application of binary buffer systems to free flow cell electrophoresis

4
Application of binary buffer systems to free flow cell electrophoresis The applicability of free flow electrophoresis (FFE) was expanded towards processing of sensitive cells. The chamber medium was adjusted to a physiologic pH of 7.35 by a mixture of N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N ¢-(3-propanesulfonic acid) (EPPS) and 2,2- bis(hydroxymethyl)-2,2¢2²-nitrilotriethanol (BISTRIS). These substances proved to be nontoxic to sensitive cells such as human smooth muscle or thyroid cells. They enhanced the electrical conductivity of the medium only slightly so that a new cell elec- trophoresis separation medium could be prepared, which contained 30 mM NaCl together with or without 1 mM CaCl 2 but did not generate problems of overheating the fluid. Suspended in this medium, human smooth muscle cells as well as human thyroid carcinoma cells remained viable single cells for at least 120 min. After this period they could be recultured to form monolayers. If electrophoresed in the Octopus preparative FFE device, they migrated as single cells and did not clot; therefore, their electropho- retic behavior could be determined exactly. Keywords: Free flow electrophoresis / Human tissue cells / Sodium chloride / Cell vitality EL 3767 Gerhard Weber 1 Daniela Grimm 2 Johann Bauer 3 1 Dr. Weber GmbH, Kirchheim, Germany 2 Institut für Pharmakologie und Toxikologie, FU Berlin, Berlin, Germany 3 Max Planck Institut für Biochemie, Martinsried, Germany 1 Introduction Free flow electrophoresis (FFE) has been applied for the separation of various kinds of cells for more than three decades [1, 2]. Limitations, however, remained as the electrophoresis process is deteriorated by elevated con- centrations of salts needed by cells during migration with- in the electrophoresis chamber medium in order to retain normal in vivo vitality. Earlier attempts to add NaCl to cell separation media suggested beneficial biological effects, but caused many problems in performance, such as tre- mendous heat generation, ion depletion, or pH changes in central chamber areas, and considerable shortening of the distance of electromigration [3, 4]. About five years ago some progress was made when the FFE device Octopus was constructed in a way that several different media could be pumped through the chamber simultane- ously; at the same time preliminary fluid systems consist- ing of at least three different media were developed, flow- ing adjacently through the chamber without generating disturbances at their border lines [5, 6]. Introducing the principle of FFE with segmented buffer films was a milestone in preparative electrophoresis, since in addition to cell electrophoresis in the presence of NaCl, preparative isoelectric focusing (IEF) and prepara- tive isotachophoresis (ITP) of low molecular substances, proteins, and subcellular particles could be developed to a degree of resolution which is comparable to resolution of capillary electrophoresis [2, 7, 8]. Progress in FFE-IEF and FFE-ITP was achieved because, together with the new instrument, new media were also designed [7±9]. Although the improvements of the FFE chamber fluid sys- tems were geared predominantly to protein or organelle separation, we recognized that substances such as 2,2- bis(hydroxymethyl)-2,2¢2²-nitrilotriethanol (BISTRIS) and N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N ¢-(3-propanesulfonic acid) (EPPS) may also be applicable to cell electrophoresis. These chemicals guarantee high pH stability without sig- nificant enhancement of the electrical conductivity of a separation medium [10] so that reasonable quantities of NaCl and/or CaCl 2 may be added without exceeding a limit of electrical conductivity tolerable by a modern FFE device such as the Octopus. Suspended in the new medium, human tissue cells remained viable single cells and could be electrophoresed over long distances, which allowed reasonable fractionation. 2 Materials and methods 2.1 Chemicals Hydroxypropylmethyl cellulose (HPMC) was purchased from Aldrich (Aldrich Chemicals, Milwaukee, WI, USA). The buffer components EPPS, and BISTRIS were ob- tained from Sigma (Deisenhofen, Germany). 2.2 FFE apparatus The experiments were performed in an Octopus free flow electrophoresis device manufactured by Dr. Weber GmbH (Kirchheim, Germany). Its separation chamber Correspondence: Dr. Johann Bauer, Max Planck Institut für Biochemie, D-82152 Martinsried, Germany E-mail: [email protected] Fax: +49-89-1417931 Abbreviations: BISTRIS, 2,2-bis(hydroxymethyl)-2,2¢2²-nitrilo- triethanol; EPM, electrophoretic mobility; EPPS, N-(2-hydroxy- ethyl)piperazine-N ¢-(3-propanesulfonic acid); FFE, free flow elec- trophoresis Electrophoresis 2000, 21, 325±328 325 WILEY-VCH Verlag GmbH, 69451 Weinheim, 2000 0173-0835/00/0202-0325 $17.50+.50/0 General

