apitulo 5 cin.enz

8/13/2019 Apitulo 5 Cin.enz

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CINETICA ENZIMATICA

BIOQUIMICA APLICADA


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CINETICA ENZIMATICA

Estudia la velocidad de las reacciones catalizadas

enzimticamente

Los principios generales de las reacciones qumicas

se aplican tambin a las reacciones enzimticas


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Factores que afectan la velocidad de

una reaccin enzimtica

1.Concentracin de Enzima

2.Concentracin de sustrato

3.pH

4.Temperatura

5.Presencia de activadores


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2. Concentracin de sustrato

Las reacciones enzimticas se saturan con el sustrato


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Efecto autosaturante

Esto significa que a mayor cantidad de sustrato,

mayor nmero de centros catalticos estarn

ocupados, lo que incrementar la eficiencia de la

reaccin, hasta el momento en que todos los sitiosposibles estn ocupados.

En ese momento se habr alcanzado el punto de

saturacin de la enzima y, aunque se aada ms

sustrato, no aumentar ms la eficiencia


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3. Efecto del pH

La actividad enzimtica pasa por un mximo (pH ptimo).El pH ptimo de las enzimas varia ampliamente; para la pepsina, del

estmago, es de 1,5, la arginasa tiene un pH ptimo de 9,7.La gran mayora de enzimas tienen un ptimo alrededor del pH

fisiolgico de, ~7.0


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3. Efecto del pH

Explicacin:

El sitio activo de la enzima esta frecuentemente compuesto

de grupos ionizables que deben estar en la forma inica

para tener actividad, unir los sustratos o catalizar la

reaccin.

Una enzima que se someta a valores extremos de pH, se

desnaturaliza.


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4. TemperaturaEn el efecto de la temperatura hay doscomponentes:

1. Aceleracin de la reaccin segn la

ecuacin de Arrhenius. (dentro del

margen de actividad)

k = A exp (-Ea/RT)

Al aumentar la temperatura, la velocidad

de reaccin aumenta y, para casi todas las

enzimas, un incremento de 10C duplica eincluso triplica la velocidad de reaccin.

2. Desnaturalizacin trmica de la

protena.Para muchas enzimas la regin de

inactivacin trmica est muy prxima de

la temperatura ptima.


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CINETICA ENZIMATICA

Cintica de reacciones con un slo substrato

Michaelis y Menten propusieron un modelo para relacionar lavelocidad de reaccin con la concentracin de substrato. Suponiendo

la existencia de un solo complejo central, el esquema de reaccin

sera:


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Velocidad de reaccin VS concentracin

La ecuacin de Michaelis-

Menten describe como

vara la velocidad de las

reacciones catalizadas por

enzimas de acuerdo a la

concentracin de sustrato:


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Parmetros enzimticos

1. Km(constante de Michaelis-Menten para cada enzima)=concentracin de S a la que la V es 1/2 Vmax.

2. Vmax= velocidad mxima terica = la velocidad cuando todos los

centros activos estn ocupados con sustrato (nunca alcanzada en la

realidad)

Unidades


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Caractersticas de Km:

Es una medida de la afinidad del enzima por el S.

Cuanto menor es Km, mayor es la afinidad del enzima por el S.

Una Km pequea, refleja una gran afinidad por el sustrato, ya que bajasconcentraciones de sustrato son suficientes para saturar al 50% de la

enzima es decir, para alcanzar Vmax.

Una Km grande, refleja una baja afinidad de la enzima por su sustrato, ya

que son necesarias grandes concentraciones de sustrato para saturar el

50% de la enzima.


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ENZIMA SUSTRATO Km(mM)

Catalasa H2O2 25.0

Hexoquinasa ATP 0.4

D-Glucosa 0.05

D-Fructosa 1.5

Anhidrasa carbnica HCO3- 9.0

Quimotripsina Gliciltirosinilglicina 108.0

N-Benzoiltirosinamida 2.5

-Galactosidasa D-Lactosa 4.0

Treonina deshidrogenasa L-Treonina 5.0

Kmde algunas enzimas


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Vmax

Vmax es una constante

Vmax es la velocidad mxima terica de la reaccin pero, en

realidad, nunca se alcanza

Para alcanzar la velocidad mxima se requiere que [S] >> [E] y

que TODAS las molculas de enzima estn unidas al sustrato.

Vmax se alcanza asintticamente a medida que la

concentracin de sustrato aumenta


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CALCULO DE PARMETROS DE LA ECUACINLinearizacin de Lineweaver-

Burk .Artificio matemtico que

permite deducir grficamente

los valores de km y Vm.

