Perbandingan Capillary Electrophoresis dengan Cellulose Acetate Electrophoresis pada

Skrening Hemoglobinopathies

Pendahuluan

· Kelainan bawaan Hb : thalassemia dan struktur varian. · Thalassemia: defek sintesis rantai globin, α-atau β-

globin. · Struktur varian/ hemoglobinopathies, kelainan struktural

Hb.· Trait β-thalassemia : anemia ringan / tanpa anemia,

MCV ↓, MCH ↓, dan kadar HbA2 ↑.

Pendahuluan

• diukur dengan elektroforesis selulosa asetat (basa) atau agar sitrat (asam), iso electro focusing (IEF), microcolumn kromatografi, dan HPLC

HbA2

• Tidak bisa membedakan antara HbE dan HbO, HbD dan HbG .

• Elektroforesis memakan waktu, tenaga khusus

• Kurang akurat dalam kuantifikasi konsentrasi Hb rendah atau Hb varian

Elektroforesis

Pendahuluan

memiliki resolusi baik, tapi memiliki

kelemahan yang sama seperti metode

elektroforesis lain

baik utk diagnosis β carrier, namun

melelahkan, dan memakan waktu

HPLC

• metode pilihan • instrument dan pelatihan khusus• hasil dalam pola yg kompleks• HbA2 ↓palsu pada HBD Punjab Trait. • HbA2 ↑ palsu pada HbS, dan co-elusi dengan HbE, Hb Osu, Christianborg, HbG Coushatta, dan Hb Lepore.

IEFKromato

grafi kolom

HPLC

Elektroforesis kapiler (CE)

• memisahkan Hb normal (A, F, dan A2), dan mendeteksi Hb varian.

• Analisis simultan, pemisahan cepat, resolusi baik, akurasi tinggi, otomatisasi penuh.

• Mampu memisahkan HbA2 dari HbE, HBC, Hb Lepore, dan HbS

•CE dapat membantu mengungkapkan karakteristik dan prevalensi mutasi thalassemia pada populasi Korea

Tujuan

· Studi ini mengukur fraksi Hb pada pasien hipokromik mikrositik untuk mendeteksi thalassemia dan Hb varian. CE dibandingkan dengan elektroforesis selulosa asetat (CA) untuk menggantikan CA dengan CE di laboratorium klinis.

BAHAN DAN METODEEksklusi : Inflamasi akut/ kronis, infeksi, tiroiditis,perdarahan

akut, keganasan

2. Px Hematologi CBCS dengan

XE2100 (Sysmex, Kobe, Jepang)

3. Selulosa asetat elektroforesis pada plate selulosa asetat Titan III ,350V, 25

menit, dg buffer basa.

4. Elektroforesis Kapiler dg prinsip CE dalam larutan bebas.

5. Nilai Referensi nilai acuan produsen.6. Konfirmasi : analisis

gen

Elektroforesis Kapiler (CE )

· CE menggunakan sistem Minicap (Sebia, Norcross, Prancis) menggunakan prinsip CE dalam larutan bebas

· Berat molekul dipisahkan dengan mobilitas elektroforesis dalam buffer basa dengan pH tertentu.

· Pemisahan juga terjadi menurut pH elektrolit dan aliran elektro-osmotik.

· Sistem ini memungkinkan analisis multipel dan simultan. Electropherograms diekspresikan dengan zona dibagi dari Z1 sampai Z15.

Analisis statistik

· Perhitungan statistik dilakukan dengan MedCalc 11.3.0.0 (Med Calc Software Company, Mariake, Belgia).

· Student t-test untuk membandingkan parameter RBC dan fraksi Hb antara kelompok kontrol dan hipokromik mikrositik.

· Perbandingan metode dengan Student-t test dan regresi linier. Nilai P <0,05 dianggap signifikan secara statistik.

