Conceitos Prvios O que DNA?

Aonde se localiza o DNA numa clula ?

Do que so formadas as membranas celulares ?

Qual a estrutura do DNA?

DNA determina as caractersticas de todos os seres vivos.

DNA composto de um alfabeto de 4-letras (nucleotdeo/ molcula) referido como A, T, C, and G.

A ordem do alfabeto determina as caractersticas do organismos, como as letras de nosso alfabeto determinam as palavras.

Cada clula do corpo humano contm >3 BILHES de letras.

A nica diferena entre os organismos vivos a quantidade e ordem do alfabeto de DNA.

CloroplastoMitocndriaVacoloMembrana celularParede celularCitoplasmaNcleo(DNA)

Componentes do DNA

DNA um polmero, sendo os monmeros os nucleotdeos, chamado ento de polinucleotdeo.

Cada nucleotdeo consiste de um acar de 5 carbonos(desoxiribose), uma base nitrogenada ligada ao acar e umgrupo fosfato.

Quatro nucleotdeos, que diferem somente na basenitrogenada.

A = adeninaG = guanina C = citosinaT = timina

Definies A combinao de uma desoxirribose e uma base constitue um desoxinucleosdeo.

A combinao de um fosfato, de uma desoxirribose e uma base constitue um desoxinucleotdeo.

http://www.blc.arizona.edu/Molecular_Graphics/DNA_Structure/Purines_BS_Labels.GIFAdenina e Guanina so Purinas. As Purinas so as maiores bases.9 tomos cada

http://www.blc.arizona.edu/Molecular_Graphics/DNA_Structure/Purines_BS_Labels.GIFTimina e Citosina so chamadas Pirimidinas. 6 tomos cada

A Hidroxila do carbono-3 da pentose do primeiro nucleotdeo se liga ao grupo fosfato ligado hidroxila do carbono-5 da pentose do segundo nucleotdeo atravs de uma ligao fosfodister (ligao covalente)http://www.universitario.com.br/celo/topicos/subtopicos/genetica/dna/Image27.gif

Com base na estrutura de dupla hlice do DNA e nas caractersticas de hidrofobicidade das molculas, a estrutura do DNA fica da seguinte forma:

O grupo fosfato e o acar (parte hidroflica) esto localizados na parte externa da molcula. As bases nitrogenadas (parte hidrofbica) esto localizadas na parte interna da molcula.

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/c/c8/FirstSketchOfDNADoubleHelix.jpgPrimeiro rascunho do Francis Crick da estrutura do DNA

Pontos importantes

Por conveno, um polinucleotdeo lido da extremidade 5para a 3. As orientaes das duas fitas antipararela: suas direes 5' - 3' so opostas. As duas fitas so mantidas unidas pela energia de muitas pontes de hidrognio (A=T e G=C) e interaes hidrofbicas.

http://www.johnkyrk.com/DNAanatomy.html

cidos NucleicosExtrao e Quantificao

DNA na minha comida???

DNA na minha comida???

CURIOSIDADE:Cada clula contm cerca de 3 metros de DNA. Refeio = 55.000.000 clulas ou Cerca de 150.000 km de DNA.

DNA na minha comida???DNA est presente nas clulas de todos os organismos vivos.

O processo de extrao de DNA de uma clula o primeiro passo em vrios procedimentos de um laboratrio.

Deve-se separar o DNA de substncias indesejveis da clula, gentilmente, para que o DNA no se desnature (quebre).Introduo

DNA na minha comida ???Pode-se extrair o DNA, preparando-se uma soluo de banana tratada com sal, gua destilada, e shampoo (detergente) .

O detergente quebra a membrana celular, dissolvendo os lipdeos (molculas de gordura) e protenas da clula, alm de quebrar as ligaes que mantm a membrana celular intacta.Introduo

DNA in minha comida ???O detergente forma ento um complexo com os lpdeos e protenas, permitindo que sejam filtrados para fora da soluo com um filtro de caf.

O DNA das clulas ficam no filtrado.

O sal permite que o DNA precipite com a adio de lcool (ons Mg e Cl).

Introduo

DNA na minha comida???Extrao de DNA

DNA na minha comida???Passo 1Em um liquidificador, misturar uma banana com um copo de gua destilada (250ml). Extrao de DNA

DNA na minha comida???Passo 1 (cont.)

Bater por for 15-20 segundos, at a soluo virar uma mistura.

Extrao de DNA

DNA na minha comida??? Passo 2Num copinho de caf, fazer uma soluo contendo 1 colher de ch de shampoo ou detergente e 2 pitadas de sal de cozinha. Extrao de DNA

DNA na minha comida??? Passo 2 (cont.)Adicionar 20 ml (4 colheres de ch) de gua destilada.

