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Corrientes iónicas en células ciliadas de órganos

otolíticos y canales semicirculares del axolotl(Seminario de Investigación y Tesis - IV)

Angélica Almanza GutiérrezMaestría en Ciencias Fisiológicas

Instituto de Fisiología

BUAP

Tutores: Enrique Soto y Rosario Vega

Julio del 2001

Corrientes iónicas en células ciliadas

1

Resumen

Las células sensoriales de los sistemas auditivo y vestibular, así como de la línea lateral sontransductores mecanoeléctricos que transforman una deflexión mecánica del haz de cilios de lacélula en un flujo de corriente a través de su superficie apical, generando un potencialreceptor.

La respuesta de las células ciliadas a los estímulos mecánicos es resultado de suspropiedades eléctricas pasivas y de la interacción de la corriente de transducción con loscanales iónicos localizados en la superficie basolateral. El mecanismo de transducción pareceser similar en las células ciliadas de diferentes órganos vestibulares; sin embargo, elprocesamiento postransduccional del estímulo mecánico parece ser diferente en las célulasciliadas de los receptores (canales semicirculares, sáculo, lagena, utrículo, papilaamphibiorum, papila basilar) que conforman el vestíbulo y también entre células ciliadas de unmismo receptor.

Mediante la técnica de fijación de voltaje, registramos la corriente total en células ciliadasaisladas de los canales semicirculares, el sáculo y el utrículo del axolotl. En los tres órganos, lacorriente total fue predominantemente una corriente de salida con una inactivación parcial. Lacinética de la corriente total en las células de los canales semicirculares fue 4.5 veces másrápida que la corriente en el sáculo y en el utrículo.

Utlizando procedimientos electrofisiológicos y farmacológicos en las células de los canalessemicirculares y en las del utrículo, encontramos tres corrientes iónicas salientes de potasio:una corriente sostenida (IK,s), una corriente transitoria (IK,t) y una corriente dependiente deCa2+ (IK,Ca).

En los canales semicirculares la IK,s aportó un 45% de la corriente total, mientras que en elutrículo, esta corriente aportó el 4.5% de la corriente total. La contribución de la IK,Ca fuemayor en el utrículo, en donde aportó un 65.1% comparado con un 40% en los canalessemicirculares. La IK,t contribuyó con un 65.1% de la corriente total en el utrículo, mientrasque en los canales semicirculares representó un 15%.

En congruencia con los datos obtenidos del registro de la corriente total, las corrientesiónicas registradas en las células aisladas del utrículo fueron más lentas que las registradas enlas células de los canales semicirculares.

En el 100% de las células registradas del sáculo y del utrículo, y en el 60% de las de loscanales semicirculares, encontramos una corriente de K+ rectificante de entrada (IIR). En lascélulas del sáculo, IIR tuvo una magnitud significativamente mayor que en las células de losotros dos órganos.

Nuestros resultados sugieren que, en el aparato vestibular del axolotl, la expresión de lascorrientes iónicas así como sus cinéticas están relacionadas con el órgano del cual provienenlas células. Esto indica que las propiedades intrínsecas de las células ciliadas contribuyen alprocesamiento de la entrada sensorial en el aparato vestibular del axolotl.

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IntroducciónLos órganos vestibulares se comportan de manera análoga a un sistema de control inercial, ya

que responden a aceleraciones angulares y lineales de la cabeza; las aceleraciones lineales

pueden ser el resultado del movimiento translacional de la cabeza o de un cambio en la

orientación de la misma con respecto a la normal; mientras que, las aceleraciones angulares

resultan de movimientos rotatorios de la cabeza (Young, 1984).

El control del movimiento corporal comprende la integración de la información vestibular

con la aportada por otros órganos de los sentidos (entradas visuales y somatosensoriales) para

producir respuestas motoras coordinadas. Dicha integración sucede al nivel de núcleos

vestibulares, cerebelo, núcleos motores y corteza, generándose un esquema sobre la postura y

el movimiento (Correia y Guedry, 1978; Goldberg y Fernández, 1984; Soto, Budelli y

Holmgren, 1998; Guth y cols., 1998).

Las estructuras sensoriales del sistema vestibular son colectivamente conocidas como

aparato vestibular. En el hombre, este aparato tiene tres funciones: 1) es el órgano primario del

equilibrio, jugando un papel dominante en la sensación subjetiva del movimiento y la

orientación espacial, 2) las entradas vestibulares al sistema de control postural generan el

ajuste de la actividad muscular y la posición corporal para mantener el equilibrio, y 3) las

influencias vestibulares sobre los movimientos de los ojos tienden a estabilizar a estos últimos

en el espacio durante los movimientos de la cabeza (Correia y Guedry, 1978; Young, 1984).

El laberinto membranoso

El sistema vestibular es filogenéticamente muy antiguo; se ha encontrado en todos los

vertebrados existentes y en restos fósiles de vertebrados. Es sorprendentemente constante en

anatomía y función a través del reino animal, lo cual indica su importancia y su papel central

en el control sensorial del comportamiento (Goldberg y Fernández, 1984; Guth y cols., 1998);

existe consenso acerca de que el oído interno de los vertebrados representa el resultado

evolutivo de una migración hacia el interior y de una especialización de los elementos del

sistema de la línea lateral (Baird, 1974).

Embriológicamente, el laberinto vestibular se origina por una invaginación del ectodermo

dando origen a una vesícula, el otocisto, el cual sufre una complicada reorganización para


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formar las diversas partes del laberinto (Aidley, 1998; Wersäll y Bagger-Sjöbäck, 1974;

Morsli y cols., 1998).

El sistema vestibular (que constituye la porción no auditiva del oído interno), es un sistema

bilateral de sacos membranosos, llamados órganos otolíticos y canales semicirculares. Estos

órganos están llenos de fluido y están contenidos en una cápsula de cartílago o hueso ubicada

en el espesor del hueso temporal y denominada laberinto óseo, (Lowenstein, 1974; Anniko,

1988; Wersäll y Bagger-Sjöbäck, 1974).

El espacio entre el laberinto membranoso y el óseo está lleno de perilinfa, mientras que en

el interior de los sacos y canales encontramos un fluido llamado endolinfa. Estos fluidos

CA

U

S

PB

L

CP

Figura 1. Aparato vestibular de una salamandra (estado adulto del axolotl). La ubicación delvestíbulo está indicada con un círculo. El vestíbulo se muestra desde su parte medial y se observa lainervación del canal anterior (CA), utrículo (U), sáculo (S), papila basilar (PB), lagena (L), papilaamphibiorum (PA) y canal posterior (PC). Desde esta vista, el canal horizontal se localiza detrás delutrículo. El ducto endolinfático (E) se extiende del sáculo hacia adentro de la cavidad craneal(Tomado de Fritzsch, 1996).

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ba

be

protegen a las delicadas estructuras de choques mecánicos y contribuyen al proceso de

acoplamiento mecánico y de transducción (Young, 1984).

En el axolotl, el laberinto membranoso se divide en dos partes: una superior, que

comprende a los tres canales semicirculares y al utrículo, y una inferior, formada por el sáculo,

la lagena, la papila basilar y la papila amphibiorum (Izquierdo, 1929; Cruz, 1994; García,

1994) (Figura 1). Según la anatomía comparada, las papilas basilar y amphibiorum están

destinadas a la función auditiva y las demás a la del equilibrio (Izquierdo, 1929).

Tanto las máculas como las crestas ampulares son regiones especiales del laberinto

vestibular formadas por células ciliadas; éstas son células especializadas en la

mecanorrecepción y constituyen el elemento funcional básico del sentido del equilibrio

(Anniko, 1988).

Las células ciliadas

Las células ciliadas varían en su tamaño (10-50 µm) y en su forma; han sido clasificadas de

acuerdo con la morfología de los cilios y el patrón de inervación (Wersäll y Bagger-Sjöbäck,

1974; Goldberg y Fernandez, 1984; Guth y cols., 1998). La primera clasificación de células

ciliadas en el epitelio sensorial de amniotes las agrupa en dos tipos: células ciliadas tipo I y

tipo II (Wersäll y Bagger-Sjöbäck, 1974). Las células tipo I tienen forma de ánfora y se

encuentran rodeadas por un cáliz formado por la terminal de una fibra nerviosa aferente; las

terminales nerviosas eferentes generalmente hacen sinapsis con el cáliz aferente (Figura 2).

Las células ciliadas tipo II son de forma cilíndrica y reciben terminales nerviosas aferentes y

Figura 2. Células ciliadas tipo I y II. Puede observarse que las

células ciliadas tipo I tienen forma de ánfora y están rodeadas

completamente por el cáliz de una terminal aferente. Las células

ciliadas tipo II son más cilíndricas y reciben terminales aferentes (ba)

y eferentes (be) en botón. Ambos tipos de terminales aferentes

presentan un cuerpo sináptico cuya función se desconoce (Tomado de

Eatock y Rush, 1997).


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eferentes en forma de botón; estas células son consideradas filogenéticamente más antiguas

que las células ciliadas tipo I (Anniko, 1988; Goldberg y Fernández, 1984). El haz de cilios

está formado por varios estereocilios y un kinocilio. El kinocilio, es un cilio verdadero;

mientras que los demás, llamados estereocilios, son microvellosidades. Los cilios emergen de

la superficie apical de las células ciliadas (Figura 3); su número es variable, pero grupos de

más de 50 estereocilios son comunes (Lowenstein, 1974; Wersäll y Bagger-Sjöbäck, 1974).

Los estereocilios tienen diferentes longitudes, están dispuestos muy regularmente de forma

hexagonal. Cada estereocilio está rodeado por otros seis equidistantes; la longitud de los

estereocilios disminuye al alejarse del kinocilio. Este arreglo da origen a la polarización

funcional de las células ciliadas en el neuroepitelio de las máculas y crestas, en donde la

localización del kinocilio coincide con la dirección de excitación de la célula ciliada (Anniko,

1988; Correia y Guedry, 1978; Hudspeth, 1983; Wersäll y Bagger-Sjöbäck, 1974).

Transducción mecanoeléctrica

Una de las posibles claves para entender la transducción en las células ciliadas radica en

entender la relación entre las asimetrías anatómicas y funcionales del haz de cilios (Pickles y

cols., 1984). Los estereocilios contienen un centro de filamentos de actina, lo que les confiere

una estructura rígida; así, cuando sufren una deflexión, la inclinación de los estereocilios

sucede a nivel de su base ( Flock y cols., 1977; Hackney y Furness, 1995). Los estereocilios

Figura 3. Fotografía con microscopía electrónicadel haz de cilios de una célula del oído interno de larana toro. El haz está formado poraproximadamente 50 estereocilios y un cilioverdadero: el kinocilio. En estado de reposo, el hazde cilios tiene la forma de un cono vertical. Lascélulas de soporte que rodean a la célula ciliadapresentan múltiples microvellosidades que seextienden desde su superficie apical (Tomado deHudspeth, 1983).

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están unidos en su ápice a través de lo que se denomina uniones de punta (tip links; Figura 4).

Estas uniones de punta se han encontrado en las células ciliadas de todas las clases

representativas de vertebrados, por lo tanto es muy probable que estén presentes en la mayoría

de las células ciliadas mecanorreceptoras en el sistema acústicolateral. Estas uniones

especializadas emergen de las puntas de los estereocilios y unen la punta del estereocilio corto

hacia el vecino más largo en la próxima fila (Pickles y cols., 1984; Pickles y cols., 1989;

Dunnebier y cols., 1995). Un análisis detallado empleando microscopía electrónica con

enfriamiento rápido reveló que la unión de punta se divide en dos ramas en su inserción con la

membrana del estereocilio más largo y en tres ramas en su inserción con el estereocilio más

corto. Si se considera que existe un canal transductor por cada rama, entonces puede haber

más de seis canales por cada unión de punta (Kachar y cols., 2000); sin embargo, existen

reportes previos que, con base en el análisis de la conductancia unitaria, han concluido que la

relación canales-cilios es 1:1 (Ohmori, 1985).

Mecanismo electrofisiológico de la transducción y potencial receptor

La superficie apical de la célula ciliada está en contacto con la endolinfa cuya composición es

alta en iones potasio y baja en iones sodio (similar a la del interior de la célula). La superficie

TL

LL

A B

Figura 4. Fotografía electrónica de las uniones de punta y laterales en las células ciliadas de la papila basilar

de pollo. (A) Se muestra el arreglo característico de las uniones de punta (tip links) entre los estereocilios

(flechas). La unión de punta une los canales iónicos mecanotransductores de la región apical con los que se

localizan en la pared lateral del siguiente cilio. (B) Estereocilio en el que se aprecia la unión de punta (TL), y

las uniones laterales entre los estereocilios (LL) (Tomado de Pickles y cols., 1984; Pickles y cols., 1989).


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basal de la célula está en contacto con la perilinfa, similar al líquido extracelular: alta en iones

sodio y baja en iones potasio (Tabla I) (Lowenstein, 1974; Ferrary y cols., 1992; Sauer y cols.,

1999).

Tabla I. Composición iónica de la endo y la perilinfa en diferentes especies animales (valores

expresados en milimoles).

Humano1 Paloma2 Cobayo1 Rana3

Perilinfa Endolinfa Perilinfa Endolinfa Perilinfa Endolinfa Perilinfa Endolinfa

Potasio 7-8 140-160 4.2 140.6 4.8-5 142-144 1.7 121

Sodio 135-150 13-16 150 ---- 148-150 15-26 120 5.4

Cloruro 135 120-130 116.6 142.2 120-121 107-110 102 941 Lowenstein, 1974. 2 Sauer y cols., 1999. 3 Ferrary y cols., 1992.

El potencial de membrana de la célula recibe influencias tanto de la permeabilidad del área

basal como del área apical; en reposo, existe una permeabilidad debida a que algunos canales

iónicos están abiertos (los canales de transducción tienen baja probabilidad de apertura); en

este estado, la permeabilidad basal es mayor que la apical generándose el potencial de

membrana en reposo (Hudspeth, 1983). Debido a que la membrana basal es permeable

principalmente a iones K+, el potencial de membrana entre el medio intracelular y la perilinfa,

tiende a ser cercano al potencial de equilibrio de éste ión (Fig. 5). Hudspeth y Corey (1977)

estimulando directamente por medio de deflecciones mecánicas al haz de cilios, registraron

intracelularmente los cambios que acompañan al movimiento del haz de cilios y encontraron

que el componente despolarizante del potencial receptor corresponde al estímulo dirigido

hacia el kinocilio y es debido a la apertura de canales adicionales en el área apical, a través de

los cuales fluyen iones positivos hacia el interior celular generando la corriente de

transducción y despolarizando a la célula; a esta despolarización se le conoce como potencial

receptor (Hudspeth y Corey, 1977; Hudspeth, 1983). El componente hiperpolarizante del

potencial receptor corresponde al estímulo en la dirección opuesta al kinocilio, lo que genera

que los pocos canales que estaban abiertos en el área apical en el estado de reposo se cierren

(Hudspeth, 1983; Pickles y Corey, 1992). Registros de corrientes de transducción (Fig. 6)

muestran que la relación corriente-desplazamiento de los cilios es saturable, no lineal y

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ampliamente asimétrica (Hudspeth y Corey, 1977; Hudspeth, 1983; Holt y cols., 1997; Thurm,

1983).

De acuerdo con lo anterior, la deflexión del haz de cilios causa la apertura o cierre de

canales iónicos transductores en los estereocilios, modulando el flujo de corriente hacia el

interior de la célula (Hudspeth y Corey, 1977). Experimentos de fijación de voltaje han

demostrado que la corriente de transducción es acarreada principalmente por iones K+ pero,

además, los canales de transducción son altamente permeables al Ca2+, y este último

contribuye también a la corriente de transducción (Ohmori, 1985, 1989). Hallazgos realizados

utilizando colorantes sensibles al Ca2+ (calcium-green, Fluo 3) en la pipeta de registro indican

que estos canales están localizados en ambos extremos de las uniones de punta de los

estereocilios adyacentes y que la concentración de Ca2+ aumenta rápidamente en las puntas de

los estereocilios cuando los canales se abren (Denk y cols., 1995; Lumpkin y Hudspeth, 1995;

para revisión ver Jaramillo, 1995).

Figura 5. Esquema del neuroepitelio vestibular que muestra la composición de la endo y la perilinfa. Elepitelio mantiene el gradiente iónico gracias a las uniones estrechas entre las células que lo forman. In situ, lacorriente de transducción es acarreada principalmente por iones K+ que producen una corriente entrantedespolarizando a la célula (potencial receptor). En cambio, en una célula aislada, la corriente de transducciónes acarreada por iones Na+ y Ca2+.


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El proceso de transducción es un evento rápido, la latencia entre el desplazamiento del haz

y la apertura de canales es de alrededor de 10 µs; esta latencia corta descarta que la apertura de

canales sea a través de la activación de una cascada de segundos mensajeros y favorece el

modelo que propone que los canales de transducción son abiertos directamente por

componentes elásticos denominados "resortes de disparo" (Corey y Hudspeth, 1983b). El

descubrimiento de las uniones de punta (Pickles y cols., 1984) sugirió que éstas podían ser los

elementos elásticos; sin embargo, estudios de microscopía electrónica de alta resolución

indican que la estructura de dichas uniones es altamente rígida y, por tanto, carece de

elasticidad, por lo que se propone la existencia de otro elemento elástico ubicado dentro del

cilio y conectado en serie con la unión de punta. Esta conexión es la que transmitiría la fuerza

hacía el canal generando su apertura (Kachar y cols., 2000).

Adaptación en las células ciliadas

Ante una deflexión sostenida del haz de cilios, los canales de mecanotransducción se cierran y

la respuesta sensorial disminuye. A este decaimiento de la corriente de transducción se le

denomina adaptación sensorial; este fenómeno fue observado por primera vez en las células

ciliadas del sáculo de la rana (Eatock y cols., 1987) y, posteriormente, en las células del

utrículo del ratón (Holt y cols., 1997) y de la cóclea de la tortuga (Crawford y cols., 1989;

BA

Desplazamiento del haz (µµµµm)

Cor

rien

te (p

A)

I

Figura 6. Corriente de transducción en las células ciliadas. (A) Gráfica de la corriente de transducción contrael desplazamiento de la punta del haz de cilios. Se observa que la relación corriente-desplazamiento esmarcadamente asimétrica: la respuesta positiva que se genera con el desplazamiento hacia el kinociliomuestra una aproximación gradual hacia un nivel y alcanza una magnitud absoluta mayor que la respuestanegativa que se genera con el desplazamiento hacia el lado contrario del kinocilio. (B) Esquema que muestrael arreglo experimental para desplazar el haz de cilios. La corriente de transducción mecanoeléctrica seregistra con un electrodo de fijación de voltaje (Tomado de Ohmori, 1985).

