RESUMEN El surgimiento de cepas resistentes a antimicrobianos en el ambiente se ha

incrementado drásticamente como consecuencia del uso desmedido e indiscriminado de antibióticos en estos sistemas. La transferencia de plásmidos que codifican resistencia a agentes antimicrobianos constituye un problema de salud pública, por lo que la posibilidad de transferencia de genes de resistencia en la naturaleza ha llamado la atención para su estudio en los últimos años.

Trabajos previos han demostrado que la transferencia del plásmido pRSA1 entre Aeromonas salmonicida el cual es patógeno de peces y Aeromonas hydrophila, patógeno del humano se lleva a cabo con éxito in vitro. Bajo este antecedente, en la presente investigación se demostró la transferencia de este plásmido bajo condiciones naturales. Como el género Aeromonas spp. es considerado un grupo nativo de ambientes acuáticos, el modelo biológico utilizado fue Ciprinus carpio, carpa susceptible a la infección por Aeromonas salmonicida y Aeromonas hydrophila.

Se generaron doce mutantes de cepas de A. hydrophila aisladas de pescado congelado y de cuadros diarreicos por transposición con el transposón miniTn5luxCDABEKm2 derivado de Photorhabdus luminiscens y el gen ntpII, el cual codifica para una neomicina fosfotransferasa que confiere resistencia a kanamicina. Los experimentos para la demostrar la transferencia del plásmido pRSA1 entre A. salmonicida y A. hydrophila fueron diseñados con el objetivo de simular las condiciones naturales del medio en donde se encuentran habitando estas dos especies bacterianas.

Se realizaron pruebas de infección con A. salmonicida y A. hydrophila respectivamente

por contaminación ambiental. La recuperación de transconjugantes se realizó en lugares donde los microorganismos ingresan a sus hospederos (tracto intestinal y branquias). Los criterios de identificación de transconjugantes fueron, la resistencia adquirida a tetraciclina, trimetoprim y sulfametoxasol, la resistencia a kanamicina y emisión de luz conferida por el transposón miniTn5luxCDABE.

Para determinar que las resistencias adquiridas eran conferidas por el plásmido después de los ensayos in vivo, se puso en evidencia un amplicón de 900 pb a partir de preparaciones plasmídicas en A. hydrophila miniTn5luxCDABE/pRSA1. Claramente se observó una reducción de frecuencias de conjugación (hasta de tres logaritmos) en las doce cepas de A. hydrophila, bajo condiciones in vivo y en comparación con los ensayos in vitro.

Para la cepa 6504 se observó una eficiente conjugación bajo las dos condiciones probadas, tanto in vitro como in vivo, esto resultó de interés por lo que se diseñó un experimento con esta cepa que permitiera identificar transconjugantes a diferentes concentraciones celulares y así determinar la mínima cantidad de bacterias, capaces de transferir el plásmido pRSA1. Se determinó que a concentraciones de 1X104 y 1X105 UFC/mL se recuperan transconjugantes con una frecuencia de 10-6.

Los resultados de esta investigación revelan que la transferencia de material genético in vivo del plásmido pRSA1 entre A. salmonicida y A. hydrophila, se lleva a cabo con éxito, lo cual explicaría una de las rutas de diseminación y surgimiento en la naturaleza de bacterias patógenas para el hombre resistentes a múltiples fármacos en este caso en sistemas acuáticos, lo cual representa un peligro potencial para la Salud Pública si estas llegaran a estar en contacto con el hombre a través del consumo de pescado crudo o insuficientemente cocido o bien mediante contaminación cruzada con otros alimentos.

INTRODUCCIÓN

Los agentes antimicrobianos se han usado ampliamente en la acuicultura para tratar infecciones debidas a una variedad de patógenos bacterianos de peces incluyendo A. hydrophila, A. salmonicida, Edwarsiella tarda, Pasteurella piscicida, Vibrio alguillarum y Yersinia ruckeri. A medida que esta industria se expande surgen preguntas en relación con las consecuencias de esta práctica, debido a que estos fármacos se administran mezclándolos con el alimento que se dispersan en el agua, contaminando directamente el ambiente, lo que resulta en presiones selectivas en el ecosistema expuesto (World Health Organization, 1999).

El surgimiento de resistencia antimicrobiana después del uso de agentes antimicrobianos en la acuacultura se ha documentado en bacterias que son patógenas de peces y en las que no lo son (opt. cit.)

A. salmonicida es un ejemplo de un microorganismo patógeno de peces el cual se ha descrito con frecuencia en muchos países por su resistencia a múltiples fármacos comúnmente usados en acuacultura. Estos incluyen sulfonamidas, tetraciclina, amoxilina, trimetoprim-sulfametoxasol y quinolonas (Dalsgaard y cols., 1994). Se ha reportado empíricamente que el primer aislamiento de A. salmonicida resistente a un agente antimicrobiano específico fue reportado poco después de la introducción del agente en el cultivo o producción de peces (Zhao & Aoki, 1992).

En patógenos de peces, muchos determinantes de resistencia a antibióticos son

portados en plásmidos R transferibles (Watanabe y cols., 1977; Aoki, 1997). La diseminación horizontal de plásmidos de resistencia de microorganismos patógenos de peces puede, por lo tanto dar lugar a la transferencia de genes de resistencia a otras bacterias, incluyendo aquellas que son patógenas de humanos (Aoki, 1997).

Cepas de A. salmonicida aisladas en 1989 de salmones enfermos de furunculosis en industrias piscícolas son un ejemplo de lo anterior, las cuales resultaron resistentes a tetraciclina, trimetoprim-sulfametoxasol (Sorum y cols., 2003). La transferencia horizontal de plásmidos se ha demostrado en bacterias aisladas de peces de agua dulce (Aoki, 1997) y en sedimentos marinos (Stewart & Sinigalliano, 1999). Los plásmidos que portan determinantes de resistencia también se han transferido in vitro de patógenos de peces a patógenos de humanos tales como Vibrio cholerae (Nakjima y cols., 1983), V. parahaemolyticus (Hayashi y cols., 1982), E. coli (Sandaa y cols., 1992), Aeromonas spp. (Vázquez y cols., 2005) y Streptococcus iniae (Weinstein y cols., 1997). Además, los plásmidos que portan determinantes de resistencia antimicrobiana múltiple se han transferido en microambientes, entre patógenos bacterianos de peces, humanos y otros animales (Kruse & Sorum, 1994).

El proceso de conjugación es considerado el principal camino para la transferencia horizontal de genes de resistencia entre bacterias. Es bien conocido que el proceso de conjugación juega un papel muy importante en la dispersión de material genético en la naturaleza, lo cual facilita la adaptación o establecimiento de microorganismos en diversos ambientes. La conjugación requiere el contacto directo entre célula y célula (donadora y receptora), con intervención de estructuras altamente especializadas como el pili y proteínas de superficie que participan como moléculas receptoras o de anclaje del pili. Esta interacción resulta en una transferencia unidireccional del material genético, de la célula donadora a la receptora. Esto esta mediado por plásmidos conjugativos, aunque algunos transposones también son capaces de desencadenar procesos de conjugación (Dionicio, 2002).

Las bacterias que han adquirido plásmidos R conjugativos, pueden infectar al humano, directamente por contacto directo a través de su ingesta de alimentos contaminados por lo que el problema va más allá de la acuacultura y se convierte además en un problema de Salud Pública (Negrete y cols., 2004).