El artificio consiste en convertir

a la ecuacin M-M en laecuacin de una recta.

Recta de forma Y = A + BX,

donde:

Y = 1/v,A = 1/Vm,

B = km/Vm, y

X = 1/[S]


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Ploteo de Eadie-Hostee

El ploteo se realiza vi/ vi/[S], con ese fin

se multiplica ambos miembros de la

inversa de la ecuacin M-M por vi.Vmax

obtenindose:

Vmax (vi) = KmVmax(vi) + Vmax(vi)[S]

vi Vmax[S] Vmax [S]

Vmax = Km.vi + vi [S]

Ordenando:

vi = Vmax - Km.vi [S]

Esta es una ecuacin de lnea recta de laforma Y = a bX.

Pendiente= Km,

Ordenada en el origen= Vmax.


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Ploteo de Hanes- Wolf

[S] = Km. + [S] . 1 .Vi Vmax Vmax

[S]

V

[S]

1

Vmax

Km

V max

0


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Ploteo Eisentahl-Cornish

Vmax = vi + vi.Km

[S]

V max

[S]

Km

V


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limitaciones de Cinetica Michaeliana

Para utilizar la ecuacin de Michaelis-Menten deben asumirse:

Las concentraciones relativas de E y S: La concentracin desustrato [S] es mucho mayor que la concentracin de enzima [E],

de manera que la proporcin de ES es relativamente pequea.

La reaccin esta en equilibrio: [ES] no cambia en el tiempo (la

velocidad de formacin de ES es igual a la velocidad de sutransformacin en E + S y en E + P).

Deben usarse velocidades iniciales (vo). Esto significa que lavelocidad de la reaccin debe determinarse tan pronto como

sustrato y la enzima se mezclan. En dicho tiempo, la concentracin

de productos es despreciable y, por lo tanto, la reaccin inversa de

productos a sustratos puede ser ignorada


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Enzimas con cinetica no Michaeliana

Hay enzimas que no obedecen

la ecuacin de Michaelis-

Menten.

Su cintica no es Michaeliana.

Esto ocurre con las llamadas

enzimas alostricas, cuya

grfica v contra [S] no es unahiprbola, sino una sigmoide

(en forma de s)


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Actividad enzimtica

Actividad enzimtica= cantidad de enzima que

transforma 1 mol de sustrato por min = una forma

comn de expresar la velocidad

Actividad especfica= unidades por mg de protenatotal de la preparacin enzimtica. Unidad ms

moderna: kat = nmoles de producto / seg


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Regulacin de la actividad enzimtica

Se usan como medicamentos, antibioticos,

insecticidas, herbicidas. etc


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INHIBIDORESIRREVERSIBLES.Inhibicin permanente

Unin irreversible por medio de

enlaces covalentes.

Modificaciones qumicas de los grupos

catalticos.

Modificada la enzima, est siempre

inhibida.

Ejm: efecto del mercurio, plomo, gasesneurotxicos y compuestos arsenicales.

In cianuro, CN-: Se fija con gran

afinidad a la sexta posicin de

coordinacin del Fe hemnico del

complejo citocromo oxidasa.Penicilinas: Inhiben enzimas sernicas

que participan en la formacin de la

pared bacteriana

REVERSIBLES.La unin del inhibidor y la

enzima es reversible.

Al quitar el inhibidor del

medio, se recupera la actividad.

Se unen a la enzima por el

mismo tipo de interacciones

que se producen entre las

enzimas y los sustratos.

hay inhibidores: COMPETITIVOS,

NO COMPETITIVOS, yACOMPETITIVOS.


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a.- Inhibidores irreversibles: Venenos

Los gases nerviosos.

Organofosforados.

Carbamatos.

Actan sobre las enzimas del sistema nervioso.

Neurotransmisores


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Agentes nerviosos

Los agentes nerviosos son esteres delcido fosfrico, con los OH sustituidos

por otros radicales. Inhiben la

acetilcolinesterasa


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Plaguisidas organfosforados

Organofosforados: malathion

Carbamatos: como el carbaril (Sevin).

Organofosforados: Esteres de fosfato

con O sustituidos con S u otros radicales.

Con enlace P-C fosfonato,

Con enlace P-N fosforamido,

Con enlace P-S fosfotiolato

Inhiben la acetilcolinesterasa


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Neurotransmisin intoxicacin

Circuito elctrico de transmisin de seal entre una sensacin

(nervio sensitivo) y un movimiento muscular (nervio motor).

