Aportes del modelo murino al conocimiento de los mecanismos patogénicos del Síndrome

Urémico hemolítico (SUH)

Marina S. Palermo, Instituto de Medicina Experimental,

IMEX (CONICET), Academia Nacional de Medicina, Buenos Aires, Argentina

E coli O157:H7:es la cepa mayormente asociada a SUH y es considerada un patógeno emergente en todo el mundo.

EHEC: bacterias gram-negativas, LPS ppalcomponente de la pared, y estimulador de la rtainflamatoria

ShigaShiga ToxinToxin ((StxStx):):STEC produce dos subtipos: Stx1 and Stx2 y sus variantes

(Stx2c, d, e, f, g, h)

Isla de Isla de PatogenicidadPatogenicidad (LEE)(LEE)(Locus enterocyte effacement) Sistema Secreción Tipo III (TTSS), moléculas efectorasProteinas Secreción : EspA, EspB and EspDIntimina-Tir (eae); enterohemolisina (Hly)

Factores Patogénicos de EHEC

Respuesta inflamatoria /innata

EHEC

Respuesta Adaptativa Respuesta Adaptativa y especy especííficafica

Tracto Gastrointestinal:(daño epitelial y endotelial, necesarios para Stx2 alcance la circulación)

Sistémico: La intensidad o tipo de respuesta inflamatoria durante el prodromo, tendría un papel activo en la evolución de la enfermedad

Inducción de respuesta protectora ? Anticuerpos especificos anti-Stx?

Importancia de la respuesta local vs la sistémica..?¿?¿?

ROL PATOGENICO ROL PROTECTOR

Hipótesis de trabajo

0102030405060708090

100

LPS -18 h + Stx2 LPS - 1 h + Stx2 Stx2Time post Stx2 injection (hs)

88 92 96 100

*

*

InflammationInflammation antianti--inflammationinflammation

1 1 ugug

5 5 ugug

25 25 ugug

PotentiationPotentiation InhibitionInhibition

ofof Stx2Stx2--toxicitytoxicity

Palermo et al, Palermo et al, Pretreatment of mice with LPS or ILPretreatment of mice with LPS or IL--11ββ exerts opposite effects exerts opposite effects on Shigaon Shiga--toxintoxin--2 lethality. 2 lethality. ClinClin. Exp. . Exp. ImmunolImmunol. . 119:77119:77--83, 1999.83, 1999.

La respuesta inflamatoria puede modular la toxicidadde la Stx y podria participar en la evolución del SUH.

% s

urvi

vors

MODELO MURINO: inyección e.v. de Stx2 pura y LPS a distintos tiempos

PMNFunciFuncióón dual vigilancia y eliminacin dual vigilancia y eliminacióón n in situin situRRáápida transicipida transicióón de estado non de estado no--adherente a adherenteadherente a adherente

Expresión dinámica de Moléculas de adhesión

Enzimas que degraden matriz extracelular

Secreción de efectores en la rta inflamatoria: citoquinasy quimioquinas

Componentes bactericidas y bacteriostáticos

Datos Previos:* Un recuento alto de neutrófilos (PMN) en sangre periférica a la presentación indica peor pronóstico. * Se detectan niveles elevados de IL-8 y elastasa en el suero y orina de pacientes cursando el período agudo de SUH.

Parámetros de activación de la respuesta inflamatoria

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

IMF

Expresión de CD11b

*

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

ng M

PO /p

ulm

ón

Adhesión a pulmón

*

Capacitdad Citotoxica

0

10

20

30

40

50

60

70

% A

DC

C

*

0

20

40

60

80

100

0 100 200 300 400 500

r2=0.42p<0.0001

% P

MN

Urea

0

20

40

60

80

100

120

0 50 100 150 200 250 300 350Tiempo (días)

% v

ivos

Stx2

Stx2 + Ac*

Fernandez, et al. StxFernandez, et al. Stx--2 induces 2 induces neutrophilianeutrophilia and and neutrophilneutrophil activation in activation in a a murinemurine model of HUS. model of HUS. ClinClin. . ImmunolImmunol. 95:227. 95:227--234, 2000234, 2000..