Los humanos expuestos a los ambientes acuícolas pueden infectarse por bacterias de diferentes maneras. Por ejemplo Vibrio spp., que forma parte normal de la microbiota marina, puede causar infecciones en heridas en personas con cortadas abiertas o abrasiones. Las bacterias de ecosistemas acuícolas también pueden transmitirse de manera directa a los humanos durante el manejo de los peces (Blake y cols., 1979).

La aparición de resistencia a antibióticos en bacterias, además de ser un problema biológico, es sin lugar a dudas un problema médico, social, económico y ético, dado que las bacterias resistentes a los antibióticos son refractarias a la terapia y provocan mayor mortalidad y morbilidad (Cosgrove y cols., 2002; Mosdell y cols., 1991). En los últimos años se ha incrementado el número de aislamientos de A. hydrophila resistentes a antibióticos y dado que esta bacteria es patógena para el hombre, es necesario el reconocimiento de los patrones de resistencia que pudieran ir adquiriendo, para establecer medidas que eviten la selección de cepas multirresistentes que produzcan brotes epidémicos. Dada la presencia de plásmidos de resistencia en A. salmonicida, la cual es patógena de peces y a que comparte el mismo hábitat con A. hydrophila, la transferencia de plásmidos entre estas bacterias podría representar un peligro potencial para la Salud Pública, es por esto que en el presente trabajo de investigación se pretende estudiar la transferencia del plásmido de resistencia pRSA1 entre A. salmonicida y cepas de A. hydrophila aisladas de pescado y cuadros diarreicos bajo condiciones naturales (in vivo), utilizando a Ciprinus carpio como modelo biológico.

MATERIAL Y MÉTODOS La figura 1 ilustra la estrategia seguida en este trabajo.

Figura 1. Diagrama de trabajo de la conjugación in vitro

Mutagénesis por transposición

A. hydrophila Tn5luxCDABE RECEPTORAS

¿La capacidad receptora de A. hydrophila se

alteró?

Ciprinus carpio infectado de forma ambiental con A.

salmonicida 718 y con A. hydrophila Tn5luxCDABE

Recuperación de transconjugantes

Identificación de transconjugantes por

resistencia adquirida y por actividad de luciferasa

Amplificación por PCR del elemento genético Int y luxE-

nptII

A. salmonicida 718 (pRSA1)

Ciprinus carpio

Confirmación de la ausencia de microbiota

luminiscente

MATERIAL BIOLÓGICO

Las cepas utilizadas en esta investigación, incluyendo las cepas testigo, las cuales correspondieron a 19 cepas de A. hydrophila, una cepa de A. hydrophila ATCC 7966 o CECT839, una cepa de A. salmonicida con el plásmido conjugativo pRSA1 y una cepa de E. coli S17-1 λpir, la cual contiene el plásmido suicida miniTn5luxCDABE.

Cuadro 1. Cepas problema y testigo utilizadas en esta investigación

Clave Cepa Origen No. de colección o

características 65 A. hydrophilaa Pescado

5806 A. hydrophilaa Pescado3305 A. hydrophilaa Pescado118 A. hydrophilaa Pescado3801 A. hydrophilaa Pescado3506 A. hydrophilaa Pescado3302 A. hydrophilaa Pescado6504 A. hydrophilaa Pescado3002 A. hydrophilaa Pescado6610 A. hydrophilaa Clínico 5794 A. hydrophilaa Clínico 5881 A. hydrophilaa Clínico 6492 A. hydrophilaa Clínico 6698 A. hydrophilaa Clínico 6632 A. hydrophilaa Clínico 3611 A. hydrophilaa Clínico 6479 A. hydrophilaa Clínico 6587 A. hydrophilaa Clínico 3510 A. hydrophilaa Clínico

Identificadas genéticamente mediante análisis de los patrones

RFLP´s del gen 16S rDNA.

839 A. hydrophilaa Leche ATCC 79664

718

A. salmonicida1

Salmón

Plásmido pRSA1 (Tetr, Sulr, Tpr) Integrón clase 1, Tn 1721 (IS 600) truncado con tetA, IncU AmpS.

S17-

1

E. coli2 S17-1λpir

-

λ-pir lisogeno S17-1 (thi pro hsdR- hsdM+ recA RP4 2-

Tc: :Mu-Km: :Tn7(TpR

SmR)) - pUTminiTn5

luxCDABE - ori R6K, miniTn5 Km2

luxCDABE, mob (RP4), Ampr

1 Posee un plásmido conjugativo de 44Kb que codifica resistencia a: tetraciclina, trimetoprim y sulfametoxasol. Presenta una región de resistencias de 12Kb que consiste en un integrón de clase 1 con el cassette de una dihidrofolato reductasa dhfrA16, el cassette sulI y un transposón truncado Tn1721 con el gen tetA, como se observar en la fig 1. Proporcionada por el Dr. Glenn Rhodes. Center for Ecology and Hydrology. Lancaster, UK. 2 Posee un plásmido conjugativo (suicida), contiene las secuencias flanqueantes iniciales y finales de reconocimiento de la transposasa, en donde se encuentra el operón completo luxCDABE sin promotor y el gen nptII proveniente del transposón Tn5, que codifica una neomicina fosfotransferasa, la cual confiere resistencia a kanamicina Fig 2. Proporcionada por el Dr. Shawn Lewenza de la Universidad de British Columbia. Canada. 3Laboratorio de Bacteriología Médica ENCB-IPN. 4American Type Culture Collection Rockhville USA. Proporcionada por la Dra. Castro Escarpulli. ENCB. IPN. aAisladas e identificadas genéticamente en el laboratorio de Microbiología Sanitaria por la Dra. Graciela Castro Escarpulli3 y Dra. Miroslava Sanchez del laboratorio estatal de Hidalgo.

CONJUGACIÓN in vitro ENTRE A. salmonicida 718 (pRSA1) y A. hydrophila.

Este experimento consistió en poner en contacto las células donadoras y receptoras en

fase logarítmica que participaron en la conjugación durante 24 h para posteriormente determinar mediante selectores de antibiótico la presencia de transconjugantes. Walter y cols. (1987), así como Sorum y cols. (2003) reportan que las conjugaciones realizadas en medio sólido, en membrana de nitrocelulosa reproducen más consistentemente las frecuencias de conjugación, en comparación con la conjugación en medio líquido, razón por la cual se decidió realizar las conjugaciones en medio sólido. Los detalles se muestran a continuación: DONADORA: A. salmonicida 718 (pRSA1) (Amps, Tetr, Tpr y Sulr). RECEPTORA: A. hydrophila (Ampr, Tets, Tps y Suls)

1. Se sembró cada una de las cepas de A. hydrophila y A. salmonicida 718 (pRSA1) en caldo soya tripticasa a 37ºC por 24 h y a temperatura ambiente por 48 h respectivamente, hasta que se obtuvo una densidad óptica de 0.5 (leído en un espectrofotómetro a 600 nm).

2. Se mezclaron 100 μL de cada uno de los cultivos en un tubo eppendorf estéril, se mezcló en vórtex.

3. Cada suspensión celular se transfirió a un filtro de nitrocelulosa con poro de 0.22 μm el cual estaba sobre agar soya tripticasa. Se incubó a 28ºC durante 24 h

4. El filtro de nitrocelulosa con el crecimiento se transfirió a un tubo con 2 mL de solución salina estéril al 0.9% y se agitó en vórtex, hasta que se desprendió por completo el crecimiento del papel filtro.