HASIL

1. Pemisahan hemoglobin normal dan varian oleh CE· Dilakukan kontrol terhadap hb A,F,S,C (Gbr. 1A). · Hemoglobin utama, termasuk A, F, S, dan C dan Hb

normal dipisahkan dengan baik. · Dalam sistem Minicap, pola fraksi keluar dari kanan ke

kiri dengan urutan sebagai berikut: dari HbA2 sampai HbA (Gambar 1B).

· Fraksi terglikasi tidak diseparasi dari HbA pada CE.

gambar. 1. Pola separasi Hb menggunakan CE terhadap kontrol AFSC (A) : kontrol, (B) : kontrol normal HbA2

2. Nilai Referensi

Expected values CE dari manufacturer

•HBA : 96,8-97,8%, •HbF : <0,5%•HbA2 : 2,2-3,2%

validasi rekomendasi untuk laboratorium ini

•HbA : 96,8-97,8%•HbF : <1%•HbA2 : 2,2-3,5%

rentang normal CA orang dewasa

•HbA : 96,8-97,8%•HbF : <1%•HbA2 : 1,9-3,5%

3. CBC dan fraksi Hb pada kontrol normal dan kelompok hipokromik mikrositik

· Pada kelompok hipokromik mikrositik, Hb, Hct, MCV, MCH, dan MCHC menunjukkan perbedaan yang nyata dibandingkan dengan kelompok kontrol (P <0,0001) (Tabel 1).

· Tidak ada perbedaan signifikan untuk kuantifikasi fraksi Hb antara kedua kelompok (P> 0,05) (Tabel 2).

4. Perbandingan dua metode· Ada korelasi yang baik untuk pengukuran HbA (r = 0,9370, P

<0,0001), HbA2 (r = 0,8973, P <0,0001), dan HbF (r = 0,8010, p = 0,0304) antara kedua metode (Gambar 2) .

· Kedua teknik menunjukkan tingkat yang sama untuk HbA (97,4 ± 0,7% oleh CE; 97,4 ± 1,1% oleh CA) dan HbA2 (2,5 ± 0,6% oleh CE; 2,5 ± 0,7% oleh CA)dan juga terhadap HbF (0,4 ± 1,1% oleh CE; 0,5 ± 2,7% oleh CA).

· Tidak ada perbedaan signifikan secara statistik untuk kuantifikasi Hb (P> 0,05) (Tabel 3).

Kesesuaian keseluruhan dari 2 metode untuk fraksi Hb adalah 89,5% (128/143) (Tabel 4).

Hasil px CE vs CA pada 143 spesimen

5. Kasus dengan fraksi Hb abnormalTotal fraksi Hb abnormal dideteksi oleh CE dan CA 1,4%.

Setelah eksklusi pasien IDA 2 pasien (1,4%) diduga thalassemia minor. Salah satu, dg tingkat HbA2 6,3%, dikonfirmasi dengan sekuensing dan salah satu kasus peningkatan HbF karena IDA

Diskusi

β-thalassemia terutama ditemukan

di Mediterania, Afrika, Asia Tenggara

Di Korea dilaporkan sekitar 20 kasus β-thalassemia sejak

1988

studi ini, membandingkan CE

dan CA untuk mengukur fraksi Hb

pasien mikrositik hipokromik dalam

kemampuan mendeteksi

thalassemia dan Hb varian

Diagnosis β-thalassemia

• analisis indeks eritrosit ,morfologi,

• kuantifikasi HbA2 menggunakan metode konvensional HPLC,elektrophoresis, dan teknik microcolumn

•Kuantifikasi HbA2 penting karena pada kadar rendah dan hanya sedikit peningkatan pada penyakit dan Hb varian sering mengganggu pengukurannya

· CA rutin digunakan tetapi kurang akurat. HPLC adalah metode pilihan tetapi mahal dan tidak tersedia secara rutin.

· Penelitian sebelumnya menunjukkan CE memisahkan HbA2 dari HbE, HBc, dan HbS.

· Metode ini : efisiensi tinggi (beberapa sampel dapat dijalankan secara paralel), akurasi tinggi, dan otomatisasi penuh.