La Stx2 activa la rta inflamatoria, particularmente los PMN, y esta poblacióncelular tiene un rol determinante en la toxicidad de la Stx

PMN

Stx2

INFLAMACIÓN ANTI-INFLAMACIÓN

Stx2 i.v. pura libre de LPS:

neutrofilia prolongada

PMN ￪CD11b￪ adhesión a vasos de pulmón￪ capacidad citotóxica

Stx2 i.v. pura libre de LPS:

Estímulo del eje HPA ￪ glucocorticoides (GC)

La depleción de GC endógenos ￪ mortalidad ￪ daño renal

Fernández GC, Clin Immunol 2000.95(3):227-34.

Gómez SA, Clin Exp Immunol 2003. 131(2): 217-24.

Resultados

La inoculación de Stx2 pura iv activa a los PMN

migración

adhesión

estallido respiratorio(IROs)

La ausencia de GC endógenos profundiza la activación de los PMN

apoptosis

neutrofilia

CD11b

AUMENTO

GC endGC endóógenos podrgenos podríían ejercer proteccian ejercer proteccióón parcial contra la n parcial contra la toxicidad de Stx2 a travtoxicidad de Stx2 a travéés de la inhibicis de la inhibicióón de la accin de la accióón n

patogpatogéénica que los PMN activados ejercen sobre el nica que los PMN activados ejercen sobre el endotelio.endotelio.Gómez SA, et al. Clin Exp Immunol 2005 139:65-73

El modelo murino aportó las primeras evidencias directas de que la respuesta inflamatoria participa en la patogénesis del SUH.En el mismo sentido, los mecanismos fisiológicos anti-inflamatorios regulan efectivamente la toxicidad de la Stx2, probablemente regulando la respuesta de los neutrófilos

Estudio de los leucocitos periféricos en pacientes con SUH

Indicadores de la activación de los PMN:a) Expresión en Membrana de antígenosb) Contenido de gránulos intracelulares

c) Cinética de PMN-degranulación por diferentes agonistas

PMN

MO

Li-NK

Parámetros de activación de PMN en pacientes

CD16 (FcγRIII) CD11b MPO

0

100

200

300

400

% IM

F

p<0.01 p<0.05

p<0.01

0

100

200

300

% IM

F

p<0.01 n.s.

n.s.

0

100

200

300

400

% I

MF

p<0.05 n.s.n.s.

0

20

40

60

80

100

% A

DC

C

*+

*

* p< 0.05 vs. sanos+ p< 0.05 vs. SUH

Sanos Uremicos SU H

Expresión disminuida de los marcadores de activación en membrana

0

20

40

60

80

100

120

140

HC

HU

S A

P

HU

S af

ter A

P

NC

UC

MFI

CD

66b

*

*

#

#

0

5

10

15

20

25

30

35

40

HC

HU

S A

P

HU

S af

ter A

P

NC

UC

Unid

ades

de

b-glu

curo

nidas

a

*

*

*

* p<0.05 vs SUH# p<0.05 vs S

Los PMN de pacientes con SUH mostraron un contenido intra-celular disminuido

020406080

100120140160

HC

HU

S A

P

HU

S af

terA

P

NC

UC

MFI

DH

R (P

MA

/bas

al)

*

*

* *

CD66b i.c. Actividad de β-Glucuronidasa

Produccion de IROs

Fernández GC et al, Impaired neutrophils in children with the typical form of Hemolytic Uremic Syndrome Pedr Nephrol 20:1306-1314, 2005..

Los PMN de los pacientes con SUH están EXHAUSTOS

Progresión de la infección por E coli O157:H7 en niños

-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7

Ingestión Diarrea Dolor

AbdominalDiarrea

Sanguinolenta(90%)

Mejora la diarrea

• carne picada• lácteos no pasteurizados• agua contaminada• jugos de fruta no pasteurizados

Pasaje a la sangre de Stx

* Lesiones en la mucosa * Brechas entre las células epiteliales adyacentes. * Pasaje a través de células epiteliales intactas

SUH (~15%)

Adaptado de Tarr et.al The Lancet 2005, 365:1073-1086

Los PMN de los pacientes con SUH están EXHAUSTOS,

probablemente como consecuencia de un proceso de activación

intenso, que debió ocurrir durante el tiempo que transcurre entre la diarrea y el diagnóstico del SUH

Resolución espontánea

(~85%)

Correlación entre el estado funcional de los PMN y la severidad en los pacientes con SUH

SUHSUHSUHSUHSUHSUH

SanosSanos LevesLeves ModeradosModerados SeverosSeveros CorrelaciCorrelacióónn

NNºº PMN PMN (x10(x1099/L)/L)

3.83.8±±0.38.0.38. 8.78.7±±0.9*0.9* 10.410.4±±1.2*1.2* 15.315.3±±1.2*#1.2*# *r=0.6,*r=0.6,p=0.001p=0.001

CD16 (CD16 (vsvs)) 151.1151.1±±16.416.4 55.055.0±±8.3*8.3* 60.860.8±±10.1*10.1* 39.839.8±±7.0*7.0* No correl.No correl.