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Fettiplace y cols., 1992). Los hallazgos experimentales en estas especies indican que la

adaptación está asociada a un corrimiento de la relación corriente-desplazamiento a lo largo

del eje del desplazamiento en dirección del estímulo aplicado (despolarizante o

hiperpolarizante), con lo que la probabilidad de apertura de los canales mecanotransductores

regresa a su valor en reposo (Corey y Hudspeth, 1983a; Eatock y cols., 1987; Holt y cols.,

1997). Funcionalmente, se propone que ante un estímulo lento o prolongado, el proceso de

adaptación estaría restaurando la sensibilidad de la célula ante un nuevo estímulo mediante un

cambio en el rango de operación del haz, para así registrar su nueva posición (para una

revisión ver Lenzi y Roberts, 1994; Eatock, 2000).

Se han propuesto dos modelos para explicar la adaptación: el modelo del motor activo (para

revisión ver Holt y Corey, 2000) y el modelo de cierre dependiente de Ca2+ (Crawford y cols.,

1989; Crawford y cols., 1991). El primer modelo considera que la tensión de las uniones de

punta es controlada por un motor de miosina conectado en serie con el canal de transducción y

con el elemento elástico. Con base en este modelo, el mecanismo es como sigue: ante una

deflexión positiva del haz, la tensión en las uniones de punta se incrementa y los canales se

abren; en consecuencia, las moléculas de miosina se deslizan hacia abajo sobre los filamentos

de actina del citoesqueleto, la tensión de las uniones de punta disminuye, los canales

comienzan a cerrarse y el haz se relaja en su nueva posición. En respuesta a una deflexión

negativa, la tensión en las uniones de punta disminuye y los canales se cierran; en este caso, el

motor de miosina sube por el estereocilio, restaura la tensión de las uniones de punta y jala al

haz en la dirección negativa (para revisión ver Hudspeth y Gillispie, 1994; Jaramillo, 1995;

Gillispie y Corey, 1997; Eatock, 2000; Holt y Corey, 2000). El modelo de cierre dependiente

de Ca2+ considera que la adaptación depende de la concentración de Ca2+ dentro de las puntas

del estereocilio; la unión directa del Ca2+ en sitios ubicados en el canal de manera intracelular

induce un rearreglo molecular que favorece el cierre de los canales (para una revisión ver Holt

y Corey, 2000; Eatock, 2000; Choe y cols., 1998; Lenzi y Roberts, 1994).

Electrofisiología de las células ciliadas

El potencial receptor en las células ciliadas depende de la interacción entre la corriente de

transducción y las propiedades activas de las células ciliadas que se originan en los canales


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iónicos presentes en su membrana basolateral y, pasivamente, por la capacitancia y la

resistencia de la membrana (Hudspeth y Lewis, 1988a; Hudspeth, 1986; Rennie y cols., 1996).

Las canales de K+ de salida son los más abundantes en la región basolateral. Se activan en

respuesta a potenciales receptores despolarizantes. El eflujo de iones potasio a través de estos

canales se opone a la corriente de transducción repolarizando a la célula. Los canales de K+ de

salida pueden pertenecer a una de las siguientes familias: dependientes de Ca2+, rectificadores

retardados y de tipo transitorio (Eatock y Rüsh, 1997).

También se encuentran los canales de calcio activados por voltaje en las células ciliadas; al

igual que en otras células (por ejemplo, en neuronas del sistema nervioso central), la entrada

de Ca2+ a través de estos canales tiene varias funciones, entre ellas, activar la exocitosis y la

endocitosis de las vesículas que contienen al transmisor, y promover la apertura de canales de

K+ dependientes de Ca2+. (Parsons y cols., 1994; Issa y Hudspeth, 1996; Cousin y Robinson,

1998; Beutner y cols., 2001).

Otro tipo de canales comúnmente presentes en las células ciliadas son los rectificantes de

entrada; estos canales se abren en respuesta a hiperpolarizaciones (por ejemplo, una deflexión

negativa del haz de cilios), su rango de activación depende de la concentración de K+

extracelular y la relación corriente-voltaje para la corriente que fluye a través de estos canales

muestra una rectificación alrededor de su potencial de inversión. El flujo iónico a través de

estos canales puede contribuir a la conductancia en reposo y consecuentemente influir en el

valor del potencial de membrana (Holt y Eatock, 1995; Eatock y Rüsh, 1997).

La electrofisiología de las células ciliadas aisladas ha sido estudiada en la rana (Hudspeth y

Lewis, 1988a,b; Holt y Eatock, 1995), la paloma (Correia y Lang, 1990), el cobayo (Rennie y

Ashmore, 1991), la rata (Eatock y Hutzler, 1992), el ratón (Rüsh e Eatock, 1996a,b), el axolotl

(Vega, 2001) y el pollo (Masetto y cols., 1998) (Tabla II). Además, Oghalai y cols. (1998),

encontraron que las conductancias dependientes del voltaje expresadas en las células ciliadas

aisladas del vestíbulo de humano son similares a las descritas en otros mamíferos, resultados

que sugieren que la electrofisiología de las células ciliadas aisladas está esencialmente

conservada en los vertebrados.

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Tabla II. Electrofisiología de las células ciliadas del aparato vestibular

Corriente Tipo de

célula

Órgano Animal

IK,L I CSC

Utrículo.

Paloma1,5, jerbillo2

Ratón3, rata4

IK,DR I, II

Utrículo

CSC

Sáculo

Ratón3,6

Pollo7, rana8, paloma1,9, cobayo10, axolotl11

Pez dorado12

IK,1 I, II

Sáculo

P. Amph.

CSC

Rana13, pez dorado12

Rana14

Pollo7, rana8,15,16

IK,h I, II

Sáculo

P. Amph.

CSC

Rana13, pez dorado12

Rana14

Pollo7

IK,A I, II CSC

P. Amph.

Rana8,17,18, paloma1,9, cobayo10, pollo7, axolotl11

Rana14

IK,Ca I, II Sáculo

CSC

Rana18,19, pez dorado12

Paloma1,9, cobayo10

ICa I, II Sáculo

P. Amph.

Rana18,19, pez dorado12

Pollo7, rana14

1Correia y Lang, 1990; 2Rennie y cols., 1996; 3Rüsh y cols., 1998; 4Eatock y Hutzler, 1992; 5Rennie y

Correia, 1994; 6Holt y cols., 1999; 7Masetto y cols., 1998; 8Masetto y cols., 1994; 9Masetto y Correia, 1997;10Rennie y Ashmore, 1991; 11 Vega, 2001; 12Sugihara y Furukawa, 1989; 13Holt y Eatock, 1995; 14Smotherman y

Narins, 1999; 15Marcotti y cols., 1999; 16Masetto y cols., 1999; 17Ricci y cols., 1994; 18Hudspeth y Lewis, 1988

a,b; 19Lewis y Hudspeth, 1983.

En términos generales, se ha encontrado que las células ciliadas tipo I de los canales

semicirculares de la paloma y del jerbillo exhiben potenciales de membrana en reposo más

negativos y conductancias de entrada mayores que las células ciliadas tipo II (Correia y Lang,

1990; Rennie y cols., 1996).

Corriente rectificadora lenta de bajo umbral IK,L. Las células ciliadas tipo I, a diferencia

de las tipo II, poseen una corriente de potasio que es activada a voltajes inusualmente


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negativos. A esta corriente Rennie y Correia (1994) la denominaron IK,I, mientras que Rüsh y

Eatock (1996a,b) la nombran IK,L (low-voltaje-activating K+ current). La IK,L se ha encontrado

en células ciliadas tipo I de órganos vestibulares en mamíferos y aves, marcando una

diferencia importante entre las células ciliadas tipo I y tipo II (Eatock y Hutzler, 1992; Correia

y Lang, 1990; Rennie y Correia, 1994; Rüsh y cols., 1998).

IK,L es una corriente saliente de K+, su potencial de inversión es cercano al potencial de

equilibrio del K+; tiene una baja permeabilidad para iones sodio, una alta sensibilidad para el

bloqueador del canal de K+ 4-aminopiridina (4-AP, 5 mM) y es sensible al Ba2+. Lo anterior

indica que el K+ es el principal ión acarreador de esta corriente. IK,L se activa a potenciales

inusualmente negativos, es sensible a fosforilación, su rango de activación es dependiente de

la temperatura, sigue una cinética lenta y sigmoidal y es modulada posiblemente vía óxido

nítrico (Eatock y Hutzler, 1992; Rüsh y Eatock, 1996; Ricci y cols., 1996; Chen y Eatock,

2000). A diferencia de muchos canales de K+, IK,L no es bloqueada por Cs+ ( Rüsh y Eatock,

1996a,b). IK,L se asemeja a la conductancia IK,n encontrada en las células ciliadas externas de la

cóclea, y se ha sugerido que el canal por el que fluye esta corriente está formado por la

subunidad KCNQ4, cuya ausencia genera sordera (para revisión ver Rogawski, 2000; Steel y

Kros, 2001).

IK,L tiene importantes consecuencias funcionales en las células ciliadas tipo I. Su gran

conductancia (21 nS/pF) lleva el potencial de membrana de la célula tipo I cerca del potencial

de equilibrio del K+, de tal manera que cambios en el voltaje de transducción tendrán mínimos

efectos sobre las conductancias dependientes del voltaje, disminuyendo la ganancia de la

célula y dando como resultado que el potencial receptor sea una función lineal de la corriente

de entrada. Si IK,L es la corriente dominante in situ, entonces las células ciliadas tipo I son

capaces de responder rápidamente a cambios repentinos en la posición de la cabeza (Rennie y

cols., 1996; Rüsh y Eatock, 1996a,b; Rennie y Correia, 1994).

Corriente rectificadora retardada IK,DR. La corriente dominante en las células ciliadas

tipo II en rata y ratón es una rectificante retardada activada por voltaje (IK,DR) (Rüsh y Eatock,

1996a,b). Esta corriente tiene una cinética sigmoidal y su rango de activación corresponde a

una corriente de K+ rectificante de salida. Una característica distintiva entre IK,L e IK,DR es su

activación en el estado de reposo: mientras que un 30% de IK,L está activada en el reposo, solo

alrededor de un 0.5% de IK,DR está activada en este estado, lo que indica que IK,DR tiene un

Angélica Almanza G

14

voltaje medio de activación desplazado a valores positivos con respecto de IK,L (Rüsh y

Eatock, 1996a,b). Con base en el potencial de inversión de la IK,DR, se observó que esta

corriente es principalmente acarreada por K+ (Eatock y Hutzler, 1992).

IK,DR es la corriente dominante en todas las células ciliadas del utrículo en el ratón hasta el

día 4 postnatal, cuando las células ciliadas tipo I empiezan a adquirir IK,L (Holt y cols., 1999;

Rüsh y cols., 1998). IK,DR es también la corriente dominante en las células ciliadas de canales

semicirculares en pollo de 10-12 días de vida embrionaria, incrementándose la variedad de

corrientes iónicas en días posteriores (Masetto y cols., 1998).

IK,DR se ha descrito también en células ciliadas de canales semicirculares de rana (Masetto y

cols., 1994), canales semicirculares de paloma (Masetto y Correia, 1997; Correia y Lang,

1990), sáculo del pez dorado (Sugihara y Furukawa, 1989), en células ciliadas de canales

semicirculares del cobayo (Rennie y Ashmore, 1991) y del axolotl (Vega, 2001).

Corrientes rectificantes de entrada IK,1 y Ih. Se han descrito dos tipos de corrientes

rectificantes de entrada en las células ciliadas del sáculo, la papila anfibiana de rana y el sáculo

del pez dorado (Holt y Eatock, 1995; Smotherman y Narins, 1999a; Sugihara y Furukawa,

1989): una de ellas se activa rápidamente y es selectiva al K+ (IK,1), mientras que la otra se

activa lentamente y es menos selectiva a K+ (Ih). Ambas corrientes se han descrito también en

células ciliadas de los canales semicirculares del pollo (Masetto y cols., 1998) y en células

ciliadas de utrículo de ratón (Rüsh y Eatock, 1996; Rüsh y cols., 1998). En canales

semicirculares y papila basilar de rana sólo se ha reportado la presencia de IK,1 (Marcotti y

cols., 1999; Masetto y cols., 1994; Masetto y cols., 1999; Smotherman y Narins, 1999b), la

cual presenta características similares a la descrita en sáculo y papila amphibiorum: su rango

de activación depende de la concentración de K+ externa, muestra selectividad al K+, su

activación es una rápida monoexponencial con un decaimiento temporal a potenciales muy

negativos y es bloqueada por Ba2+ y Cs+ (Marcotti y cols., 1999; Holt y Eatock., 1995;

Masetto y cols., 1994; Masetto y Correia., 1997 ).

La Ih en las células ciliadas es una mezcla de corriente de Na+ y K+; es relativamente lenta,

y alcanza su estado estable en cientos de milisegundos, en contraste con la IK,1 que llega a su

estado estable en pocos milisegundos. Su activación e inactivación siguen una cinética

sigmoidal lenta. La Ih es bloqueada por Cs+ externo, pero no por Ba2+ (Holt y Eatock, 1995).


15

Corriente transitoria de salida, IK,A. La IK,A es una corriente de K+ inactivante cuya

cinética de activación e inactivación es dependiente del voltaje, es sensible a bajas

concentraciones de 4-AP y se encuentra parcialmente inactivada en el potencial de reposo. IK,A

ha sido descrita en células ciliadas de canales semicirculares de rana (Masetto y cols., 1994;

Ricci y cols., 1994; Hudspeth y Lewis, 1988a,b), de paloma (Masetto y Correia, 1997; Correia

y Lang, 1990), de cobayo (Rennie y Ashmore, 1991), de pollo (Masetto y cols., 1998), de

axolotl (Vega, 2001) y en células ciliadas de la papila anfibiana de la rana (Smotherman y

Narins, 1999a).

Corriente de Ca2+, ICa. Originalmente, la corriente de Ca2+ fue descrita en las células

ciliadas del sáculo de la rana por Hudspeth y Lewis (1988a,b). En estas células, la amplitud de

la corriente es muy variable con una media de 240 pA, alcanzando la corriente máxima a –10

mV; se activa a potenciales más positivos de -60 mV, no presenta inactivación durante

despolarizaciones prolongadas y se encuentra parcialmente activada en potenciales cercanos al

potencial de reposo (Lewis y Hudspeth, 1983b). En células ciliadas cocleares del pollo y de

los canales semicirculares de la rana, la ICa es de tipo L y presenta alta sensibilidad al Cd2+

extracelular (100µM) y al Ni2+ en altas concentraciones. Es parcialmente bloqueada con

nifedipina y activada con BayK8644; presenta una rápida activación y no se inactiva, (Fuchs y

cols., 1990; Prigioni y cols., 1992; Zidanic y Fuchs, 1995). Sin embargo, en células ciliadas

saculares de rana, mediante registros de canal único, además de distinguir canales de Ca2+ de

tipo L, se detectaron canales de Ca2+ de tipo no L, los cuales son insensibles a dihidropiridinas

y presentan una activación a potenciales más negativos que los de tipo L (abajo de -50 mV),

por lo que los autores sugieren que se trata de canales de tipo N (Su y cols., 1995).

Se piensa que los canales de Ca2+ de tipo L son los que están directamente acoplados a la

liberación de neurotransmisor (Perin y cols., 2000; Zidanic y Fuchs, 1995) mientras que el

papel de los canales de Ca2+ de tipo no L no se conoce con precisión (Perin y cols., 2000).

Corriente de K+ activada por Ca2+, IK,Ca. En células ciliadas aisladas del sáculo de la rana

la corriente más prominente es la corriente de K+ de salida activada por Ca2+ (IK,Ca); esta

corriente se activa a potenciales más positivos de -60 mV, es sensible a TEA y se elimina con

condiciones que bloqueen a la ICa; la activación de esta corriente es de 10 a 100 veces más

rápida que la IK,Ca reportada en neuronas de caracol (Hudspeth y Lewis, 1988a,b; Lewis y

Hudspeth, 1983; Meech y Standen, 1975).

Angélica Almanza G

16

En anfibios y en mamíferos la IK,Ca, además de su rápida activación, presenta una

inactivación parcial a un nivel estacionario (Masetto y cols., 1994; Rennie y cols., 1996;

Armstrong y Roberts, 1998). En células ciliadas del sáculo de la rana, IK,Ca es sensible a la

iberiotoxina en un rango nM, lo cual indica que se produce a través de canales de K+ de tipo

BK (Big K) (Armstrong y Roberts, 1998). Por el contrario, en las células ciliadas de canales

semicirculares del jerbillo y de la paloma, así como en las de la papila basilar de tortuga, IK,Ca

no muestra sensibilidad para la iberiotoxina, pero es bloqueada por apamina en rango nM, lo

que sugiere que se produce a través de canales de K+ de tipo SK (Small K) (Rennie y Correia,

1994; Tucker y Fettiplace, 1996 ).

Variabilidad en la expresión de corrientes iónicas.

Las células ciliadas tienen marcadas diferencias fisiológicas, morfológicas, bioquímicas y

farmacológicas; aun dentro de un mismo órgano presentan diferentes propiedades. Las

conductancias mecanosensibles de las células parecen ser similares en muchas de sus

propiedades; sin embargo, las conductancias basolaterales expresadas por una célula pueden

ser distintas a las de las células de la vecindad. Debido a esto, es altamente probable que estas

diferencias de permeabilidad controlen la manera en la cual las células ciliadas responden

individualmente a las señales de entrada, las procesan y producen una modificación en la

salida para su ulterior procesamiento neural (Guth y cols., 1998; Eatock y Rüsh, 1997).