5. Se centrifugó a 5000 rpm durante 1 min, para posteriormente eliminar el sobrenadante. 6. A partir del paquete celular, se realizaron diluciones decimales hasta 10-10 en solución

salina estéril al 0.9%. 7. De cada dilución se tomaron 100 μL y se sembraron por extensión en superficie en agar

soya tripticasa suplementado con ampicilina (125 μg/mL) y tetraciclina (25 μg/mL) para la selección de las transconjugantes, mientras que para la selección de las receptoras se sembró igualmente por extensión en superficie en agar soya tripticasa suplementado con ampicilina (125 μg/mL).

8. Se incubó durante 24 h a 37ºC y se contaron las colonias, las cuales correspondieron a las transconjugantes, determinando así la frecuencia de conjugación para cada cepa de A. hydrophila. Para la determinación de frecuencias de conjugación se aplicó la siguiente operación aritmética: Frecuencia de conjugación = (UFC/mL transconjugantes) / (UFC/mL receptoras).

9. Se seleccionaron de 2 a 3 colonias de transconjugantes, resembrándose en agar soya tripticasa suplementado con ampicilina (125 μg/mL) y tetraciclina (25 μg/mL). (Procedimiento modificado: Schmidt y cols., 2001).

EXTRACCIÓN DE DNA PLASMÍDICO. TÉCNICA DE BIRNBOIM Y DOLY (MODIFICADA)

Las cepas de A. hydrophila que presentaron el fenotipo deseado: Ampr, Kans, Tets, Tps y Suls,

fueron seleccionadas para conjugar in vitro con A. salmonicida 718 (pRSA1) como se

muestra a continuación.

Para determinar que las transconjugantes recibieron el plásmido pRSA1 proveniente de A.

salmonicida 718 se realizó la extracción de plásmidos por la técnica de BIRNBOIM y DOLY

(MODIFICADA) como se muestra a continuación.

La técnica consiste en una lisis alcalina y se basa que, en el intervalo de pH estrecho que

existe de 12.0 a 12.5, ocurre la desnaturalización del DNA cromosomal no superenrollado generándose una masa de DNA lineal la cual se puede separar por centrifugación. La modificación consiste en la eliminación del remanente de proteína con limpieza de fenol:cloroformo. El procedimiento se desarrolló como sigue:

1. De un cultivo puro de 24 h de crecimiento se seleccionaron de 4 ó 5 colonias, se sembraron en 3 mL de caldo tripticaseína extracto de levadura a doble concentración (2 XTY) y se incubaron a 37°C en agitación durante 18 a 24 h

2. Se transfirieron 1.5 mL del cultivo a tubos y se centrifugó en una microcentrífuga a 12 000 rpm durante 5 min, posteriormente se eliminó el sobrenadante.

3. Se resuspendió el paquete celular con 100 μL de solución I (Tris-HCl 25 mM pH 8, EDTA 10 mM, glucosa 50 mM) y 1 μL de RNasa (10 mg/mL).

4. Se mezcló y se dejó 5 min a temperatura ambiente. 5. Se adicionó un volumen de 200 μL de la solución II (lisis) (NaOH 0.2N-SDS 1%), se

mezcló por inversión (con cuidado) y se colocó inmediatamente en hielo durante 5 min. 6. Se precipitó el DNA cromosomal, las proteínas y el SDS con 150 μL de la solución III

(acetato de potasio 5 M, ácido acético glacial pH 4.8), se mezcló por inversión (con cuidado) y se colocó en hielo durante 5 min.

7. El tubo se centrifugó a 12 000 rpm durante 5 min. 8. Se tomaron 400 μL del sobrenadante y se transfirieron cuidadosamente a otro tubo. 9. Se adicionaron 200 μL de cloroformo-fenol saturado (100-100) con Tris pH 7.8. 10. El tubo se centrifugó a 12 000 rpm durante 5 min. 11. Se precipitó el DNA por adición de 0.64 volúmenes de isopropanol frío y se mezcló por

inversión. 12. El tubo se centrifugó a 12 000 rpm por 5 min. 13. Se eliminaron las sales mediante 2 lavados con 100 μL de etanol al 70%. 14. Se decantó e invirtió el tubo sobre papel absorbente y se dejó secar a temperatura

ambiente. 15. El botón se resuspendió en 50 µL de solución reguladora TE (Tris-HCL 10mM, EDTA-1

mM, pH 8) (Birnboim & Doly, 1979). Se utilizó como testigo de extracción a A. salmonicida 718 con el plásmido conjugativo pRSA1.

INTRODUCCIÓN DE GEN REPORTERO Y SELECTOR POR MUTAGÉNESIS CON EL TRANSPOSÓN miniTn5LuxCDABE EN A. hydrophila POR CONJUGACIÓN CON E. coli S17-1 λpir. DONADORA: E. coli S17-1 λpir miniTn5luxCDABE (AmpR y KanR). RECEPTORA: A. hydrophila (AmpR y Kans).

1. Se sembraron las cepas de E. coli S17-1 λpir y A. hydrophila en caldo soya tripticasa a 37ºC, hasta obtener una densidad óptica de 0.5 (leído en un espectrofotómetro a 600 nm).

2. Se mezclaron en proporción 1:1 cada uno de los cultivos en un tubo eppendorf estéril, se homogeneizó la suspensión en vórtex.

Las cepas de A. hydrophila que conjugaron in vitro con A. salmonicida 718 pRSA1, fueron

mutadas cromosómicamente con el transposón miniTn5lux por conjugación entre Escherichia

coli S17-1 λpir, como se detalla a continuación:

3. La suspensión celular se transfirió a una caja Petri con agar soya tripticasa que contenía un filtro de nitrocelulosa con poro de 0.22 μm. Se incubó a 37ºC durante 24 h

4. El filtro de nitrocelulosa con el crecimiento se transfirió a un tubo con 500 μL de solución salina estéril al 0.9% y se agitó en vortex hasta que se desprendió todo el crecimiento del papel filtro.

5. A partir de este botón celular, se realizaron diluciones decimales en solución salina al 0.9%.

6. Se sembraron por extensión en superficie 100 μL de cada dilución en agar almidón sales biliares verde brillante suplementado con kanamicina (30 μg/mL).

7. Se incubó durante 24 h a 28ºC y se seleccionaron las transposantes por su resistencia a kanamicina (30 μg/mL) y por la emisión de luz.

AMPLIFICACIÓN DE luxE-nptII MEDIANTE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) EXTRACCIÓN DE DNA CROMOSÓMICO DE A. hydrophila miniTn5lux 1. Se preparó un cultivo líquido de 18 a 24 h de las cepas de A. hydrophila miniTn5luxCDABE

incubado a 280C. 2. Se colocaron 1.5 mL del cultivo en un tubo para microcentrífuga y se centrifugó 1 min a

5000 rpm, para descartar el sobrenadante. 3. Se agregaron 500 μL de TE (50/20), y las células se resuspendieron, se centrifugó 1 min a

5000 rpm, para descartar el sobrenadante. 4. Se agregaron 175 μL de TE (50/20) para resuspender las células. 5. Se agregaron 5 μL de proteinasa K (20 mg/mL) y 20μl de SDS al 10%, y se agitó

cuidadosamente para mezclar y se incubó a 56º C de 1 a 2 h. 6. Se agregaron 500 μL de TE (10/1) y 20 μL de NaCl 5 M, se agitó cuidadosamente. 7. Se realizaron dos extracciones con fenol, agregando 500 μL de fenol al tubo, agitando con

cuidado (15 min de preferencia en un dispositivo rotatorio) para mezclar lo mejor posible y se centrifugó por 10 min.

