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Aplicações da Eletroforese Capilar
Ana Carolina Peiter
Larissa Brussa Reis
Micaela Domingues
Rômulo Silva de Oliveira
Stefani Natali Stoll
Universidade Federal de PelotasDisciplina de Genômica IIDocente: Fabiana Seixas
Pelotas, 02 de maio de 2012.
Transporte em solução eletrolítica
Influência de um campo elétrico.
Diferenças de mobilidades
O que é Eletroforese?
Histórico
Eletroforese capilar -1981, por Jorgenson e Lukacs
~ à técnica tradicional.
Tubo capilar, preenchido
com um eletrólito.
Conduzida em TUBOS
O que é EC?
15 a 100 µm /50 a 100 cm
CAMPOS ELETRICOS ALTOS
BAIXO TEMPO ALTA EFICIENCIA E
RESOLUÇÃO
Grupos silanóis (SiOH) - (SiO- + H+)- soluções tampão.
Fluxo Eletroosmótico
cátodoânodo
Principais vantagens
Fatores Geométricos
Pequena demanda de amostra
Injeção e Detecção
Alta eficiência Baixo tempo
Variações da ECEletroforese capilar de zona (CZE)
Cromatografia eletrocinética micelar (MEKC)
Focalização isoelétrica capilar (CIEF)
Eletroforese capilar em gel (CGE)
Eletroforese capilar de zona (CZE)
Capilar e os reservatórios - cheios
com um tampão.
Corrente Elétrica + Poder Tamponante
Variações da EC
Cromatografia eletrocinética micelar (MEKC)
Variação da CZE Separa Moléculas neutras
Variações da EC
Focalização isoelétrica capilar (CIEF)
Separação -PI
pI não ocorre migração sob a
ação de um campo elétrico
Anfólito carreador
Variações da EC
Eletroforese capilar em gel
Separação pelo tamanho
Migração através da matriz do gel
Variações da EC
Ausência de Fluxo Eletroosmótico
Oligo-nucleotideos PROTEÍNA
Eletroforese capilar em gel
Variações da EC
• Colóides liofílicas-poliacrilamida;• Colóides liofóbicos-agarose.
Variações da EC
Eletroforese capilar em gel
Rede Polímérica
• RAPIDEZ• VERSATILIDADE• BAIXO CUSTO POR ANÁLISE• ALTO PODER DE SEPARAÇÃO
Vantagens gerais da EC
Não é adequada para:
• DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS VOLATEIS
• NÃO POLARES
Limitações gerais da EC
Sequenciamento de DNA
Relembrando...
•Método Químico- 1976 (EUA)
Maxam & Gilbert
•Método enzimático- 1977 (Reino Unido)
Sanger &Coulson
Método de Sanger
Método de Sanger
Molécula Nativa Desnaturação Cadeia
simples = MOLDE!
Manual X Automático
Eletroforese Capilar (Sanger- Automatizado)
1)PCR tradicional 2)Purificação do produto
3)Nova PCR (placa)4)Purificação da placa
5)Sequenciamento6)Análise dos resultados
1) PCR
• PROGRAMA:• 94 0C por 5 min
• 94 0C por 1 min
• 55 0C por 1 min
• 72 0C por 1 min
• 72 0C por 5 min
• 4 0C
35 ciclos
COMPONENTES:
DNA molde
dNTP’s
DNA Polimerase
Primer
Magnésio
Tampão
Água
2) Purificação do produto de PCR
3 formas Kit GFX Enzimas PEG 8000
• 1 de 50 ul • 2 de 25 ul
Volume final 50ul
• Purificar• Eluir
25ul • gel de agarose
5ul
2.1) COM KIT: GFX PCR DNA (GE Healthcare)
2) Purificação do produto de PCR
• 2.2) COM ENZIMAS
Exonuclease I (EXO I)
-GE Healthcare- E70073Z (2.500U)
Shrimp Alkaline Phosphatase
(SAP) - GE Healthcare -
E70092X 5000U
Pós-purificação
Condições para a reação de seqüenciamento:
PCR purif + Primers (R/F)
Nova PCR (DNA +
Primers+ MIX)
3) Nova PCR
2ul de pré-mix
1ul do primer
2ul de DNA
Vortex
Spin
Termociclador
3) Nova PCR
Poços não utilizados:
água
Lacrar!
3) Nova PCR
Purificação da Placa-
Protoloco
Sequenciador
5) Sequenciamento MEGABACE
• Sequencing e não Genotyping;• RINSE TIPS limpeza dos capilares • FLUSH AND DRY 1X semana • MATRIX FILL AND PRERUN: matriz• INJECT SAMPLES AND RUN
(lado da placa correto)
• Placa com o LPA/ 180 minutos• Pós: Store Cappilars (25ºC)
Picos Linha de base
Distância entre picos
Qualidade: BAIXA
4) Análise dos resultados (Cromatograma)
Qualidade: MÉDIA
4) Análise dos resultados (Cromatograma)
Picos Linha de base
Distância entre picos
4) Análise dos resultados (Cromatograma)
Qualidade: ALTA
Picos Linha de base
Distância entre picos
Genotipagem
Processo pelo qual identificamos cada polimorfismo de interesse para um grande
número de indivíduos
Tudo parte pelo o DNA a ser analisado...
