apuntes bioensayo

5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com

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Apuntes de Bioensayos.

1.- INTRODUCCIÓN Y PRINCIPIOS GENERALES.

Características generales del curso

1.1.1. Propósito y entrega de temario y calendario de prácticas de

laboratorio.

1.2. Conceptos Básicos.

Que es un Bioensayo??

Un bioensayo es el uso de un organismos VIVO como un agente de

prueba para la presencia o concentración de un compuesto químico o

un efecto ambiental.

1.2.1. Diseño Experimental.

Un experimento es una investigación planeada para descubrir

nuevos hechos o para confirmar o negar los resultados de

investigaciones previas. En un experimento se manipulan

deliberadamente una o más variables independientes (supuestas

causas) para analizar las consecuencias que la manipulación tiene



b á bl d d ( f ) d d

1. Simplicidad. La selección de los tratamientos y la disposición

experimental deberá hacerse de la forma más simple posible.

2. Grado de precisión. El experimento deberá tener la

capacidad de medir diferencias entre tratamientos con los grados de

precisión que desee el investigador. Para cumplir con este propósito se

deberá partir de un diseño y un número de repeticiones adecuados.

3. Ausencia de error sistemático. Se debe planear un

experimento con el propósito de asegurar que las unidadesexperimentales que reciban un tratamiento no difieran

sistemáticamente de aquellas que reciben otro tratamiento,

procurando de esta manera obtener una estimación insesgada del

efecto de tratamientos.

4. Rango de validez de las conclusiones. Este deberá ser tanamplio como sea posible. Los experimentos que contribuyen a

aumentar el rango de validez del experimento son los experimentos

replicados y los experimentos con estructuras factoriales.

5. Cálculo del grado de incertidumbre. En todo experimento

existe algún grado de incertidumbre en cuanto a la validación de las

conclusiones. El experimento deberá ser concebido de modo que sea



canario moría, por ser mas sensible, ellos tenían la oportunidad de

salir y no correr la misma suerte. Otros ejemplos de organismos de

prueba son, el uso de cerdos para detectar y colectar trufas, perros

para detectar explosivos y drogas, gametos de erizo de mar paradetectar eco toxicidad en agua de mar, Euglena gracilis para detectar

niveles de vitamina B12.

Lo anterior es útil para asegurarse que la respuesta de una

población expuesta a cierto agente tóxico se deba al efecto de éste y

no a variaciones tanto de la sensibilidad de los organismos como de

fallas operacionales en la aplicación del método.

Los Organismos de prueba pueden ser:

• Organismos criados en Laboratorio

• Organismos colectados en campo.

En general, es preferible utilizar organismos criados en el laboratorio

en vez de los recolectados en el campo porque los exámenes

estandarizados requieren de un abastecimiento siempre disponible de

organismos en buena salud provenientes de cultivos de condicionesconocidas y constantes. Los bioensayos hechos en el laboratorio

usando organismos recolectados en el campo han sido menos



1.2.3. Material de Prueba.

Cualquier objeto orgánico o inorgánico donde se van a aplicar los

diseños experimentales con el fin de observar una respuesta,

Compuestos químicos, extractos, fuente de compuestos o materia que

pueden generar una respuesta biológica en los organismos de un

ecosistema. Puede ser material de prueba, el sedimento marino,

pesticidas, materia orgánica

1.2.3. Aplicación del análisis Estadístico.

En esta etapa se selecciona la(s) variable(s) respuesta(s) o

variable (s) dependiente(s). El experimentador debe estar seguro que

la respuesta que se va a medir realmente provee información útil

acerca de la investigación.

Cada respuesta medible, está representada matemáticamente en

un modelo lineal. La idea general de un modelo es expresar las

observaciones generalmente denotadas por , en términos de “efectos'' que contribuyen a . Esos efectos se pueden clasificar en

tres categorías: Efectos de Tratamiento, Efectos de Diseño y Efectos



Error Experimental. Una característica de todo material

experimental es la variación. Asociada con la unidad experimental está

el error experimental, este error es el reflejo de que las UE no son

iguales. También podemos decir que es una medida de la variaciónexistente entre las respuestas de las UE tratadas en forma similar.

Contribuyendo al error experimental están:

a) El error de tratamiento, el cual resulta de cualquier falta de

uniformidad en la realización física del experimento o en la replicación

de un tratamiento. Por ejemplo, si se van a administrar 20 ppm de

cierta sustancia, administramos 19 ó 21 ppm.

b) El error de estado.o variabilidad inherente al material al cual

se aplican los tratamientos, el cual es debido a los cambios aleatorios

en el estado físico de una UE. Por ejemplo, en un experimento denutrición con camarones como material experimental, los individuos

tendrán constitución genética diferente, ésta es una variabilidad

inherente al material experimental o error de estado. Las camarones

se colocarán en jaulas sujetas a diferencias de calor, luz y otros

factores; esto constituye una falta de uniformidad en la realizaciónfísica del experimento o error de tratamiento.

Al h i f i dí i i l d fi



Manejar el material experimental de tal manera que se logre

reducir los efectos debido a la variabilidad inherente.

Refinar la técnica experimental. Es responsabilidad del

experimentador que se haga todo lo posible para asegurar una técnica

cuidadosa porque ningún tipo de análisis estadístico puede mejorar los

datos obtenidos de experimentos mal efectuados. La técnica

defectuosa puede aumentar el error experimental de dos maneras:

i) Puede introducir fluctuaciones adicionales de una naturalezamás o menos aleatoria y, posiblemente, sujetas a las leyes del azar.

Tales fluctuaciones, si son grandes, deberán revelarse por sí mismas

en la estimación del error experimental, posiblemente mediante la

observación del coeficiente de variación. Este es una medida de

variación relativa y es utilizado para comparar la precisión de dosexperimentos o de dos medidas.

ii) Mediante errores no aleatorios. Éstos no están sujetos a las

leyes del azar y no siempre pueden detectarse mediante la

observación de las medidas individuales. Se dispone de pruebas

estadísticas para detectarlo.

La técnica defectuosa también puede producir medidas



El error experimental no puede detectar sesgos; estima la

precisión o la repetibilidad de las medidas, pero no estima la exactitud.

Error Observacional. Se considera como parte del error

observacional el error de medida, es decir, el error debido a la

imprecisión de la medida o procedimiento de detección (aparatos) y el

error de muestreo debido a la selección de las UE para la

investigación.

1.3. Panorámica de la Aplicación del Bioensayo en problemas

relacionados con la bioprospección en el medio marino.

La evaluación de sustancias bioactivas o de condiciones

ecotóxicas requiere de la medición de una multiplicidad de parámetros

que se deben de tomar de manera y en cantidad suficiente para que

permitan extraer conclusiones a través de un análisis estadístico

correcto. A pesar de que en el mar viven unas 500,000 especies lo que

representa casi el 75% del total de especies del planeta, el número de

sustancias bioactivas, conocidas, de origen terrestres superan

considerablemente a las de origen marino. Esta diferencia se puede

deber a que el medio marino es mucho mas homogéneo que el

ambiente terrestre, principalmente en factores como la disposición de



et al ., 1989). A pesar de que en cantidad la lista de sustancias de

origen marino es menor a las de origen terrestre, en calidad hay

muchos ejemplos de sustancias; la saliva que el pulpo emplea para

inmovilizar cangrejos contiene un poderoso estimulante cardiacollamado 5-HT, Las microalgas generan toxinas muy potentes, el fluido

corporal del cangrejo cacerola inhiben el crecimiento de bacterias

coliformes, experimentación exploratoria en este mismo curso de

Bioensayos ha demostrado que la tinta del Invertebrado conocido

como “Vaquita” Aplysia californica inhibe significativamente elcrecimiento de bacterias coliformes, las esponjas producen Ectionina

que es un antibiótico de amplio espectro, la holoturina de los pepinos

de mar es un bloqueador nervioso. Además de los organismos

marinos, en general el agua de mar es un suero biológico que además

de contener sales disueltas contiene una gran cantidad y variedad de

materia orgánica entre esta materia se encuentran disueltas

hormonas, enzimas, toxinas y esteroides principalmente, lo que hace

del agua de mar un medio que inhibe y promueve reacciones

bioquímicas.