Dissolver o sal e o shampoo/ detergente mexendo devagar para evitar fazer espuma. Extrao de DNA

DNA na minha comida??? Passo 3 soluo do passo 2, adicionar 3 colheres cheias da soluo de banana do passo 1.

Misturar a soluo com a colher por 5-10 minutos. Extrao de DNA

DNA na minha comida??? Passo 4Enquanto uma pessoa mistura a soluo de banana, outra coloca um pedao (cone) de filtro de caf dentro do outro copo de plstico. Dobre as abas do filtro para fora para que no encoste no fundo do copo. Extrao de DNA

DNA na minha comida??? Passo 5Filtre a mistura no filtro e deixe a soluo drenar por vrios minutos at ter cerca de 5 ml (cobrindo o fundo do copo) do filtrado para testar. Extrao de DNA

DNA na minha comida??? Passo 6

Pegar um tudo com lcool gelado. Para melhores resultados, o lcool deve estar o mais gelado possvel. Extrao de DNA

DNA na minha comida??? Passo 7

Encher a pipeta de plstico com a soluo de banana. Extrao de DNA

DNA na minha comida??? Passo 8Adicionar a soluo ao lcool. Deixe descansar por 2 a 3 minutos sem mexer o tubo. muito importante no agitar o tubo. Extrao de DNA

DNA na minha comida???ResultadosVoc pode assistir o precitado branco de DNA na camada de lcool. O DNA tem uma aparncia de um muco esbranquiado e como se fosse uma nuvem. Extrao de DNA

Extrao com FenolFenol usado para desnaturar e remover protenas de solues que contm cidos nuclicos. Homogeneizao do material (nitrognio lquido ou banho de gelo seco e etanol), com tampo.2.Adicionar o mesmo volume de fenol amostra, colocar no vortex ou agitar.

3.Centrifugar para separar 2 fases (de fenol embaixo e aquosa acima). Transferir fase aquosa para novo tubo.

Repetir 2 e 3.

Extrao com Fenol (Cont.)4. Repetir a extrao agora com 24:1 Clorofrmio: lcool isoamlico. Centrifugar, recolher fase aquosa e repetir 4.

5.Adicionar 0,1 volume de NaOAc 3M + 1,8 volumes de etanol 95% gelado, inverter tubo algumas vezes (passo para livrar o DNA dos sais e concentrar o DNA).

6. Se houver precipitao ou nuvem, centrifugar 5 a 10 min. Se no conseguir ver DNA, -20C 15 a o/n e centrifugar. Retirar EtOH

Lavar precipitado com 70% etanol e centrifugar

8.Retirar etanol, secar ao ar e ressuspender em TE ou ddH20 (50 a 500 l)

Pontos ImportantesO fenol usado para remover protenas e outros contaminantes da soluo aquosa do DNA.

O clorofrmio ajuda desnaturar protenas e a remover o fenol residual.

O lcool isoamlico geralmente adicionado ao clorofrmio para reduzir espuma.

Extrao SimplesMaterial + Tampo de Lise: Tris, EDTA, SDS, NaCl e proteinase K.Digesto a 37 C (clulas, 2-3 hs) ou 55 C (tecido, overnight) sob agitao.Precipitao com isopropanolResgatar o precipitado (nuvem) e ressupender em gua ou TE.

Extrao de DNA plasmidialPlasmdeos: pedaos de DNA extracromossmicos, covalentemente fechados; Codificam genes de resistncia antibiticos ou metais pesados, produode pigmentos, de virulncia, etc.Tambm possuem genes para sua prpria replicao 1-20 kb x ~ 5000 kb em E. coli, sendo fcil a separao dos DNAs

Extrao de DNA plasmidialDepois de crescer o plasmdeo recombinante em bactria, temos que nos livrar dos outros componentes das clulas bacterianas (membranas, parede celular, ribossomos, RNA e DNA cromossomal Ento adicionamos uma soluo com NaOH (que aumentao pH e desnatura o DNA cromossomal e no o do plasmdeo) e SDS (que vai solubilizar as membranas e causar a lise das clulas).Centrifugar cultura e ressuspender pellet em tampo Tris EDTA (que liga divalentemente a ctions Ca e Mg e com isto ajuda a desestabilizar a membrana de E. coli).