8. Se hizo una extracción con 500 μL de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1), se agitó cuidadosamente y se centrifugó por 2 min.

9. Se hicieron cuatro extracciones con éter saturado con agua para eliminar todo rastro de fenol, y se incubó a 65º C de 5 – 10 min para evaporar el éter.

10. Se agregaron 500 μL de isopropanol, se agitó con mucho cuidado por inversión y se centrifugó por 30 seg. Se descartó el sobrenadante.

11. Se enjuagó el DNA con 1 mL de etanol al 70% frio, y se centrifugó 30 seg. Se descartó el sobrenadante.

12. Se secó el DNA a 65ºC y se disolvió en 100 μL de agua desionizada estéril. (Sambrook, 1989).

AMPLIFICACIÓN DE luxE-nptII MEDIANTE PCR Para la amplificación mediante PCR de gen luxE-nptII se sometieron a la amplificación aproximadamente 200-300 ng del DNA genómico, en un volumen final de 50 μL. La mezcla de reacción contenía: Tris-HCl 20 mM (pH8.4), KCl 50 mM, MgCl2 1.5 mM,, desoxirribonucleósidos trifosfato dNTP´s (dATP, dCTP, dGTP y dTTP ) 0.3 mM de cada uno, iniciadores Fwd y Rev 10 µM de cada uno y 1 U de Taq polimerasa. Las condiciones para cada ciclo de reacción programada fueron: Desnaturalización inicial a 94°C durante 3 min y 35 ciclos en las siguientes condiciones: 94°C durante 1 min (Desnaturalización), 52°C durante 1 min (Alineamiento), 74°C durante 1.30 min (Extensión). Al finalizar se efectuó una última extensión a 74°C durante 10

Para comprobar que las cepas de A. hydrophila poseen el transposón integrado se amplificó

una región del transposón miniTn5luxCDABE que corresponde a los genes luxE-nptII

mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como se indica a continuación.

min Las secuencias de los iniciadores diseñados para este propósito se muestran en el cuadro 4.

Cuadro 2. Iniciadores empleados para la amplificación del gen luxE-nptII.

ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS DE PCR luxE-nptII POR ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA AL 1.5%.

1. 50 mL de solución reguladora de TAE 1X se colocaron en un matraz y se adicionaron 0.75 g de agarosa, se calentó hasta su disolución.

2. Se vació el gel en una placa cuando estuvo aproximadamente a 45°C, se colocó el peine para formar los pozos, hasta que se gelificó.

3. Se preparó una mezcla 15 μL del producto de PCR con 5 μL de regulador de carga. 4. Se colocó en cada pozo 15 μL de cada una de las muestras. En un pozo se colocaran 5

μL del marcador de peso molecular del fago ФX174/HaeIII. 5. Se conectó a una fuente de poder a 60 volts por 2 h 6. Se tiñó el gel durante 20 min con bromuro de etidio en una concentración de 1 µg/mL. 7. Se observó en un documentador de imágenes (Sambrook, 1989).

TRANSFERENCIA in vivo DEL PLÁSMIDO pRSA1 ENTRE A. salmonicida 718 y cepas de A. hydrophila miniTn5luxCDABE.

Se empleó como modelo biológico en la transferencia del plásmido pRSA1 a Ciprinus carpio (Carpa platinorecipientes con 2 litros de agua con verde de malaquita a una concentración de 40 mg/L y tiosulfato de sodio durante un periodo de 5 días y con cambio constante de agua. Una vez transcurrido este tiempo se agruparon los peces en conjuntos de tres, en peceras de cristal con 6 litros de agua y tiosulfato de sodio, la cual estuvo a temperatura ambiente, con oxigenación constante. Estos se mantuvieron durante un periodo de aclimatación de 2 semanas. Antes de infectar con A. salmonicida 718, los peces fueron sometidos a varios factores productores de estrés entre ellos: incremento gradual de temperatura hasta 32ºC (con termostatos regulables) e inanición (Sampson, 2001; Esch & Hasen, 1980; Walter & Plumb, 1980). Esto es con el objetivo de aumentar las posibilidades de colonización del microorganismo en los peces estresados. INDUCCIÓN DE LA INFECCIÓN

Región Amplificada

Secuencia 5´ 3´ Tamaño esperado del amplicón

FW 5` CTT TCT TTG AGG ATG AAA TGC´3 luxE-nptII. RV 5` GTC GGT CTT GAC AAA AAG AAC´3

1000 pb

Aquellas cepas de A. hydrophila que presentaron el fenotipo Ampr, Kans, Tets, Tps y Suls, que

lograron conjugar in vitro y que fueron mutadas por inserción cromosomal con el

miniTn5luxCDABE, que se logró hacer evidente el elemento genético del transposón luxE-

ntpIIpor PCR, se escogieron para ensayar la conjugación in vivo.

1. A partir de una colonia aislada de A. salmonicida 718 (pRSA1), se inoculó un tubo con 10

mL de caldo Luria. Se incubó a temperatura ambiente a 200 rpm de 48 a 72 h 2. Una vez transcurrido el tiempo, se concentró el cultivo por centrifugación. 3. Se realizaron dos lavados del paquete celular con PBS estéril. Y se ajustó la suspensión

celular a una densidad óptica de 0.5-1.0, lo cual correspondió a una concertación de 108 células/mL. (leído en un espectrofotómetro a 600 nm).

INFECCIÓN POR INOCULACIÓN INTRAPERITONEAL 1. Una vez que los peces fueron sometidos a los factores productores de estrés antes

mencionados, estos se anestesiaron por inmersión (Norqvist y cols., 1989) en recipientes de cristal conteniendo benzocaína sódica a una concentración de 40 mg/L de agua (Kozinska y cols., 2002).

2. A partir de la suspensión celular de A. salmonicida 718 (pRSA1), se inocularon intraperitonealmente 0.1 mL en cada uno de los peces (108 UFC/mL) (Fernández cols., 1995). Se utilizaron controles negativos inoculando peces con 0.1 mL de PBS.

3. Los peces se dejaron recuperar, sumergiéndolos en peceras individuales conteniendo agua sin anestésico, manteniéndolos bajo los mismos factores estresantes de inanición, bajos niveles de oxigeno e incremento de la temperatura a 32oC durante 4 días más (Sampson, 2001).

4. Se esperó que la infección en los peces se hiciera aparente en un periodo máximo de siete días.

INFECCIÓN POR INMERSIÓN 1. A partir de la suspensión celular de A. salmonicida 718 (pRSA1), se preparó una pecera

con agua conteniendo a la cepa virulenta a una concentración de 105 células/mL. 2. Se colocaron a los peces en la pecera conteniendo la cepa de A. salmonicida 718 (pRSA1),

durante un periodo de 2 h (Norqvist y cols., 1989 (modificado)1. 3. Una vez transcurrido el tiempo necesario se pasaron los peces a recipientes de 6 litros de

agua, manteniéndolos bajo los mismos factores estresantes de inanición e incremento de la temperatura a 32oC (Sampson, 2001).