2. BIOÉTICA

S ú l E l di f Bi hi (N Y k 1978 l I



la calidad de vida humana. Esta disciplina esta conformada por la

interacción de varias ciencias por lo que se fundamenta en la

experimentación con seres vivos. Se puede decir que en si, esta

ciencia trata de justificar la investigación en animales. Existen distintasagrupaciones humanas que rechazan la idea de experimentar en

animales, ya que estos últimos tienen el mismo derecho a la vida que

un ser humano; pero también hay algunos movimientos humanos que

la apoyan y mantienen de esta manera a los laboratorios.

2.1. Utilidad del uso de los bioensayos en la investigación

biomédica y ambiental pros y contras.

PROS

La utilidad de los bioensayos recae primordialmente en ser un

método de detección relativamente simple y que se puede emplear

para el monitoreo de causas y sus efectos de tipo ambiental y en

farmacología. En un organismo, especial, la respuesta biológica

(efecto) se puede generar a concentraciones menores a los límites de

detección de los principales métodos analíticos y aunque, un método

analítico sea lo suficientemente fino para evaluar un nivel o

concentración de compuesto o causa de daño, sus datos no nos



• Vigilancia para asegurar el cumplimiento de parámetros

estatales y federales de calidad ambiental.

Estas acciones se pueden aplicar en:

• Toma de decisiones de corporativos industriales y/o compañías

biomédicas en el desarrollo, manufactura y comercialización de

nuevos productos.

• Cumplir requisitos de regulación para registrar nuevos productos o

procesos.

• Obtener permisos de descarga.

• Evaluación de riesgo ambiental.

• Elementos de cargo o descargo en litigios.

• Fuente de datos de calidad del medio ambiente para proteger

organismos de futuras afectaciones.

CONTRAS.

La principal desventaja de un bioensayo es que sus resultados,

difícilmente, generan información específica de un compuesto, causa ocondición ambiental. Durante el desarrollo de los bioensayos los

organismos de prueba son sometidos a diferentes condiciones



necesariamente significa lo contrario o sea que el ecosistema no le

provea lo necesario.

2.2. 2.3. El Derecho de los animales a no ser usados en la

investigación Biomédica. Y El Derecho del hombre a utilizar

organismos para experimentación.

La Asociación Médica Mundial afirma que el uso de animales en

la investigación biomédica es esencial para el progreso médico, y a

pesar que se dice que en la experimentación con animales deben decumplirse las normas que rigen el trato compasivo de los animales,

esto no se cumple o de la misma manera sigue afectando al

organismo. Ya que al estar experimentando con animales y producir

alguna lesión es un proceso traumático aunque se utilicen anestésicos

ya que al terminar el efecto les producen dolor y se ven afectados enla disminución de peso. Así mismo, el impacto de estrés sobre los

mecanismos fisiológicos se ha estado analizando al igual que el miedo,

que tan solo con sentir el acercamiento del hombre les causa miedo,

una posible solución sería tener un mayor acercamiento a los

organismos para que mitiguen el miedo ante la presencia humana.

Se conoce que la bioética tiene por objeto material los actos



2.4. Otras alternativas al uso de animales en experimentación

biomédica y en la enseñanza en la carrera de oceanología.

La creciente sensibilidad respecto a la experimentación en

animales en investigación biomédica y la enseñanza de las ciencias

naturales, y la búsqueda de enfoques nuevos en los aspectos prácticos

de la misma son parte de un debate actual y, probablemente,

necesario.

La utilización de animales de experimentación en investigación

Biomédica y en la enseñanza de las prácticas de diferentes

asignaturas de las Ciencias naturales y en especial en nuestra

Facultad en las prácticas de Fisiología, Bioquímica, Zoología, Química

Orgánica, Aprovechamiento de Productos Marinos, Acuacultura y por

supuesto en BIOENSAYOS ha venido siendo la metodología másempleada por todos los profesores de estas disciplinas. Gracias a la

utilización de estos animales, los estudiantes han podido ver de cerca

los diferentes fenómenos que se les habían explicado anteriormente en

la clase de teoría. En la mayoría de los casos, excepto en

BIOENSAYOS, son prácticas cruentas donde varios animales sonsacrificados y además en la mayoría el fin didáctico no se cumple y el

estudiante se convierte en un simple espectador Es obvio que éste



25 de la Convención Europea para la Protección de los Animales

Vertebrados utilizados en Experimentación y otros Fines Científicos se

especifica:

"aquellos procedimientos llevados a cabo con fines educativos o

de entrenamiento … se deben restringir a los absolutamente

necesarios para los fines relativos a la enseñanza y el entrenamiento y

se permitirán únicamente si sus objetivos no pueden ser conseguidos

por métodos audiovisuales u otros que sean suficientemente

efectivos".

En las legislaciones relacionadas con la protección de los

animales de todos los países se considera fundamental aplicar el

principio de las 3Rs, promulgado por Russell y Burch en 1959 (1). Este

principio nos indica la necesidad de Reemplazar los animales deexperimentación por otros métodos, siempre que sea posible y que el

nuevo método nos aporte el mismo grado de información.

En el caso de la docencia e investigación se plantea el reemplazo

de los animales de experimentación por otros métodos. Entre los

métodos propuestos se pueden citar: a) modelos, maniquíes ysimuladores mecánicos; b) películas y vídeos; c) simulaciones de

d i d lid d i l d) i ió



bimolecular que le da estructura y constituye una barrera que impide

el paso de substancias hidrosolubles.

Las proteínas de la membrana están suspendidas en formaindividual o en grupos dentro de la estructura lipídica, formando los

canales por los cuales entran a las células, en forma selectiva, ciertas

substancias.

La selectividad de los canales de proteínas le permite a la célula

controlar la salida y entrada de substancias así como los transportes

entre compartimentos celulares. Las proteínas de la membrana no solo



molécula "señal", por ejemplo, una hormona, haya llegado a la

superficie celular.

En la membrana se localizan unas glicoproteínas que identifican

a otras células como integrantes de un individuo o como extrañas

(inmunoreacción). Las interacciones entre las células que conforman

un tejido están basadas en las proteínas de las membranas.

Resumiendo, la estructura de las membranas depende de los

lípidos y las funciones dependen de las proteínas.

3.2. Procesos de entrada de sustancias a través de membranas

Absorción

La absorción de un Xenobiótico se define como el proceso por

medio del cual éste atraviesa membranas y capas de células hastallegar al torrente sanguíneo. El mecanismo de ingreso del xenobiótico

al organismo usa los mismos mecanismos de transporte diseñados

para movilizar compuestos de estructura similar.

Los principales mecanismos de transporte son los siguientes:



acuosos o canales de pequeño tamaño pueden pasar de modo pasivo

los compuestos hidrófilos, iones y electrólitos (PM menor 100)

La difusión simple es el mecanismo de transporte más

importante en la absorción de los Xenobióticos. La velocidad de

difusión pasiva se basa en la ley de Fick

d

CiCf DmAKmw

dt

dX )( −=

Donde:

• Dm: Coeficiente de difusión del Xenobiótico en la membrana(cm2 /min)

• A: Superficie de la membrana (cm2)

• Kmw: Coeficiente de partición del Xenobiótico en la interfase agua-membrana.

• Cf: Concentración del xenobiótico fuera de la membrana• Ci: Concentración del xenobiótico en el interior de la membrana

• d: Grosor de la membrana en cm.



Transporte activo.- El transporte activo, la endocitosis o la

difusión mediada por un transportador son los mecanismos por los

cuales se difunden los compuestos de peso molecular grande (sean

polares o liposolubles) y los que se transportan en contra del gradientede concentración. Requieren de un transportador y se consume

energia (ATP).

Cinética

Extracelular Memb Intracelular

P X X P P X v

V

V

+ → + ⇔ '3

1

2

El Xenobiótico fuera de lamembrana se absorbe y enlaza alportador “P”a una velocidad V1

para formar el complejo XP, lavelocidad V2 es la velocidad dedesorción a la cual el xenobióticose separa de P y permanece fuerade la célula.