Extrao de DNA plasmidial (cont.)Decrescemos o pH com acetato de potssio (o DNA cromossomal no poder a voltar a sua estrutura original e sair de soluo) Purificar o DNA com extrao com fenol e clorofrmio, seguido de precipitao com etanol ou com uma membrana de slica gel (o DNA vai se ligar membrana sob altas concentraes de sais e se desligar com a reduo da concentrao de sais, ao contrrio das protenas e sais que passaro direto. Aps lavagem com etanol para lavar os sais o DNA pode ser eludo Ao centrifugarmos, o DNA cromossomal precipitar e o plasmidial ficar em soluo junto com protenas e sais.

O DNA pode se livrar do RNA pelo tratamento com RNAse A

Extrao de RNASoluo Desnaturante:Tiocianato de Guanidina 4MCitrato de Sdio 25 mM 0.5% Sarcosil Beta-Mercaptoetanol 0.1 MEnvolve lise das clulas, desnaturao das protenas da membrana celular e depois os passos normais como em DNAEnvolve desnaturante forte para quebrar clulas, solubilizar seus componentes e desnaturar RNAses endgenas simultaneamente.

Extrao de RNAmUsada para RNAm raros, para fazer sondas ou para bibliotecas de cDNA.

Eucariotos: usa-se colunas de celulose e oligo dT ou magnetic beads e oligo dT (uma cadeia sinttica de 20-30 timinas)

J possvel para procariotos 1,5 a 5% do RNA celular

O RNA est INTACTO???Gel de agarose desnaturante: paradesfazer a estrutura secundria do RNA

QuantificaoPara qu:

Sintetizar cDNA para produo de bibliotecaPurificao de fragmentos de DNA para subclonagem

Quantificao de produtos amplificados

Deteco de molculas de DNA em preparaes de drogas.

QuantificaoMais usada com EspectrofotmetroA260 d estimativa da concentraoLeitura da absorbncia a 260 e 280 nm

OD260 = 1.0, dsDNA = 50 g/mL; RNA = 40 g/mLDesvantagens: interferncia com material para extrao, inabilidade de diferenciar entre DNA e RNA, sensibilidade: 50-250 ng DNA/ mL

RNA e pH (>7,5): pH cido afeta a absoro com A260, ajustar com Na2HPO4 (conc. final de1mM)Quantificao

Como fazerReagentes e EquipamentoEspectrofotmetro UV, cubetas de quartzo, ddH20

1Zerar o aparelho com ddH20 2Diluir um volume conhecido de cido nucleico em gua.3Realizar a leitura em OD260 e OD280. 4Calcular a concentrao.

ClculosEx.: 3l de DNA + 97l H20; OD260 =0,0157

PurezaDNA: Razo A260/A280 >= 1,75 - 1,80

< 1,75 contaminao com lipdeos ou protenasRNA: Razo A260/A280 ~ 2,0

< 2,0 contaminao com guanidina (da extrao)> 2,0 contaminao com fenol ou clorofrmio

OUTROS MTODOSFluormetro: utiliza material fluorescente que se liga ao cido nuclico sem problemas com protenas (picoGreen; sondas de cianina). Seletivos para dsDNA.

Vantagem maior a sensibilidade: 0,5 ng/ mL (100 a 1000 vezes maior que o espectrofotmetro)

OUTROS MTODOSGel de agarose: aplicando-se as amostras de DNA juntamente com padres de concentrao conhecida100 a 300 ng de plasmdeo

http://www.neb.com/nebecomm/productfiles/778/images/N3231.gifPor meio decorrida juntoa um marcadorde DNA

cidos NuclicosEstabilidade DNA versus RNA

Nucleases

Cuidados: autoclavagem de materiais e tampes; estocagem (DNA e RNA).

TE (10 mM tris-HCl, pH 8,1, 1 mM EDTA) x nucleases e DEPC x RNAses

Armazenagem de DNA e RNADNA: 4C (em TE) ou - 20C (maior tempo) RNA: manter sempre no gelo quando manipulado ea - 70C (maior tempo)

Pontos ImportantesMaioria das nucleases precisam de Mg para atividade, o EDTA ajuda na inativao delas.

RNA normalmente armazenado em ddH20 que foi previamente tratada com DEPC (0,1%) para inativar as RNAses.

Muitas RNAses sobrevivem autoclavagem ento DEPC deve ser usado tambm para solues. Importante inativar DEPC antes de usar pois pode modificar o RNA e inativar enzimas (RT e quinases)

DEPC altamente txico para humanos !!!DEPC incompatvel com TRIS !!!

ANIMAOhttp://gslc.genetics.utah.edu/units/biotech/extraction/

ANIMAOhttp://www.jove.com/Details.htm?ID=246&VID=238

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