Acetilcolina --- colina + acetato

Enzima: acetilcolinesterasa

Un inhibidor de la acetilcolinesterasa, inhibidor de lacolinesterasao anticolinesterasaes un compuesto qumico queinhibe a la enzima colinesterasa impidiendo que se destruya la

acetilcolina liberada, produciendo como consecuencia unaumento en la concentracin y en la duracin de los efectos del

neurotransmisor.

i hib l


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Los venenos inhiben la

acetilcolinesterasa

Reaccionan con la enzima de

manera similar a la acetilcolina.

La reactivacin de la enzima duramenos tiempo con los

carbamatos, que con los

organofosforados.

De ah que, los carbamatos se

consideran inhibidores reversiblesporque en poco tiempo dejan la

enzima libre, mientras que a los

organofosforados se les llama

inhibidores irreversibles porque el

proceso de reactivacin, tarda

mucho mas tiempo, y la enzima

pierda propiedades catalizadoras


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Armas qumicas

El Gas sarn. Es un lquido incoloro e inoloro usado como arma qumica debido asu extrema potencia como agente nervioso.

Fue clasificado como arma de destruccin masiva en la resolucin 687 de la ONU.La produccin y almacenamiento de gas sarn fue declarada ilegal en la

Convencin sobre Armas Qumicas de 1993.

Fue desarrollado como pesticida en 1939 en Alemania.

Puede convertirse en vapor (gas) y propagarse al ambiente.


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b.- Inhibidor Reversible

La unin del inhibidor y la enzima es reversible.

Al quitar el inhibidor del medio, se recupera la actividad.

Hay 3 tipos:

Competitiva

No Competitiva

Acompetitiva (Alostrica)

I hibid i i


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Inhibidores competitivos

Los inhibidores competitivos tienen gran parecidoestructural con el sustrato natural.

Compiten con el sustrato por ocupar el sitio activodela enzima.

Esta unin es reversibley aumentando laconcentracin de sustrato aumentamos el nmero demolculas de enzima libre.

Sulfas(inhibe pasos metablicos en bacterias

I hibi i titi


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Inhibicin competitiva

Malonato Deshidrogenasa del cidosuccnico

Sulfas Infeccionesmicrobianas

Antihipertensores: Captopril y Enalopril

Alopurinol Controla la gota

Fluoruracilo Cncer


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Efecto antibiotico de las sulfas

Las bacterias sensibles Requieren del (para amino benzoico)

PABA para la produccin del cido dihidroflico, un pasoesencial en la produccin de las purinas y la sntesis de cidos

nucleicos.

Las sulfamidas actan como anlogos estructurales del PABA,

inhibiendo competitivamente a la enzima dihidropteroatosintasa.

Al bloquear la sntesis del cido flico, se inhibe el crecimiento

y reproduccin del germen


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Inhibidor competitivo


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Competitiva


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Inhibicin No Competitiva

El inhibidor se combina con la enzima o con el complejo ES,

interfiriendo con la formacin de producto. El valor de Km no vara

Ejm. Yodoacetato. Se une a SH de cisteina y modifica el centro

activo


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No competitiva

V = Vmax. S. .1.

Kmax+S (1+I/Ki)

Km se mantiene


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Inhibicin acompetitiva

El inhibidor se une solo al complejo ES para dar un complejo

inactivo. La Kmse mantiene y la Vmaxdisminuye.


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Diferenciacin de tipos de inhibiciones

reversibles.


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Aplicaciones

Muchos medicamentos son inhibidores enzimticos.

La validez de un inhibidor enzimtico medicinal suele venir

determinada por su especificidad (su carencia de unirse a otras

protenas) y su potencia (su constante de disociacin, la cual

indica la concentracin necesaria para inhibir a una enzima). Una alta especificidad y potencia asegura que el medicamento va

a tener pocos efectos secundarios y por tanto una baja toxicidad.


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REACCIONES CON MS DE UN SUBSTRATO

Mecanismos para explicar este tipo de reacciones:

la mayora pueden clasificarse en dos tipos:

a)Se libera un producto a partir de un primer complejo

binario antes de la unin con el segundo substrato.

b)Todos los substratos se unen a la enzima antes de la

catlisis (en caso de dos substratos se denomina

mecanismo de formacin de complejo ternario)


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a.- Reacciones mediante formacin de un complejo ternario.En este caso, el complejo ternario puede formarse independientemente del

orden de unin de los substratos (aleatorio), o bien nicamente en un orden

determinado (mecanismo ordenado).