[ ][ ] [ ][ ]XKV X 11 P P V =→1α



[ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ][ ] [ ] [ ][ ]

[ ]

[ ]

[ ]

[ ][ ]

[ ][ ]

enzimáticanaturalezadees Portador El

Menten-Michaelisdeecuaciónlaesigu

activotrasnportedecinéticala

revelanosecuación Esta X Kt

X V V

X Kt

X

Vmax

V

Pt

XP

X Kt

X

(3)enos sustituim Pt

XP

Vmax

V

Pt K

XP K

Vmax

V

Vmax

V divide sesi Pt K Vmax la entonces Pt [MP] cuando

o xenobióticel conenlazadosestan portadoreslostodoscuandodá semáximotrasnporte El

XP K V

2de

Pt

XP

X Kt

X

X Kt XP XPt

XPX KtXP XPt KtXP XPt-XPX

Kt MP

XPt-XPX Kt

XP

XP Pt X 1de XP Pt P entoces

XP P Pt Si

33

33

3

+

=⇒

+

=⇒=

+

=⇒=

==

=

=

+

∴

+=

+=∴=

=∴=−

⇒−=

+=

max

3

)(

3

3

3

33

La Endocitosis

Existen dos formas la

Fagocitosis y la

Pinocitosis, se trata de un



3.3 Factores inherentes a los principios activos que influyen en

el efecto farmacológico.

Las propiedades fisicoquímicas de los Xenobioticos

Pequeño radio atómico o molecular

Grado de ionización

Coeficiente de partición

Pka

• Se realiza a favor de un

gradiente de concentración

• Necesita un portador

• No consume energia



la velocidad de absorción y del tiempo de residencia del agente en la

superficie de transporte.

3.4. Factores inherentes a los organismos que influyen en el

efecto farmacológico.

Cuando el tóxico se ingiere, entra al Tracto Gastro Intestinal

(TGI), la mayor cantidad se absorbe en el estómago y en los intestinos

aunque también puede haber absorción en cualquier lugar del TGI,

incluyendo las absorciones sublingual y rectal.El sitio de absorción depende en parte del estado de ionización

del compuesto. Los ácidos débiles es más probable que se absorban en

el estómago, donde hay un pH bajo, mientras que las bases débiles,

que están menos ionizadas a pH alto, se absorben mejor en el

intestino donde existen estas condiciones.

La gran área de absorción del intestino y los largos tiempos de

residencia, dependiendo de la movilidad intestinal, permiten que se

tengan absorciones considerables aunque el flux, cantidad

transportada por unidad de área y de tiempo, sea pequeño.

La absorción de los xenobióticos usa los mismos mecanismos

que tiene el TGI para absorber los nutrimentos Por ejemplo el plomo



La absortividad del tóxico ingerido depende de sus propiedades

físicoquímicas. Como se mencionó antes, los compuestos liposolubles

de bajo peso molecular y los compuestos no ionizados se absorben

mejor.

Los xenobióticos se pueden ligar reversiblemente a las proteínas

plasmáticas, por medio de distintos tipos de uniones: interacciones

hidrófobas, puentes de hidrógeno y fuerzas de van der Waals. La

molécula de proteína tiene un número limitado de sitios donde se

pueden ligar, tanto los xenobióticos, como los compuestos endógenos.

Así que, un agente determinado tiene que competir con los demás

compuestos (xenobióticos y/o endógenos) por los sitios de unión

disponibles. La unión reversible del compuesto a las proteínas impide

la difusión simple pero no limita su transporte activo.

3.5. Modelos que explican la absorción, distribución,

biotransformación y excrecion de sustancias por los

organismos.

3.5.1. ADBE.

Adsorbción.

ó



Los modelos ADBE y ADME representan la cinética de

transferencia de xenobióticos en un organismo y su efecto

farmacológico, a traves del estudio de estos modelos se generan las

terapias correspondientes para eliminar su efecto.

La interacción dinámica de todos los procesos que constituyen el

ADME, determina el tiempo que permanecerá un agente dentro del

organismo después de que éste ha sido expuesto a una dosis

determinada. Al estudio de la velocidad de cambio de la

concentración de las especies tóxicas dentro del organismo se

le conoce como toxicocinética.

Las tasas de cambio que se presentan en cada fase del ADME se

pueden modelar matemáticamente e integrarlas en un modelo que

represente la dinámica global del tóxico dentro del organismo.Cada proceso, sea este de cambio de lugar y/o de identidad

química, se puede representar por una ecuación diferencial en la que

la derivada de la concentración con respecto al tiempo en un sitio

determinado, se expresa como una función de la concentración en ese

lugar. La constante de proporcionalidad se denomina velocidadespecífica y normalmente se representa por la letra "k".

(h // f d h i d / b/ 2 3 5 h l)

http://superfund.pharmacy.arizona.edu/toxamb/c2-3-5.html

http://superfund.pharmacy.arizona.edu/toxamb/c2-3-5.html



dC/dt = - kelC

dondeC = concentración plasmática

kel = constante de velocidad de eliminación de

primer orden

t = tiempo al que se muestreó la sangre.

Este modelo indica que la velocidad global a la que procede el

ADME de un compuesto es directamente proporcional a la

concentración y que la velocidad no varía linealmente con la dosis,

sino que su variación es exponencial. La velocidad de eliminación es

alta cuando la dosis es alta, pero disminuye fuertemente a medida quela concentración del tóxico disminuye.

Vida media es el tiempo que tarda el organismo en reducir a la

mitad la concentración del tóxico.

Si un compuesto tiene una vida media de 24 horas y su

concentración en un momento dado es 40 mg/L, en un día se bajará la

concentración a 20 mg/L, pero bajar esta concentración otros 20 mg/L



y su eliminación mostrará una cinética de orden cero aparente, aunque

a concentraciones no saturantes presente una cinética de primer

orden. Por el contrario, los compuestos que normalmente se eliminan

siguiendo una cinética de orden cero, cuando las concentraciones sonmuy bajas, su eliminación sigue una cinética de primer orden

aparente. El modelo que representa la cinética de orden cero es:

dC/dt = Ko

Donde: ko es la constante de velocidad de

orden cero,

C y t tienen el mismo significado que en la

ecuación anterior

Cuando se tienen dosis repetidas el nivel del tóxico se aproxima

a la concentración de estado estacionario porque las velocidades de

eliminación y de absorción son iguales. Se necesitan aproximadamente

5 vidas medias para alcanzar el estado estacionario, así que los

compuestos que se eliminan muy lentamente tardan mucho enalcanzarlo.



Ts es el tiempo de residencia en el organismo y

t es el intervalo entre dosis.

3.6. Biotransformación.

Biotransformación Fase I

(http://superfund.pharmacy.arizona.edu/toxamb/c2-3-4-1.html)

La Fase I es un conjunto de reacciones de oxidación que

preparan a los tóxicos para que puedan transformarse por las

reacciones de la Fase II. Esto lo logran transformando los grupos

funcionales del xenobiótico en sitios que pueden llevar a cabo

reacciones de la Fase II, o bien introducen grupos nuevos que le dan

esta característica. Para hacer este trabajo las células cuentan con dos

sistemas de enzimas, que tienen la función de introducir en el

substrato un átomo de oxígeno proveniente del oxígeno molecular

(oxigenasas de función mixta). Estos dos sistemas son las amino-

oxigenasas y los Citocromos P-450. Ambos sistemas se encuentran

localizados en el retículo endoplásmico. Las amino-monoxigenasas

oxidan aminas y compuestos sulfurados.



reduciédolo del nivel (III) a (II), de férrico a ferroso, (C) la reducción

abre el sitio activo del O2, (D) el O2 entra a su sitio activo y oxida al

xenobiótico que está en la superficie de la enzima transfiriéndole uno

de los átomos de oxígeno.

Existen varios Citocromos P-450 que se diferencian en su

especificidad, por ejemplo, el P-450 IIE oxida al etanol y el P-450 IA

oxida al alfa-benzo-pireno.

Si la concentración de oxígeno en la célula es muy baja,

entonces la reacción catalizada por el Citocromo P-450 es una

reducción en la que el NADPH actúa como donador de iones hidruro.

Las reacciones de reducción más comunes son la transformación

de nitroderivados aromáticos a aminas, la azoreducción de aminas

primarias y la deshalogenación reductiva. La reducción puede dar lugara la formación de un radical libre más tóxico que el xenobiótico

original, capaz de producir daños en el ADN. Esta biotransformación es

entonces una bioactivación. Por ejemplo; el tetracloruro de carbono

sufre la deshalogenación reductiva produciendo el radical libre

triclorometilo.



Reacciones de Reducción Catalizada por Citocromo P-450.



endógenos, permitiendo, al mismo tiempo, que la célula oxide al

xenobiótico y se deshaga de estos compuestos endógenos altamente

tóxicos. El producto de esta reacción es un alcohol que puede ser

destoxificado por una alcohol deshidrogenasa.