CONJUGACIÓN in vivo 1. Cada una de las cepas mutantes de A. hydrophila miniTn5lux se crecieron en caldo Luria

suplementado con kanamicina (30μg/mL) durante 18 a 24 h en agitación. 1La modificación consistió en incrementar el tiempo de exposición del microorganismo con el que se indujo la infección. Esto es de un tiempo de 30 min a 2 h de exposición por contaminación ambiental. 2. Una vez crecidas las cepas de A. hydrophila miniTn5luxCDABE fueron concentradas por

centrifugación y lavadas dos veces con PBS estéril. 3. La suspensión celular de cada una de las cepas fue ajustada a una densidad óptica de 0.5,

lo cual correspondió aproximadamente a una concentración de 108 células/mL (leído en un espectrofotómetro a 600 nm).

4. A partir de esta suspensión se realizaron las diluciones necesarias para obtener una

concentración de 105 células por mL en un volumen final de 500 mL. 5. Los peces a los cuales se les indujo la colonización por la cepa donadora del plásmido

pRSA1 se colocaron en peceras individuales conteniendo 500 mL agua con cada una de las cepas A. hydrophila receptoras del plásmido pRSA1 durante 2 h, fue sin los factores productores de estrés.

6. Inmediatamente se sacrificaron por asfixia con cloroformo para efectuar la disección por arriba y a lo largo de la línea lateral, desde el opérculo hasta el ano de tal manera que fuera expuestas las vísceras. Se tomaron muestras del contenido intestinal y branquias para realizar la búsqueda de transconjugantes de A. hydrophila miniTn5lux, las cuales se procesaron de la siguiente forma:

7. En el caso de las branquias, se dividieron en dos partes, la primera parte se colocó en 1 mL de PBS estéril y se homogeneizó en vortex, se recuperó el sobrenadante, el cual se centrifugó durante 1 min a 5000 rpm/min.

8. El botón obtenido se resuspendió en 100 μL y se sembró por extensión en superficie placas conteniendo medio AASBVB suplementado con los antibióticos de selección ampicilina (125 μg/mL), tetraciclina (25 μg/mL), kanamicina (30 μg/mL), y sulfametoxasol/trimetroprim (23.75/1.25 μg/mL).

9. Para el caso del contenido intestinal también se dividió en dos partes iguales y una de ellas

se sembró de forma directa por extensión en superficie en placas conteniendo medio AASBVB suplementado con los antibióticos de selección ampicilina (125 μg/mL), tetraciclina (25 μg/mL), kanamicina (30 μg/mL), y sulfametoxasol/trimetroprim (23.75/1.25 μg/mL).

10. La segunda porción (tanto de branquias como contenido intestinal) se diluyó seriadamente en PBS estéril y las diluciones resultantes se espatularon sobre cajas de AASBVV con los antibióticos de selección. Las placas se incubaron durante 24 h a 32ºC para la selección de transconjugantes.

11. Cada una de las diluciones se sembraron por extensión en superficie en agar AASBVB suplementado con ampicilina (125 μg/mL), y kanamicina (30 μg/mL). Las placas se incubaron durante 24 h a 32ºC. (Figura 3).

12. Se contaron las colonias, las cuales correspondieron a las transconjugantes, determinando así la frecuencia de conjugación para cada cepa de A. hydrophila. Para la determinación de frecuencias de conjugación se aplicó la siguiente operación aritmética: Frecuencia de conjugación = (UFC/mL transconjugantes) / (UFC/mL receptoras).

13. Se documentaron las placas de selección tomando fotografías en la oscuridad, con una cámara profesional NIKON, con una película ASA 3200.

14. Se seleccionaron colonias con morfología característica del género y por la emisión de luz y se resembraron en agar TSA suplementado con ampicilina (125 μg/mL), tetraciclina (25 μg/ mL), kanamicina (50 μg/mL) y sulfametoxasol/trimetroprim (23.75/1.25 μg/mL). Se procedió a la amplificación por PCR el elemento genético Int que corresponde al extremo 5´ del integrón de pRSA1 el cual codifica para una integrasa de clase 1 (Sorum cols., 2003).

RESULTADOS DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA DE DONADORAS Y RECEPTORAS PARA LA PRODUCCIÓN DE TRANSCONJUGANTES 1. Cada una de las cepas mutantes generadas de A. hydrophila miniTn5lux y A. salmonicida

718 se crecieron en caldo Luria suplementado con kanamicina (30μg/mL) y tetraciclina (25 μg/mL) durante 18 a 24 h en agitación respectivamente.

2. Una vez crecidas las cepas de A. hydrophila miniTn5lux y A. salmonicida 718 fueron concentradas por centrifugación y lavadas dos veces con PBS estéril.

3. La suspensión celular de cada una de las cepas fue ajustada a una densidad óptica de 0.5, lo cual correspondió a una concertación de aproximadamente 108 células/mL.

4. A partir de esta suspensión celular se realizaron las diluciones apropiadas en PBS estéril para obtener 10, 102, 103, 104 y 105 células por mililitro en un volumen final del 500 mL.

5. Las diluciones se sembraron por vaciado en placa en agar cuenta estándar (ACE) y se incubaron a 280C (A. hydrophila) y temperatura ambiente (A. salmonicida) para verificar el contenido celular.

A partir de cada una de las concentraciones celulares se realizó el mismo procedimiento de infección antes mencionado para la recuperación de transconjugantes del contenido intestinal y de branquias.

RESULTADOS

De las cepas de A. hydrophila que presentaron el fenotipo deseado es decir, resistencia

a ampicilina y sensibilidad a kanamicina, tetraciclina y Sulfametoxasol/ Trimetoprim, 16 cepas fueron elegidas para conjugar in vitro con A. salmonicida 718 (pRSA1), ya que estos

marcadores de sensibilidad y resistencia fueron utilizados para seleccionar las transconjugantes del plásmido pRSA1, que les conferirá los determinantes de resistencia antes mencionados.

De acuerdo a los resultados obtenidos en las pruebas anteriores la ampicilina (100 μg) y la tetraciclina (20 μg) fueron utilizados como antibióticos de selección para las transconjugantes de A. hydrophila, tanto in vitro como in vivo. Por otro lado, kanamicina (30μg) fue utilizada para la selección de las transposantes de las cepas de A. hydrophila.

A las veinte cepas de A. hydrophila se les realizó el análisis plasmidíco mediante su extracción por medio de la técnica de Birnboim y Doly (modificada). Sin embargo, debido a que algunas cepas que no presentaron el fenotipo de resistencias deseado (3611, 6479, 6587 y 3002), fueron eliminadas del estudio. DETERMINACION DE LA PRESENCIA DE PLASMIDOS NATIVOS EN LAS CEPAS DE A. hydrophila. TÉCNICA DE BIRNBOIM Y DOLLY (MODIFICADA)

Al realizar la extracción de DNA plasmidíco por la técnica modificada de Birnboim y Doly en las cepas de A. hydrophila se determinó la presencia de plásmidos en ocho de las veinte cepas analizadas (cepas 3305, 6504, 3611, 3302, 3801, 5806, 6479 y 6610). Cabe mencionar que las cepas 3611, 3305, 3302, 3801, 6610 y 5806 se identificaron más de un plásmido de diversos tamaños (Figura 2).