Upload: gerhard-weber

Post on 06-Jun-2016

215 views

Category:

Documents


2 download

TRANSCRIPT

Page 1: Application of binary buffer systems to free flow cell electrophoresis

���������� � ���� ���� � ����� �� ��� ������� ���������������

��� ����������� � ��� ��� �������������� ����� ��� �������� ������ ����������� �������� ������ ��� ������ ������ ��� ������� � � ����������� �� � �� ! � ������� � �"�#"������������������$���"� �"� "���������� ���� ����� ��%%&� ��� #'#"����������������"#'#�#�"�������������� �()&�*)&�� ����� �������� ������ � �������� � �������� ����� ���� �� ����� ����� ������ �� ������ ������ ������������ �� ��������� ���������� � �� ������ ���� ������� �� �� � ��� ���� ����"���������� ��������� ������ ����� � ��������' ����� �������� + �, -�.������� ��� �� ����� / �, .�.�# � ��� �� ������� ������� � ���������� �� ����� &�������� �� ��� ������' ����� ����� ������ ����� �� ���� �� ����� ��������������� ����� �������� ����� ������ ����� �� � ���� /#+ ���� 0 �� ��� ������ �������� � ��������� � ��� ����������� ) �������������� �� �� 1����� ������������� ������' ��� ������� �� ������ ����� ��� ��� �� ���2 ���� ���' ���� ���������"���� ������� ����� � ��������� �������

�� ������ ���� ��� �������������� 3 ����� ����� ����� 3 &����� �������� 3 .��� ������ �4 �5�

������� ������

������ ������

���� ������

/6�� 7��� 8��'9��������' 8������

#)���� :� %�����;��������� ����;������' �< (�����'(�����' 8������

,�� %����; )���� :�(��������' ,���������'8������

� ����������

���� ��� �������������� ����� ��� ��� ������� �� ����������� � ������� ;���� � ����� �� ���� ��� ����������� =/' #>� 4��������' �������' �������� �� ���������������� ������� �� ���������� � ������� ���"��������� � ���� ������ � ����� ������ �������� ���"�� �� �������������� ������ ������ �� ����� � ����������� �� ���� ������� ������� ����� � ��� -�.� � ������������� ����� �������� ��� ����� ��������� � ���'� ������ ���� ������� �� ��� �������' ���� �� ��"������� ��� ���������' ��� ��������' �� �� ��������� ������ ������ �����' ��� ����������� ��������� � �� ������� � �������������� = ' ?>� 0�� ��� �������� ���� �������� ��� ���� ���� �� ��� ������1����� ��� ��������� �� � ��� �� ������� �� ��������� ����� � ������ ������ �� ������ ��������"�����2 � �� ���� ��� ����������� ���� ������ ������"��� � � ���� ���� �� ���� ����� ���� ���������' ���"��� ��������� ������ �� ������ ����� ������������������� � ���� ����� ����� =!' 5>�

)��������� �� ��������� � ��� ��� �������� � �� ���� ��� � �������� �� ���������� ��������������'����� �� ������� � ���� �������������� �� �� �������� � -�.�' ���������� ���������� ������� �)��� ��� �������"