Biotransformación Fase II

La Biotransformación Fase II, tal como se mencionó

anteriormente, consiste en reacciones de conjugación, catalizadas por

un conjunto de enzimas, la mayoría de ellas localizadas en el citosol.Las reacciones consisten en agregar un grupo polar de tamaño

relativamente grande a los productos de las reacciones de la Fase I o a

los xenobióticos originales que contienen los grupos funcionales

apropiados para ser substratos de las reacciones de conjugación. Los

donadores de los grupos polares tienen que ser compuestos de altaenergía, ya que las reacciones de conjugación no son

termodinámicamente favorables.

El resultado que se logra con estas reacciones es un gran

incremento de la solubilidad en agua del xenobiótico.

Glucuronidación.- La reacción consiste en agregar un grupo

glucuronil en un grupo hidroxilo amino o sulfhidrilo del tóxico La



sulfotransferasas, enzimas solubles localizadas en el citosol. El

producto de la reacción es un sulfato orgánico ionizado, muy soluble

en agua que se excreta en la orina.

Aminoacidación.- La reacción consiste en la formación de una

unión peptídica entre el grupo amino de un aminoácido, normalmente

glicina, y un carboxilo en el xenobiótico. Obviamente para que esta

reacción se pueda dar es indispensable que el xenobiótico tenga un

grupo carboxilo. Estos conjugados son eliminados en la orina debido a

que el sistema de transporte del riñón reconoce al aminoácido.

Glutationización.- La glutationización consiste en la adición de

glutatión (GSH), a través de su grupo sulfhidrilo (nucleofílico), con un

carbón electrofílico del xenobiótico. La reacción es catalizada por la

glutatión-S-transferasa y el glutatión mismo es el cofactor de alta

energía. El glutatión es un tripéptido, Glu-Gli-Cis. El compuesto que se

forma se rompe en el riñón produciendo el Cis-derivado, que se acetila

para producir un conjugado del ácido mercaptúrico, el cual se excreta

en la orina. Esta reacción es importante en la destoxificación de

epóxidos y peróxidos. La glutatión-S-transferasa se encuentra encélulas de muy diversos tejidos. Si esta reacción disminuye

significativamente el nivel celular de glutatión el organismo puede



compuestos endógenos y forma parte en la biosíntesis de varios

aminoácidos y esteroides, así como en la metilación del ADN.

Las reacciones de la Fase I activan grupos funcionales, la

metilación los enmascara impidiendo que participen en reacciones de

la fase II, por lo tanto, si se metilan los xenobióticos se disminuye la

tasa de eliminación del compuesto.

Como se puede ver, varias de las reacciones de la Fase II

requieren de los mismos grupos funcionales, así que los compuestos

que pueden ser modificados por más de una enzima entran en

reacciones que son mutuamente competitivas.

Qué tanto tiene lugar una reacción determinada depende, de la

capacidad del tejido para llevar a cabo la reacción y de la afinidad de

la enzima por el substrato. La capacidad está definida por la cantidadde cofactor presente en el tejido cuando éste es expuesto al

xenobiótico.

Capacidades y Afinidades de las Reacciones de Conjugación

REACCIÓN CAPACIDAD AFINIDADGlucuronidación Alta Baja



se incrementará la concentración del sulfoester y posteriormente

aparecerá el derivado glucuronidado. Esto significa que el fenol tiene

mayor afinidad por la sulfotransferasa, esta reacción procederá hasta

que se agote la disponibilidad de PAPS. Cuando se agota el PAPS seempieza a utilizar el UDPglucuronato. En el caso de la N-acetilación,

las afinidades y capacidades pueden cambiar debido al polimorfismo

de esta enzima (acetiladores lentos contra los acetiladores rápidos).



En los moluscos esta biotransformación es muy lenta y los PAHs

tienden a acumularse en estos organismos.

Bioactivación

La bioactivación es el conjunto de reacciones metabólicas que

incrementan la toxicidad de los xenobióticos, o sea que los metabolitos

resultantes de la biotransformación de la sustancia absorbida son más

tóxicos que el compuesto original. Por ejemplo las toxinas de las

mareas rojas incrementan su toxicidad cuando son metabolizadas enel hígado de los peces.

La mayoría de las bioactivaciones son producidas por las enzimas

de la Fase I, aunque algunas de las enzimas de la Fase II también

pueden bioactivar algunos xenobióticos. Este efecto lateral indeseable

de la biotransformación ocurre cuando se producen especies químicasmuy reactivas, normalmente compuestos electrofílicos con gran

afinidad por los nucleófilos. El ADN, las proteínas y los lípidos son

nucleófilos.

La mayoría de las reacciones en los que se generan productos de

aducción de ADN y proteínas se deben a la interacción de estas

macromoléculas con los productos de las reacciones de bioactivación.



• Inducción de Enzimas. Un xenobiótico puede inducir una enzima

que bioactiva a otro xenobiótico. Por ejemplo el etanol induce la

síntesis del Citocromo P-450 que bioactiva al tetracloruro de

carbono. Esta interacción hace que el tetracloruro de carbonosea más tóxico cuando se administra junto con alcohol

• Inhibición de enzimas. La inhibición también puede incrementar

la bioactivación. Por ejemplo, una substancia que bloquee la

síntesis de los Citocromos P-450 hará que el organismo se

vuelva más susceptible a los tóxicos que son destoxificados porlos P-450. Las substancias que inhiben la síntesis de Citocromo

P-450 también pudieran servir de antídoto si la especie tóxica es

producto de la bioactivación del xenobiótico por el Citocromo P-

450

Las rutas de Bioactivación son las siguientes:

1. El tejido blanco contiene las enzimas para bioactivar el

xenobiótico y es el sitio activo para la especie tóxica. El ejemplo

clásico de esta ruta es la bioactivación del tetracloruro de

carbono vía la deshalogenación por el P-450 del hígado,

produciendo el radical libre triclorometilo, el cual reacciona con



cruzadas en los neurofilamentos causando daño en nervios

periféricos.

Ejemplos de Reacciones de Bioactivación

En resumen:



en la Fase I, que dan productos mucho más solubles en agua

que los compuestos absorbidos y los productos de la Fase I

• Algunas reacciones de la Fase II producen compuestos menos

solubles en agua• La capacidad de los tejidos para hacer transformaciones Fase II

depende de la cantidad disponible de cofactores en las

condiciones fisiológicas en las que se encuentra el organismo

Normalmente el organismo tiene las defensas adecuadas para manejar la

agresión química para lo cual cuenta con lo siguiente:

• las enzimas de las dos fases de la biotransformación

• la presencia de antioxidantes que eliminan radicales libres y

reducen especies tóxicas

• las proteínas plasmáticas que ligan los tóxicos en el plasma

sanguíneo impidiendo su difusión hacia los tejidos

La toxicidad ocurre cuando todas las defensas han sido vencidas.

Por ejemplo el fenol, como vimos anteriormente, se destoxifica

primero por sulfatación y después por glucuronidación. Cuando seagotan los dos cofactores para estas reacciones, el fenol se empieza a

l d di t ib ió h i iti ti l éd l



O H eOH

O H OH eO H

O H eO

OeO

H

H

H

2.

2.

22

222

2

22

→ +

+ → +

→ +

→ +

+

+

+−

−

−

−

−

−

Reacción Neta O H eO H 2

42 4 → + +−

En esta secuencia se producen radicales como el O2-

(superóxido), H2O2 (peróxido de Hidrógeno) y OH-, que son muy

reactivos y perjudiciales a los sistemas biológicos. El O2-, y el OH- son

radicales libres del oxígeno. El agua oxigenada; H2O2, aunque no es un

radical libre es también muy reactiva y junto con el O2- es un precursor

del OH-:

2.

222 OOH OH O H O ++ → +−−

Esta reacción es muy lenta sin embargo metales como el Fe y Cu

catalizan la reacción y facilitan la producción de .OH.:

Quelato FeOH OH O H Quelato Fe

Quelato FeOQuelato FeO

−+−+ → +−

−+ → −+

++

++−

322

2

22

32

.

Reacción Neta: 2.

222 OOH OH O H O ++ → +−−

Compuestos que generan radicales libres:

Quinonas, Herbicidas, Nitro-Aromáticos, Hidroxi-Aminas



Vitamina C Vitamina A (β -caroteno)XantofilasSuperOxidasaDismutasa (SOD)Catalasa

2222

2222

22

22

OO H CAT

O H

OO H SOD

H O

+

+ → +

→

+

La célula no está indefensa contra estas especies reactivas, tiene

dos líneas principales de defensa para protegerse.