Una vez identificadas aquellas cepas que poseían en fenotipo de interés (Ampr, Kans, Tets, Tms y Suls), se procedió a realizar las conjugaciones in vitro con A. salmonicida 718 (pRSA1).

FRECUENCIAS DE CONJUGACIÓN in vitro ENTRE A. salmonicida 718 (pRSA1)

Y A. hydrophila Sólo 12 cepas (5794, 5806, 118, 6632, 6698, 6504, 6492, 3305, 3510, 3506, 839 y

3302), lograron recibir el plásmido conjugativo pRSA1, proveniente de A. salmonicida 718 con frecuencias que variaron desde 10-3 a 10-6 (Cuadro 4).

Cuadro 4. Frecuencias de conjugación in vitro entre A. hydrophila y A. salmonicida 718 (pRSA1).

Cepa

Clave

Origen de aislamiento

1º ensayo 2º ensayo 3º ensayo Frecuencia promedio

Aquellas cepas de A. hydrophila que no lograron conjugar in vitro con A. salmonicida 718 (pRSA1) fueron eliminadas de este estudio.

Todas las cepas de A. hydrophila que recibieron el plásmido fueron identificadas mediante la resistencia adquirida a tetraciclina (20 μg/mL), reacción a la prueba de oxidasa y mediante la extracción de DNA plasmidíco por la técnica de Birnboim y Doly modificada para así observar la banda de 44 kb, correspondiente a la del plásmido conjugativo pRSA1 como se muestra en la figura 5 y 6.

DEMOSTRACIÓN DE LA PRESENCIA DEL PLASMIDO pRSA1 EN LAS TRANSOCNJUGANTES DE A. hydrophila. TÉCNICA BIRBOIM Y DOLY MODIFICADA.

De las 12 cepas de A. hydrophila (5794, 5806, 118, 6632, 6698, 6504, 6492, 3305, 3510, 3506, 839 y 3302) que lograron conjugar in vitro con A. salmonicida 718, se procedió a realizar la extracción de DNA plasmídico. MUTAGENESIS CON EL TRANSPOSÓN miniTn5luxCDABE EN A. hydrophila

Debido a la abundancia de bacterias resistentes a antibióticos en la microbiota de los peces, se reducían las posibilidades de recuperar las transconjugantes de A. hydrophila de los ensayos in vivo. Para facilitar el seguimiento de las transconjugantes las doce cepas de A. hydrophila que lograron recibir el plásmido pRSA1 in vitro fueron mutadas con el transposón miniTn5luxCDABE proveniente del plásmido pUT en E. coli S17-1 λpir, para introducir el gen reportero de luciferasa la cual está codificada en el operón lux y el gen nptII. Es importante mencionar que se realizó por cultivo la búsqueda de flora luminiscente nativa en la microbiota de la carpa para poner en evidencia la ausencia de bacterias luminiscentes capaces de enmascarar las mutantes que se generaron.

Con estos marcadores de selección y reportero se incrementaron las posibilidades de

aislar e identificar a las transconjugantes que se obtuvieron de los ensayos de conjugación in vivo con A. salmonicida 718 (pRSA1), eliminando a gran parte de la microbiota acompañante y a cualquier otra cepa de A. hydrophila resistente a tetraciclina que no se derive de la conjugación con A. salmonicida 718 y por supuesto que la emisión de luz indicará que es la misma cepa de Aeromonas que se introdujo al sistema.

Doce mutantes de A. hydrophila fueron generadas por transposición con el operón completo de luxCDABE derivado de Photorhabdus luminiscens y el gen nptII proveniente del

A. hydrophila 65 Pescado No conjugó A. hydrophila 5806 Pescado 7.4 X 10-3 7 X 10-3 4 X 10-3 6.13 X10-3

A. hydrophila 3506 Pescado 4.3 X 10-4 3.5 X 10-4 9 X 10-4 5.6 X 10-4 A. hydrophila 118 Pescado 4.4 X 10-5 1.8 X 10-4 7 X 10-4 3.08 X 10-4 A. hydrophila 3510 Clínico 4.3 X 10-6 2.5 X 10-6 6 X 10-6 4.3 X 10-6 A. hydrophila 3801 Pescado No conjugó A. hydrophila 839 Pescado 1.1 X 10-3 7.5 X 10-3 5.6 X 10-3 4.7 X 10-3 A. hydrophila 3305 Pescado 1.6 X 10-6 2.4 X 10-5 3.9 X 10-5 2.15 X 10-5 A. hydrophila 3302 Pescado 1 X 10-5 8.7 X 10-6 6 X 10-6 8.23 X 10-6 A. hydrophila 6504 Pescado 6 X 10-5 6.1 X 10-5 2 X 10-5 4.7 X 10-5 A. hydrophila 6610 Clínico No conjugó A. hydrophila 5794 Clínico 3.6 X 10-4 4 X 10-3 8.3 X 10-3 4.22 X 10-4 A. hydrophila 5881 Clínico No conjugó A. hydrophila 6492 Clínico 1 X 10-4 2.6 X 10-4 5.6 X 10-4 3.06 X 10-4 A. hydrophila 6698 Clínico 1.8 X 10-5 6.2 X 10-5 5.3 X 10-5 4.43 X 10-5 A. hydrophila 6632 Clínico 2 X 10-4 1.8 X 10-4 4.1 X 10-4 2.63 X 10-4

transposón Tn5, el cual codifica para una neomicina fosfotransferasa la cual confiere resistencia a kanamicina.

Estas doce mutantes fueron seleccionadas por su resistencia a kanamicina y por la

emisión de luz debido a la actividad de luciferasa. Clonas de las doce cepas transpuestas que fueron resistentes a kanamicina pero la actividad de luciferasa no se hizo evidente, esto es por que el transposón miniTn5lux no se insertó cerca de un promotor que le permitiera su expresión, lo que hizo que la resistencia a kanamicina se adquiriera más no la actividad de luciferasa, mientras que en aquellas células que recibieron el transposón cerca de un promotor la emisión de luz se hizo evidente (figura 3 y 7). La emisión de luz descarta también una posible inserción o cointegración cromosomal del plásmido pUTlux.

Figura 5. Fotografías obtenidas de una de las doce mutantes generadas por transposición (cepa 6504) con el miniTn5luxCDABE mostrando la actividad de luciferasa. Fotografías tomadas con

película asa 3200: Imagen A (1/60 de segundo de exposición) e imagen B (5 min de exposición). Obsérvese el desarrollo de colonias resistentes a kanamicina (30μg/mL) sin

emisión de luz, (indicadas en flechas rojas) clonas en donde el operón luxCDABE no se insertó cerca de un promotor (IMAGEN A) y colonias luminiscentes (IMAGEN B) clonas en donde el

operón luxCDABE se insertó cerca de un promotor que le permitió su expresión.

