram tratadas com tripsina, lavadas duas vezes com PBS frio e centrifugadas. O sedimento de clulas foi ressuspenso em 1 ml de PBS frio e fixadas em 9 mL de etanol a 70% a -20 C durante pelo menos 12 h. Em seguida, as clulas foram centrifugadas e ressuspensas em 500 ul de PBS, RNase A foi adicionado e as clulas foram incubadas a 37 C durante 30 min. Iodeto de propdio tampo de colorao (PI) foi adicionado no escuro temperatura ambiente durante 30 min (de acordo com o programa do processo celular Kit de Deteco de apoptose PI). Um mnimo de 1 x 10 clulas de 6 / mL para cada um dos grupos foi analisada por meio de um EPICS XL-MCL modelo contador (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EUA).</p> <p>A anlise estatstica</p> <p>Bioestatsticas anlises foram feitas utilizando o pacote de software SPSS 11.5. Todas as experincias foram repetidas pelo menos trs vezes. Os resultados de vrias experincias so dados como a mdia SE. No paramtrico de Kruskal-Wallis foi utilizado para detectar diferenas entre os diferentes grupos experimentais. O teste de Mann-Whitney U-teste foi subsequentemente utilizada para a avaliao estatstica em dois grupos de comparaes. Coeficiente de correlao de Pearson foi utilizado para variveis contnuas e independentes e dependentes. Um nvel de P </p>