Las conductancias iónicas en las células ciliadas varían dependiendo de la especie animal,

el órgano y la región del órgano del oído interno del cual provienen, así como del estado de

desarrollo del animal (Masetto y cols., 1998; Marcotti y cols., 1999; Sugihara y Furukawa,

1989; Masetto y cols., 1994; Rüsh y cols., 1998).

En rebanadas de las crestas ampulares de la rana se distinguen morfológicamente tres clases

de células ciliadas: células con forma cilíndrica, ubicadas en la parte central de la cresta;

células con forma de bastón (células "club"), que prevalecen en las regiones periféricas, y

células con forma de pera, las cuales se localizan en las regiones intermedias (Masetto y cols.,

1994; Marcotti y cols., 1999). Registros electrofisiológicos en rebanadas de canales

semicirculares de rana y paloma muestran que la IK,A es el principal componente de la

corriente de salida en las células ciliadas de las regiones periféricas de la cresta, encontrándose

ausente en las células de la región central en donde IK,DR es la conductancia predominante,


17

mientras que la expresión de IK,Ca es similar en las células de ambas regiones (Masetto y cols.,

1994; Marcotti y cols., 1999; Masetto y Correia, 1997).

La expresión de las corrientes rectificantes de entrada IK,1 e Ih en las células ciliadas

saculares de la rana, se ha relacionado con la forma de la célula, siendo las de forma cilíndrica

las que expresan ambas corrientes, mientras que las de forma esférica solo presentaron Ih (Holt

y Eatock, 1995).

De manera similar, Sugihara y Furukawa, en 1989, encontraron en el sáculo del pez dorado

que las células cilíndricas expresan IK,1, a diferencia de las células ovoides. Sin embargo, en

los canales semicirculares de la rana, las células con forma “club”, ubicadas en la parte media

de la región periférica cercana al centro de la cresta, expresan IK,1, a diferencia de las células

de la misma forma pero localizadas en la periferia (Marcotti y cols., 1999).

Las propiedades eléctricas de las células ciliadas de la papila anfibiana de la rana también

varían dependiendo de la ubicación de las células en el epitelio sensorial. Todas las células,

expresan IK,Ca e ICa, mientras que IK,A se limita a las células ubicadas rostralmente, e IK,1 se

localizó solamente en las células de la región caudal (Smotherman y Narins, 1999a).

Las diferencias regionales arriba mencionadas indicarían que las células ciliadas localizadas

en áreas discretas de los epitelios sensoriales vestibulares pueden extraer diferente

información de la señal sensorial para su codificación (Steinacker y Romero, 1991).

Resonancia eléctrica

El procesamiento auditivo y vestibular comprende la transformación de estímulos complejos

en señales eléctricas y en sus componentes de frecuencia; las células ciliadas, además de ser

responsables de la mecanotransducción, también pueden jugar un papel importante en la

Figura 7. Resonancia eléctrica en una célula ciliada de la papila anfibiana de la rana. Se muestra la respuestade la célula ante pulsos despolarizantes de amplitud creciente (25, 50...125 pA). El factor de calidad (Qc)disminuye conforma aumenta la intensidad del estímulo. La frecuencia de resonancia se incrementa conformese incrementa la intensidad del estímulo. La oscilación al final del pulso permanece sin cambio (tomado deSmotherman y Narins, 1999).

Angélica Almanza G

18

selectividad de frecuencias (Fettiplace, 1987). En 1981, Crawford y Fettiplace describieron la

resonancia eléctrica en las células cocleares (papila basilar) de la tortuga; en estas células la

resonancia se manifiesta como oscilaciones de voltaje generadas por la inyección de pulsos de

corriente (Fig. 7) y se piensa que la frecuencia de esta resonancia eléctrica determina la

frecuencia auditiva característica; es decir, la frecuencia de sonido que produce la máxima

respuesta de voltaje (Crawford y Fettiplace, 1981).

La resonancia eléctrica de las células ciliadas ha sido descrita en anfibios, reptiles y peces,

principalmente en órganos relacionados con respuestas a estímulos sonoros como son el sáculo

y la papila basilar (Crawford y Fettiplace, 1981; Husdpeth y Lewis, 1988a, b; Lewis y

Husdpeth, 1983b; Sugihara y Furukawa, 1989, 1995).

En la rana, Lewis y Hudspeth (1983b, Husdpeth y Lewis, 1988a, b) encontraron que el

comportamiento oscilatorio que presentan las células ciliadas aisladas enzimáticamente del

sáculo es generado por la interacción entre la IK,Ca y la ICa. Inicialmente, cuando se inyecta un

pulso de corriente despolarizante, el capacitor de la membrana se carga y la célula se

despolariza; entonces, la ICa dependiente de voltaje se activa y el calcio intracelular aumenta;

tanto el incremento de calcio intracelular como la despolarización activan a la IK,Ca y se

produce una corriente de potasio de salida la cual hiperpolariza a la célula deactivando a la ICa

(Fettiplace, 1987; Husdpeth, 1986).

Para caracterizar la resonancia eléctrica de las células ciliadas se asume que la célula se

comporta como un circuito resonante ante un pulso de corriente; la respuesta de tal circuito es

una oscilación sinusoidal que se amortigua exponencialmente, que tiene una frecuencia f y una

constante temporal de amortiguamiento τd , con lo cual se puede calcular el factor de calidad Q

de acuerdo con la siguiente ecuación (Crawford y Fettiplace, 1981):

Q = [ ]21

2 25.0)( +fdπτ

Valores grandes para Q corresponden a oscilaciones más prolongadas e indican que la célula

se encuentra sintonizada con la frecuencia f.

Recientemente, se reportó que el tratamiento enzimático utilizado para aislar a las células

ciliadas modifica las corrientes iónicas que determinan la resonancia, por lo cual las

diferencias entre preparaciones y especies deben ser reconsideradas (Armstrong y Roberts,

1998).


19

Planteamiento del problema

En los órganos vestibulares de los amniotes han sido descritos dos tipos de células ciliadas:

tipos I y II; además de la diferencia existente entre su terminal aferente, ellas difieren en su

forma, en la geometría de su haz de cilios y en sus conductancias de K+.

En los anfibios se encuentran únicamente células ciliadas tipo II; sin embargo, aun

perteneciendo a un mismo tipo celular, éstas presentan diferencias morfológicas tanto in situ

como aisladas, y pudieran también tener diferencias entre sus conductancias iónicas

dependiendo del órgano vestibular al que pertenecen. Es por esto que es importante determinar

las propiedades electrofisiológicas de las células ciliadas en diferentes órganos vestibulares, y

con ello establecer si estas especializaciones están relacionadas con la función que cada

órgano desempeña en el oído interno.

El axolotl, representa un modelo adecuado para llevar a cabo este trabajo, ya que nos

permite estudiar un tipo de células ciliadas y definir si existen diferencias electrofisiológicas

dentro de un mismo tipo celular.

HipótesisLas células ciliadas tipo II en el axolotl, presentan diferencias tanto morfológicas como

electrofisiológicas dependiendo del órgano vestibular al que pertenecen, lo cual está

relacionado con la función que cada órgano desempeña dentro del aparato vestibular.

Objetivos1. Caracterizar mediante protocolos de estudio electrofisiológico y farmacológico las

corrientes salientes presentes en las células ciliadas del sáculo, utrículo (órganos otolíticos)

y canales semicirculares (órgano no otolítico).

2. Caracterizar mediante el estudio electrofisiológico y farmacológico las corrientes entrantes

presentes en las células ciliadas aisladas del sáculo, utrículo y canales semicirculares.

3. Caracterizar los diferentes tipos de corrientes iónicas salientes presentes en las células

ciliadas de los canales semicirculares y en el utrículo.

Angélica Almanza G

20

4. Definir las propiedades cinéticas, la sensibilidad al voltaje y la farmacología de las

corrientes iónicas presentes en las células ciliadas.

5. Caracterizar la morfología de las células ciliadas aisladas del sáculo, utrículo y canales

semicirculares.

6. Establecer de manera general la presencia de diferencias electrofisiológicas entre las

células ciliadas de los órganos estudiados en este trabajo.

7. Integrar la información de las corrientes iónicas con los datos morfológicos para producir

mapas de distribución de subtipos celulares, relacionando el tipo de corrientes iónicas con

la morfología de las células aisladas.

Material y métodosAnimal de experimentación

En este trabajo utilizamos ajolotes de las especies Ambystoma tigrinum o Ambystoma

mexicanum, sin importar el tamaño de los anfibios.

Disección

Para aislar el oído interno del axolotl, el animal se decapitó y el maxilar inferior se separó del

superior; éste último se conservó desprendiéndole el epitelio que lo cubre. El cráneo se fijó en

una cámara con base de SylgardMR y se perfundió inmediatamente con solución extracelular

normal (Tabla III) a 4°C para anfibio (Bracho y Budelli, 1978). Bajo un microscopio

estereoscópico se identificó la región del oído interno, se retiró el cartílago que recubre al

vestíbulo (cápsula ótica) hasta observar las estructuras que lo componen; se localizaron el

utrículo, el sáculo y las ámpulas de los canales semicirculares y se disecaron cada uno de ellos

por separado. Mediante un corte en el epitelio se descubrieron las máculas y las crestas

sensoriales y, en el caso de las máculas, la membrana otolítica fue removida mediante un flujo

lento de solución extracelular normal.

Disociación celular

Una vez que se disecaron las máculas otolíticas y las crestas, se efectuó la disociación

enzimática para aislar a las células ciliadas localizadas en cada una de las preparaciones (cada


21

Tabla III. Soluciones (en mM).KCl NaCl MgCl2 CsCl TEACl BaCl2 CaCl2 HEPES EGTA GTPMg ATPNa2 NMDG+ Glucosa

Extracelular

Normal5 111 1 ---- ---- ---- 1.8 5 ---- ---- ---- ---- 10

Intracelular

Normal100 10 2 ---- ---- ---- 0.134 10 2 ----

Extracelular

sin Ca2+ ni

Mg2+

5 111 ---- ---- ---- ---- ---- 5 ---- ---- ---- ---- 10

Intracelular

modificada

con Cs+ para

ICa

---- ---- ---- 49.5 27 ---- 0.1 9 9 0.09 1.8 63 ----

Extracelular

modificada

con Ba2+

para ICa

---- 63 ---- 22.5 18 4.5 0.9 9 ---- ---- ---- ---- 10

Osmolaridad ajustada a 240 mOsm.

Soluciones extracelulares ajustadas a pH 7.4 con NaOH.

Solución intracelular normal ajustada a pH 7.2 con KOH.

Solución intracelular modificada con Cs+ ajustada a pH 7.2 con CsOH .

preparación se trató individualmente). Diversos autores han reportado resultados satisfactorios

usando como enzima a la papaína (Hudspeth y Lewis, 1988a,b; Tucker y Fettiplace, 1996;

Smotherman y Narins, 1999); en nuestro laboratorio, usando la misma enzima, se obtuvo una

gran cantidad de células en buenas condiciones (Vega, 2001); sin embargo, antecedentes en

nuestro laboratorio indican que la papaína hace desaparecer la actividad aferente de las

neuronas vestibulares del axolotl, y en un estudio reciente se reportó que la actividad

proteolítica de esta enzima modifica las propiedades electrofisiológicas de las células ciliadas

de los canales semicirculares de la rana (Armstrong y Roberts, 1998), por lo cual decidimos

utilizar una enzima diferente.

Ensayos realizados en el laboratorio nos llevaron a establecer un método de disociación con

el cual obtuvimos células ciliadas aisladas en buenas condiciones a juzgar por su apariencia al

microscopio.

El procedimiento fue el siguiente:

Angélica Almanza G

22

1. El epitelio sensorial se colocó en solución extracelular normal a la cual se le agregó

colagenasa tipo IA (Sigma) 0.1 mg/ml durante 7 minutos a una temperatura de 30°C.

2. La preparación se cambió a la solución extracelular sin Ca2+ ni Mg2+ (Tabla III)

conteniendo tripsina (Sigma) 1 mg/ml durante 10 minutos a 30°C.

3. Posteriormente la preparación se colocó en solución extracelular sin Ca2+ ni Mg2+ con

albúmina bovina (Sigma) 1 mg/ml durante 10 minutos a 4°C.

4. Por último, el tejido se trasladó a la cámara de registro ubicada en el microscopio invertido

(Nikon Diaphot) en donde las células ciliadas se separaron mecánicamente con dos

disectores de vidrio con puntas finas redondeadas y se dejaron reposar durante 10 minutos

en solución extracelular normal sin flujo para que las células se adhirieran al fondo de la

cámara. Inmediatamente después se inició la perfusión con solución extracelular normal.

Morfometría de las células aisladas

Las células ciliadas se observaron por medio de un microscopio invertido (Nikon Diaphot) con

óptica de contraste de fase. La imagen de las células al microscopio se digitalizó por medio de

una cámara de video compuesto blanco y negro (NEC TI-24A CCD), acoplada al tubo lateral

del microscopio y conectada con una tarjeta digitalizadora de video (Data Translation 6800).

Las imágenes se procesaron mediante el uso del programa Global Lab Image Ver. 2.0 (Data

Translation). En estas imágenes se estudió la forma de la célula ciliada, se midieron sus

diámetros para calcular su área y, con base en ésta, calcular teóricamente su capacitancia. La

capacitancia así obtenida se comparó con la medida electrónicamente por el amplificador de

fijación de voltaje.

Registros eléctricos

Los registros de las corrientes iónicas se llevaron a cabo mediante la técnica de fijación de

voltaje en su versión de célula completa (Sakman y Neher, 1984) y se realizaron a temperatura

ambiente (20-22°C) usando un amplificador de fijación de voltaje (Axopatch 1D y 200B,

Axon Instruments). La señal de salida del amplificador se filtró con un corte de frecuencias de

2 a 5 KHz y se muestreó a 5 o 10 KHz dependiendo del protocolo en cuestión. Los registros se

digitalizaron con un conversor analógico-digital (Digidata 1200) de 12 bits utilizando un

sistema pClamp (versión 5 y 8, Axon Instruments) y se almacenaron en el disco duro de una


23

computadora PC compatible. Las pipetas para los registros de fijación de voltaje se fabricaron

con un estirador horizontal (Sutter P-80/PC) y se emplearon pipetas de vidrio de borosilicato

(WPI) de 1.2 mm de diámetro externo. Las pipetas se llenaron con solución intracelular (Tabla

III) y, en el baño, tuvieron una resistencia eléctrica de 2.5 a 4 MΩ y un diámetro de punta de

1µm aproximadamente.

El potencial de punta medido experimentalmente en varios ensayos (Neher, 1992) fue de

1.5 mV. La versión de célula completa de la técnica de fijación de voltaje se obtuvo después

de cancelar la capacitancia de la pipeta y de formar un sello >2 GΩ. En estas condiciones, la

resistencia de acceso (Ra), la resistencia de membrana (Rm), la constante de tiempo (τm) y la

capacitancia de membrana (Cm), fueron calculadas en línea por el programa pClamp 8.

Además, en las células estudiadas, dimos un pulso de -10 mV partiendo de un potencial de

sostenimiento de -70 mV (con los filtros abiertos y digitalizado a 20 KHz); este pulso fue

utilizado para calcular posteriormente la Cm, y la τm, valores con los que obtuvimos la

resistencia en serie (Rs) a través de τ = R × C. No encontramos diferencias significativas entre

los valores obtenidos en línea y los obtenidos con el pulso de voltaje.

Para medir el potencial de membrana (Vm) de las células ciliadas de los tres órganos

utilizamos el método de fijación de corriente sin inyección de corriente.

Una vez que registramos las propiedades pasivas, en todos los registros (a menos que se

especifique otra cosa), la capacitancia y el 80% de la resistencia en serie se compensaron

electrónicamente. No se aplicaron correcciones adicionales para el potencial de punta ni para

la resistencia en serie sin compensar.

La perfusión de las soluciones extracelulares fue de manera constante con un flujo de 0.5

ml por minuto usando una bomba peristáltica (LKB, Microperpex). Para la microperfusión de

los fármacos utilizamos un sistema de inyección para microdiálisis (Baby Bee, BAS). Los

fármacos usados fueron 4-aminopiridina (4-AP), tetraetilamonio (TEA) y BaCl2, todos

bloqueadores de canales de K+, así como NiCl2, bloqueador de canales de Ca2+.

Para el estudio de la IK,Ca, el CdCl2, bloqueador del canal de Ca2+, simplemente se añadió a

la solución extracelular normal.

En el estudio de la ICa, se utilizaron soluciones modificadas para bloquear a las corrientes

de K+ (Tabla III).

Angélica Almanza G

24

Análisis de datos

Los datos de fijación de voltaje fueron analizados mediante el programa Clampfit (versión 8,

Axon Instruments).

Para determinar las constantes de tiempo de activación e inactivación en las corrientes, se

ajustó una función exponencial a cada trazo de corriente usando un algoritmo de mínimos

cuadrados en el pClamp. A los datos obtenidos para las constantes de tiempo en función del

voltaje, les ajustamos funciones exponenciales. Consideramos como aceptables ajustes con un

coeficiente de correlación (r2) ≥ 0.98.

Para la activación e inactivación de estado estable, los datos fueron aproximados con

funciones de Bolztmann utilizando el programa computacional Origin 4 (Microcal). Las

funciones de Boltzmann presentadas en este trabajo son de la forma:

f(x) = 1/[1 + exp((V1/2 - Vm)/S)]

donde f(x) = I/Imax para la inactivación, y f(x) = g/gmax para la activación, V1/2 es el voltaje

medio de activación o inactivación (mV), Vm es el potencial de membrana en mV, y S es la

pendiente (constante de Boltzmann).

La amplitud de la corriente en el estado estable se midió 50 ms antes del final del pulso. La

amplitud de la corriente al pico se determinó calculando la corriente máxima para cada paso de

voltaje con el Clampfit.

Análisis estadístico. Los resultados se presentan como la media ± ES. La prueba

estadística empleada fue la t de Student; se consideraron como diferencias estadísticamente

significativas aquellas con P < 0.05, y altamente significativas aquellas en que P < 0.001.