• Análise dos fragmentos de DNA amplificados por PCR
• Sequenciamento de DNA
Eletroforese Capilar
Em animais
• Melhoramento clássico (seleção de indivíduos pelo seu fenótipo)
• Escolhas de características como: carcaça, leite, sexagem, doenças....
Em Microorganismos
• Antes dos capilares, sequenciadores...(Tipagem por testes morfológicos e bioquímicos, sensibilidade a fagos,
sensibilidade a bacteriocinas, perfis imunológicos e perfis de susceptibilidade a agentes antimicrobianos).
• genes para proteínas da superfície celular• genes de resistência a antibióticos• genes codificando para o rRNA 16S.
Em Plantas
• Melhoramento genético• Características comerciais: produção de
amido; açúcar;• Resistência a pragas; • Resistência adversidades climais;
Em Humanos:
• Paternidade;• Doenças hereditárias;• Criminalistica;• Medicina individualizada; • Oncologia;
Técnicas com Eletroforese Capilar
1. Análise de AFLP• Criação de mapas genéticos para novas espécies• Determinação de parentesco entre as cultivares• Estabelecimento de grupos de ligação em cruzamentos• Diversidade genética e molecular• Estudos de filogenia
Variações nos padrões das banda permitem os indivíduos ser genotipados ou diferenciados com base sobre os alelos que
carregam.
Extração de DNA
Enzimas de Restrição PCR
Preparação das
amostras
Eletroforese Capilar
Análise dos dados
2. Análise ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat)
(ISSR) PCR é uma maneira rápida e barata com base na variação nas regiões entre os microssatélites. Este método tem uma grande variedade de usos, incluindo:
• Caracterização da relação genética entre populações, • Impressão digital genética, • Marcação de gene,• Detecção de variação clonal,
• Identificação de cultivares, • Análise filogenética, • Detecção de instabilidade genômica, • Avaliação de hibridização.
Purificação do DNA
Design de Primer PCR Preparação
das amostrasEletroforese
CapilarAnálise dos
dados
3. Os microssatélites STR
• Os locos de microssatélites conhecidos como STRs (short tandem repeats ou repetições curtas consecutivas) apresentam alelos ou fragmentos de DNA de 100 a 300 pb;
• Estudos de mapeamento de ligação;• Estudos de associação e identificação de organismos.
3.1. Instabilidade microssatélite
• Descreve a fidelidade reduzida durante a replicação do DNA repetitivo frequentemente que ocorrem nas células tumorais.
4. SNP Genotyping
• São variantes de DNA comuns presentes em todo o genoma humano
• SNPS têm sido mostrados para ser responsável por :- diferenças nas características genéticas,- susceptibilidade a doenças e resposta a terapias de
droga.
Purificação do DNA
Template
Design de Primer PCR Limpeza da
Amostra
Reação de Sequenciame
nto
Limpeza da Reação
Eletroforese Capilar
Análise dos Dados
5. RFLP
T-RFLP análise é uma técnica utilizada para estudar comunidades microbianas complexos baseados em variação no gene 16S rRNA.
Tem sido usado para examinar as populações bacterianas em diversos ambientes naturais e compreender a estrutura da comunidade e
dinâmica em resposta a alterações nos parâmetros ambientais ou fisiológico.
Aplicações
Artigos Científicos, Teses e Dissertações
• Utilização acoplada à espectrometria de massa:
Poder de resolução e eficiência da CE
Universalidade e sensibilidade da MS
Solutos que apresentam
pequenas variações no tempo
de migração, ou até mesmo
que migram com a mesma
velocidade, podem ser
identificados.
Nos últimos 20 anos...
• CE+MS notoriedade crescente como ferramenta analítica
• Anualmente, a Electrophoresis, dedica uma edição especial inteira a trabalhos exclusivos com CE-MS.
Baixa disponibilidade
de amostra
Testes pediátricos, geriátricos e forenses
Menos que 10 nL de
amostra por injeção
Métodos analíticos aplicados a análises clínicas
• Separar cafeína e outros derivados em amostras de saliva, soro e urina
• Alíquotas aplicadas diretamente sem qualquer pré-tratamento
• A resolução e a reprodutibilidade foram satisfatórias e somente 2 min foram consumidos para se efetuar a análise.
Eletroforese capilar
Sensibilidade, precisão e
especificidade
Tempo de análise 2x menor
Cromatografia líquida de alta eficiência
Método equivalente
Consumo de solvente é 100
vezes maior
Cromatografia capilar eletrocinética micelar
Conclusão
• Ferramenta valiosa na separação simultânea de metilxantinas e outros compostos com funções químicas diversas.
• Sensibilidade, precisão e exatidão satisfatórias.