CD11b (CD11b (vsvs)) 184.0184.0±±26.126.1 124.1124.1±±19.2*19.2* 80.180.1±±11.2*11.2* 62.362.3±±7.9*7.9*§§ --0.37,p=0.010.37,p=0.01

CD66b (g.2CD66b (g.2ºº)) 184.6184.6±±32.3132.31 156.8156.8±±16.516.5 81.281.2±±15.9*15.9*§§ 103.3103.3±±13.8*13.8* --0.35,p=0.010.35,p=0.01

MPO (g. 1MPO (g. 1ºº)) 166.7166.7±±24.024.0 160.3160.3±±23.023.0 99.399.3±±17.117.1§§ 96.096.0±±19.3*19.3*§§ --0.51,p=0.010.51,p=0.01

IROsIROs 99.099.0±±10.110.1 113.6113.6±±21.721.7 123.3123.3±±34.034.0 37.737.7±±17.4*17.4*§§ --0.51,p=0.010.51,p=0.01

*

Correlation Between PMN Functional State ..Fernández, et al. Pediatric Res. 61:123-8, 2007

La eliminación de las población de Monocitos/macrófagos reduce tanto la toxicidad de

la Stx2 como la potenciación por LPS

0102030405060708090

100

Time after Stx2 injection (hours)

% s

urvi

val

LPS-1h + Stx2 Stx2

Lip-Clod + Stx2 Lip-Clod + (LPS+Stx2)

Palermo, M.S.; et al. Depletion of liver and splenic macrophages reduces the lethality of Shiga toxin-2 in a mouse model. Clin. Exp. Immunol. 116:462-467, 1999.

Toxicidad In vivo de la Stx2 en ratones deficientes en receptores de quimioquinas

48 72 96 120 144 1680

25

50

75

100WT

CCR1 -/-

MCP-1 -/-

CX3CR1 -/-

time

% s

urvivo

rs

Estos resultados preliminares estimularon el estudio de receptores para quimioquinas en los pacientes y la

búsqueda de agentes bloqueantes como herramientas terapéuticas para prevenir el SUH

Hipótesis: Fractalquina podría participar en la patogénesis del SUH, favoreciendo la adhesión a endotelio en zonas de alto “shear-stress”, de células con alto potencial citotóxico, aumentando el daño por Stx2.

Involvement of fractalkine pathway in the pathogenesis of childhood Hemolytic Uremic SyndroRamos, MV y col. Blood 109: 2438-2445 2007

En pacientes con SUH encontramos disminución de los Mocirculantes positivos para Fractalquina (CX3CR1), y la presencia de algunas de estas células en el glomérulo.

Correlación entre marcadores fenotípicos de Mo y severidad

SUHSUH CorrelaciCorrelacióónn

SanosSanos LevesLeves ModeradosModerados GravesGraves

% % MoMo CX3CR1CX3CR1+ 85 85 ±± 33 60 60 ±± 99 6868±±1010 3535±±8*8* r= r= -- 0.4,0.4,p= 0.02p= 0.02

% Mo CX3CR% Mo CX3CR-

/CD62L/CD62L++1212±±22 3535±±4*4* 2828±±1212 5555±±7**7** r= 0.6,r= 0.6,

p= 0.027p= 0.027Mo Mo CX3CR+/CD62L+CX3CR+/CD62L+

65 65 ±± 44 54 54 ±± 66 5858±±99 3131±±6**6** r= r= -- 0.67,0.67,p= 0.001p= 0.001

IMF CD62 DPIMF CD62 DP 217 217 ±±3131 303 303 ±± 5151 137 137 ±±99 94 94 ±± 26**26** r= r= -- 0.560.56p< 0.045p< 0.045

IMF CD62 SPIMF CD62 SP 432432±± 6464 330 330 ±± 2929 262262±± 4141 188 188 ±± 59*59* r= r= -- 0.62,0.62,p<0.02p<0.02