ResultadosPara aislar las células del epitelio sensorial vestibular utilizamos enzimas que producen una

digestión parcial del tejido. Las células de los canales semicirculares se obtuvieron utilizando

papaína en concentración de 0.25 mg/ml, lo cual, nos permitió aislar células ciliadas en buenas

condiciones (superficie brillante, lisa y sin organelos visibles). Debido a que el uso de esta

enzima para aislar células ciliadas ha sido cuestionado por otros grupos de investigación,

decidimos cambiar la enzima por colagenasa en concentración de 0.1 mg/ml. Con esta enzima,

se aislaron las células ciliadas de la mácula del utrículo y el sáculo obteniendo tambien células

en buenas condiciones.


25

Resistencia en serie

Los valores de la Rs no fueron significativamente diferentes entre las células aisladas de los

diferentes órganos vestibulares. El valor medio de Rs fue de 7.6 ± 0.6 MΩ y la Rs no

compensada fue de 1.8 ± 0.4 MΩ. En las células de los tres órganos vestibulares realizamos un

análisis de correlación entre la cinética de activación e inactivación de las corrientes iónicas y

la Rs no compensada; en el sáculo, el coeficiente de correlación tuvo un valor de 0.09, en el

utrículo de 0.2 y en los canales semicirculares de 0.3. Estos resultados indican que no existe

una correlación entre la Rs no compensada y la cinética de la corriente iónica en las células

aisladas de los diferentes órganos vestibulares.

Propiedades eléctricas pasivas de las células ciliadas

Las propiedades pasivas de las células aisladas con papaína no fueron estadísticamente

diferentes de las células aisladas con colagenasa. En la tabla IV y en la figura 8 se presentan

las propiedades pasivas para las células ciliadas de los órganos vestibulares estudiados.

Tabla IV. Propiedades pasivas de las células ciliadas tipo II en el axolotlRm Cm-E Cm-T Vm n

CSC 392 ± 47 MΩ 17.2 ± 0.5 pF 12.8 ± 2.5 -51 ± 1.8 mV 57

Utrículo 325 ± 29 MΩ 11.9 ± 0.5 pF 10.8 ± 0.54 -55 ± 1.2 mV* 57

Sáculo 250 ± 41 MΩ Ψ 20 ± 2 pF** 18 ± 2 -60 ± 1.4 mV Ψ Ψ 7

Cm-E se refiere a la capacitancia de membrana medida electrónicamente.

Cm-T se refiere a la capacitancia de membrana obtenida teóricamente con base a la superficie de membrana.

Comparaciones estadísticas (t-student) fueron hechas entre las medias de los parámetros de las células aisladas

del sáculo vs. utrículo (*), sáculo vs. canales (Ψ) y utrículo vs. canales (†).

*, Ψ , † P<0.05.

**, Ψ Ψ , †† P<0.001.

Angélica Almanza G

26

Figura 8. Gráfica de los valores de capacitancia medidos eléctricamente y los calculados con base en el análisisde la morfología celular para las células de los canales semicirculares. Los datos se presentan ordenados demenor a mayor. Puede observarse que el análisis morfológico subestima los valores de capacitancia, debido a quelos cilios no son distinguibles claramente y por tanto no se toman en cuenta en este análisis, en tanto que lamedición eléctrica necesariamente incluye el aporte capacitivo de la membrana que forma el aparato ciliar. Enalgunos casos ambas capacitancias coinciden. Suponemos esto es debido a que las células perdieroncompletamente su aparato ciliar durante la discociación.

Corrientes iónicas totales

Para determinar si hay diferencias en las corrientes iónicas expresadas en células ciliadas

realizamos registros electrofisiológicos de corrientes totales en células aisladas de los canales

semicirculares (CCSC, n = 7), utrículo (CU, n = 7) y sáculo (CS, n = 7).

Denominamos corriente iónica total a la que se produjo con un protocolo de fijación de voltaje

de doble pulso. Este protocolo partió de un potencial de sostenimiento de -85 mV y se

aplicaron pulsos de prueba con duración de 800 ms entre -130 y 50 mV con incrementos de 10

mV (Vtest1), los cuales fueron seguidos por un pulso con duración de 200 ms y un valor de

voltaje constante a 20 mV (Vtest2). En Vtest1 se midió la corriente al pico y la constante

temporal de activación e inactivación de la corriente. En Vtest2 se estudió la inactivación de

estado estable.

Células (orden progresivo)

0 10 20 30 40 50

Cap

acita

ncia

pF

5

10

15

20

25

30

Eléctrica

Morfológica

(n = 50)


27

En todas las células estudiadas encontramos que las corrientes dominantes fueron las

de salida de potasio; sin embargo, se observaron diferencias cinéticas en las células aisladas de

los diferentes órganos. Por ejemplo, en las CCSC, las corrientes iónicas tuvieron una

activación media hasta 4.5 veces más rápida que en las CU y CS (Fig. 9).

Sáculo. En las CS, la corriente total registrada con el protocolo de doble pulso mostró

claramente dos componentes: uno entrante y uno saliente (Fig. 10). El componente entrante se

produce en el rango de Vm de -130 a -90 mV y tiene una rectificación entre -80 y -50 mV. Su

potencial de inversión fue de -86.2 ± 0.5 mV, valor cercano al potencial de equilibrio

Canal

Sáculo

Utrículo

5 nA

1 nA

2 nA

200 ms

Figura 9. Corrientes totales generadas conun protocolo de doble pulso. Ejemplostípicos de registros obtenidos de célulasaisladas de los canales semicirculares, delutrículo y del sáculo. Se observa que, lascinéticas de activación e inactivación delas corrientes iónicas en las células de loscanales semicirculares son más rápidasque en las células del utrículo y del sáculo.

Figura 10. Relación corriente-voltajepara valores al pico () y a los 800ms () para la corriente total en elsáculo. Los puntos representan lamedia ± E.S (n = 7).

Voltaje (mV)-140 -100 -60 -20 20 60

I/Im

ax

-0.2

0.2

0.4

1.0

Angélica Almanza G

28

calculado para el K+, por lo cual pensamos que este componente corresponde a una corriente

de K+ que fluye a través de canales del tipo rectificador anómalo. Para el componente entrante,

la corriente media al pico fue de 0.18 ± 0.02 nA a -130 mV, y la corriente media a los 800 ms

fue de 0.16 ± 0.02 nA en el mismo voltaje.

En cuanto al componente de salida, éste se activa alrededor de -50 mV alcanzando un valor

medio de la corriente al pico de 9.3 ± 1.2 nA a +50 mV y un valor medio de la corriente a los

800 ms de 5 ± 0.7 nA.

Figura 11. Características de la corriente total en las células ciliadas del sáculo (n = 7). En A y B,gráfica de la constante temporal de activación e inactivación como función del potencial de membrana;en los insertos se muestra la función exponencial utilizada para ajustar a los datos, así como los valoresde los parámetros. En C y D, curvas de activación e inactivación de estado estable para la corriente enfunción del voltaje. La curva para la activación se obtuvo ajustando dos funciones de Boltzmann a losdatos. La primera entre -130 y -50 mV (para el componente de entrada) y la segunda entre -60 y +50mV (para el componente de salida). En los insertos, se muestra el valor del voltaje medio de activación(V1/2) y la constante de Boltzmann (S) para el componente entrante (*) y para el componente saliente(†). Para la inactivación de estado estable, los datos se ajustaron con una función de Boltzmann entre-130 y +50 mV; en el inserto, valores para el V1/2 y S de la inactivación de estado estable. En todos loscasos, los símbolos representan la media ± E.S.

A

Voltaje (mV)-60 -40 -20 0 20 40 60

τ act

-T (m

s)

0

10

20

30B

Voltaje (mV)-60 -40 -20 0 20 40 60

τ inac

-T (m

s)

200

400

600

D

Voltaje (mV)-120 -80 -40 0 40

I sts

t / I s

tst-m

ax

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

C

Voltaje (mV)-120 -80 -40 0 40

G/G

max

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

f(x) = ae-bx

a = 9.8 ± 0.2b = 0.016

f(x) = yo +ae-bx + cxa = 17± 7.2b = 0.07 ± 0.01c = 0.89 ± 0.3yo = 262.2 ± 10.1

V1/2 = -55.5 ± 1.4 mVS = 6.7 ± 1.2

* V1/2 = -80 ± 1 mVS = 3.4 ± 1.4

† V1/2 = -18 ± 4 mVS = 27 ± 4


29

La constante temporal de activación (τact-T) para la corriente de salida fue calculada

ajustando una exponencial simple a la fase de subida de cada trazo de corriente. El curso

temporal de la activación en las células aisladas del sáculo mostró una dependencia

exponencial del voltaje (Fig. 11A), con valores para la τact-T entre 1.4 y 36.8 ms (entre -40 y

+50 mV), con un valor medio de 9.8 ± 2.8 ms a 0 mV.

La constante temporal para la inactivación (τinac-T) de la corriente saliente en el sáculo se

calculó ajustando a la fase de caída de la corriente una exponencial simple. En estas células, la

τinac-T también mostró una dependencia exponencial del voltaje (Fig. 11B), con valores para la

τinac-T entre 184 y 600 ms (entre -40 y +50), con un valor medio de 279 ± 35 ms a 0 mV.

La activación de la corriente en función del voltaje se ajustó mediante dos ecuaciones de

Boltzmann considerando la presencia de dos componentes en la corriente total (Fig. 11C), uno

entrante en el rango de -130 a -50 mV con un V1/2 = -80 ± 1 mV y S = 3.4 ± 1.4; y uno saliente

entre -60 y +50 mV con un V1/2 = -18.4 ± 3.7 mV y S = 26.6 ± 4.

La inactivación de estado estable para la corriente total se ajustó igualmente con una

ecuación de Boltzmann (Fig. 11D) teniendo un V1/2 = -55.5 ± 1.4 mV y S = 6.7 ± 1.2.

La corriente total en el sáculo tuvo una gmax = 68.1 ± 8.6 nS.

Utrículo. Al igual que en el sáculo, el registro de la corriente total en las CU mostró tanto

el componente entrante como el saliente (Fig. 12A). El componente entrante, al igual que en el

sáculo, se activó en el rango de Vm de -130 a -90 mV mostrando una rectificación entre -80 y

-50 mV con un potencial de inversión en -84.5 ± 0.4 mV. El valor medio de la corriente al

pico fue de -0.09 ± 0.01 nA a -130 mV y el valor medio de la corriente a los 800 ms fue -0.07

± 0.01 nA en el mismo voltaje. El componente de salida se activó alrededor de -50 mV

alcanzando un valor medio de la corriente al pico de 3.4 ± 0.8 nA a +50 mV y un valor medio

de la corriente a los 800 ms de 1.14 ± 0.17 nA en el mismo voltaje.

El curso temporal de la activación para la corriente total se relacionó de forma compleja

con el voltaje de membrana, ya que la τact-T disminuyó con la despolarización hasta potenciales

por debajo de 20 mV y a potenciales mayores se incrementó (Fig. 12B). Los valores para la

τact-T estuvieron en el rango de 0.8 a 14.5 ms (entre -40 y +50 mV) con un valor medio de 2.4 ±

0.6 ms a 0 mV.

Angélica Almanza G

30

La τinac-T para la corriente total en el utrículo se calculó ajustando a la fase de caída de la

corriente una doble exponencial. En todas las células, tanto la τinac-T1 como la τinac-T2 fueron

independientes del voltaje (datos no mostrados), presentando una gran variabilidad. Los

valores para la τinac-T1 estuvieron en el rango de 135 a 586 ms (medidos entre -40 y +50 mV)

con un valor medio de 483 ± 70 ms a 0 mV; y los valores para la τinac-T2 estuvieron en el rango

de 34.3 a 204.2 ms (medidos entre -40 y +50 mV) con un valor medio de 84.4 ± 7.8 ms a 0

mV.

Figura 12. Características de la corriente total en las células ciliadas del utrículo (n = 7). En A, relacióncorriente-voltaje para valores de la corriente al pico () y a los 800 ms (); nótese que por arriba de +50mV se observa una rectificación de la corriente. En B, gráfica de la constante temporal de activación enfunción del voltaje; en el inserto, se muestra la función exponencial utilizada para ajustar los datos, asícomo los valores de los parámetros para tal función. En C y D, curvas de activación e inactivación deestado estable para la corriente en función del voltaje. La curva para la activación de la corriente seobtuvo ajustando dos funciones de Boltzmann a los datos. La primera entre -130 y -50 mV (para elcomponente entrante) y la segunda entre -60 y +50 mV (para el componente saliente). En los insertos, semuestra el valor del V1/2 y S para el componente entrante (*) y para el componente saliente (†). Para lainactivación de estado estable los datos se ajustaron con una función de Boltzmann entre -130 y +50 mV.En el inserto, valores para el V1/2 y S de la inactivación de estado estable. En todos los casos, los símbolosrepresentan la media ± E.S.

C

Voltaje (mV)-120 -80 -40 0 40

G/G

max

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

D

Voltaje (mV)-120 -80 -40 0 40

I sts

t / Is

tst-m

ax

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

A

-140 -60 60

I/Im

ax

-0.2

0.6

1.0

Voltaje (mV)

B

Voltaje (mV)-60 -40 -20 0 20 40

τ act

-T (m

s)

2

4

6

8 f(x) = yo +ae-bx + cxa = 11 ± 11b = 0.02 ± 0.01c = 0.22 ± 0.1yo = -9.2 ± 11

*V1/2 = -78 ± 5 mV S = 8 ± 4

† V1/2 = -23 ± 2 mV S = 12.4 ± 1.5

V1/2 = -55.5 ± 1.4 mVS = 13.5 ± 2


31

La activación de la corriente en función del voltaje se ajustó mediante dos ecuaciones de

Boltzmann considerando la presencia de dos componentes en la corriente total (Fig. 12C), uno

entrante en el rango de -130 a -50 mV con un V1/2 = -78.1 ± 5 mV y S = 8 ± 4; y uno saliente

entre -60 y +50 mV con un V1/2 = -22.7 ± 1.7 mV y S = 12.4 ± 1.5.

La inactivación de estado estable para la corriente total se ajustó igualmente con una

ecuación de Boltzmann (Fig. 12D) teniendo un V1/2 = -55.5 ± 1.4 mV y S = 13.5 ± 1.7.

La corriente saliente total en el utrículo tuvo una gmax = 27.3 ± 5 nS; cabe hacer notar que

tanto el componente de corriente entrante como el saliente tuvieron una magnitud menor que

en el sáculo.

Canales semicirculares. A diferencia de las células registradas del utrículo y del sáculo, la

corriente total en las CCSC mostró un componente entrante despreciable, cuyo valor medio de

la corriente al pico y a los 800 ms fue de -20 ± 7 pA.

Con respecto al componente de salida, éste se activó alrededor de -55 mV alcanzando un

valor medio de la corriente al pico de 8.8 ± 1.8 nA a +50 mV y un valor medio de la corriente

a los 800 ms de 4.5 ± 1.5 nA en el mismo voltaje (Fig. 13A).

El curso temporal de la activación de la corriente mostró una dependencia exponencial del

voltaje haciéndose más rápida con potenciales despolarizantes (Fig. 13B). Los valores para la

τact-T estuvieron en el rango de 0.4 a 10 ms (entre -40 y +50 mV) con un valor medio de 1.9 ±

0.9 ms a 0 mV.

Al igual que en el utrículo, la τinac-T para la corriente total en los canales semicirculares se

calculó ajustando a la fase de caída de la corriente una doble exponencial. Tanto la τinac-T1

como la τinac-T2 fueron independientes del voltaje (datos no mostrados) y presentaron gran

variabilidad. Los valores para la τinac-T1 estuvieron en el rango de 71.6 a 992.5 ms (medidos

entre -40 y +50 mV) con un valor medio de 279 ± 56.3 ms a 0 mV; y los valores para la τinac-T2

estuvieron en el rango de 9.3 a 43.2 ms (medidos entre -40 y +50 mV) con un valor medio de

22.3 ± 5.8 ms a 0 mV.

Tanto la activación como la inactivación de estado estable se ajustaron con una ecuación de

Boltzmann entre -130 y +50 mV (Fig. 13C y D). La activación tuvo un V1/2 = -23.8 ± 2.3 mV

y S = 15 ± 2 y la inactivación un V1/2 = -60.4 ± 0.8 mV y S = 10.6 ± 0.7.

Angélica Almanza G

32

La corriente saliente total en los canales semicirculares fue cercana a la de las células del

sáculo, con una gmax = 64.5 ± 13 nS. En la tabla V se resumen los datos de los registros de

corriente en las células aisladas de cada órgano vestibular.

C

Voltaje (mV)-120 -80 -40 0 40

G/G

max

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

D

Voltaje (mV)-120 -80 -40 0 40

I sts

t / Is

tst-m

ax

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

B

Voltaje (mV)-60 -40 -20 0 20 40 60

τ act

-T (m

s)

0

1

2

3A

-140 -60 60-0.2

0.6

1.0

I/Im

ax

Voltaje (mV)

Fig. 13. Características de la corriente total en las células ciliadas de los canales semicirculares (n = 7).En A, relación corriente-voltaje para valores de la corriente al pico () y a los 800 ms (). En B, gráficade la constante temporal de activación en función del voltaje; en el inserto se muestra la funciónexponencial utilizada para ajustar los datos así como los valores de los parámetros de ésta función. Seobserva que la τact-T muestra una dependencia exponencial del voltaje. En C y D, curvas de activación einactivación de estado estable para la corriente total en función del voltaje. En ambos casos, los datos seajustaron con una función de Boltzmann entre -130 y +50 mV. En los insertos, se muestran los valorespara el V1/2 y S de la activación e inactivación de estado estable, respectivamente. En todos los casos, lossímbolos representan la media ± E.S.

V1/2 = -24 ± 2.3 mVS = 15 ± 2

V1/2 = -60 ± 0.8 mVS = 10.6 ± 0.7

f(x) = ae-bx

a = 2 ± 0.03b = 0.016


33

Tabla V. Resumen de los parámetros obtenidos del registro de la corriente total en células

ciliadas aisladas de cada órgano (sáculo, utrículo y canales semicirculares).