��� ��������������� �)�%� � ��� ��������� ��������'�������' ��� ���������� �������� ����� � ��������� �� ������ � ��������� ����� �� ��������� � ���������� ��������� �������������� =#' �' @>� %������� �� ���")����� ���")�% ��� �������� ������' ������ ��� ����� ��������' ��� ����� ���� ���� �������� =�AB>�0������ �� ����������� � �� ��� ������ ���� ���"��� ���� ������ ������������ � ������ �� ������������������' �� �������$�� �� �������� ���� �� #'#"����������������"#'#�#�"�������������� �()&�*)&� ����"�#"������������������$���"� �"� "���������� ���� �������%%&� ��� ���� � ��������� � ���� �������������������� ��������� �������� ���� �� ������ ����� ���"�� ���� ���������� � �� ��������� ���������� � ���������� ������ =/+> �� �� ��������� C������� � -�.� ���3�� .�.�# ��� � ����� ����� ��������� ����� � ��������� ���������� ������� � � ������ ��������� ���� �� �� 1������ &�������� �� �� ���������' ����� ����� ����� �������� ����� ������ �������� ����� � �������������� ���� ���� ��������' ������������ ��������� �����������

� �������� �� �������

�!� "��������

������������������ ��������� ��%,.� ��� ��������� ��� 0������ �0������ .��������' ,�����;��' 7)' <&0����� � �� ��������� �%%&' ��� ()&�*)& ���� �"����� ��� &���� �6������� ��' 8��������

�!� ##$ ���������

��� ���������� ���� ��� ����� �� �� 1����� ��� ����������������� ������ ���� ������ � 6�� 7���8�� �9��������' 8�������� )� ��������� ������

"������������ 6�� D����� (����' ,�� %����; )���� :�(��������' 6"@#/!# ,���������' 8������$%����� �����E�������������#�&� F?B"@B"/?/�B /

�����'������� ��()*�(' #'#"����������������"#'#�#�"������"��������2 $+ ' ������������� ������2 $++(' �"�#"�������"�����������$���"� �"� "���������� ���� �����2 ##$' ��� ��� ����"����������

������ ������ #+++' ��' #!A #@ #!

G 7)4�H"I.� I����� 8��' 5B?!/ 7�������' #+++ +/� "+@ !3++3+#+#"+ #! J/��!+F�!+3+

������

Page 2: Application of binary buffer systems to free flow cell electrophoresis

��� � ����� � !++ ��' � ���� � /++ �� ��� � ���;"���� � +�? �� ��� ������� ���������� ��� � �� ������ ������ ������� ��� � ����� � @ �� ��� ���� 0�� ����� ��� � �� ������' ����� ����� ����� ������� ���������� ���� ������� � ������������ � ! � /+! ��� /+� �����3�4' ������������ 0 �� ����� ���'�� � �� ��� ��������� �� �������������� ���������� ��������� � B5 ������ &����� ���� �� ���� ���"������ ��������' �� ����� ���� ������ � �� 1.�"6��"I)& ������� ���� ��� ��� ������� ����"������������ ���������� �� ���� ����� � �� ����� ��� � ����������� ������ ��� �� ���� ������� � �� �����"����� �������� � ��� ��� �������� � � ..6 ������ ���� ��������� ��� ���������� ��� ��������� ���� ���"����� ��� �� �������������� ������ � ���� ���"������

�!� ##$ �����

��� ������ �������� ��� ������ ��� #++ �, ����������� ��� �� ������� �������� ��� � ������ � /++ �, -�.�' /++ �, �.� ��� #++ �, �����$��� ��������� ������ ��� �������� � �������������������� ��� ������ ��������� ������ ����� �������� � ��� ��� �� ������ ������ �� ���� ��$$���=!>� ��� ������ ��������� ������ �������� + �, -�.���� ?+ �, ()&�*)&' #+ �, �%%&' /�+ �, �������' ���/+ �, �������' ������� � �� �� !2 �� ������ ������������ �������� /!+ �, ������ ��� ��' ?+ �, ()&�"*)& ��� #+ �, �%%&' �� �� !2 ��� �� ������� ������������ �������� ++ �, -�.�' ?+ �, ()&�*)&' #+ �,