Mecanismo aleatorio. Los substratos A y B forman un complejo con la enzima.

Cualquiera de ambos puede combinarse con el otro substrato para formar el

complejo ternario EAB, que conduce a los productos X e Y y a regenerar laenzima:

M i d d


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Mecanismo ordenado. Un substrato (A) se une inicialmente con la enzimaformando el complejo EA. El segundo substrato slo se une al complejo EA para

conducir al complejo ternario EAB:

b.- Reacciones enzimticas sin formacin de un complejo ternario.

El mecanismo se denomina ping-pong, formndose un complejo de la enzima con unsubstrato (EA), que libera el producto X, quedando como EA' (por ejemplo, un acil-enzima)

que es atacado por el segundo substrato (por ejemplo, transfirindose el grupo acilo).


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Regulacin de la actividad enzimticaLos seres vivos han generado mecanismos para regular las rutas

bioqumicas.La regulacin es esencial por las siguientes razones:

Mantenimiento de un estado ordenadono hay desperdicio de

recursos.

Conservacin de la energautilizacin de la Energa suficiente en

las clulas, para consumir los nutrientes segn sus necesidades

energticas.Respuesta a variaciones ambientalesson los ajustes rpidos que

deben realizar las clulas (pH, [S], TC), por su capacidad de aumentar

o disminuir la velocidad de las reacciones especficas.

Sobre la actividad de la enzima Sobre la cantidad de la enzima


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Clases de regulacin enzimtica

1. Alostricas. Su actividad cataltica es regulada

por unin no covalente de un metabolito

especfico, en un sitio de la protena diferente al

centro activo.

2. NO Alostricas. Se unen covalentemente y seinterconvierten en forma activa e inactiva, por

accin de otras enzimas:


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1.- Control a nivel de sustrato

Mediante interaccin de los sustratos y productos decada reaccin con la enzima

hexoquinasa

Glucosa + ATP -------> Glucosa-6-fosfato + ADP

El propio producto de la reaccin puede

inhibircompetitivamentea la enzima

_

C (N ti )


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2.- Control por retroalimentacin (Negativa)Un aumento de concentracin del producto final de una ruta

metablica inhibe una de las primeras reacciones de la ruta

(generalmente la primera)

A ---> B ---> C ---> D ---> E

E acta como inhibidor del primer enzima.

Ello impide:

La utilizacin innecesaria del primer sustratoLa acumulacin del producto final

Se evita la acumulacin de intermedios

(al ser la mayora R. Reversibles)

_


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RUTAS METABLICAS CONTROLADAS POR RETROALIMENTACIN

Glicolisis Fosfofructokinasa ATP

Neoglucognesis FBP fosfatasa AMP

Bios. cs. Grasos AcetilCoA carboxilasa AcilCoA

Bios. Colesterol HMGCoA reductasa Colesterol

Bios. Purinas PRPP sintetasa AMP,GMP,IMP

RUTA ENZIMA INHIBIDOR

E i l i Presentan una cintica


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Enzimas alostericassigmoidal, indicativa deefectos cooperativos en la

unin del sustrato.

Su actividad est reguladapor otras molculas

efectoras.

Pueden mantener las

concentraciones de sus

sustratos en valores

bastante constantes:

Existe una concentracin

crtica de sustrato ([S]c) por

debajo de la cul la enzima

es prcticamente inactiva

Ejemplos de cintica


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Ejemplos de cintica.

1. En una reaccin enzimtica que transcurre con una

concentracin de enzimas de 0,015g/l, se obtienen los siguientesdatos:

[S] (g/l) 20 15 10 6.5 5.0 4.0 3.3 2.5

v(g/l-min)1.14 1.01 0.87 0.7 0.59 0.5 0.44 0.35

Deduzca el modelo que representa la cintica del proceso.


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Representando grficamente se tiene:

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 5 10 15 20 25


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Deduccin de los, coeficientes de la ecuacin .

S v (g/l-min) 1/S 1/v

20 1.14 0.05 0.877

15 1.01 0.066 0.990

10 0.87 0.10 1.149

6.5 0.70 0.15 1.428

5.0 0.59 0.20 1.695

4.0 0.50 0.25 2.000

3.3 0.44 0.30 2.273

2.5 0.35 0.40 2.857

G fi Li b B k


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Grafica Linewaber-Burk

y = 5.3879x + 0.6147

R = 0.9914

0.0000

0.5000

1.0000

1.5000

2.0000

2.5000

3.0000

0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 0.450

1/v

S Li b B k


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Segn Linewaber-Burk

Interaccin.= 1/vmax=0.614

vmax = 1.628 g/l-min.