• La primera es la presencia de antioxidantes los cuales donan o

aceptan un electrón para formar intermediarios estables.

Ejemplos de ellos son el alfa-tocoferol, ascorbato y GSH.

• Probablemente de mayor importancia, particularmente en la

destoxificación de radicales oxigenados y del peróxido dehidrógeno, son los sistemas de enzimas protectoras. Éstas

incluyen la peróxido dismutasa, la cual convierte el superóxido en

peróxido de hidrógeno, la GHS peroxidasa y la catalasa

convierten al peróxido de hidrógeno en agua.

Si el radical libre no es inactivado causará daños a la célula y

puede hacerlo vía la unión a un blanco o capturando un hidrógeno del



El daño por radicales libres está implicado en las lesiones

causadas por agentes químicos, por radiación, inflamación,

envejecimiento y reperfusión/isquemia.

Metabolismo de Metales y Toxicidad.

Se pueden clasificar en dos tipos

Metales esenciales : Cu, Mn, Zn

Metales no esenciales: Cd, Pb, Hg

La exposición a concentraciones elevadas de ambos tipos de

metales es tóxica, los metales generan enlaces no específicos a

biomoléculas. El metabolismo y biotransformación de un metal y su

enlaces dentro de las células, generan quelatos que bien pueden ser

almacenados en compartimientos intracelulares o pueden eliminarse.

Los mecanismos de biotransformación en macro y microalgas pueden

implicar diferentes procesos como la unión con Metalotioeninas,

síntesis de fitoquelatos o la formación de complejos con polifenoles o

Taninos.

Las Metalotieneinas son proteínas de bajo peso molécular ricasen cysteina que compleja iones metálicos en anillos Tiol. La función de

í



dibásica del potasio de 2,3,-dibromo-5-hydroxyl-1’,4-disulfato son

muy efectivos en secuestrar iones metálicos.

Estos mecanismos de biotransformación actuan como

reguladores de metales esenciales y no esenciales y modulan subiodisponibilidad para las macromoléculas.

Se conoce que algas pardas como el Fucus vesiculosus tienen la

capacidad de asimilar grandes cantidades de metales sin sufrir daño en

su metabolismo.



CRITERIOS PARA LA SELECCIÓN DE ORGANISMOS DE PRUEBA.

Principios de Weil.

Semejanza Metabólica

Para generar la dosis de referencia (DRf) de un medicamento

para su aplicación en Humanos se debe de considerar que existe un

factor de incertidumbre (Uf) que se presenta cuando se usan animalesde prueba como modelos de toxicidad para humanos. La magnitud de

esta incertidumbre de puede determinar por evaluación de las

variaciones Inter-químicas que existen entre las proporciones de dosis

asociadas con efectos toxicológicos similares en animales de

laboratorio y humanos:

Uf= NOAEL crónico en Animales/ NOAEL crónico en Humanos

NOAEL (Non Observed Adverse Effects Level) es el nivel de exposición

experimental que representa el máximo nivel probado al cual no se

observan efectos tóxicos. Para el propósito de evaluación de riesgoséste es el dato clave que se obtiene de los estudios de Dosis-

Respuesta Si las exposiciones experimentales fueron intermitentes se



• Mientras mas información se tenga sobre una droga en

diferentes especies, abulones, camarones, almejas y monos,

la dosis de referencia, DRf, que se obtiene permite reducir el

factor de incertidumbre, Uf.• Los datos de comparación entre especies sugieren que las

proporciones pueden variar según la dosis empleada en el

ensayo.

Además de las consideraciones anteriores para la evaluación del

Uf, se debe de tener en cuenta la variabilidad interhumana, porque

cuando se tienen datos suficientes sobre el efecto de una droga en

Humanos, su dosis se puede estimar sin la necesidad de aplicar el

factor de incertidumbre Uf. Pero, cuando no existen datos suficientes

sobre seres humanos sensibles, al Uf se agrega otro factor de

incertidumbre que expresa la variabilidad en respuestas entre

individuos y se trata con un factor de 10 veces.

Este factor de incertidumbre asume que existe variabilidad de

respuesta entre humanos y que esta variabilidad no se puede obtener

categóricamente debido al tamaño de la muestra que se puede usar esmuy reducido. Este factor también implica que existen sub-poblaciones



DRf= NOAEL/ Uf n

4.1.2. Vias de entrada.

Consideraciones sobre la vía de exposición. La filosofía

detrás del cálculo de la DRf es la misma, independientemente de cual

sea la vía de exposición, sin embargo, la forma de calcularla es

diferente.

Si en los estudios experimentales la exposición fue intermitente,

la DRf se calcula ajustando los valores observados de tal manera quereflejen exposiciones continuas.

El procedimiento de cálculo de las dosis de referencia orales es el

descrito anteriormente.

Los valores tabulados de las DRf están expresados en mg de

substancia por Kg de masa corporal por día.

Cuando la vía de exposición es el aparato respiratorio, la

extrapolación de datos obtenidos con animales debe de considerar

• Las diferencias anatómicas entre el animal de estudio y el hombre.

Estas diferencias pueden afectar el patrón de deposición, salida y

redistribución de los contaminantes. Consecuentemente, las diferentes



Los valores de DRf tabulados se expresan en función de la

concentración del tóxico en el aire en mg por metro cúbico para una

exposición continua de 24 horas por día.

Otros índices. Además de las DRf se han calculado y publicadootros índices de toxicidad que se denominan HA1 y HA10 para

exposiciones de corta duración. Son concentraciones de contaminantes

en agua potable, a las cuales no se presentan efectos adversos si la

exposición es de una duración especificada, un día o 10 días

respectivamente. Estos índices de toxicidad no-cancerígena se

obtienen dividiendo el NOAEL por los Uf y UFM adecuados. Se basan

en que un niño de 10 Kg. ingiere 1 litro de agua por día y se incluye un

margen de seguridad para proteger a los miembros más sensibles de

la población. Los HAs no incluyen ningún riesgo cancerígeno aún si la

substancia es un cancerígeno potencial.

4.2. Criterios para la selección de organismos de prueba.

Se entiende por bioensayo un ensayo en que un tejido, organismo

o grupo de organismos vivos se usan como reactivo para determinar la

potencia de cualquier sustancia fisiológicamente activa cuya actividad

se desconoce (FAO, 1981).

http://www.monografias.com/trabajos14/nociones-basicas/nociones-basicas.shtml

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controlar muchas de las variables hace posible la eliminación de las

fluctuaciones propias de las condiciones naturales, que generalmente

oscurecen o interfieren con la finalidad principal del estudio llevado a

cabo (Rodríguez et al., 1995).Selección de Especies

Para obtener la máxima información de los bioensayos es

necesario escoger los organismos más apropiados. Se debe tener en

cuenta que requieren diferentes períodos de aclimatación en el

laboratorio, según las especies, y es sumamente importante que los

organismos de ensayo se manipulen con cuidado, no sufran daños, se

encuentren sanos y sean de edad o tamaño uniformes (FAO, 1981);

Según Henry (1988) la selección de organismos para bioensayos debe

basarse en:

• Los objetivos del programa toxicológico

• La información disponible sobre los posibles organismos

• Las características de las especies

• Las instalaciones y equipos de laboratorio

• El nivel de capacitación de los técnicos

C it i l d l ió

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http://www.monografias.com/trabajos/adpreclu/adpreclu.shtml

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bioensayos.

Organismos para

bioensayos

Adaptabilidad del organismo Comúnmente

utilizado comoun organismos

para

bioensayos

Cultivo de

laboratorio

Recolección

de campo

1. Algas Excelente Disponoble Si

2. Protozoos Excelente

Muy difícil de

recolectar

cultivo puro

Muy limitado

3. Invertebrados

a. Planctónicos

1. Rotíferos Bueno

Muy difícil de

recolectar

cultivo puro

Limitado

Alta tasa de



b. Bénticos

1. Anélidos Mediano Mediano Limitado

2. Insectos Bajo Mediano Si

3. Moluscos Bueno Mediano Si

4. Crustáceos Bajo Mediano

4. Peces Excelente Alta tasa de

mortandad

después de la

recolección de

campo

Si

(Henry, 1988)

¿Es apropiado el ciclo de vida de los organismos a los objetivos y

diseños? (Henry, 1988).