Para contar con una evidencia adicional de la mutagénesis inducida en las cepas de A. hydrophila y descartar la presencia de bacterias luminiscentes endógenas se diseñaron iniciadores que permitieron demostrar por PCR la presencia del transposón en las doce cepas de A. hydrophila mutadas. Estos iniciadores amplificaron un fragmento que va desde una región del gen luxE; el cual codifica para la sintetasa encargada de la biosíntesis del sustrato de la enzima luciferasa, hasta otro fragmento gen nptII el cual codifica la enzima neomicina fosfotransferasa, la cual confiere resistencia a kanamicina. El producto de PCR de aproximadamente 1000 pb, permitió saber si el transposón se encontraba insertado en el cromosoma del huésped.

Se identificó un amplicón de la talla molecular esperada (aproximadamente 1000pb), lo

cual indica que está presente el transposón miniTn5luxCDABE que se utilizó para mutar a las doce cepas de A. hydrophila (figura 8). En todos los casos, se confirmó la presencia de este amplicón, lo que fue útil como un criterio de identificación de las transconjugantes obtenidas de

A B

los ensayos in vivo, ya que los genes nptII y luxE por separado en una bacteria de manera natural nunca darían lugar a tal amplicón.

Figura 6. Amplificación mediante PCR del elemento genético luxE-nptII de las 12 cepas de A. hydrophila capaces de conjugar in vitro con A. salmonicida 718 (pRSA1). Carril: M: Marcador de peso molecular fago ФX174/HaeIII. Carriles 1-12: A. hydrophila miniTn5luxDABE cepas: 5794, 118, 6632, 6698, 6492, 3510, 3506, 839, 5806, 6504, 3305 y 3302. Carril 13: Testigo negativo;

A. hydrophila 839. Carril 14: Testigo positivo; E. coli S17-1 λpir miniTn5luxCDABE. CONJUGACIÓN in vitro ENTRE A. salmonicida 718 (pRSA1) Y A. hydrophila miniTn5lux.

Para determinar que la mutación inducida por el miniTn5lux en las doce cepas de A. hydrophila, no afectó la capacidad para poder conjugar nuevamente con A. salmonicida 718, o en su defecto que no se modificó sensiblemente la frecuencia de conjugación de estas cepas, se montaron nuevamente los ensayos de conjugación in vitro, obteniéndose frecuencias muy similares a las observadas en la conjugación de las mismas cepas de A. hydrophila sin el transposón (cuadro 5).

Cuadro 5. Comparación de frecuencias de conjugación entre las 12 cepas nativas de A. hydrophila y las

mismas cepas mutadas con el transposón miniTnluxCDABE.

Cepa Clave Frecuencia de conjugación in vitro cepas nativas

Frecuencia de conjugación in vitro cepas mutantes

A. hydrophila 3302 4.89 X10-5 1.9 X10-5 A. hydrophila 3506 1.62 X10-3 8.46 X10-5 A. hydrophila 6698 1.76 X10-3 5.48 X10-4 A. hydrophila 6632 1.09 X10-3 2.58 X10-4 A. hydrophila 6504 1.28 X10-3 1.06 X10-4 A. hydrophila 6492 1.05 X10-4 2.53 X10-5

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

1353 1078 pb 872 pb 603 pb

310

TRANSFERENCIA in vivo DEL PLÁSMIDO pRSA1 ENTRE A. salmonicida 718 y cepas de A. hydrophila miniTn5luxCDABE

Los ensayos de conjugación in vivo se realizaron por triplicado para determinar si existía alguna consistencia en las frecuencias de conjugación obtenidas. La búsqueda de transconjugantes de A. hydrophila miniTn5lux se realizó en sitios en donde comúnmente los microorganismos ingresan a su hospedero, estos fueron: tracto intestinal y superficies branquiales. En la cuadro 9 se muestran las frecuencias de conjugación obtenidas para las doce mutantes de A. hydrophila miniTn5lux de los tres ensayos de transferencia in vivo del plásmido conjugativo pRSA1.

Las doce cepas (5794, 5806, 118, 6632, 6698, 6504, 6492, 3305, 3510, 3506, 839 y

3302), lograron recibir el plásmido conjugativo pRSA1, proveniente de A. salmonicida 718 con frecuencias que variaron desde 10-4 a 10-7 (cuadro 9).

Los antibióticos de selección para las transconjugantes obtenidas de los ensayos in vivo de las doce cepas de A. hydrophila fueron: 100 μg/mL de ampicilina ya que la cepa donadora del plásmido conjugativo es sensible a este antibiótico y resistente a tetraciclina (resistencia conferida por el plásmido), 20 μg/mL de tetraciclina, 23.75/1.25 μg/mL, sulfametoxazol/trimetroprim y 30 μg/mL de kanamicina (resistencia conferida por el transposón miniTn5luxCDABE).

Debido a que en el medio de selección se desarrollaron colonias no luminiscentes

resistentes a kanamicina, tetraciclina, trimetroprim, sulfametoxasol y ampicilina de transconjugantes en las placas de AASBVB, se tuvo que realizar un conteo diferencial de colonias luminiscentes para obtener frecuencias de conjugación correctas. En la figura 9 se observa una de las placas de selección de transconjugantes luminiscentes. Nótese la presencia de gran cantidad de colonias a luz visible y el número de las transconjugantes de A. hydrophila expuestas a la oscuridad que muestran la actividad de luciferasa.

A. hydrophila 3305 1.94X10-5 1.31 X10-5 A. hydrophila 5806 2.08 X10-3 1.79 X10-4 A. hydrophila 5794 4.17 X10-4 5.43 X10-5 A. hydrophila 118 2.62 X10-4 5.81 X10-5 A. hydrophila 839 1.67 X10-3 1.73 X10-5 A. hydrophila 3510 3.98 X10-5 3.57 X10-4

B

Figura 7. Fotografía de una de las placas de selección con y sin luz de transconjugantes in vivo

mostrando la recuperación de transconjugantes de A. hydrophila luminiscentes. Nótese la presencia de microbiota asociada resistente a los antibióticos de contraselección que no

luminescen en la oscuridad y las colonias de A. hydrophila transconjugantes indicadas con flechas rojas que luminescen en la oscuridad (IMAGEN A) y la presencia de transconjugantes luminiscentes resistentes a los antibióticos de selección (IMAGEN B) Fotografías tomadas con

película asa 3200: Imagen A (1/60 de segundo de exposición) e imagen B (5 min de exposición).

CONCENTRACIÓN MÍNIMA DE A. DONADORA Y RECEPTORA PARA LA OBTENCIÓN DE TRANSCONJUGANTES.

Para la cepa 6504 se observó una buena frecuencia de conjugación bajo las dos condiciones probadas, tanto in vitro como in vivo (Cuadro 8), esto resultó de gran interés para diseñar un experimento con esta misma cepa que permitiera identificar transconjugantes a diferentes concentraciones de bacterias donadoras y receptoras del plásmido pRSA1, para así poder estimar la factibilidad de que esta transferencia ocurra en condiciones naturales. Después de establecer las condiciones necesarias se llevaron a cabo los experimentos de conjugación in vivo con 1, 10, 100 y 1000 células/mL de la clona 6504 y cantidades equivalentes de A. salmonicida 718 la cual mostró una eficiente frecuencia para conjugar in vivo con un volumen final de 500 mL, se procedió a la recuperación de transconjugantes del contenido intestinal y superficies branquiales. Las concentraciones celulares se eligieron bajo la premisa de que con concentraciones de 1, 000,000 UFC/mL de A. salmonicida y A. hydrophila miniTn5luxCDABE (cepa 6504) se lograron recuperar transconjugantes con frecuencias de 10-3 y 10-5. CONFIRMACION DE LA TRANSFERENCIA DE pRSA1 MEDIANTE LA AMPLIFICACIÓN POR PCR DEL ELEMENTO GENÉTICO Int DE LAS 12 TRANSCONJUGANTES in vivo.