Pendiente: Km/vmax. = 5.387

Km = 8.776 g/l

El modelo ser.

V = Vmax.S/(Km+S)

V = 1.628S/(8.776+S)

Comprobar por Eadie-Hostfee

Liberalizacin de Eadie-Hostfee


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Liberalizacin de Eadie-Hostfee

V = Vmax Km.V/S

y = -0.1148x + 0.1861R = 0.9758

0.000

0.020

0.040

0.060

0.080

0.100

0.120

0.140

0.160

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

v/S

INMOVILIZACION DE ENZIMAS


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INMOVILIZACION DE ENZIMAS

Se entiende por enzimainmovilizada (EI) aquellaasociada a una matriz noesencial para su actividad.

El biocatalizador se confina a una

regin determinada a travs de

la cual se pasa la solucin delsubstrato, que sale como un

producto, libre de catalizador.

Heterogneo: uso continuado

Operacincontinua

Reutilizacin

Mtodos de Inmovilizacin


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Retencinfsica Inmovilizacinqumica

Adsorcin EntrecruzamientoUnin covalenteAtrapamientooinclusin

Mtodos de Inmovilizacin

d l


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Agarosa

Celulosa

Quitina

Dextrano

cidos naturales

Almidn

Soportes de inmovilizacin


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I ili i d i


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Inmovilizacin de enzimas


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Enzimas: Aplicaciones

Fabricacin del Queso


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Fabricacin del Queso

La operacin mas importante es la coagulacin de la caseinaPara ello utilizamos una serie de enzimas que podemos

encontrar en vegetales o animales

La pepsina y la quimosina son las enzimas mas importantes. Se

encuentran en varios animales, entre ellos los rumiantes.Otras enzimas como papaina.

Estos producen cogulos elsticos

La utilizacin de unas u otras enzimas repercute activamente en

el sabor y en la naturaleza del queso

Industrias Lcteas


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Industrias Lcteas

La lactasa es el enzima que

consigue romper la lactosa,

que es el azcar que

contiene la leche Mucha gente es intolerante

a la lactosa

Existen en el mercado

leches que vienen conlactasa

Industria Panadera


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Industria Panadera

La mas comnmente utilizada es la lipoxidasa, queconjuntamente con el blanqueante, le da a la masa un carcter

mas manejable

Esta contenida en la harina de soja y de otras leguminosas.

Para aumentar la accin de la levadura se aade amilasa, en

forma de harina de malta

Se usan para ello tambin algunos mohos que contienen la

enzima

La harina de malta, tiene un inconveniente, y es que cambia el

color del pan

Industria Cervecera


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Industria Cervecera

El proceso fundamental es la rotura del almidn

Los azucares simples formados son fermentados por

las levaduras

Esto se lleva a cabo con las amilasas, provenientes dela malta.

A veces se aaden otros almidones como de arroz o

patata para aprovechar al mximo la actividad de las

enzimas

Fabricacin de Zumos


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Fabricacin de Zumos

Las peptinas provocan que los zumos sean demasiadoviscosos y turbios.

Esto se elimina con enzimas, contenidos en el propio zumo oque se pueden aadir

En el proceso, como subproducto tenemos metanol, queaparece en muy baja concentracin


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Tipos de pectinasas


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Detergentes

Estos llevan enzimas que ayudan a limpiar

Las proteasas facilitan la eliminacin demanchas de origen proteico

Las lipasas eliminan las manchas de grasa y

otros compuestos orgnicos

Estos detergentes que llevan enzimas se

denominan detergentes biolgicos

Medicina y Farmacia


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Medicina y Farmacia

El uso de enzimas en el sector mdico y farmacutico es

potencialmente inmensa, pero su utilizacin es mnima

Se usan slo si se tiene una seguridad absoluta de su eficacia.

Alrededor de 150 enfermedades metablicas se han atribuido

a defectos enzimticos.

En teora, y una vez conocido el defecto, debera ser posible

administrar la enzima ausente al paciente y aliviar o eliminar

los sntomas de la alteracin.

Los intentos para tratar las enfermedades metablicas

hereditarias mediante la administracin de enzimas tienenxito parcial. El principal problema es que la enzima

incorporada al organismo tiende a acumularse en el hgado y

el bazo.
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