El diseño de los bioensayos tiene que ser cuidadosamente

considerado en el contexto del ciclo de vida del organismo. La mayoría

de los protocolos de bioensayos agudos y crónicos requieren



Los sedimentos pueden servir como fuentes de sustancias

tóxicas para el agua superficial o para los organismos bénticos que

viven en los sedimentos. Las sustancias tóxicas que se mueven desde

los sedimentos hacia el agua superficial pueden ser determinadospreparando lixiviados del sedimento para bioensayos. También pueden

ser de preocupación las sustancias tóxicas que están estrechamente

ligadas a los sedimentos y que pueden ser bioconcentradas en

organismos bentónicos, particularmente cuando éstos son un

componente importante de una cadena alimenticia que resulta en laexposición humana (Henry, 1988). Los bioensayos para determinar

toxicidad en agua o de sedimentos en contacto con agua se realizan en

mejor forma con organismos planctónicos o de libre natación. Aún

cuando el sedimento puede ser el material de prueba, la toxicidad

puede ser evaluada exponiendo los organismos planctónicos a unlixiviado o a un extracto del sedimento usando el agua superficial

(Henry, 1988). Si se sospecha la presencia de sustancias tóxicas

firmemente ligadas a los sedimentos, entonces deben usarse los

organismos bentónicos en contacto directo con los sedimentos. Estas

pruebas revelarán cualquier toxicidad de los sedimentos y también elpotencial de bioacumulación de las sustancias tóxicas y su

http://www.monografias.com/trabajos16/ecosistema-contaminacion/ecosistema-contaminacion.shtml#CADENA

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• De fácil cultivo, lo que garantiza un adecuado suministro de

organismos en los ensayos y el establecimiento con exactitud

de la edad o estado de desarrollo. La edad es de suma

importancia en los bioensayos, ya que la sensibilidad puedevariar significativamente durante su desarrollo (Esclapés,

1999).

• Especies con gran susceptibilidad a exposiciones con

sustancias xenobióticas. Garantizando cubrir el peor de los

escenarios, y proporcionando resultados que ofrecen una alta

protección al resto de la cadena trófica (Esclapés, 1999).

El uso de más de una especie permitirá una determinación más

cuidadosa de toxicidad porque los organismos acuáticos varían en su

respuesta a las sustancias tóxicas. Por ejemplo, los peces pueden ser

más sensibles que los invertebrados a una sustancia química, mientras

que puede suceder lo contrario con otra sustancia química (Henry,

1988).

Organismos criados en el laboratorio para bioensayos. Ventajas:

Disponibilidad en forma inmediata de organismos aclimatados,saludables, que han sido criados bajo las mismas condiciones (Henry,

é

http://www.monografias.com/trabajos12/elorigest/elorigest.shtml

http://www.monografias.com/trabajos5/hiscla/hiscla2.shtml#peces

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laboratorio y de alimentación asegurará que todos los organismos de

prueba responderán a las sustancias tóxicas en forma similar con el

paso del tiempo. Es una característica importante cuando se comparan

los resultados de diferentes laboratorios (Henry, 1988). Desventajas:Muchos organismos con ciclo complejo de vida o información

insuficiente sobre su cultivo no pueden ser cultivados en el laboratorio.

Por lo tanto, la variedad de organismos está limitada cuando se usan

los que han sido cultivados en el laboratorio. Los requerimientos de

cultivo para organismos acuáticos varían sustancialmente, aún entreespecies estrechamente relacionadas. Es necesario conocer el alimento

óptimo, la temperatura, el ciclo de luz y el agua a fin de mantener

cultivos continuos en el laboratorio. Aunque muchas algas,

invertebrados y especies de peces se han usado como organismos

para bioensayos, sólo existe información disponible sobre algunasespecies, que permiten un cultivo satisfactorio de laboratorio (Henry,

1988).

Falta de representatividad a las condiciones y organismos en la

comunidad a ser probada. El aspecto negativo de los organismos

estándares criados en el laboratorio es que ellos no son

necesariamente representativos de la comunidad acuática o de las

http://www.monografias.com/Salud/Nutricion/

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• ¿Puede recolectarse el organismo directamente del campo?

¿Esto ocurre en poblaciones grandes, monoespecíficas?

• ¿Están los organismos disponibles durante todo el año o sólo

durante ciertas estaciones?

• ¿Es el organismo sensible al manejo durante su recolección y

transporte al laboratorio?

• ¿Se adaptará el organismo al agua del laboratorio o se

necesita un abastecimiento de agua fresca diariamente desdeel campo?

Ventajas: Representativo de la comunidad impactada por el

efluente. Se puede seleccionar una especie importante en una

comunidad específica (Henry, 1988). Las pruebas de microcosmos

conteniendo muchas especies pueden prepararse fácilmente. Sepueden desarrollar exámenes con varias especies en la misma cámara

de prueba. Los organismos que son compatibles, tales como caracoles,

almeja, peces y plantas acuáticas pueden incluirse en la misma

cámara de prueba, permitiendo un estudio simultáneo de efectos

múltiples (Henry, 1988). Los bioensayos hechos en el laboratorio

utilizando organismos recolectados en el campo han sido menos



durante todo el año o tienen varios cambios en su ciclo de vida (Henry,

1988). La edad, salud y condiciones de cultivo de los organismos son

desconocidas. No existe manera de obtener organismos

"estandarizados" del campo y frecuentemente hasta la edad esdesconocida (Henry, 1988). Los invertebrados son un grupo mucho

más diverso que las algas o los peces, con diferencias dramáticas en

su forma física, sus características históricas de vida y sus requisitos de

cultivo (Henry, 1988). Es conveniente el uso del plancton en los

bioensayos debido a su pequeño tamaño y porque con ellos es posiblerealizar muchos ensayos en espacios reducidos. Su ciclo vital es muy

corto y se conocen sus necesidades nutricionales. Son buenos para los

estudios de bioacumulación, puesto que se ubican en el nivel más bajo

de la pirámide trófica (FAO, 1981).

5 ESTRATEGIAS PARA LA VALORACIÓN DE SUSTANCIAS

BIOACTIVAS.

5.1. Bioprospección.

La bioprospección es la búsqueda de elementos útiles de la

naturaleza generalmente para fines comerciales o medicinales

http://www.monografias.com/Fisica/index.shtml

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ellas?? Con respecto a la relación de actividad de acuerdo al phyla,

ambiente marino, temperatura, profundidad, localidad geográfica.

Con respecto al phyla se ha observado que la actividad es una

propiedad general, pero hay actividades específicas que se concentranen cientos phylas, por ejemplo la actividad antifungal se observa

principalmente en los Holothuridos (Echinodermata). Durante la

campaña AHCE 1978 (Alpha Helix Caribbean Expedition) se evaluaron

unas 650 especies en actividades antibacteriales, antifungales y

antivirales, además de citotóxicas.

Actividades, antimicrobianas, antivirales y citotóxicas en

diferentes pilas. Bioprospección Alpha Helix Caribbean. 1978.

% de Especies activas

Phylum Especiesevaluadas

E.c B.s. S.c. P.a. HSV-1 CV-1

Porifera 187 14 41 19 11(138) 14 62

Cnidaria 70 4 26 7 2 (66) 17 56

Ectoprocta 1 100 100 0 0 0 0

Mollusca 20 5 15 0 0 (17) 0 33

Annelida 3 33 0 0 0 0 0

Arthropoda 6 0 0 0 0 0 0



actividades respecto a la profundidad e indican que a pesar de ser

localidades diferentes, las actividades son similares en las dos

localidadas. La actividad presenta patrones parecidos en organismos

bentónicos de profundidades de 600 a 762m. La principal limitante enla colecta de organismos a profundidades superiores es por supuesto

el costo.