�%%& ��� �! �, �������' �� �� !� )� ����� � ������$������������� � ���' �� ������ ��� ������ ��� ���������� ������ ��������� ��������� +�?K �%,.� ��� �� ���������� 6����� �������������� � ������� ++ I ��� ������� � � ������ � ++ �0 ��� � ��"������� � /+�.�

�!, "����

�!,!� "��� ���������� �� �������-

��� ��������� ������ ���� ���� ,4"/ ��� ������� ��� ������ �������� ��������� ��������� �� �������� �&���������� � ��� =//>2 ���������� �������� �������� ���� ������� �� #! �������� �� 6,�, �������%��&����' -�������' 8������� ��������� /++ �,������ �������'# �, 4"��������'/ ��3�4 �������'��� �� �34 -��.1 ' ��� ����������� ��� /+K ������ ����� �8���' ���������' 8�������' /++ )<3�4����������' ��� /++ �� ����������3�4 �%��&����������� ����� ������ ����� ���� ������� ������� �������� ��������� ����� =/#>� ���� ��� ��� �������

�� ��� �������� �� *%,) /5?+ ������ �������������� /+K ��� ��� ����� �8����' /++ �, ������ ����"��� �&�����' # �, 4"�������� �&�����' /++ )<3�4 ����"������' ��� /++ ��3�4 ���������� �(�������' (�����' 8��"������ 0�� ����� ���� ����� �� ���������� �� ������ ���;� �(���� L 6��;�����' ���������' 8������� ���������� ����� ������� ���� ������ ��������� � ��.��� !K .1#� ��� ������ ��� ������� � "��� ����"����� %���� � ���� ��������' ����� ���� ������� �������"����� ��� �� ��� ��� � �� ������ ������� .��� ���������� ���� ��� �� ����� ��� ������ ���������� ������ ����� ��� ����� ���������� ���� ���� ���� ��������� ������

�!,!� "��� ��� ���

������������' ������������������ ��� ��� �������"��� ���� �������� ���� ��� ����� ������ �� ��������������� =/ >' ����� � �0.&"&.0- ������ ��������� ���(���� L 6��;����� ��� ����������� �C������ ���1������",�������� �<����������' 8�������� �)�."������ ����� ���������� �������� ������ ���;�������� ����������� ���� ��������� ��� 6�;� �8������'6�����;�2 ���� ������ ���������� ��� �� ���� ���&�����

� *������ �� ���������

�!� ��������������� � ��� �� ���������������

0� ��� � ��� ���� ��� � �� �� �������� � � ��������� ������������� ����� � ���� ������� � �� ���"���' ����� �������� ���� �� ������ � ������� ������������ ����������� 0 ����� ������ � ()&�*)& ����%%& ��� �������' ����� � �������� ���� �� � � ����"��������� ����� � �� !� <���� ���� ���������' �� ����������� ��������� ������ ��� �������� �� ������������� ) �������� + �, -�.� ��� ������ �� ������������������� � �# �&3�� � #+�.� ��� ������ ��� �������� ����� � ����������2 ���� ���' /+? ����� ��������������� ����� ��� /+? ����� ����� ������ ����� ��������� � �� ���� ���' ���� ��������� �4 � �� ���"������ ������� ���� �� ��� ���� ������ ����������� �� /#+ ��� � ���� ��������� ��� ,���� ! ��� 6������&�����' ��������' �� ����� � ������ �� ����� ����������� � �� �� ������ -��' ���C��� ���� �;�� ������ ������� ���� 0 �� ���' /++K � �� ������ �����"���� ����� ��� B!K � �� ����� ������ ����� ���������� ����� ��� ���������� ��� ��������� ���� ������"����� ���� ���� ����� � %��� ������ ��� ������� � ��. �� �# �� )� ��� ������' �� ;���� � ����� ������� �� ��� � ���� ������ ����� /�� ������ �� ��� ������� �������� ���� ��� � ��������' !+K � �� �����"