· Pada studi ini, terdapat hubungan yang baik untuk pengukuran HbA, HbF, dan HbA2 antara CE dan CA.

· Persentase kesepakatan fraksi Hb,CE dan CA : 89,5%. · CA tidak mengidentifikasi beberapa penurunan HbA2 dan

kenaikan HbF. Ini menunjukkan bahwa CE lebih sensitif dari CA untuk mendeteksi fraksi Hb.

· CA hanya mendeteksi 25% varian Hb.· Beberapa studi menunjukkan presisi yang rendah untuk

kuantifikasi HbA2 berdasarkan elektroforesis.· Fitur menonjol metode CE kemampuan memisahkan

HbA2 sepenuhnya dari HbE.

· Dalam studi ini, 29 pasien mengalami penurunan HbA2. Di antaranya, 25 kasus didiagnosis sebagai IDA, dan 4 kasus tersebut dianggap memiliki sifat α-thalassemia.

· Dalam penelitian ini, salah satu donor yang diidentifikasi memiliki β-thalassemia adalah dari Asia Tenggara, Burma. pertumbuhan migrasi dari daerah dengan prevalensi tinggi β-thalassemia ke Korea.

· Frekuensi gen β-thalassemia di Korea sekitar ≤ 0,1% . · Pada studi ini, total fraksi hemoglobin abnormal : 1,4%

dideteksi oleh CE dan CA. · Prevalensi hemoglobinopathies sangat rendah di Korea,

sehingga elektroforesis Hb belum diperiksa rutin.· CE disarankan sebagai alat skrining untuk gangguan

hemoglobin pada populasi Korea.

Kesimpulan

· CE sebanding dengan CA dalam hal pengukuran fraksi Hb, dan cocok untuk skrining.

PICO

· Population : Pasien mikrositik hipokromik dengan atau tanpa anemia

· Intervention : Pemeriksaan elektroforesis metode kapiler· Comparation : Pemeriksaan elektroforesis metode selulose

asetat· Out come : Pemeriksaan elektroforesis metode

kapiler dapat menggantikan metode selulose asetat untuk pemeriksaan thalasemia dan hemoglobinopati pada laboratorium klinis.

Telaah kritis uji diagnostik

1. Validitas :· Apakah penelitian uji diagnostik dilakukan dengan standar

baku emas yang benar? Ya.· Apakah tes diagnostik dilakukan terhadap pasien dengan

spektrum yang sesuai dan dapat diterapkan dalam prakatek sehari-hari ? Ya

· Apakah tes (atau kelompok tes) divalidasi dengan kelompok kontrol? Ya

2. Penilaian uji diagnostik : tidak dilakukan karena studi ini tidak bertujuan untuk mencari sensitivitas /spesifisitas.

3. Kemamputerapan. · Apakah uji diagnostik tersebut terjangkau, tersedia dan

akurat? Ya· Apakah keseluruhan uji diagnostik bermanfaat pada pasien?

Ya

Valid, penting, dapat diterapkan

Level of evidence: 2b

terimakasih

Alpha Thalassaemia Classification (2).

►α trait due to deletion of one or two of the four alpha genes, asymptomatic (eg - α/ α α, --/ α α, - α/- α).

►Hemoglobin H disease is the lack of three of the four α genes resulting in alpha thalassaemia major.

►Hemoglobin Bart’s Hydrops Fetalis results from absence of all four α genes, incompatible with post natal life.

Beta Thalassemia Classification.

►β thal major is homozygosity or compound heterozygosity resulting in severe phenotype.

►β thal minor or trait is heterozygosity with asymptomatic phenotype.

►β thal intermedia is an intermediate phenotype produced by a variety of genotypes.

Alpha Thalassaemia Major - target cells, microcytosis, hypochromia, NRBCs, poikilocytes, polychromasia, basophilic stipling, tear drops.

βThal Major anisocytosis, poikilocytosis, targets, tear drops, fragments, hypochromaia, basophilic stippling.

α2Δ2

α2γ2

Table 1: Laboratory features in different clinical states.