Son pocas las variaciones con la profundidad las actividades

antibacteriales y antifungales se reducen generalmente en organismos

colectados en aguas profundas. Este fenómeno probable estarelacionado con las temperaturas del agua, ya que la incidencia de

actividades antibacteriales y antifungales en organismos colectados en

la costa oeste de España asi como en Maine y Nueva Escocia son muy

bajas mientras que las actividades citotóxicas y antivirales se

presentan en intervalos normales. Las actividades con respecto a la

temperatura del agua indican que los organismos de zonas trópicales

exhiben mayores actividades que aquellos de aguas templadas. Esto

se refleja principalmente en la presencia de Icthiotoxinas de esponjas

y holoturidos. Las aguas frias de las costas Nororientales de Estados

Unidos, orientales de Canada, Oeste de España y Nueva Zelanda son

zonas ricas de aprovisionamiento de sustancias con actividades



i). El experimentador debe liberarse de toda simpatía personal

hacia determinado tratamiento que pudiera sesgar los resultados.

ii). Todas las observaciones que se tomen deben ser anotadas

cuidadosamente en un registro apropiado, no dejando nada a lamemoria. Los datos deben anotarse en forma ordenada, de tal forma

que puedan ser utilizados por otro experimentador si fuese necesario

en una fecha más o menos lejana, quien debe poder entender todas

las anotaciones.

iii) Se recomienda que el experimentador tome las

observaciones (aleatoriamente) olvidándose cuáles son los

tratamientos de las parcelas a fín de no dejarse influir por prejuicios

sobre determinados tratamientos.

iv). En algunos experimentos no es práctico tomarobservaciones en toda la unidad experimental, tal es el caso de

determinaciones químicas. En estos casos es recomendable muestrear

la unidad experimental para obtener subunidades. Generalmente hay

mas variabilidad entre las unidades que entre las subunidades

experimentales. Es por esto que no debe haber mucho interés enmuchas determinaciones químicas en cada unidad experimental, ya

l b id d l i i l UE l i



organismos internacionales, como EPS (1990), indican que se debe

ejecutar un número mínimo de veinte (20) bioensayos de toxicidad

consecutivos con el tóxico de referencia antes que se pueda realizar

una calibración intralaboratorio. El Laboratorio de Bioensayos hatrabajado estrechamente bajo la guía de la US EPA, Los bioensayos,

como toda herramienta de medición, deben tener cierta precisión y

exactitud en sus resultados.

Organizaciones internacionales (ASTM, 1996; OECD 1993;ISO,

1996;EC, 1992 y USEPA, 1994) han estandarizado metodologías parala realización de estos bioensayos con distintos organismos, en donde

además se describen métodos de cultivo, condiciones de los

experimentos, aplicabilidades y restricciones.

Una vez estandarizadas las metodologías experimentales, los

laboratorios que ejecuten el bioensayo deben realizar una calibración

de su método. La calibración es un proceso relacionado con los

conceptos que rigen el control de calidad, y cuyo objetivo es

determinar la precisión y exactitud que puede y debe alcanzarse en los

resultados generados por un determinado bioensayo. Lo anterior es

útil para asegurarse que la respuesta de la población expuesta a cierto

agente tóxico se deba al efecto de éste y no a variaciones tanto de la



Us Epa. 1990. Methods for measuring the acute toxicity of

effluents and receiving waters to freshwater and marine organism.

Fourth Edition. Report 600/4-90/027F.

Pruebas de hipotesis

Si queremos decidir entre dos hipótesis que afectan a un cierto

parámetro de la población, a partir de la información de la muestra

usaremos el contraste de hipótesis, cuando optemos por una de

estas dos hipótesis, hemos de conocer una medida del error cometido,

es decir, cuantas veces de cada cien nos equivocamos.

En primer lugar, veremos cómo se escribirían las hipótesis

que queremos contrastar:

H0 se llama hipótesis nula y es lo contrario de lo que

sospechamos que va a ocurrir (suele llevar los signos igual, mayor o

igual y menor o igual)

H1 se llama hipótesis alternativa y es lo que sospechamos que

va a ser cierto (suele llevar los signos distinto, mayor y menor)

Los contrastes de hipótesis pueden ser de dos tipos:



• alfa: Es la probabilidad de cometer un error de tipo I.

• beta: Es la probabilidad de cometer un error de tipo II.

De los dos, el más importante es alfa que llamaremos nivel de significación y

nos informa de la probabilidad que tenemos de estar equivocados si

aceptamos la hipótesis alternativa.

Debido a que los dos errores anteriores a la vez son imposibles de controlar,

vamos a fijarnos solamente en el nivel de significación, este es el que nos

interesa ya que la hipótesis alternativa que estamos interesados en probar y

no queremos aceptarla si en realidad no es cierta, es decir, si aceptamos la

hipótesis alternativa queremos equivocarnos con un margen de error muy

pequeño.

El nivel de significación lo marcamos nosotros. Si es grande es más fácil

aceptar la hipótesis alternativa cuando en realidad es falsa. El valor del nivel

de significación suele ser un 5%, lo que significa que 5 de cada 100 veces

aceptamos la hipótesis alternativa cuando la cierta es la nula.

Solamente vamos a estudiar el contraste bilateral para la media.

CONTRASTE DE HIPÓTESIS BILATERAL PARA LA MEDIA

Si se cumple una de las siguientes hipótesis:



• , valor teórico y es el valor que en la distribución N(0,1) deja a su

derecha un área de alfa/2 para un nivel de significación alfa. Es el

valor z que definíamos ala principio del tema.

La regla de decisión fijado el nivel de significación, alfa, es la siguiente:

• Si se acepta la hipótesis alternativa, llegamos a la

conclusión de que la hipótesis es cierta.

• Si se acepta la hipótesis nula, en realidad no podemos

afirmar que sea cierta, sino que la hipótesis alternativa no es cierta,

ya que el margen de error con el que se acepta la hipótesis nula es

muy grande.

Actividad 21. Un equipo de psicólogos han comprobado que en cierta

población infantil, el tiempo (en minutos) empleado en realizar determinada

actividad manual, sigue un modelo Normal de probabilidad. Un grupo de 36

niños, seleccionados aleatoriamente en dicha población, realizaron esa

actividad manual en un tiempo medio de 6,5 minutos con una desviación

típica muestral de 1,5 minutos. A partir de esta información, para un nivel de

significación del 1% (alfa=0,01) ¿podíamos rechazar la hipótesis de que el

tiempo medio en la población es de 7 minutos? Utiliza la escena siguiente.



en el 2001 de 36,5 horas. Sabiendo que:

donde representa el número de horas perdidas por el i-ésimo trabajador.

a) ¿Podríamos rechazar, con un nivel de significación del 1% la hipótesis de

que el número medio de horas perdidas a causa de accidentes laborales en

esa empresa durante el año 2001 fue de 35 horas?

b) ¿Y para un nivel de significación del 5%?

Adaptación de María Vicenta Cabalgante Perera

de la unidad:

http://descartes.cnice.mecd.es/Bach_HCS_2/inferencia_estadistica/index_inferencia.htm


http://descartes.cnice.mecd.es/Estadistica/Muestreo_Inferencia_Estadistica/estimacion_intervalos.html

http://descartes.cnice.mecd.es/Estadistica/Muestreo_Inferencia_Estadistica/index.htm




Weil, C.S. (1972). Statistics vs safety factors and scientific

judgment in the evaluation of safety for man. Toxicol. Appl.

Pharmacol . 21, 454-463.

Weil, C.S., and McCollister, D.D. (1963). Relationship between

short- and long-term feeding studies in designing an effective toxicity

test. Agric. Food Chem. 11, 486-491.

Factores de Incertidumbre en dosis de medicamentos entre

Humanos y pruebas con animales

Variabilidad De Interhuman

Siempre que sea posible, los datos sobre seres humanos se

utilicen para conducir el gravamen de riesgo del noncancer, de tal

modo evitando los problemas inherentes con la extrapolación de los

interspecies. Si existen los suficientes datos sobre individuos sensibles,

la dosis subliminal se puede estimar directamente, es decir, sin la

necesidad de un factor de la incertidumbre. Si no existen los datos

adecuados sobre seres humanos sensibles, se encuentra una

incertidumbre que se debe tratar -ma's a menudo con un factor 10-

fold. Este factor de la incertidumbre asume que ocurre la variabilidad



variabilidad interhuman fue apoyado indirectamente, pero que puesto que

los animales de experimento son generalmente menos heterogéneos

cuando están comparados a los seres humanos, el factor de diez veces no

era necesariamente conservador. Calabrese (1985) encontró diferencias

considerables entre temas humanos en su capacidad de metabolizar

sustancias extranjeras, y concluyó que un factor de diez veces

proporcionó la protección para cerca de 80-95% de la población. Esta

conclusión, sin embargo, fue basada en la suposición que el factor de diez

veces era explicar la gama total de la variabilidad humana. Hattis et el al.