Análise de resíduos de pesticidas em alimentos
• Análise de ácidos nucléicos, bem como seus adutos, por detectar níveis bem abaixo
dos permitidos por lei.
• Adutos de benzopireno foram avaliados, uma vez que são compostos policíclicos aromáticos presentes no meio ambiente.
•Metabólitos (hemoglobina glicada, cetoácidos, hormônios),
•Forense: investigação de drogas (canabinóides, anfetaminas) em fluidos alternativos
Clínica
•Emissões veiculares (aldeídos e cetonas) e águas de abastecimento (pesticidas).
Ambiental•Pureza,
qualidade de fármacos anti-retrovirais (AIDS) e anti-câncer (ftalocianinas metaladas).
Fármacos
•Constituintes (carboidratos, ácidos graxos, ácidos carboxílicos,), aditivos (corantes e vitaminas) e contaminantes (pesticidas).
Alimentos
•Extratos vegetais (compostos fenólicos), óleos essenciais e hidrolisados de proteína de interesse fitoterápico.
Produtos naturais
Eletroforese Capilar como ferramenta analítica para a toxicologia forense
Fármacos e drogas de abuso de interesse forense
Cloridrato de Metanfetamina
designer drugs - Ectsasy
Agente simpatomimético
cloridrato de cocaína -
crack
Heroína - diacetilmorfina
Morfina
• Soluções de trabalho em diferentes concentrações
Soluções Padrão
• Capilar de Sílica fundida75um – 48,5cm 25kV
Equipamento • NaOH 1M por 5 min
• Eletrólito de corrida -20 min
Condições
• 87 amostras humor vítreo
• Solventes orgânicos
Preparo amostras • Gráfico 3D: tempo de retenção, espectro de luz e intensidade de luz absorvida
Detector por arranjo de diodos
OBJETIVOElaboração de sistemática
analítica para determinação de drogas de abuso e seus produtos,
empregando a técnica de Eletroforese Capilar.
Resultados e Conclusões
A Eletroforese Capilar com detecção de diodos pode ser utilizada para detecção e quantificação de drogas de
abuso em humor vítreo, pois fornece limites de detecção, quantificação, precisão e exatidão adequados para essa
finalidade.
Determinação e quantificação das vitaminas C e E associadas em produtos cosméticos
OBJETIVOValidação das metodologias analíticas para a determinação e quantificação do derivado do ácido ascórbico, tetraisopalmitato de ascorbila e o princípio ativo acetato de tocoferila que estão associados nas formulações cosméticas.
• Extratos em pó• Placebo
Amostras
• Espectrofotometria no UV
• Cromatografia• Eletroforese capilar
Análises • Sílica – 50cm/50um• NaOH 0,1M por 15
min • Água deionizada e
eletrólito de corrida
Eletroforese capilar
Resultados e Conclusões
O desenvolvimento de metodologia analítica para a Eletroforese Capilar não obteve bons resultados através da
técnica utilizando a microemulsão óleo-aquosa.
Desenvolvimento de metodologia para especiação de cromo em amostras
por eletroforese capilar de zona
OBJETIVOPropor um desenvolvimento de
um sistema de Eletroforese Capilar de zona para a
determinação e especiação de metais em amostras de águas
• Açude da Marcela• Indústria de Curtume,
Sergipe
Amostras
• Caseiro: fonte de alta tensão, capilar, eletrodos de platina, detector de UV, software
Sistema Eletroforético • Sílica, revestido pr
grupos silanóis • Água destilada, HCl 1M
– 5 min• NaOH 0,1M – 15 min• Solução eletrolítica
Capilares
Resultados e Conclusões
A eletroforese capilar de zona com detecção UV mostrou-se adequada para separação de complexos Cr(III)-EDTA com tempo de análise
inferior a 5 minutos. A partir dos resultados obtidos, concluiu-se que Cr(III) foi totalmente complexado pela matéria orgânica dissolvida nas águas do curtume e do açude. Nenhum sinal referente aos picos do complexo foi
observado nos eletroferogramas.
Referências• http://www.fea.br/Arquivos/Biotecnologia/• http://www.cenargen.embrapa.br/publica/trabalhos/ct022.pdf• http://www.oocities.org/~esabio/eletrof.htm• http://blog.cca.ufscar.br/lamam/files/2010/07/sequenciamento.htm• http://www.scielo.br/pdf/qn/v30n1/20.pdf
http://www.scielo.br/pdf/qn/v31n8/37.pdf• http://www.scientiaplena.org.br/ojs/index.php/sp/article/view/761• http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-29082006-170445/
pt-br.php• http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9139/tde-30102008-154631/pt-
br.php• http://www2.dbd.puc-rio.br/pergamum/tesesabertas/
0212144_06_cap_02.pdf• http://www.ufjf.br/ecologia/files/2009/11/estagio_docencia_Denise1.pdf• http://www.scielo.br/pdf/qn/v20n5/4891.pdf
Obrigado pela atenção!