Iron Deficiency

Chronic Disease

Iron Overload

Thalassemia

Haemoglobin N or ↓ ↓ N N or ↓

Serum Fe ↓ ↓ ↑ ↑ or N

Transferrin Receptor

↑ ↓ or N ↓ N

Transferrin Sat. ↓ ↓ ↑ N

Ferritin ↓ ↑or N ↑ ↑ or N

MCV ↓ ↓ or N N ↓

Marrow Fe ↓ ↑ ↑ ↑

Genotype Diagnosis Haematology Clinical Signs Biological Signs/aa aa Absence Hb A : N

HbA2 : N (2-3.5%)- /a aa Heterozygous a

+Slight microcytosis Absence Hb A and HbA2: N

Hb Bart’s 0-3% at birth

- /-a a Homozygous a + microcytosishypochromia

No significant clinical signs

Hb A and HbA2: N or Hb Bart’s 2-8% at birth

- -/aa Heterozygous a o

- -/-a a o / a + compound heterozygote(Hb H disease)

microcytosis, hypochromia

Haemolytic anaemiasplenomegaly

Hb A HbA2 (1.5%<)Hb Bart’s > 5%Hb H 10-20%

- -/- - a o homozygote(hydrops foetalis)

severe anaemia destruction of the erythroblasts

Severe hypoxia Absence of HbA and HbFHb Bart’s 80-100%Hb Portland < 5%

Alpha Thalassemias : Hb fractions and indices

Sickle cell

Hemoglobinosis Hb SSickle cell disease

Indeks eritrosit· Mean corpuscular volume (MCV). MCV adalah ukuran

atau volume rata-rata eritrosit· Mean corpuscular hemoglobin (MCH). MCH adalah

jumlah rata-rata hemoglobin dalam eritrosit· MCHC: adalah perhitungan rata-rata konsentrasi

hemoglobin di dalam eritrosit. MCHC menurun (hipokromia) dijumpai pada kondisi di mana hemoglobin abnormal diencerkan di dalam eritrosit, seperti pada anemia dan kekurangan zat besi dalam talasemia. Peningkatan MCHC (hiperkromia) terdapat pada kondisi di mana hemoglobin abnormal terkonsentrasi di dalam eritrosit, seperti pada pasien luka bakar dan sferositosis bawan.

· RDW adalah variasi ukuran eritrosit. Dalam beberapa kasus anemia, seperti anemia pernisiosa, variasi dalam ukuran eritrosit (anisositosis) bersama dengan variasi dalam bentuk (poikilositosis) menyebabkan peningkatan RDW.

· MPV adalah ukuran rata-rata trombosit/platelet.· PDW merupakan indikasi variasi ukuran trombosit yang

dapat menjadi tanda pelepasan platelet aktif.

Normal pattern

Hb A: 2 2a b

Hb F: 2 2a g

Hb A2: 2 2a d

+

-Agarose gel

Alkaline buffer

Adult Newborn

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 12 24 36

%

Age (months)

HbFHbAHbA2

Direct detection of hemoglobins

at 415 nm

Capillarys: 33 samples/hr, Minicap: 9 samples/hr

Hb identification for Capillarys/MinicapZ 15 : Hb HZ 14 : //Z 13 : Hb-J Rovigo, Hb N-Baltimore

Z 12 : Hb Bart’s, Hb J-Providence, Hb J-Mexico, Hb J-baltimore….Z 11 : Denaturated Hb A, Hb KaoshiungZ 10 : Hb Hope, Hb M-Iwate

Z 9 : Hb A, Hb Camperdown, Hb Phnom Penh……Z 8 : Acetylated Hb F, Hb Altanta, Hb Athens-GA

Z 7 : Hb F, denaturated Hb S, Hb Porto-Alegre……..

Z 6 : Hb D-Punjab, denaturated Hb E, Hb Korle-Bu, Hb Lepore, Hb Köln….

Z 5 : Hb S, Hb Hasharon, Hb Handsworth, denaturated Hb O-Arab.