Parámetro Sáculo Utrículo Canales Semicirculares

n 7 7 7

Propiedades Activas

Componente entrante (paso de voltaje de -80 a -130 mV)

Ip, nA -0.18 ± 0.02*** -0.09 ± 0.01 -0.02 ± 0.007 Ψ Ψ Ψ

Ip/Cm, nA/pF -0.075 ± 0.01** -0.03 ± 0.004†† -0.014 ± 0.003 Ψ Ψ Ψ

Iss, nA -0.16 ± 0.02** -0.07 ± 0.01 -0.02 ± 0.007 Ψ Ψ

Iss/Cm, nA/pF -0.07 ± 0.01** -0.03 ± 0.004† -0.013 ± 0.003 Ψ Ψ

V1/2, mV -80.1 ± 1 -78.1 ± 5 --------

S 3.4 ± 1.4 8 ± 4 --------

Gmax, nS 40 ± 5 14 ± 3 --------

Gmin, nS 12 ± 1.5 7 ± 1 --------

Componente saliente (paso de voltaje de -80 a 0 mV)

Ip, nA 4.2 ± 0.7** 1.9 ± 0.3† 4.4 ± 1

Ip/Cm, nA/pF 0.19 ± 0.04 0.19 ± 0.03 0.325 ± 0.09

Iss, nA 2.1 ± 0.4** 0.9 ± 0.06 2.3 ± 0.7

Iss/Cm, nA/pF 0.096 ± 0.023 0.095 ± 0.017 0.166 ± 0.05

τa-T, ms 9.8 ± 2.8*** 2.4 ± 0.6† 1.9 ± 0.9 Ψ Ψ Ψ

τi-T1, ms 279 ± 35* 483 ± 70† 279 ± 56.3

τi-T2, ms -------- 84.4 ± 7.8††† 22.3 ± 5.8

V1/2a-T, mV -18.4 ± 3.7 -22.7 ± 2.3 -23.8 ± 2.3

Sa-T 26.6 ± 4 12.4 ± 1.5 15 ± 2

V1/2ss-T, mV -55.5 ± 1.4 -55.5 ± 1.4 -60.4 ± 0.8

Sss-T 6.7 ± 1.2 13.5 ± 1.7 10.6 ± 0.7

gmax, nS 68.1 ± 8.6** 27.3 ± 5† 64.5 ± 13

Comparaciones estadísticas (t-test) fueron hechas entre las medias del sáculo vs. utrículo (*), sáculo vs. canales

(Ψ) y utrículo vs. canales (†). *, Ψ , † P<0.05; **, Ψ Ψ , †† P<0.01; ***, Ψ Ψ Ψ , ††† P<0.001

Angélica Almanza G

34

Densidad de corriente

La amplitud de la corriente total medida al pico (Ip) y al final (Iss) del pulso de voltaje fue

significativamente diferente en las células provenientes de los diferentes órganos vestibulares;

por esta razón decidimos calcular la densidad de corriente (amplitud de la corriente entre la Cm

celular) y determinar si estas diferencias se mantenían.

De la relación densidad de corriente-voltaje (Fig. 14) podemos observar que en el rango de

-80 a 40 mV la densidad de corriente fue semejante en las células provenientes de los tres

órganos vestibulares (tabla V); sin embargo, por debajo de -80 mV, la densidad de corriente en

las células saculares fue 5 veces mayor que en las células de los canales semicirculares y 2.5

mayor que en las células del utrículo. Además, a potenciales por arriba de 40 mV, la densidad

de corriente en las células del utrículo mostró una rectificación, disminuyendo con valores de

voltaje despolarizantes.

A

Voltaje (mV)-80 -40 40

pA/p

F

400

800B


pA/p

F

200

400

**

*

Figura 14. Densidad media de la corriente total al pico (A) y a los 800 ms (B) en las células de loscanales semicirculares (), sáculo () y utrículo (). La densidad de la corriente en el sáculo essignificativamente mayor (*) a voltajes de membrana hiperpolarizantes, mientras que a voltajes por arribade 40 mV, la densidad de la corriente es significativamente menor en el utrículo.


35

970321 -canal ánfora 970730 - canal club 980219 canal cilíndrica

92211-3, utrículo ánfora A90811-1, utrículo club A90811-1, utrículo cilíndricaFigura 15. Microfotografías de células ciliadas aisladas de los canales y del utrículo representativas de las formas

que hemos denominado como anforas, club y cilíndricas.

20 µm

20 µm

Angélica Almanza G

36

Morfología celular

Las células ciliadas aisladas de los diferentes órganos vestibulares fueron clasificadas con base

en su forma. En los canales semicirculares y el utrículo, distinguimos tres tipos celulares

morfológicamente diferentes: células cilíndricas, en forma de bastón (club) y ánforas.

Mientras que en el sáculo encontramos un solo grupo celular en forma de pera. En las Figuras

15 y 16 se muestran algúnos ejemplos representativos.

A01312-3 sáculo pera A01312-1 sáculo pera

Figura 16. Microfotografías de células ciliadas aisladas del sáculo representativas de la forma que hemos

denominado como peras.

Para establecer alguna correlación entre la morfología celular y las propiedades

electrofisiológicas, consideramos la media de los siguientes parámetros obtenidos de la

corriente total: coeficiente de inactivación (Ip/Iss)1, constante temporal de activación y

constante temporal de inactivación. Debido a que en el sáculo encontramos un solo grupo

celular, este análisis se llevó a cabo solamente en el utrículo (Fig. 17) y en los canales

semicirculares (Fig. 18). Los resultados indican que en ninguno de los órganos vestibulares

1 Definimos como coeficiente de inactivación a la relación entre la corriente al pico con la corriente al final delpulso de voltaje. Es un valor numérico que nos indica que tanto se inactiva la corriente.

20 µm


37

existe una correlación significativa entre la forma celular y los parámetros electrofisiológicos

más significativos que definen a las corrientes iónicas en estas células.

Identificación de las corrientes iónicas en las células ciliadas

Para disecar las diferentes corrientes iónicas que componen a la corriente total de las células

ciliadas del axolotl, realizamos procedimientos electrofisiológicos y farmacológicos en 50

células aisladas de los canales semicirculares y en 56 células aisladas del utrículo. En la

literatura existe una amplia información sobre las diferentes corrientes iónicas expresadas en

las células del sáculo, por esta razón, decidimos considerar para este análisis solamente a las

células del utrículo y de los canales semicirculares. Las corrientes salientes de K+ que

identificamos en estas células son: una corriente no inactivante, una corriente transitoria de

salida y una corriente sensible al Ca2+. En adición, identificamos dos corrientes entrantes: una

de K+ y una de Ca2+ con al menos dos componentes (uno con inactivación y otro sostenido).

AI s

s / I

p

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8B

τ act

-T (m

s)

0

2

4

6

C

τ inac

-T (m

s)

0

50

100

150

200

250

300

Cilíndricas Club Ánforas Cilíndricas Club Ánforas

Cilíndricas Club Ánforas

Figura 17. Relación entre la morfologíacelular y las propiedades electrofisiológicasen las células del utrículo. Se identificarontres grupos celulares morfológicamentediferentes: células cilíndricas, club yánforas; en cada gráfica se muestra larelación entre los diferentes parámetroselectrofisiológicos considerados y los gruposcelulares. En A, relación coeficiente deinactivación-morfología. En B, relaciónconstante temporal de activación-morfología. En C, relación constantetemporal de inactivación-morfología.

Angélica Almanza G

38

Corriente transitoria de salida. Inicialmente, para aislar las corrientes iónicas utilizamos

el procedimiento electrofisiológico descrito por Connor y Stevens (Connor y Stevens,

1971a,b; Hille, 1984), el cual permite separar las corrientes inactivantes de las no inactivantes.

En este método, las corrientes obtenidas con un protocolo de fijación de voltaje con potencial

de sostenimiento de -30 mV, pulsos crecientes de 10 mV desde -100 hasta +40 mV y duración

de 400 ms, se restaron a las corrientes obtenidas con un protocolo de fijación de voltaje igual

pero con un potencial de sostenimiento de -85 mV. Adicionalmente, se añadió Cd2+ 0.1 mM

en el baño como un bloqueador de la corriente de Ca2+ y, consecuentemente, de las corrientes

activadas por Ca2+.

A

I ss

/ Ip

0.0

0.2

0.4

0.6


B

τ act

-T (m

s)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0


C

τ inac

1-T

(ms)

0

50

100

150

200


D

τ inac

2-T

(ms)

0

10

20

30

40


Figura 18. Relación entre la morfología celular y las propiedades electrofisiológicas en las células de loscanales semicirculares. Se identificaron tres grupos celulares morfológicamente diferentes: célulascilíndricas, club y ánforas; en cada gráfica se muestra la relación entre los diferentes parámetroselectrofisiológicos considerados y los grupos celulares. En A, relación coeficiente de inactivación-morfología. En B, relación constante temporal de activación-morfología. En C y D, relación constantetemporal de inactivación-morfología; para la inactivación, ajustamos una exponencial doble a la fase decaida de la corriente (τinac1 y τinac2).


39

En presencia de Cd2+, la corriente resultante de la sustracción fue una corriente de K+

transitoria de salida (IK,transitoria) (Fig. 19A y B).

Tanto en las CU (n = 10) como en las CCSC (n = 50), IK,transitoria se activó a potenciales

cercanos a -60 mV, alcanzando un valor medio de la corriente al pico de 7.6 ± nA a 50 mV. La

activación de la corriente se ajustó con una función de Boltzmann (entre -100 y +50 mV), con

un V1/2 = -30 ± 3.5 mV y S = 19 ± 3.5 para los canales semicirculares (Fig. 19C), y V1/2 = -6.9

± 1.5 mV y S = 19.5 ± 1.5 para el utrículo (Fig. 14D).

Para estudiar la inactivación de estado-estable de la IK,transitoria, utilizamos un protocolo de

doble pulso el cual partió de un potencial de sostenimiento de -85 mV y se aplicaron pulsos de

prueba con duración de 600 ms entre -100 y +50 mV con incrementos de 10 mV (Vtest1), los

cuales fueron seguidos por un pulso con duración de 200 ms y un valor de voltaje constante a

+20 mV (Vtest2). La corriente al pico medida durante Vtest2 nos permitió definir la inactivación

de estado estable, esta corriente fue normalizada como función de la máxima corriente y el

componente no inactivante fue sustraído como sigue:

)()()()(

22

22,

testtest

testi

testiststatransitori VminIVmaxI

VminIVII

−−

=

Los datos obtenidos para la inactivación de estado-estable (stst) fueron ajustados con una

función de Boltzmann (entre -100 y +50 mV) con un V1/2 = -71 ± 2.3 mV y S = 23 ± 1.3 para

los canales semicirculares (Fig. 19C) y V1/2 = -66.8 ± 1.5 mV y S = 12.1 ± 1.2 para el utrículo

(Fig. 19D).

Para determinar las propiedades cinéticas de la IK,transitoria, ajustamos funciones

exponenciales a la fase de subida y de caida de cada trazo de la corriente. La constante

temporal para la activación (τn) de la IK,transitoria en ambos órganos fue dependiente del voltaje,

haciéndose más rápida con los pulsos de voltaje despolarizantes. La activación de la IK,transitoria

en las células aisladas de los canales semicirculares (Fig. 19E) fue alrededor de 9 veces más

rápida que en el utrículo (Fig. 19F); por ejemplo, en los canales semicirculares a 0 mV,

τn = 1.7 ± 0.11 ms y en el utrículo a 0 mV τn = 14.2 ± 2.2 ms.

Con base en la constante temporal de inactivación (τh), al igual que se ha descrito para la

rana (Norris y cols., 1992), en las células ciliadas aisladas de los canales semicirculares

distinguimos claramente dos grupos de células. Un 80% de las células tuvo una inactivación

rápida con una τh promedio = 33.5 ± 2.8 ms, mientras que el 20% restante

Angélica Almanza G

40

Figura 19. Corriente de K+ transitoria de salida (IK,transitoria) en las células de los canales semicirculares(A,C,E,G) y del utrículo (B,D,F). En A y B, registros típicos de IK,transitoria. En C y D, gráficas de laconductancia en función del voltaje para la activación () e inactivación () de la IK,transitoria (para CCSC,n = 50 y para CU, n = 5). En E y F, gráficas para la constante temporal de activación τn,transitoria contra elvoltaje en los canales semicirculares (n = 39, E) y utrículo (n = 5, F). En G, constante temporal deinactivación τh-rápida (n = 24) y τh-lenta (n = 18) en función del voltaje para los canales semicirculares.En E, F y G, los datos se ajustaron con una función exponencial de la forma f(x) = ae-bx. En todos loscasos, los símbolos representan la media ± E.S.


41

mostró una cinética de inactivación lenta con una τh promedio = 130.9 ± 8.1 ms. En ambos

grupos, la τh tuvo una dependencia exponencial del voltaje (Fig. 19G).

La ecuación que puede modelar de manera general a la IK,transitoria es:

( )KatransitoriKr

atransitoriKatransitoriKatransitoriK EVVhVngI −⋅⋅⋅= )()( ,,,,

donde atransitoriKg , es la máxima conductancia, n es el parámetro de inactivación elevado a una

potencia r, h es el parámetro de inactivación, V es el pulso de voltaje y Ek es el potencial de

equilibrio del K+. En el utrículo del ajolote atransitoriKg , = 60 ± 1 nS y en los canales

semicirculares atransitoriKg , = 58 ± 10 nS.

Figura 20. Corriente de K+ sostenida (IK,sostenida). En A, registro típico de una célula aislada de los canalessemicirculares; después de la perfusión con Cd2+, la corriente transitoria y la sostenida se identificaronmediante la sustracción con diferentes potenciales de sostenimiento. En B, se muestra la relación I/V paralos valores al pico de la corriente control (con Cd2+), la corriente transitoria y la corriente sostenida parala célula en A. En C, se muestra la relación I/V para los valores a los 350 ms de las mismas corrientes queen B.

Ipico


Cor

rient

e (n

A)

1

2

3

4

I350 ms


Cor

rient

e (n

A)

1

2

3

4Control con Cd2+ IK,transitoriaIK,sostenida

A

B C

Cd2+ 1 mM

IK,sostenida

IK,transitoria

50 ms 1 nA

Angélica Almanza G

42

Para aislar farmacológicamente a la IK,transitoria se perfundió 4-AP 10 mM. Las corrientes se

obtuvieron con un protocolo de fijación de voltaje con un potencial de sostenimiento de

-85 mV, pulsos crecientes de 10 mV desde -100 hasta 40 mV y duración de 800 ms. Después

de perfundir 4-AP (en CU, n = 4 y en CCSC, n = 50), con la sustracción de la corriente

restante a la corriente control se aisló la corriente sensible a 4-AP, la cual mostró

características similares a la aislada de manera electrofisiológica.

La IK,transitoria representó un 15% de la corriente total en los canales semicirculares, y un

30.4% en el utrículo.

Corriente rectificadora retardada. Con el mismo método ya descrito, y con un potencial

de sostenimiento de -30 mV, se separó una corriente de activación lenta que no presentó

inactivación durante los pulsos de 400 ms (Fig. 20A). Esta corriente sostenida mostró ser

altamente sensible a TEA, fue bloqueada totalmente a una concentración de 1 mM de TEA.

En ambos órganos, esta corriente sostenida del tipo rectificador retardado, se activó

alrededor de -60 mV (Fig. 20B y C) y, en los canales semicirculares (n = 50), el curso

temporal de la activación τn estuvo en el rango de 1.03 a 0.81 ms (para pulsos de voltaje entre

-40 y +50 mV); mientras que en el utrículo (n = 10), el curso temporal de esta corriente fue

más lento, siendo el rango para la τn = 5-10 ms (para pulsos de voltaje entre -10 y +50 mV).

De acuerdo con lo anterior, en nuestras células, IK,sostenida puede ser descrita por la siguiente

ecuación: )(,,, Kr

sostenidaKsostenidaKsostenidaK EVngI −⋅⋅=

La corriente IK,sostenida fue predominante en los canales semicirculares, constituyendo un

45% de la corriente total, mientras que en el utrículo, IK,sostenida fue casi despreciable,

representando sólo un 4.5% de la corriente total.

Corriente de K+ activada por Ca2+ (IK,Ca). Para definir la presencia de la IK,Ca y estudiar

algunas de sus características se usó el Cd2+ para bloquear a la corriente de Ca2+(hay que

considerar que en nuestros experimentos bloqueamos la corriente de Ca2+, por lo que la

corriente que llamamos IK,Ca es realmente una suma de IK,Ca y ICa). La aplicación de Cd2+ 0.1

mM en el baño, modificó de manera consistente el curso temporal de las corrientes de salida

de K+ registradas en las 12 células del utrículo y en las 12 células de los canales

semicirculares. El protocolo de pulsos empleado para el estudio de esta corriente partió de un

potencial de sostenimiento de -80 mV y se aplicaron pulsos de -100 a +100 mV con

incrementos de 10 mV y una duración de 400 ms. Cuando la corriente residual (luego de la


43

aplicación de Cd2+ 0.1 mM) se sustrajo de la corriente control, encontramos una corriente de

salida que se activa rápidamente y con una inactivación parcial (Fig. 21A y 22A).

La curva corriente -voltaje calculada en la corriente aislada tiene forma de N, tal como fue

descrito originalmente por Meech y Standen (1975) para la IK,Ca en las neuronas de molusco.

Tanto en las células aisladas del utrículo como en las de los canales semicirculares, la

corriente se activa a potenciales cercanos a –40 mV y tanto el componente transitorio como el

sostenido muestran una pendiente negativa a potenciales mayores a +50 mV (Fig. 21B y 22B).

Esta forma de la curva corriente-voltaje se debe al decremento en el influjo de Ca2+ cuando el

voltaje se aproxima al potencial de equilibrio del Ca2+ (Meech y Standen, 1975).