*p<0.05 vs sanos; **p<0.005 vs leves Ramos, MV y col. Blood 109: 2438-2445, 2007

Análisis Retrospectivo del subset CD16+ de Mo

HC IC HUS 1 HUS 2+30.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

*

*

*

*p<0.05 vs HC

Abs

olut

e co

unts

of

CD

16+

Mo

x109 /L

TNF IL10 TNF IL10 TNF IL10 TNF IL10 TNF IL100.0000.0250.0500.0750.1000.1250.1500.1750.200

HUSHC IC HUS 1 HUS 2+3

*

*#

#

*

p=0.09

*p<0.05 vs HC TNF; #p<0.05 vs HC IL-10+p<0.05 vs IC TNF; p<0.05 vs IC IL-10

+ #

#

Num

ber

of C

D16

+pr

oduc

ing

the

resp

ectiv

e cy

toki

nex1

09 /L

Cytokine production is altered in monocytes from children with hemolytic uremic syndrome.Fernández y col. J. Clin. Immnol, 32:622-31, 2012

En los pacientes con SUH se observa que lasprincipales células de la respuesta innata han sidofuertemente activadas, correlacionanado con el gradode severidad:

A mayor severidad los PMN presentan un mayor grado de desactivaciónA mayor severidad aumenta el % de Monocitos inflamatorios, con alta capacidad de producir citoquinas .

La intensidad o el tipo de respuesta inflamatoria durante el prodromo, tiene

un rol activo en la evolución de la enfermedad

La ausencia del receptor CCR1 limita el daño renal en el modelo murino de SUH

Ramos, MV et al. Am J Ramos, MV et al. Am J PatholPathol. 2012 Mar;180(3):1040. 2012 Mar;180(3):1040--88

0

50

100

150

Basal 24h 72h

*

*#

p<0,05

p<0,05wt CCR1-/-

Ure

a (m

g/dl

)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Basal 24h 72h

*p<0,05

wt CCR1-/-

Cre

atin

ine

(mg/

dl)

0

50000

100000

150000

400000500000600000

Basal 24h 72h

*

*

#

w t CCR1-/-

PMN/

ml

0

20000

40000

60000

80000

100000

Basal 24h 72h

* #

*w t CCR1-/-

Mon

ocyt

es/m

l

Signos clínicos de daño renal

Alteraciones de leucocitos sistémicos

Daño renal por Stx2 en ratones KO para CCR1

PMN

0

1000

2000

3000

Basal 24h 72h

*

Cells

/ml

Monocytes

0

10000

20000

30000

40000

Basal 24h 72h

*

cells

/ml

Macrophages

0

100000

200000

300000

Basal 24h 72h

*

cells

/ml

Ramos, MV et al. Am J Ramos, MV et al. Am J PatholPathol. 2012 Mar;180(3):1040. 2012 Mar;180(3):1040--88

Endothelium

Subendotelium

Endothelial damage

Stx-direct mechanism:Inhibition of protein sinthesis

Stx-indirect mechanism:Mediated by activated PMN, Mo

and NK

PMN degranulation, ROS release

PMN Activation

TNF-αIL-1β

IL-8TNF-αIL-1β 2- Platelet agregation

& degranulation

Monocyte activation

Rol de la respuesta inflamatoria sobre la toxicidad de Rol de la respuesta inflamatoria sobre la toxicidad de la Stx2la Stx2

1- GB3 Induction2- Endothelial Activation: P and E-selectins & ICAM, IL-8 secretion, 3.- FKN Induction

IFN Producction

División InmunologíaDra. Sonia Gómez

Dra Leticia Bentancor

Dra María Victoria Ramos

Bioq. Romina Fernandez Brando

Lic. Analia Panek

Lic. Maria Pilar Mejías

Dra. Gabriela Fernández

Dr. Martín Isturiz

Departamentos Nefrología

Dr. Ramón ExeniDra. Irene GrimoldiDra. M. Carmen LazoDra. Andrea Exeni

Dra. Graciela VallejoDra. Christian Elias-Costa

Dr. Mario DiazDra. Laura Lopez

Dra. Flavia Ramirez

Facultè de Medecine P Salpètrière, Paris, France

Dr. Christophe Combadiere

Hospital de Niños R. Gutierrez, Cdad de

Buenos Aires

MUCHAS GRACIAS!!!

Why is the kidney the main affected organ??

Fractalkine: CX3CL1

* The expression of fractalkine and the presence of CX3CR1-expressing cells have been demonstrated in the kidney of patients with various types of nephropathies.* In animal models, the treatment with anti-CX3CR1 antibody blocked leukocyte infiltration into the glomeruli and improved renal function