#5 8� 7���' 6� 8���� ��� D� (���� ������ ������ #+++' ��� #!A #@

Page 3: Application of binary buffer systems to free flow cell electrophoresis

����� ���� �������� � ������ ������� 0 �� �����;� �� ������ ������ ����� ��� �� ����� ����������� ��� ����� ��� ���� ����������� ����� ������������� ��������� �� �� ()&�*)&3�%%& ������� ���� ���� ������ ���� �������� ����� �� ����� ����������� ����� ��� ������ ��������� ������

�!� $�������������� ���������� � ��� ����������� ������

�!�!� $� ����� ���

)� ����� � �� �� ������������� �������� � �� ���������' ����� ���������� ���� �������������� � ++ I �� 5 ���' ����� �������� � ��� ������� � �! ��� ���� �������� � ��������� ����� ��� � ��� "����� ���� � #�! ��� ��� ����� �������� �� ��������������� ������ ��%,� � ����� ������������������� �� � ()&�*)&3�%%& � ���� ������ �� ����� �� ���� �� � ��� �� ������ ������ � ���� �������������� �� �������� =5' /?>� &���� � ��������� � ���� �%, ������ ��� ����� �� ��� ���� ���� ���� ���"���� �������� �� ����� ���������� =/!>' ���� ���������������� ����� #�! ��� ? �� ��� � ������� ������ �����' ����� ���� � �������������� �� ������������� &��� �������� ���� ����� ��������� ���� �������"����

�!�!� .��� ������ ������ �����

7��� �� ������������� ������� � �� ����� ����������� ��� �����$�� �� ���������� � �� ����������'��� ���� ���� � ������ ����������� ������' ������������ � ������� � #�5 �� ����� #�� ���� �������� �� ��

����� ������ ���� �%, �� #5K ����� ��� �� ������"��� �%,� ��� ����� ������ ���� ��������� ����� �� C��� �����������' ����� �� ����� ��� � �� ������������� � ��� ���;� ��� ������������� ���������������������� � ����������������� �������� ������������� ���;����� ������� ����� �� ���� �� � �� ������"����� ���������� � �� ���� ����������

�!�!� .��� �� ���� �������� �����

��� ���� ��������� �� �� �� ����� ������ ����� �������� ���� �� �� �������������� � ����� ������ �����"���� ������ 0������ � ��� ���������� �������� �������� �� ���� ��� B+K � �� ����� �������� ����"�������' �� ������������� ������ ��������� ����� ��"������ � � ������ ����� ' �� �� ) �������� �� ������ ������ ��� ������ �� ���������� � ������������������ ����� ��� ������� �� ���� �%,� �� ��� �C��� ��������� � ����� ��������� �%, ����� ' �� �� 0� ����"����� ��������� ��� ���� ���� �� ������ �������������� ���� �������������� �� �� ()&�*)&3�%%& ����������������� ��� �� ��������� �, � .�.�#� )� ��������� �� ������ ����� ����� ������ ��� �� ������"���� ����� ' ������ *�������� � ������������� �����"��� � ����� ������ � .�.�# ��� ������� ��� �������=/5' /�>� �������' � ���� � ��� ;��������' ���� � ���"�� ���� �� ������ � / �, .�.�# �� ���� ������������������� �� ����� �� ���� ��� �� ��� �������� ���"����� 7����� �� .�#F � �� �� ��� � �� �������� ��"��� � ()&�*)& ��� �%%& � ���; ��� �������� ���������� ��� � �� ��������� ������� � �� ���������� ��� ���������� � �� ������ ����� ������� � � ����������

������ ������ #+++' ��' #!A #@ -�� � �� �� ���� �������������� #�

#�-��� �! ,���������� ���������� � ����� ����������� ����� ��� ������� ��� ����� ������ �������������� ����� ������� � �� #? � � �������� � ��. �� ���"������ �������

#�-��� �! ������������� ������ � ����� ����� ���"��� ����� �� ���������� � ����� �����������

Page 4: Application of binary buffer systems to free flow cell electrophoresis

, "������- �����/�

)� ��� ���� �� ������� �� ���������� � �� ����� � "�� ����� ()&�*)&3�%%& � ���� ��������������� �������������� ������ � � ������ �� ��������� � ���� ����"���������� ������ ��� + �, -�.�� &�������� �� ���������' ����� ���������� ����� � ������������������ � ������� � �! �� � � ��� ���� �� ����� ������� # ��� ' ����� ���� � ������� ������� ����� � B+ 7 ��� �������' ����� ��� � �������� ������ ������ ������ ���� �� ��� ���� ��� ������� � �� ��"�������� �� ����� ����� ������ ����� ��� ��������������� ����� ���� ��� � ��� ���������� � �� ������ ��� ������� �� ��� ������ �� ������� ���������� ������� ���� ������ ������ ���� ����������������������$����� � �������� ����� ���� �� ����� �������� ���� � ����� ���� ��� ��������� ������ � ������� � ������� ���� ��� ��� ������ �������� =/@>�

*������� D��� #!' /BBB

0 *�������

=/> ������' 9�' ������ ������ /B@#' �' # ?A#? �

=#> 9�M��N�;��N' 4�' (��M�;' %�' ������ ������ /BB@' ��'/+5?A/+�?�

= > (����' D�' ������' 9�' ������ ������ /B@?' �' #5BA#�?�

=?> (����' �� 8�' 7���' 8�' �������' 9�' ��������' <�'&��������' 6�' ����� ��� ��� /B@@' ���' B/AB!�

=!> (����' (�' (����' D�' &�� ��' )�' 7���' 8�' ������ ������/BB!' ��' B#AB��

=5> (����' D�' 7���' 8�' ������ ������ /BB5' ��' !#5A!#@�

=�> 7���' 8�' (��M�;' %�' ������ ������ /BB@' ��'/5?BA/5! �

=@> 7���' 8�' (��M�;' %�' ������ ������ /BB@' ��' +B+A +B �

=B> 8���' -� ��' )$���' &�'�� ��� �������� /B�#' � ' ! A5@�

=/+> (���' ,�' 1����' D�' ,��C��$' *� (�' ������ ������ /BB '� ' /+//A/+/@�

=//> &����������' D� 0�' *������ ' D�' ,����������' D�' ,���"�����' *�' (��;' ��' �� ������' ��' ������' .�' !� �"�� ����/BB5' ��' /// �

=/#> .������' -� ,�' 0�����' .� -�' (�' D� �� -�' .������' D�'.������' D� ��' �� ����' -�' ,�������' %� ��' 7��' ,� D�'!� ��� #���� #������� /BB�' ��' /! 5A/!?/�

=/ > 8����' 6�' (����' D�' �� ������' ��' *������' 8� 0� D�'9�����' �� %�' $ ����� /BB�' �' @!BA@5!�

=/?> -���' &�' �����' 0�' 4�� ' *� .�' 9������' 0�' #������/B@@' �' # #A# ��

=/!> &������;�' 8� 8�' �����' 7� .�' (����' D�' ,�������' 6� *�'������ ������ /BB�' �%' //+BA///B�

=/5> ,������' &� 4�' 6������' �� I�' !� ���&�� ����� /B@!' %�'/B�A#+#�

=/�> I�����' �� ��' ��O (����' D� �����' #��� ������ ������' .*.%����' (��� *���' �4 /BB?' ��� #?/A#! �

=/@> ��������' -�' �����' &�' H�;�����' ��' 1$���' H�' 9���"���' )�' 9�����;�' 6�' &�������' 6�' &����' 7�' �����'� ������ /BB@' ��' /##�A/# +�

#@ 8� 7���' 6� 8���� ��� D� (���� ������ ������ #+++' ��� #!A #@

#�-��� �! ������������� ������� � ����� ������ ���"������ ����� �� �� ������ ��� ������� ��� �� ����"���� � / �, .�.�# ����� ��������