C

Voltaje (mV)-20 0 20 40

τ n (m

s)

0.0

0.5

1.0

B

Voltaje (mV)-100 -50 50

I/Im

ax

1

A

Control

Con Cd2+

IK,Ca

50 ms

1 nA

Figura 21. La corriente de K+ activada por Ca2+ (IK,Ca) en las células de los canales semicirculares. En A,ejemplo del procedimiento de substracción para obtener la corriente sensible a Cd2+ (IK,Ca + ICa). En B, semuestra la curva normalizada de la corriente contra el voltaje (n = 12) para valores al pico () y a los 350ms () En C, gráfica de la constante temporal de activación (τn) en función del voltaje (n = 10); en elinserto se muestra la función exponencial empleada para ajustar los datos. En todos los casos, lossímbolos representan la media ± E.S.

f(x) = ae-bx

a = 0.7 ± 0.02b = 0.02

Angélica Almanza G

44

Para calcular la constante temporal de activación τn de la IKCa, en ambos órganos, se ajustó

una función exponencial a la fase de activación de la corriente. En las células ciliadas de

ambos órganos, la τn mostró una dependencia exponencial del voltaje, disminuyendo con la

despolarización (Fig. 21C y 22C). La IK,Ca presentó una activación más rápida en las células

aisladas de los canales semicirculares. Por ejemplo, en el utrículo, a 0 mV, la τn fue de 2.62 ±

0.7 ms, mientras que en los canales semicirculares la τn fue de 0.67 ± 0.06 ms.

En el utrículo, la constante temporal de inactivación se calculó ajustando a la fase de caída

una doble exponencial y, en los canales semicirculares, una exponencial simple. En todas las

células, la τh para la inactivación fue independiente del voltaje, mostrando una gran

variabilidad. A 0 mV, en el utrículo, la τh1 varió entre 5 y 45 ms y τh2 entre 70 y 130 ms;

mientras que en los canales semicirculares, la τh varió entre 23 y 80 ms.

Figura 22. La corriente de K+ activada por Ca2+ (IK,Ca) en las células del utrículo. En A, registrocaracterístico de la corriente sensible a Cd2+. En B, relación corriente-voltaje para valores al pico () y alos 350 ms () de la IK,Ca (n = 12). En C, constante temporal de activación τn en función del voltaje (n =8); en el inserto, función exponencial empleada para ajustar los datos. En todos los casos, los símbolosrepresentan la media ± E.S.

A

50 ms 0.5

nA

C

Voltaje (mV)-60 -20 20 60

τ h (m

s)

0

5

10

15

20B

Voltaje (mV)-100 -50 50 100

I/Im

ax

f(x) = ae-bx

a = 0.7 ± 0.02b = 0.013


45

Debe mencionarse que esta corriente tiene dos flujos de corriente (Masetto y cols., 1994):

una corriente entrante de Ca2+ y una corriente saliente de K+ por lo que, pensando en términos

de las ecuaciones de Hodgkin y Huxley (1952) podríamos describirla de forma general como:

[ ]( ) [ ]( ) )(, ,,,, KmCakr

CaKCaKCaK EVCahCaVngI −⋅⋅⋅=

donde, la activación de la corriente (parámetro n) depende de la concentración de Ca2+ en el

citoplasma y del voltaje de membrana; mientras que, de acuerdo con nuestros resultados, la

inactivación (parámetro h) es independiente del voltaje, pero aparentemente es dependiente de

la concentración de Ca2+ intracelular.

El porcentaje de IK,Ca con respecto a la corriente total fue muy prominente en ambos

órganos; en los canales semicirculares esta corriente aportó un 40% de la corriente total, y en

el utrículo constituyó un 65%.

Corriente rectificante de entrada. Utilizando un potencial de sostenimiento de -70 mV y

pasos de voltaje hiperpolarizantes (entre -130 y -50) con una duración de 380 ms, apareció una

corriente rectificante de entrada (IIR) en el 60% de las células de los canales semicirculares

(n=50) y en el 100% de las células del utrículo (n=16) (Fig. 23A).

La IIR se activó a potenciales negativos con respecto al potencial de membrana (Fig. 23B), su

potencial de inversión fue alrededor de -74 mV y se bloqueó completamente con 500 µM de

BaCl2. En las células de ambos órganos, la IIR mostró una activación rápida; en los canales

semicirculares la media para la constante temporal de activación fue τm = 0.19 ± 0.02 ms, y en

Figura 23. Corriente rectificante de entrada (IK,IR). En A, registro de IK,IR en una célula aislada de loscanales semicirculares. La corriente se generó con un VH = -70 mV y pasos de voltaje de -130 a -70 mV.En B, relación corriente-voltaje para IK,IR en células del utrículo (, n = 16) y de los canalessemicirculares (, n = 50). En la gráfica se observa que el potencial de inversión para esta corriente enambos órganos es alrededor de -75 mV, cercano al valor teórico para el potencial de equilibrio del K+ (EK= -78 mV).

A B

Voltaje (mV)-140 -120 -100 -80 -60

Cor

rient

e (p

A)

-600

-400

-200

0

200

pA

100 ms

Angélica Almanza G

46

Tabla VI. Parámetros obtenidos de las diferentes corrientes iónicas aisladas de las células del

utrículo y de los canales semicirculares.

Parámetro Canales Semicirculares Utrículo

IK,transitoria

Vact, mV -60 -60

τn, ms (a 0 mV) 1.7 ± 0.11†† 14.2 ± 2.2

τ h, ms (a 0 mV) 33.5 ± 2.8 (80% de las células)††

131 ± 8.1 (20% de las células)†

302 ± 78

V1/2n, mV -30 ± 3.5 -6.9 ± 1.5

Sn 19 ± 3.5 19.5 ± 1.5

V1/2h, mV -71 ± 2.3 -66.8 ± 1.5

Sh 23 ± 1.3 12.1± 1.2

gmax, nS 60 ± 1 58± 10

(IK,transitoria/Itotal) x 100 15†† 30.4

IK,sostenida

Vact, mV -60 -60

τ n, ms (entre -40 y +50 mV) 1.03-0.81†† 5-10

τ h, ms -------- --------

(IK,sostenida/Itotal) x 100 45†† 4.5

IK,Ca

Vact, mV -40 -40

τ n, ms (a 0 mV) 0.67 ± 0.06†† 2.62 ± 0.7

τ h, ms (entre -40 y +50 mV) 5-45†† 70-100

(IK,Ca/Itotal) x 100 40†† 65

IK,IR

EK, mV -74 ± 2 -74 ± 2

τ m, ms (a -130 mV) 0.19 ± 0.02†† 0.72 ± 0.05

τ h, ms (a -130 mV) 59.3 56.7 ± 5.5

Comparaciones estadísticas (t-test) fueron hechas entre las medias de los parámetros de las células aisladas de los

canales semicirculares vs. utrículo. † P<0.05. †† P<0.001.


47

el utrículo, τm = 0.72 ± 0.05 ms. En el 80% de las células de los canales semicirculares con

corriente de entrada, IIR no se inactivó. En el 20% restante, IIR se inactivó con una τh = 59.3 ±

ms. En todas las células del utrículo, IIR presentó inactivación con una τh = 56.7 ± 5.5 ms.

De manera general, podemos describir a esta corriente con la siguiente ecuación:

)( iónmIRrIRIRIR EVhmgI −⋅⋅⋅=

donde, los parámetros tienen el significado ya mencionado antes y Eión es el potencial de

inversión para la corriente, el cual fue muy cercano a EK; sin embargo, necesitamos hacer una

caracterización más completa para poder establecer su selectividad iónica.

En la tabla VI se resumen los valores de los parámetros medidos en las diferentes corrientes

iónicas aisladas en las células del utrículo y de los canales semicirculares.

Corriente de calcio. El registro de esta corriente (ICa) se realizó en 16 células ciliadas

aisladas de los canales semicirculares del axolotl; para su estudio, utilizamos soluciones

modificadas para bloquear las corrientes de K+ en las cuales sustituimos al K+ por Cs+ y

colocamos TEA en la solución extracelular (Tabla III).

En las corrientes de Ca2+ registradas con un potencial de sostenimiento de -70 mV, el

potencial de inversión fue cercano a +20 mV, un valor bajo comparado con el potencial de

equilibrio estimado (muy positivo), lo cual probablemente se debe a un bloqueo incompleto de

las corrientes de salida, tal como ha sido descrito por otros autores (Ohmori, 1984; Prigioni,

1992). La contribución de las corrientes de salida a las corrientes entrantes totales se estudió

bloqueando la corriente entrante de Ca2+ con Cd2+ 0.1 mM en la solución extracelular, con lo

cual el bloqueo de ICa fue completo quedando solamente las probables corrientes de salida,

incrementando de una manera casi lineal a potenciales positivos. La figura 24A muestra la

relación IV para la corriente de Ca2+, obtenida como la diferencia entre las corrientes

registradas antes y después de la aplicación de Cd2+.

En todos los experimentos dirigidos a estudiar la ICa, el Ca2+ se sustituyó por Ba2+ en la

solución extracelular. En la figura 24B se muestra un trazo representativo de la relación

corriente voltaje para la corriente de Ca2+ y la corriente de Ba2+; se puede apreciar que la

amplitud de la corriente entrante incrementa aproximadamente al doble cuando el Ca2+ se

sustituye por 4.5 mM de Ba2+.

La existencia de “run-down” en las corrientes de calcio se ha reportado tanto en células

ciliadas del oído interno (Ohmori, 1984; Martini y cols., 2000; Hudspeth y Lewis, 1988a)

Angélica Almanza G

48

como en otros tipos de células, (por ejemplo, en neuronas vestibulares del ratón) (Chambard y

cols., 1999). Para estudiar la presencia de este fenómeno en las células ciliadas del ajolote

utilizamos un pulso a un valor fijo de -20 mV con un potencial de sostenimiento de -80 mV

con una duración de 80 ms (n = 6). En todas las células observamos que hay una fase inicial en

que la corriente de Ca2+ crece. A este fenómeno se le ha llamado “run-up” y se presenta

también en otras preparaciones (para una revisión ver Meir y cols., 1999). Una vez que el

“run-up” ocurre, la amplitud de la ICa permanece estable durante unos minutos

(aproximadamente entre tres y cinco minutos). Posteriormente, ocurre un decremento en la

amplitud de la corriente de Ca2+, fenómeno que se ha denominado en la literatura como "run-

down" (Fig. 24C). Los estudios realizados sobre la ICa se llevaron a cabo una vez que el “run-

up” sucedió y antes de que el “run-down” ocurriera.

Utilizando un protocolo de pulsos de voltaje de 10 mV que va de -70 a +50 mV, con un

potencial de sostenimiento de -70 mV y una duración de 200 ms, se registró una corriente

entrante de pequeña amplitud (en un rango de 50 a 80 pA), con inactivación parcial y que es

A

Voltaje (mV)

-80 -40

I (nA

)0.2

-0.2B

Voltaje (mV)

-40 -20 20

I (nA

)

-0.10

-0.06

0.02

C

Tiempo (min)0 2 4 6 8 10 12

Cor

rient

e (p

A)

60

80

100

120

140

160

180 Figura 24. En A, relacióncorriente-voltaje para una célula delos canales semicirculares. Semuestra la ICa registrada encondiciones control (), lacorriente residual (saliente) luegode la perfusión de Cd2+ 0.1 mM ()y la ICa () obtenida como ladiferencia entre la corrienteentrante y la corriente de salida. EnB, relación corriente-voltaje en unacélula para la ICa () y la IBa (). EnC, variación de la amplitud de la ICaen función del tiempo.


49

bloqueada por Cd2+ y Ni2+ 0.1 mM (datos no mostrados), lo que indica que se trata de una

corriente de Ca2+.

Debido a que observamos que la ICa presentaba una inactivación parcial con el potencial de

sostenimiento de -70 mV, decidimos probar diferentes potenciales de sostenimiento para ver si

la inactivación era dependiente del voltaje. La ICa se registró en una misma célula (n = 6) con

dos diferentes potenciales de sostenimiento: uno de -100 mV, con el que se obtuvo la ICa total

y otro de -60 mV, con el que se obtuvo un componente de la ICa que no se inactivó. Restando

Figura 25. Corriente de Ca2+ (ICa) en las células ciliadas de los canales semicirculares. En A, corrienteentrante generada con pulsos de voltaje partiendo de un potencial de sostenimiento (VH) de -60 mV; estecomponente es sostenido. En B, la corriente generada con un VH = -60 mV fue substraída de la corrientegenerada con un VH = -100 mV; la corriente residual nos muestra al componente que se inactiva. En C,relación corriente-voltaje para el componente sostenido () y para el componente que se inactiva (,valores al pico). En D, la constante temporal de inactivación τh en función del voltaje para el componenteinactivante. En el inserto, se muestra la función exponencial utilizada para ajustar los datos.

D

Voltaje (mV)-60 -40 -20 0 20

τ h (m

s)

0

4

8

12

16

C

Voltaje (mV)

-80 -40 80

Cor

rient

e (n

A)

-0.06

0.15

A

50 ms 50 p

A

B

50 p

A

50 ms

-60 mV

-100 mV

f(x) = yo +ae-bx + cxa = 9.2 ± 1.9b = 0.03 ± 0.02c = 0.5 ± 0.4yo = -4.3 ± 1.9

Angélica Almanza G

50

las corrientes generadas con el potencial de sostenimiento de -60 mV de las generadas con el

de -100 mV, obtuvimos el componente de la ICa que presentó inactivación (Fig. 25A y B).

El componente sostenido se activó a potenciales más positivos de -60 mV, alcanzando su

máxima amplitud alrededor de -30 mV y su magnitud, a este potencial, varió entre 60 y 180

pA (Fig. 25C). Su activación fue rápida, siendo el valor para la τ de activación de 3.1 ± 0.6 ms

(medida entre -30 y -10 mV).

En cuanto al componente que se inactiva, a -60 mV éste se encuentra ya parcialmente

activado, alcanzando su máxima amplitud alrededor de -40, mV y su magnitud a este potencial

varió de 30 a 50 pA (Fig. 25C). La τ para la inactivación mostró una relación compleja con el

voltaje pues, inicialmente, con los pulsos despolarizantes la inactivación fue más rápida, y a

voltajes más positivos de -10 la τ se incrementó (Fig. 25D).

Con base en los datos anteriores pensamos que la corriente de calcio puede describirse de

forma general por la siguiente ecuación:

( ) ( ) ( ) ( ) ( )CaholdxCaCaCaCa EVVhVmgEVVmgI −⋅⋅⋅+−⋅⋅= ,

donde x,Cag se refiere a la conductancia inactivante de Ca2+ cuyas características aún no

hemos identificado suficientemente como para definirla, y Cag a la corriente de Ca2+ que no

presenta inactivación.

El Ca2+ participa en la regulación de una gran variedad de funciones celulares;

específicamente, en las células ciliadas, el Ca2+ está involucrado en varios eventos como son la

mecanotransducción, la adaptación de la corriente de transducción, la resonancia eléctrica y la

liberación del transmisor (entre otras). Se ha demostrado la existencia de una gran variedad de

canales de Ca2+ activados por voltaje, los cuales difieren entre sí en cuanto a su biofísica,

bioquímica y a su farmacología; considerando las múltiples funciones celulares dependientes

de este ión, es posible que cada tipo de canal de Ca2+ se encuentre asociado a una función

específica. Dada la gran importancia del Ca2+ en la regulación de diversas funciones celulares,

existe un gran interés en determinar qué tipos de canales de Ca2+ se localizan en las células

ciliadas; sin embargo, el estudio de los diferentes subtipos de corrientes de Ca2+ implica una

problemática experimental debida en gran parte a la ausencia de herramientas farmacológicas


51

suficientes que puedan bloquear selectivamente a uno u otro canal. En nuestro caso, hemos

iniciado el estudio de la corriente de Ca2+ en los canales semicirculares del aparato vestibular

del axolotl; sin embargo, debido a las limitaciones temporales de este estudio y a las

dificultades experimentales ya mencionadas, decidimos posponer el estudio detallado de esta

corriente en los diferentes órganos vestibulares.

100 mV

--70 mV70

0 mV0

55 msms

B

-70 mV 0 mV0

5 msms10020 mV

C

D

Corriente (nA)-0.8 -0.4 0.0 0.4 0.8

Volta

je (m

V)

-240

-200

-160

-120

-80

-40

0

UtrículoSáculoCanales

100 mV

0 mV0-70 mVmV-

5 5 ms

A

Figura 26. Fijación de corriente. En A, B y C, respuesta de voltaje de las células aisladas de los canalessemicirculares, sáculo y utrículo (respectivamente) ante pulsos de corriente hiper- y despolarizante. Lascélulas se fijaron alrededor de -70 mV y se registró la respuesta ante la inyección de corriente desde -0.5hasta 0.5 nA en incrementos de 0.1 nA. En D, relación voltaje-corriente para células del sáculo (n = 4),utrículo (n = 4) y canales semicirculares (n = 10). Se observa que, las células de los canalessemicirculares tienen una mayor ganancia ante pulsos de corriente hiperpolarizante, mientras que lascélulas saculares muestran una menor ganancia. Ante pulsos de corriente despolarizante, las células de lostres órganos muestran ganacias similares.

Angélica Almanza G

52

Fijación de corriente

Para evaluar el cambio en el voltaje de membrana ante pulsos de corriente, el potencial de

membrana fue fijado a -70 mV mediante inyección de corriente, y dimos una serie de pulsos

de corriente entre -0.5 y 0.5 nA en incrementos de 0.1 nA con una duración de 800 ms.

La presencia de una corriente de Ca2+ y una corriente de K+ activada por Ca2+, nos sugirió

la posible presencia de resonancia eléctrica en nuestras células, tal y como se ha descrito en

otras preparaciones (Crawford y Fettiplace, 1981; Hudspeth y Lewis, 1988a,b).

Ante pulsos de corriente hiperpolarizante, en las células de los canales semicirculares la

membrana se hiperpolarizó lentamente y continuó haciéndolo, como si fuera una respuesta

pasiva, durante el tiempo que duró el pulso de corriente (Fig. 26A). Este mismo

comportamiento se ha observado en las células ciliadas ubicadas periféricamente en la cresta

de los canales de la rana, en donde IK1 está ausente (Marcotti y cols., 1999). En cambio, en el

sáculo y en el utrículo, ante el mismo estímulo, la respuesta fue completamente diferente, ya

que la membrana se hiperpolarizó rápidamente pero con una amplitud pequeña (Fig. 26B y C).

Este tipo de respuesta es característica de las células ciliadas que expresan IK1 (Sugihara y

Furukawa, 1989; Masetto y cols., 1994).