Z 4 : Hb E, denaturated Hb C, Hb Köln, Hb A2 variants, M-Iwate Hb A2 variants

Z 3 : Hb A2, Hb O-Arab

Z 2 : Hb C, Hb Constant Spring, Setif HbA2 variantZ 1 : Hb dA2 Hb aA2, Hasharon Hb A2 variant, Winnipeg Hb A2 variant……

44

Case 7: 65 years, Male, Hgb 9.4g/dl, Hematocrit 27.3

Co-migration with A2

A= 62.1 %

A2 = 31.7%*

45

Case 7: Hb E migrates separately from Hb A2

Hb E

Hb A

Hb A2

Hb A 51.8%Hb A2 2.9%Hb C 35.9%

Hb A

Hb A2

Hb C

Case 9: Diabetic patient, 61 years, Hb 11.6g/dl, hematocrit 34.8, MCV 85

Slight anemia; compatible with heterozygote A/C

Hb F

Hb A2

Hb A

Beta variant: association a/bmutated

Example for a beta variant

a a

b b

Hb A

a a

d d

Hb A2

b variant (One additional peak)

bm bm

a a

Electrophoresis Principle.

►Separation of haemoglobins with electrophoresis at pH 8.4 (alkaline) and pH 6.2 (acid).

►Scanning allows quantification of the hemoglobin present, bands are seen by staining.

►At alkaline pH Hb C, E, A2 and O migrate together to form a single band, Hb S, D and G also co migrate.

Electrophoresis Principle (2).

►At acid pH Hb C separates from E and O and Hb S separates from D and G.

►Hb E and O cannot be separated by electrophoresis neither can Hb D and G.

HPLC Disadvantages (2).

► Capillary zone Electrophoretic method can be used to quantify Hb A2 in the presence of Hb S by eliminating interference from these adducts.

► Interference can also be eliminated by the use of micro anion-exchange column methodology.

► Integration errors can result in false decreases in the values obtained, although this can be minimized by applying known corrections.

Capillary electrophoresis CE· Capillary electrophoresis (CE) was developed from

combining several features of different methods including the principle of gel electrophoresis, the fused silica capillary of gas chromatography (GC), and the highly sensitive detectors of high-performance liquid chromatography (HPLC).

CESeparation in CE is based on different mobility of analytes under an electric field, which occurs in a capillary filled with buffer. Unlike other media (e.g., paper, agarose, and polyacrylamide gel), electrophoresis in a capillary can use a high voltage (up to 800 V/cm) due to the physical properties of fused silica capillaries. A large surface area to volume ratio of a capillary provides effective heat dissipation. The small dimension of a capillary requires small amounts of samples and buffer and the automation of CE requires less time and labor.

· In 1989, Karger organized the first International Symposium on High Performance Capillary Electrophoresis (12) and, in the same year, the first commercial CE instrument was available. Since then, the number of publications on CE have been rapidly increasing due to its versatility, simplicity, and high efficiency.

The principle of CEThe principle of CE is based on the different

migration of solutes in an electric field, and electrophoresis is performed in narrow-bore capillaries filled with electrolyte. The mobility of

analytes depends upon their sizes, charges, and degree of ionization, viscosity, temperature, and dielectric constant of the background electrolyte (BGE). Upon application of voltage, analytes

are driven by two forces, the electrophoretic migration and the electro-osmotic flow (EOF).

Indeks eritrosit

Ntaios et al., 2007. Ann Hematol 86:487–491

Indeks eritrosit

Niazi, et al., 2010. Gomal journal of medical sciences2010,v0l 8 n0 2

· Several acquired conditions are associated with modest elevations of HbF. They include pregnancy, recovery from marrow hypoplasia, aplastic anemia, leukemia, thyrotoxicosis, hepatoma, and juvenile chronic myeloid leukemia.4 The latter condition is exceptional in that it seems to reflect a genuine

reversion to fetal erythropoiesis.5 The remainder seem to be examples of the transient reactivation of HbF under conditions of acute erythropoietic stress, that is, rapid expansion of the erythron.6