(1987) analizaban 101 modems de los parámetros toxicokinetic individuales

para 49 sustancias específicas (sobre todo drogas) en los grupos de

adultos cinco o más sanos. Estos datos sugirieron que un factor de diez

veces de la incertidumbre considerara el cerca de 96% de la variación en

estos parámetros toxicokinetic. Sin embargo, estos datos también midió la

gama total de la variabilidad humana en este experimento, y no el puntomedio a la variabilidad humana sensible. Sheeman y Gaylor (1990)

compararon los cocientes del LD 50 del adulto a los mamíferos recién nacidos

para 238 productos químicos como medida de variabilidad de los

intraspecies. El cociente mediano era 2,6 (adulto a recién nacido). Los

cerca de 86% por de los valores eran menos que un cociente de diez veces,similar a las observaciones Dourson y Stara (1983).



assumptions for this uncertainty factor are that the results seen in

experimental animals are relevant to humans, that toxicokinetic and

toxicodynamic differences exist among species, and that humans are

more sensitive than animals at a given mg/kg/day dose or mg/m

3

concentration. A number of authors have tried to quantify this area of

uncertainty by investigating the ratios between animals and humans,

and between different animal species for a number of parameters.

For example, Brown and Fabro (1983) identified the lowest effective dose to

cause teratogenicity in animals and humans for eight chemicals. Ratios(animal-to-human) vary from 1.8 to 50, with a geometric mean of 7. For the

chemicals examines, these authors state that humans appear to be more

sensitive, although the difference is generally less than an order of

magnitude. Dourson and Stara (1983) showed an interspecies adjustment

factor calculated as the cubed root of the ratio between the assumedaverage human body weight (70 kg) and animal weight. Assuming that

such an adjustment could account for all of the differences in animal to

human extrapolation, then a 10-fold factor accounts for many of the

experimental animal to human differences. Ford (1990) suggests that

kinetic and metabolic data, when available, should be used in the

assessment of the likely human health hazard of reproductive toxicants

from animal toxicity data Calabrese et al (1992) and Hoel et al (1975) have



assessment. The use of PBPK models for this purpose is likely to grow

(Jarabek 1995a,b). Agencies such as Health Canada, IPCS, and EPA have

positions reflecting the use of reduced interspecies UF when dosimetric

adjustments, toxicity data or comparative toxicokinetics are available.

Less-than-Chronic Studies to Chronic

The subchronic-to-chronic UF is based on the assumption that an effect

seen at shorter durations will also be seen after a lifetime of exposure, but

at lower doses. This factor also assumes that effects may only be seen

after an experimental group is exposed chronically. In fact, severalinvestigators have examined subchronic-to-chronic ratios of NOAELs and

LOAELs, and the average differences between subchronic and chronic

values are only 2 to 3, while some small percentage of chemicals have

ratios that exceed 10-fold (McNamara, 1976; Dourson and Stara 1983;

Woutersen et al., 1984; Aida et al. 1992; Kadry et al., 1995). Lewis (1993)showed an analysis of subchronic-to-chronic NOAEL ratios based on peer-

reviewed literature or information from the U.S. National Toxicology

Program. Criteria for inclusion in their analysis were rigorous. Of 54

chemicals considered, only 18 chemicals were analyzed. Of these, 78% had

ratios of 3.5 or less. All but one of these ratios (17/18, or 94%) had ratios of

10-fold or less. Unpublished work in EPA (Swartout, 1995) encompasses

more chemicals than described above, but the criteria for inclusion are not



LOAEL to NOAEL

If a LOAEL exists on which to base the estimation of a subthreshold dose,

the uncertainty in the NOAEL must be addressed. Analysis of several data

bases suggest that a factor of 10 or lower is adequate and that use of datadoes support a lower factor with certain chemicals. For example, Dourson

and Stara (1983) describe ratios of LOAELs to NOAELs of either

subchronic or chronic exposures based on data from Weil and McCollister

(1963). Ninety-six percent of these ratios had values of 5-fold or less. Kadry

et al. (1995) also evaluated the uncertainty factor for LOAEL to NOAEL

extrapolation for several chlorinated compounds. Ratios were 1.4 to 8.9 for

methylene chloride, 2 to 5 for pentachlorophenol, 2 or 4.2 for

monochlorobenzene, 3.3 or 10 for chlorpyrifos, and 1.6 or 2.2 for 1,1-

dichlorethane. The authors conclude that 91% of these ratios were 6-fold or

less; all of them were 10-fold or less.

The results of the research on LOAEL to NOAEL extrapolation are not

extensive, nor unexpected. Experiments are seldom designed with doses in

excess of 10-fold apart, leading to the common statement that these ratios

depend more on dose spacing than inherent toxicity. The choice of dose

spacing, however, often reflects the judgment on the likely steepness of

the dose-response slope, with steeper slopes resulting in tighter dose

spacing. The data indicate that when faced with a LOAEL and not a NOAEL,



que varían en forma continua y tienen un valor único para cada dosis

(dentro de la variabilidad normal que siempre se observa cuando se hacen

bioensayos).

La curva dosis-efecto se construye graficando en las ordenadas losEfectos (E) causados en el organismo expuesto a una substancia química

y en las absisas las Dosis (D) a las que fue expuesto. Si la experimentación

se hizo con el tejido blanco aislado expuesto directamente a la substancia,

la respuesta observada normalmente es una función hiperbólica de la

dosis de una forma similar a la ecuación Michaelis-Menten para expresar la

velocidad inicial de una reacción enzimática. La curva pasa por el origen

del sistema de coordenadas cartesianas y la pendiente máxima se presenta

en el origen. La pendiente permanece aproximadamente constante durante

un rango amplio de la dosis (cinética de primer orden), después la

pendiente disminuye con la dosis hasta que se vuelve cero (cinética de

orden cero) y la respuesta adquiere su valor máximo. A este valor máximo

se le denomina efecto máximo (Emax) y es una medida de la eficacia del

tóxico.

En algunas ocasiones, la relación dosis-efecto no es tan definida y dentro

de una población se observa una distribución de respuestas para cada

dosis. En este caso el efecto que se mide no es la magnitud, se mide el

porcentaje de la población en estudio que presenta una determinada



Figura 2.5.1.A.- Curva Dosis-Respuesta.0 a 1.-Región NOAEL; 2.-LOAEL; 3.-Región Lineal; y 4.-Respuesta Máxima.

La curva pasa por el origen (cuando la dosis es cero, la respuesta es cero)

y a valores muy bajos de la dosis, la curva es horizontal con un valor del

efecto igual a cero (la curva va sobre el eje de las dosis). La respuesta

empieza a tener un valor mayor que cero cuando la dosis llega al nivellímite. De allí en adelante la pendiente de la curva crece con la dosis, hasta

que se llega a una pendiente máxima. Esta pendiente se mantiene por un

amplio rango de dosis en el que la respuesta es directamente proporcional

a la dosis (línea recta). A dosis mayores la pendiente empieza a decrecer

hasta que la curva se vuelve asintótica a un valor máximo de la respuesta(Emax).

i C d ú á l d i l f



crecientes. Cuando se aumenta aún más la dosis se presentan los efectos

letales crecientes que también se relacionan con la dosis en la misma

forma que los efectos anteriores. Las dos curvas son paralelas (Figura

2.5.1.B).

Figura 2.5.1.B. Curva Dosis-Respuesta. Compuesto que presenta las doscurvas.

1= curva de dosis-efectos tóxicos; y 2= curva de dosis-efectos letales.

2.5.1.1 Potencia vs. Eficacia

Potencia se refiere al rango de dosis dentro del cual una substancia

produce respuestas crecientes. La curva del tóxico (o droga) más potente

aparece más cercana al origen.

L t i d d tá i fl i d f t t l l



La potencia de un droga está influenciada por factores tales como la

absorción, el metabolismo, etc. La eficacia está relacionada a una acción

más fundamental de la droga, es una medida de la capacidad intrínseca de

la droga para producir un efecto. Este valor se estima midiendo la altura

máxima de la curva dosis-respuesta (cuando la curva se vuelve asintótica a

las absisas) y, como ya vimos anteriormente, se le denomina Emax.

Dos drogas que son cualitativamente iguales en producir un efecto

particular pueden diferir en su eficacia, en su potencia, o en ambas (Figura

2.5.1.C). El compuesto 1 es más potente que el compuesto 2, y el

compuesto 2 es más potente que el compuesto 3; los compuestos 1 y 2

tienen igual eficacia, pero el compuesto 3 es menos eficaz que 1 y 2 .

apuntes bioensayo

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