Ante pulsos de corriente despolarizante, las células provenientes de los tres órganos

mostraron una resonancia altamente amortiguada que consistió en un único transitorio (Fig.

26A, B y C). No encontramos evidencia de más de una oscilación en el voltaje de membrana.

Esto nos sugiere que Q es menor de 1 y, como se ha sugerido, posiblemente esta oscilación

con bajo factor de calidad no sea una resonancia eléctrica como tal que nos indique que la

célula está sintonizada a cierta frecuencia, sino más bien que la membrana celular se está

comportando como un filtro pasabajas (ver Weng y Correia, 1999).

En el rango de 0 a -0.4 nA, la resistencia de entrada (Ri) en el estado estable (obtenida de la

regresión lineal ajustada a la media de los datos) para las células del sáculo (n = 4) fue de 54

MΩ, para las del utrículo (n = 4) de 69.5 MΩ, y para los canales semicirculares (n = 10) de

311.5 MΩ; mientras que en el rango de 0 a 0.6 nA la Ri fue de 65 MΩ en sáculo, 102 MΩ en

utrículo y 36 MΩ en los canales semicirculares (Fig. 26D).

Aun cuando en los tres órganos se observa un transitorio, podemos notar que los valores de

Ri con pulsos despolarizantes son diferentes, siendo las células de los canales semicirculares


53

las que presentan una muy baja Ri en el estado estable, determinada seguramente por la

magnitud de la corriente iónica sostenida que se activa lentamente.

Discusión

Uno de los hallazgos principales de nuestro trabajo es que las corrientes iónicas de salida en

las células ciliadas de los canales semicirculares tienen cinéticas de activación e inactivación

rápidas, mientras que las corrientes con cinéticas lentas se encuentran en las células

provenientes de los órganos otolíticos. Estas claras diferencias cinéticas no están relacionadas

con las diferentes formas celulares encontradas, lo que indica que las propiedades

electrofisiológicas de las células ciliadas tipo II no dependen de la morfología celular, sino

más bien del órgano vestibular del cual provienen.

En la literatura existen pocos estudios que comparen las propiedades cinéticas del conjunto

de corrientes iónicas en células ciliadas de diferentes órganos vestibulares en una misma

especie. Eatock y Hutzler (1992) registraron la corriente iónica total en células del utrículo y

canales semicirculares de la rata; el curso temporal de la activación de la corriente, la relación

I/V y la magnitud de la corriente rectificante de entrada fueron semejantes entre las células de

un mismo tipo sin importar el órgano de origen. Encontraron diferencias significativas entre

las células tipo I y II, ya que en la mayoría de las tipo I se encontró una corriente de salida

activa en el reposo. Posteriormente, Ricci y cols. (1996), encontraron que las conductancias

basolaterales de las células tipo I aisladas de la paloma son semejantes entre órganos

vestibulares funcionalmente diferentes (canales semicirculares, utrículo, sáculo y lagena).

Weng y Correia (1999) compararon, en la paloma, las corrientes iónicas de salida presentes en

las células ciliadas tipo II de los canales semicirculares con las del utrículo. Estos autores

encontraron que en ambos órganos existen células con cinéticas rápidas y lentas dependiendo

de su ubicación regional en cada órgano.

Propiedades Pasivas

Las células ciliadas del vestíbulo del axolotl difieren en sus propiedades pasivas dependiendo

de su localización vestibular. Las células saculares tuvieron un Vm más negativo que las

células de los canales semicirculares (P < 0.01) y del utrículo (P < 0.05). Una explicación para

Angélica Almanza G

54

estas diferencias es la expresión de una corriente rectificante de entrada en las células del

sáculo que sería la responsable de mover el Vm hacia valores más negativos (y cercanos al EK).

Otra diferencia fue en cuanto a la Cm y la Rm: las células del sáculo mostraron una baja Rm con

respecto a las de los canales semicirculares y una Cm mayor que las del utrículo; estas

diferencias podrían explicarse considerando que el área de las células en este órgano fue

mayor que la de las células de los otros órganos y, por tanto, la relación R ∝ 1/C se cumple.

Sin embargo, la Cm en el sáculo no fue significativamente diferente a la Cm encontrada en las

células de los canales semicirculares. Por lo tanto, pensamos que en el potencial de reposo de

las células saculares se encuentra activa una conductancia, lo que hace que la Rm disminuya (R

= 1/G); la presencia en mayor magnitud de una corriente rectificante de entrada en las células

del sáculo nos hace suponer nuevamente que es esta conductancia la que determina las

diferencias mencionadas.

La Cm medida electrónicamente (Cm-E) en las células saculares y del utrículo no fue

significativamente diferente a la calculada con base a la superficie de membrana (Cm-T), aun

cuando Cm-E mostró una tendencia a ser siempre ligeramente mayor; sin embargo, en las

células de los canales semicirculares, Cm-E fue significativamente mayor (P < 0.05) que Cm-T.

Esta diferencia puede explicarse por el método empleado para realizar la medición: la

medición de capacitancia eléctrica considera la capacitancia dada por el haz de cilios, mientras

que la medición morfológica no toma en cuenta este valor, ya que en nuestras condiciones

experimentales el haz de cilios no es distinguible como para hacer un análisis de su estructura

y considerar la capacitancia que aporta la superficie de membrana de los cilios. El que en las

células saculares y del utrículo la diferencia entre Cm-E y Cm-T no haya sido significativa

concuerda con lo observado al microscopio: los cilios de las células de estos dos órganos son

mucho más cortos que los cilios en las células de los canales semicirculares. En general, las

propiedades eléctricas pasivas de las células ciliadas estudiadas en este trabajo fueron

comparables con las reportadas previamente por otros autores para las células tipo II (Rennie y

Ashmore, 1991; Norris y cols., 1992; Ricci y cols., 1994; Masetto y cols., 1994; Rennie y

cols., 1996).

Corrientes iónicas totales

Densidad de corriente. La magnitud de la corriente total (Ip, Iss) fue significativamente


55

diferente en los tres órganos vestibulares, pero la densidad de corriente fue homogénea entre

-80 y 40 mV; en este rango, la diferencia en la magnitud de la corriente se debió a la mayor

área de membrana presente en las células del sáculo. Sin embargo, a potenciales más negativos

que -80 mV, la densidad de corriente en las células saculares fue significativamente mayor que

en las células de los canales semicirculares (P < 0.001) y que en las del utrículo (P < 0.05);

esto nos indica que, a potenciales hiperpolarizantes, la diferencia en la magnitud de la

corriente se debe a un incremento de la conductancia por unidad de membrana más que a una

diferencia en el área de la célula. Otro dato interesante es que a potenciales de membrana más

positivos de +40 mV, la densidad de corriente en las células del utrículo rectifica y se hace

significativamente menor que la densidad en las otras células; esto nos dice que en las células

del utrículo, a valores muy despolarizantes, la conductancia por unidad de membrana

disminuye; además, la rectificación observada en la densidad de corriente como función del

voltaje nos da un indicio de que en estas células se expresa de manera dominante la corriente

de K+ activada por Ca2+ descrita en las neuronas de molusco por Meech y Standen (1975).

Componente entrante. La presencia de un componente entrante se correlacionó con el

origen vestibular de las células ciliadas. En el sáculo, la conductancia entrante por unidad de

membrana fue hasta 5 veces mayor que en los canales semicirculares (donde este componente

fue casi despreciable) y 2.5 veces más que en el utrículo. Las características generales del

componente entrante registrado en las células saculares y del utrículo se asemeja a la corriente

rectificante de entrada (IK1) descrita en otros tipos celulares; por ejemplo, la relación IV

mostró una rectificación alrededor del potencial de membrana y produjo una pequeña corriente

de salida a potenciales de membrana positivos con respecto al EK (Sakmann y Trube, 1984).

En el sáculo de la rana leopardo se reportó la presencia de dos corrientes rectificantes de

entrada: IK1 e Ih; la activación de IK1 tuvo un V1/2 = -86 ± 0.7 mV, S = 5.3 ± 0.14,

Gmax = 31 ± 2.2 nS y Gmin = 9 ± 1.3 nS; mientras que para Ih, V1/2 = -92 ± 2.2 mV,

S = 9.6 ± 0.43, Gmax = 5.3 ± 0.7 nS y Gmin = 1.5 ± 0.5 nS (Holt y Eatock, 1995); estos valores

para la IK1 en el sáculo de la rana leopardo son semejantes a los obtenidos (con el ajuste de

Boltzmann para la curva de activación entre -130 y -50 mV) en las células saculares del

axolotl para el componente entrante (ver tabla V), lo cual nos hace pensar que esta

conductancia entrante es IK1. Los valores obtenidos con el mismo ajuste en el utrículo, caen

entre lo reportado para IK1 e Ih, por lo que probablemente ambas conductancias se estén

Angélica Almanza G

56

coexpresando en las células utriculares (cabe mencionar que el V1/2 reportado para Ih varía

entre -67 y -97 mV).

Hay una correspondencia entre la magnitud de la corriente entrante y el Vm: las células

saculares son las que tuvieron una mayor conductancia entrante y un Vm más negativo con

respecto al utrículo y los canales semicirculares; nuestros resultados sugieren que la presencia

de IK1 afecta de manera importante al potencial de membrana y a la conductancia en reposo y,

como consecuencia, a las respuestas de voltaje ante pulsos de corriente, punto que se discutirá

más adelante. En otras células ciliadas también se ha reportado que el Vm es afectado de la

misma forma por la expresión de IK1 (Holt y Eatock, 1995; Sugihara y Furukawa, 1989;

Masetto y cols., 1994; Masetto y Correia, 1997; Marcotti y cols., 1999).

Componente saliente. En las células del sáculo y del utrículo, la conductancia saliente

total se detectó realmente activa alrededor de -40 mV, mientras que en los canales

semicirculares la corriente se activó a un voltaje más negativo (alrededor de -50 mV). Esta

diferencia de alrededor de 10 mV en la activación posiblemente se debe a que las diferentes

corrientes de K+ que constituyen a la corriente total tienen una dependencia intrínseca del

voltaje diferente en cada órgano vestibular (Eatock y Hutzler, 1992). Estos valores de voltaje

en que encontramos ya activado al conjunto de corrientes salientes es similar a lo reportado en

otras células ciliadas (rango de activación entre -60 y -50 mV) (Hudspeth y Lewis, 1988a;

Rennie y Ashmore, 1991; Eatock y Hutzler, 1992; Smotherman y Narins, 1999; Masetto y

cols., 1994; Masetto y Correia, 1997).

El ajuste de Boltzmann para las curvas de activación (G/Gmax) de la corriente saliente revela

que el valor del voltaje en el cual se encuentra activo el 50% de la conductancia máxima fue

semejante en las células de los tres órganos (alrededor de -20 mV); sin embargo, hubo una

clara diferencia en los valores de la constante de Boltzmann (S), la cual nos indica el cambio

necesario en el voltaje para que la conductancia cambie e-veces. Por lo tanto, considerando los

valores de S, podemos concluir que de los tres órganos, las células saculares son las menos

sensibles a los cambios en el voltaje; esto quiere decir que para producir un cambio

significativo en la activación de la corriente es necesario que exista un cambio grande en el

voltaje de membrana.

En la misma curva de activación podemos notar que para las células del sáculo y del

utrículo, la conductancia no se hace cero en ningún voltaje; alrededor del potencial de


57

membrana, en el sáculo, el 20% de la conductancia se encuentra activa, en el utrículo un 10%

y en los canales tan solo un 5%. El porcentaje de la conductancia activa en el sáculo es similar

a lo reportado en las células saculares de la rana leopardo donde, en el reposo, alrededor de un

28% de IK1 se encuentra activa (Holt y Eatock, 1995). Una vez más, parecería que la

conductancia entrante, expresada en diferente magnitud en los tres órganos vestibulares del

axolotl, determina el porcentaje de conductancia activa en el reposo.

Con respecto a la inactivación de estado estable, alrededor del potencial de membrana en

las células de los tres órganos un 50% de los canales iónicos se encuentran inactivados; visto

de otra manera, en el reposo, el 50% de los canales iónicos se encuentra disponible para

repolarizar a la célula ante un estímulo despolarizante. Como se observa en la curva, la

inactivación de la corriente total en los tres órganos fue incompleta, quedando alrededor de un

40% de los canales disponibles a potenciales más positivos de -40 mV; esta inactivación

incompleta posiblemente se debe a que la corriente total consiste de más de un componente, al

menos uno inactivante y uno sostenido, o bien, componentes con una inactivación incompleta

a lo largo del tiempo (Marcotti y cols., 1999).

Las propiedades cinéticas de la corriente saliente fueron similares en todas las células

dentro de cada órgano y ampliamente diferentes entre los mismos. La activación de la

corriente en las células de los canales semicirculares fue casi 20 veces más rápida (τ = 0.5 ±

0.1 ms) que en las células saculares (τ = 9.8 ± 2.8 ms) y 5 veces más rápida que en las células

del utrículo (τ = 2.4 ± 0.6 ms). Estos resultados discrepan, al menos parcialmente, con lo

reportado en la literatura, lo cual discutimos a continuación.

No conocemos evidencias de que células ciliadas saculares en otras especies tengan

cinéticas de activación tan lentas como las encontradas en el sáculo del axolotl (ver tabla V);

las células tipo I y II, en la rata, tienen una constante de activación entre 8-15 ms, pero éstas

provenían del utrículo y de los canales semicirculares (Eatock y Hutzler, 1992); un valor

similar es el encontrado en las células ciliadas tipo I de la paloma, en donde sin importar el

órgano estudiado (sáculo, utrículo, canales semicicrculares y lagena) la τ para la activación fue

alrededor de 10 ms (Ricci y cols., 1996). Por el contrario, en el pez dorado, la τ para la

corriente en las células saculares fue menor a 5 ms (Sugihara y Furukawa, 1989), la mitad de

lo encontrado en el sáculo del axolotl.

Angélica Almanza G

58

En los canales semicirculares de la rana (Masetto y cols., 1994) y la paloma (Masetto y

Correia, 1997; Weng y Correia, 1999), se encontró que las células ciliadas en diferentes

regiones de la cresta ampular tienen un conjunto de conductancias con propiedades cinéticas

diferentes. En la periferia, se encontraron células con cinéticas de activación e inactivación

rápidas (células rápidas), mientras que en la región central, las células tuvieron cinéticas lentas

(células lentas). La disección de corrientes en las células de los canales semicirculares de la

rana (Masetto y cols., 1994), mostró que en las células rápidas, la corriente dominante es una

corriente de K+ transitoria de salida (IK,A), mientras que en la región central, la corriente de

salida total se encuentra dominada por una corriente rectificadora retardada (IK,DR). Por

analogía, se sugiere que esta expresión diferencial de corrientes encontrada en la rana se

mantiene en la paloma (Masetto y Correia, 1997; Weng y Correia, 1999). Siguiendo el mismo

patrón, en el utrículo de la paloma se encontraron también células lentas y células rápidas; las

células rápidas se localizaron en la zona extraestriolar, mientras que las células lentas,

estuvieron ubicadas en la región estriolar (Weng y Correia, 1999).

Al igual que los autores anteriores, nosotros también encontramos células lentas y células

rápidas pero, a diferencia de ellos, las propiedades cinéticas de la corriente en las células

pertenecientes a un mismo órgano vestibular fueron homogéneas y la diferencia se dio entre

las células de diferentes órganos. Las células lentas las encontramos en el utrículo, mientras

que las células rápidas se ubicaron en los canales semicirculares, y un tercer tipo celular que

podemos clasificar como "muy lentas" corresponde a las células que conforman a la mácula

sacular. Aun cuando dentro de un mismo órgano no encontramos dos grupos celulares

distinguibles por sus propiedades cinéticas, dos datos interesantes resaltan cuando

comparamos la cinética de las células del utrículo y de los canales semicirculares del axolotl

con lo reportado por Weng y Correia (1999) en estos mismos órganos pero de la paloma: 1)

las características cinéticas de la corriente en las células de los canales semicirculares del

axolotl corresponden a la cinética de las células rápidas ubicadas en la periferia de la cresta

ampular de los canales semicirculares de la paloma, y 2) las características cinéticas de la

corriente en las células del utrículo del axolotl corresponde a la cinética de las células lentas

ubicadas en la zona estriolar del utrículo de la paloma. Éste es un hallazgo muy interesante

que nos sugiere dos cosas: 1) que nuestro procedimiento experimental de alguna manera sesgó

nuestros resultados y, por tanto, sólo registramos células provenientes de la periferia (en el


59

caso de los canales) y de la zona estriolar (en el caso del utrículo); o bien, 2) que a diferencia

de la paloma, las propiedades cinéticas de las células tipo II en el axolotl son homogéneas

dentro de cada órgano vestibular, pero heterogéneas entre ellos. La diferencia en las

propiedades cinéticas de las células tipo II puede indicar que en cada órgano vestibular la

codificación del estímulo sensorial es diferente.

Corrientes iónicas aisladas

Tanto en las células ciliadas aisladas de los canales semicirculares como en las células ciliadas

del utrículo encontramos principalmente tres corrientes de K+ de salida: una transitoria, una

sostenida y una dependiente de Ca2+; sin embargo, la contribución de cada una de éstas a la

corriente total fue diferente. Además, y en congruencia con los resultados obtenidos del

registro de la corriente total, las cinéticas de las corrientes aisladas en las células de los canales

semicirculares fueron más rápidas que en el utrículo.

Corriente de K+ transitoria (IK,t). En los canales semicirculares, la corriente transitoria de

K+ sensible a 4-AP se identificó como una corriente de tipo A (Connor y Stevens, 1971a,b),

cuyas cinéticas de rápida activación e inactivación coinciden con las reportadas por otros

autores en células ciliadas (Hudspeth y Lewis, 1988; Rennie y Ashmore, 1991; Norris y cols.,

1992).

La IK,A es el componente principal de la corriente de salida en células aisladas de los

canales semicirculares en la rana (Norris y cols., 1992), en la paloma (Lang y Correia, 1989) y

en el cobayo (Rennie y Ashmore, 1991). Sin embargo, en los canales semicirculares del

axolotl, IK,A no es la corriente dominante, ya que constituyó un 15% de la corriente total,

comparado con el 40% que representó la IK,Ca. En el utrículo, la corriente transitoria de salida

constituyó un 30% de la corriente total y también fue sensible a 4-AP; sin embargo, la cinética

fue alrededor de 9 veces más lenta que en los canales semicirculares; por esta razón, aun

cuando esta corriente se asemeja a la tipo A, decidimos denominarla únicamente como

"transitoria" (IK,t). Una corriente con cinéticas similares se reportó en las células ciliadas

aisladas del sáculo del pez dorado donde la corriente transitoria tiene una constante temporal

de activación entre 0.4-10 ms y una constante temporal de inactivación entre 0.6 - 2 seg

(Sugihara y Furukawa, 1995). En diversas preparaciones (por ejemplo: neuronas vestibulares,

Angélica Almanza G

60

miocitos ventriculares, entre otras), también se ha reportado la presencia de corrientes

transitorias que se activan e inactivan lentamente (Xu y cols., 1999; Chabbert y cols., 2001).

Se ha sugerido que la principal función de IK,t es la de un amortiguador que se activa luego

de las hiperpolarizaciones y que actuaría de una manera transitoria y rápida en contra de la

despolarización producida por un estímulo (Housley, 1989). Esta función estaría

principalmente restringida a las células de los canales semicirculares del axolotl, por lo que

cuando las células son despolarizadas después de un estímulo hiperpolarizante (condición que

remueve la inactivación), IK,t se activaría y rápidamente repolarizaría a la membrana celular

frenando la liberación de neurotransmisor. El reclutamiento de esta corriente originaría un

aumento significativo en la conductancia de membrana con una consecuente disminución en la

constante temporal de membrana, lo que le permitirá a la célula seguir al estímulo de manera

más fiel. Sin embargo, ante estímulos largos, debido a la inactivación de IK,t, su contribución

sería pobre. Por lo tanto, la presencia dominante de IK,t en las células ciliadas de los canales

semicirculares del axolotl, disminuiría la respuesta de la célula ante despolarizaciones rápidas

y determinaría que estas células no tengan resonancia eléctrica ante pulsos de corriente.

Corriente de K+ sostenida (IK,s). Al igual que en las células ciliadas de los canales

semicirculares de la rana, paloma, jerbillo, y el utrículo de ratón (Masetto y cols., 1994; Ricci

y cols., 1996; Marcotti y cols., 1999; Rennie y cols., 1994; Rush y Eatock, 1996a,b),

encontramos que, en los canales semicirculares del axolotl, una corriente sostenida de salida

tipo IK,DR (decidimos llamar a esta corriente "sostenida", IK,s) representó un alto porcentaje de

la corriente total (45%). Contrario a lo esperado, en las células aisladas del utrículo del axolotl,

la corriente dominante fue IK,Ca, mientras que IK,s representó solamente un 4.5% de la corriente

total estando ausente, de hecho, en la gran mayoría de las células.

La predominancia de IK,t o IK,s determina que las células ciliadas sean "rápidas" o "lentas",

respectivamente (Lang y Correia, 1989; Masetto y cols., 1994; Masetto y Correia, 1997). Sin

embargo, según nuestros resultados, en el utrículo del axolotl esto no es así, pues aun cuando

IK,s es despreciable, las células provenientes de este órgano son lentas, así que podemos decir

que no es la presencia de una u otra corriente lo que está determinando que la célula sea lenta

o rápida, sino más bien la cinética individual de cada corriente y, por supuesto, el peso que

ésta tenga sobre el complejo de corrientes iónicas. Así, la ausencia de IK,s en el utrículo se

compensa con la presencia de una corriente IK,t sumamente lenta, mientras que en los canales


61

semicirculares, tanto la IK,t como la IK,Ca presentan cinéticas de activación e inactivación muy

rápidas.

Debido a que IK,s carece de un proceso de inactivación o éste es sumamente lento,

probablemente ésta sea la principal corriente presente ante despolarizaciones sostenidas

cuando ya otros canales se han inactivado.

Corriente de K+ dependiente de Ca2+. En las células utriculares, la corriente de K+

dependiente de Ca2+ (IK,Ca) fue la dominante, constituyendo el 65% de la corriente total, y en

los canales semicirculares esta corriente representó el 40% de la misma.

La presencia de la IK,Ca como corriente dominante en células ciliadas se ha descrito

solamente en los canales semicirculares y en el sáculo del pez sapo (Steinacker y cols., 1997;

Steinacker y Romero, 1991) y en el sáculo de la rana (Lewis y Hudspeth, 1983b; Hudspeth y

Lewis, 1988a); sin embargo, Armstrong y Roberts (1998) reportan también la presencia

dominante de IK,DR en el sáculo de la rana.

En nuestra preparación pudimos observar dos características interesantes en relación con la

IK,Ca; una de ellas es la compleja dependencia que se da entre la activación y el voltaje a

potenciales por arriba de 20 mV, y la otra, es la rápida inactivación dependiente del tiempo.

En cuanto a la activación, la τ se incrementó a potenciales más positivos de 20 mV; esto puede

explicarse (tentativamente) asumiendo que la disminución del influjo de Ca2+ determina no

solamente una reducción en la corriente de salida de K+, sino también una disminución en su

velocidad de activación (Hudspeth y Lewis, 1988a). En cuanto a la inactivación, Masetto y

cols., en 1994, plantean la posibilidad de que ésta sea debida a una compuerta dependiente del

tiempo y del voltaje (como en el caso del canal para la corriente de tipo A) y no dependiente

de la cinética de la corriente de Ca2+; este planteamiento se basa en el hecho de que Prigioni y

cols., en 1992, en las células aisladas de los canales semicirculares de la rana, no encontraron

evidencia alguna de que la corriente de Ca2+ presentara inactivación. Sin embargo, en nuestras

células no es así, pues hemos encontrado que la corriente de Ca2+ presente en las células

aisladas de los canales semicirculares tiene un componente que se inactiva, el cual, entonces,

podría ser el que está acoplado a la IK,Ca y ser por tanto el que determinaría la inactivación de

esta corriente.

Se han descrito tres tipos de canales de K+ dependientes de Ca2+ con base a la conductancia

de canal único: pequeños (SK, 2-25 pS), intermedios (IS, 25-100 pS) y grandes (BK, 100-300

Angélica Almanza G

62

pS); los cuales, además, difieren en cuanto a la secuencia primaria de aminoácidos,

sensibilidad al Ca2+, cinéticas de activación, perfil farmacológico y función fisiológica (para

revisión ver Vergara y cols., 1998; Wallner y cols., 1999; Kaczorowski y García, 1999; Ha y

cols., 2000). La expresión simultánea de estas diferentes poblaciones de canales, tanto en las

células de los canales semicirculares como en las del utrículo, podría explicar la presencia

invariable de un componente transitorio rápido seguido por un componente sostenido en el

registro de la IK,Ca, así como también las diferencias en los valores de la τ para la activación y

la gran variabilidad en la τ de inactivación.

Posiblemente la IK,Ca, estaría actuando como un amortiguador transitorio ante el influjo de

iones Ca2+; se ha planteado que esta corriente, junto con la ICa, es la responsable de la

resonancia eléctrica en células ciliadas de anfibios, reptiles y peces, principalmente en los

órganos relacionados con respuestas a estímulos sonoros como son el sáculo y la papila basilar

(Crawford y Fettiplace, 1981; Husdpeth y Lewis, 1988a, b; Lewis y Husdpeth, 1983b;

Sugihara y Furukawa, 1989, 1995). Sin embargo, aun cuando la presencia de IK,Ca es

dominante en las células ciliadas aisladas del utrículo del axolotl, no encontramos evidencia de

resonancia eléctrica.

Corriente de Ca2+. La existencia de diferentes tipos de canales de Ca2+ se ha demostrado

mediante estudios cinéticos, farmacológicos y moleculares en diversas preparaciones (Randall

y Tsien, 1997; Pérez-Reyes y cols., 1998; Cribbs y cols., 1998; Bean y McDonough, 1998;

Pérez-Reyes, 1999; Lee y cols., 1999a,b; Jiménez y cols., 2000; Protas y Robinson, 2000;

revisión por Meir y cols., 1999; revisión por Triggle, 1999). Sin embargo, las propiedades de

los canales de Ca2+ en el sistema vestibular son menos conocidas. En el sistema acústico

vestibular, estudios farmacológicos han indicado la presencia de una población de canales de

Ca2+ tipo L; sin embargo, el umbral de activación para estos canales es más negativo que el

observado en canales de Ca2+ tipo L neuronales (Fuchs y cols., 1990; Zidanic y Fuchs, 1995).

En los canales semicirculares de la rana se identificó una población homogénea de canales de

Ca2+ tipo L (Prigioni y cols., 1991) mientras que, en el cobayo, los canales de Ca2+ parecen ser

del tipo T (Rennie y Ashmore, 1992). En el sáculo de la rana, estudios de canal único sugieren

la existencia de otros canales de Ca2+, probablemente de tipo N (Su y cols., 1995). Martini y

cols., (2000) reportaron una población heterogénea de canales de Ca2+ en los canales


63

semicirculares de la rana; esta población está constituida por canales de Ca2+ tipo L y dos

canales de Ca2+ tipo R: uno con inactivación y otro sin inactivación.

En nuestro trabajo en las células ciliadas aisladas de los canales semicirculares, cuando

bloqueamos a las corrientes salientes de potasio, encontramos una corriente entrante de

pequeña amplitud (alrededor de 50 pA), la cual es bloqueada con Cd2+ y Ni2+ y cuya amplitud

incrementa al doble cuando el Ca2+ extracelular es sustituido por Ba2+. Lo anterior indica que

se trata de una corriente de Ca2+. A diferencia de los resultados de Prigioni y cols. (1992), que

sólo encontraron una corriente de Ca2+ que no presenta inactivación, nosotros hemos

encontrado que en las células de los canales semicirculares del axolotl hay por lo menos dos

tipos de corrientes de Ca2+: una que no se inactiva, con una activación rápida (τ = 3.1 ± 0.6

ms, medida entre -20 y -10 mV), y se activa a potenciales cercanos a -50 mV, tratándose

posiblemente de una corriente de Ca2+ tipo L; el segundo tipo de corriente corresponde a un

canal de Ca2+ con inactivación y que se activa a potenciales de membrana negativos (alrededor

de -60 mV), tratándose probablemente de un canal de Ca2+ tipo T o R. Sin embargo, para

determinar con claridad los tipos de canales de Ca2+ presentes en nuestras células, debemos

utilizar en el futuro agentes farmacológicos como las dihidropiridinas y las conotoxinas.

Armstrong y Roberts (1998) demostraron que la inactivación en la corriente de Ca2+ (que

no está presente en las células disociadas enzimáticamente, Hudspeth y Lewis, 1988a)

desaparece cuando el Cs+ en la pipeta de registro es sustituido por N-metilglucamina (NMG+),

y sugieren que el componente inactivante es una corriente de Cs+ fluyendo a través de canales

dependientes de Ca2+ e independientes del voltaje del tipo SK. En nuestro trabajo, el

componente inactivante permanece, aun cuando en nuestra pipeta colocamos NMG+, lo cual

sugiere la presencia de un canal distinto al que genera la corriente no inactivante. A diferencia

de lo observado por Martini y cols. (2000), en nuestras células, la inactivación de la corriente

de Ca2+ no es dependiente de Ca2+, pues cuando sustituimos el Ca2+ por Ba2+, sigue estando

presente este componente; debido a estas diferencias, es probable que un canal distinto a los

reportados por Martini se encuentre en las células ciliadas aisladas de los canales

semicirculares del axolotl.

Al igual que en otros sistemas, por ejemplo en neuronas de los ganglios dorsales de rata y

en neuronas vestibulares de ratón (Fedulova y cols., 1985; Chambart y cols., 1999), las

corrientes de Ca2+ mostraron un decaimiento (run-down) que ocurrió después de algunos

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minutos de registro; además de este fenómeno, se presentó antes un incremento progresivo en

la amplitud de la corriente cuando se dieron de manera repetitiva pasos despolarizantes (run-

up). Ambos fenómenos se encuentran relacionados con fosforilaciones y desfosforilaciones de

proteínas intracelulares, las cuales estarían modulando y determinando la probabilidad de

apertura o cierre del canal (Cox y Dunlap, 1992; Diversé-Pierluissi y Dunlap, 1993; para

revisión ver Lederer y Lewis, 1999; Meir y cols., 2000; Martini y cols., 2000).

Fijación de corriente

Se ha reportado que las células ciliadas tipo I y II difieren en cuanto a sus valores de

resistencia de entrada (Ri), constante temporal de membrana (τm) y, por tanto, en su respuesta

ante inyecciones de corriente; (Correia y Lang, 1990; Rennie y Ashmore, 1991). Así, por

ejemplo, en los canales semicirculares del jerbillo, las células tipo I tienen una Ri alrededor de

21.4 ± 14.3 MΩ y una τm entre 0.03-0.4 ms, mientras que las tipo II tienen una Ri = 860.9 ±

273.6 MΩ y una τm = 4 ms (Rennie y cols., 1996). La baja resistencia de entrada en las células

tipo I es debida a la presencia de IK,L, la cual se encuentra activa en el reposo (Eatock y

Hutzler, 1992; Rüsh y Eatock, 1996; Ricci y cols., 1996). La presencia de IK,L en las células

ciliadas tipo I determina que estas células tengan una relativa homogeneidad en cuanto a sus

propiedades pasivas y activas; sin embargo, esto no ocurre en las células tipo II, donde se

observa más bien una heterogeneidad en cuanto a las mismas propiedades. Así, por ejemplo, la

Ri reportada en las células tipo II varía dependiendo de la especie, el órgano vestibular y la

región del epitelio sensorial estudiado, encontrándose valores para Ri entre 300 MΩ y 1.5 GΩ

(Rennie y cols., 1996; Rennie y Ashmore, 1991; Ricci y cols., 1994; Masetto y cols., 1994).

De acuerdo con nuestros resultados, en el aparato vestibular del axolotl la Ri varía

dependiendo del órgano vestibular del cual provienen las células; esta diferencia posiblemente

está determinada por la presencia de la conductancia entrante activa en el reposo. Como ya se

mencionó, IK1 se encuentra activa en mayor proporción en las células del sáculo, y son éstas

células las que tienen una menor Ri en el reposo, le siguen las células del utrículo y

finalmente, las de los canales semicirculares, las cuales tienen la mayor Ri. Las diferencias no

significativas entre los valores de Cm descartan que sea el tamaño de la célula el responsable

de las diferencias en la Ri.


65

Considerando los valores de Ri y con base en la gráfica VI, podemos decir que ante una

inyección de corriente hiperpolarizante, el cambio en el potencial de membrana en las células

saculares es menor que en las células del utrículo y mucho menor que en las de los canales

semicirculares. Las células de los canales semicirculares son las que muestran una mayor

ganancia en las curvas corriente-voltaje, aunque las diferencias en la dirección excitatoria son

no significativas (ver Fig. 23).

Por lo tanto, con base a las propiedades pasivas (Ri, τm, Cm) y activas de la células,

podemos establecer, tentativamente, las siguientes implicaciones fisiológicas:

1. En analogía con las células ciliadas tipo I, en el axolotl, ante cambios inmediatos en la

posición de la cabeza, el sáculo es capaz de responder más rápidamente que el utrículo y los

canales semicirculares, aunque lo hace con una ganancia menor.

2. Nuestros resultados indican que las células provenientes del sáculo tienen baja ganancia, no

rectifican significativamente y sus propiedades cinéticas sugieren que no son capaces de seguir

estímulos de alta frecuencia como sería de esperar si realmente cumplieran con una función

auditiva.

3. Las células del utrículo tienen una mayor ganancia, mejor capacidad de seguir estímulos de

mayor frecuencia (< 25 Hz) y no rectifican significativamente.

4. Las células de los canales semicirculares, muestran una rectificación significativa, con alta

ganancia en la dirección hiperpolarizante y, a pesar de que sus corrientes tienen una cinética

mucho más rápida, la alta resistencia de entrada de estas células determina que tengan

igualmente una baja capacidad para seguir estímulos de alta frecuencia (< 30 Hz).

5. Dada la notable rectificación que se ha reportado en la corriente de transducción, pensamos

que los canales codifican de forma bidireccional, en tanto el utrículo y el sáculo no tienen una

buena sensibilidad bidireccional.

Conclusiones1. La diferencia principal en los diferentes órganos vestibulares es la cinética del conjunto

de corrientes iónicas expresadas por las células ciliadas: las células de los canales

semicirculares son más rápidas que las células del utrículo y del sáculo.

3. La corriente de K+ sostenida (IK,s) es la corriente dominante en las células de los canales

semicirculares, mientras que en el utrículo, es despreciable.

4. La corriente de K+ activada por Ca2+ (IK,Ca) es la corriente dominante en el utrículo.

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5. La corriente de K+ transitoria sensible a 4-AP (IK,t) contribuye de manera similar en el

utrículo y en los canales semicirculares, sin embargo, su cinética de activación e inactivación

es cinco veces más rápida en las células de los canales semicirculares.

6. En las células de los canales semicirculares, hay al menos dos tipos de ICa: una sostenida,

posiblemente tipo L, y una inactivante, posiblemente tipo T.

7. La corriente rectificante de entrada tipo IK1, se encuentra expresada en el 100% de las

células del sáculo y del utrículo, y en el 60% de las células de los canales semicirculares. La

magnitud de IK1, así como el porcentaje de activación de esta conductancia en valores cercanos

al potencial de membrana, fue significativamente mayor en las células saculares.

8. Nuestro estudio sugiere que, en el axolotl, la expresión de corrientes iónicas, así como

sus cinéticas se encuentran regionalizadas en los diferentes órganos vestibulares, lo cual

determinaría la especialización funcional que cada órgano tiene dentro del aparato vestibular.

9. Estos resultados nos permiten concluir que las células ciliadas del utrículo y sáculo del

axolotl no tienen propiedades electrofisiológicas que sugieran que están relacionadas con la

codificación de estímulos sonoros, hecho que coincide con observaciones conductuales que

indican que estos animales no emiten sonidos (vocalizaciones) ni responden a estímulos

auditivos.

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