La amplificación de un segmento del gen que codifica una integrasa usando los iniciadores descritos por Zhang y cols, 2006, rindió un amplicón de una talla molecular de 923 pb mediante PCR a partir de preparaciones plasmídicas o cromosomales en las doce cepas de A. hydrophila miniTn5lux tentativamente portadoras del plásmido pRSA1 por lo que las resistencias múltiples de las cepas están asociadas al plásmido conjugativo (Figura 10). Este amplicón corresponde a una región altamente conservada de este plásmido. Esta secuencia es denominada Int, la cual codifica una integrasa perteneciente al integrón de clase 1 que posee

A

este plásmido. De tal forma que al obtener este amplicón a partir de preparaciones plasmídicas resulta claro que esta asociado al plásmido pRSA1 y a que la transferencia del mismo se llevó a cabo con éxito en las receptoras de A. hydrophila miniTn5luxCDABE.

Figura 8. Amplificación del elemento genético Int mediante PCR en las 12 cepas de A.

hydrophila miniTn5lux transconjugantes obtenidas de los ensayos in vivo con A. salmonicida 718 (pRSA1). Carril: M: Marcador de Boeringher VIII. Carriles 1-12: A. hydrophila

miniTn5luxDABE cepas: 5794, 118, 6632, 6698, 6492, 3510, 3506, 839, 5806, 6504, 3305 y 3302. Carril 13: Testigo positivo; A. salmonicida 718 (pRSA1).

COMPARACIÓN DE FRECUENCIAS DE CONJUGACION EN LOS ENSAYOS in vitro E in vivo ENTRE A. salmonicida 718 y A. hydrophila

Se observó una tendencia de reducción de frecuencias de conjugación, hasta de 3 logaritmos en las doce cepas de A. hydrophila, bajo condiciones estandarizadas de laboratorio (in vitro) y en comparación con los realizados bajo condiciones in vivo. Las condiciones del medio acuático y del modelo biológico son adversas para que el evento de conjugación entre A. salmonicida 718 y A. hydrophila se lleve a cabo, tanto que, para la recuperación de transconjugantes se hizo uso de herramientas moleculares para identificarlas (miniTn5lux) y PCR dirigida contra el plásmido (Int).

DISCUSIÓN

Todas las cepas de A. hydrophila estudiadas presentaron resistencia a ampicilina (10μg). La resistencia a este β lactámico es intrínseca en este género bacteriano, generalmente está codificada en el gen cphA el cual codifica una metalo β lactamasa. McKeon y cols. (1995) han reportado que el 100% de cepas de A. hydrophila aisladas de aguas residuales presentan resistencia a este antibiótico. Estos mismos resultados de resistencia a este fármaco los logramos observar en las veinte cepas de A. hydrophila estudiadas.

A. salmonicida 718 es una cepa atípica que presenta el plásmido conjugativo pRSA1 y presenta sensibilidad a ampicilina, lo que permitió usar este antibiótico como selector de transconjugantes junto con tetraciclina (20 μg/mL). La cepa de E. coli S17-1 λpir utilizada como donadora del plásmido suicida el cual contiene el transposón miniTn5luxCDABE, presentó

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 M

1114 900 692 501 489 404

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 M pb

resistencia a este mismo antibiótico, siendo así kanamicina el antibiótico utilizado para la selección de las transposantes.

La resistencia a tetraciclina ha sido extensamente estudiada en el género Aeromonas y se menciona que regularmente esta resistencia esta asociada a la presencia de plásmidos conjugativos del grupo de incompatibilidad U (Rhodes y cols., 2004), por lo que podría suponerse que las cepas 3611 y 6479 las cuales presentaron plásmidos, pudieran estar relacionados con este grupo de incompatibilidad y por supuesto con la resistencia. Mientras que para las cepas 3002 y 6587 las cuales exhibieron resistencia a tetraciclina; resistencia asociada a plásmidos conjugativos y que no presentaron plásmidos, sugiere que esta resistencia es cromosomal. Sorum y cols. (2003) mencionan que estas resistencias al no encontrarse en plásmidos probablemente un transposón llevó a cabo la integración en el cromosoma del hospedero; este fenómeno pudo haber sucedido en estas dos cepas explicando así la ausencia de plásmidos. Dicho fenómeno es confirmado por DePaola y cols. (1988) quienes mencionan que el determinante de resistencia a tetraciclina puede estar localizado cromosomalmente.

En lo que respecta a la presencia de plásmidos mediante la extracción modificada de Birnboim y Doly, se lograron hacer evidentes moléculas de diversos tamaños. En algunas cepas se encontró más de un plásmido; tal es el caso de la cepa 3611, la cual presentó 4 plásmidos diferentes. Brown y cols. (1997) reportan la presencia de plásmidos en 22 de 140 cepas de Aeromonas spp. estudiadas (16 % de incidencia), con tamaños que varían de 2.3 a 100 kb, estas cepas fueron aisladas de aguas residuales, mientras que nosotros encontramos una incidencia de 40%, en las 20 cepas. Esto podría asociarse a que las cepas provienen de un origen diferente (heces humanas y pescado congelado).

Por otro lado fue examinado el potencial para transferir in vitro el plásmido pRSA1 de A. salmonicida 718 a cepas de A. hydrophila, bajo condiciones estandarizadas de laboratorio. De las 16 cepas que se probaron sólo 12 de ellas lograron recibir con éxito el plásmido pRSA1. Montando las conjugaciones en medio sólido se obtuvieron frecuencias de conjugación que varían desde 10-3 a 10-6 (cuadro 5).

Una de las características de las cepas portadoras de plásmidos que pertenecen al grupo de incompatibilidad U, incluido el plásmido pRSA1 es que presentan un pili pequeño y rígido, que es característico de plásmidos de amplio rango de hospedero, como la conjugación con este tipo de estructuras es totalmente dependiente de superficie, por ser pili muy cortos, se considera que las conjugaciones en medio sólido son más eficientes (Bradley, 1980).

Sandaa y Enger (1996b), reportan que el plásmido pRSA1 tuvo una frecuencia de transferencia a E. coli HB101 de 1.4X10-2, así Schmidt y cols (2001), reportan frecuencias de conjugación con E. coli de 4.3X10-4. Las frecuencias obtenidas en este trabajo (10-3-10-4) tienen gran similitud con las reportadas por los autores antes mencionados.

Sorum y cols. (2003), reportan que el plásmido pRSA1 fue transferido con éxito a E. coli DH5α a 22ºC con frecuencias de conjugación de 1.2X10-3 a 0.59 desde 1 a 51 h después de montada la conjugación. Frecuencias similares fueron también observadas en cepas de Salmonella enterica. pRSA1 también pudo ser transferido con éxito a Vibrio cholerae, V. parahaemolitycus, Yersinia ruckeri, no obstante, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus no lograron recibir pRSA1. Con base en lo anterior, consideramos que el tiempo adecuado para recuperar el máximo número de transconjugantes y así obtener las frecuencias de conjugación elevadas son 24 h de conjugación entre A. salmonicida 718 (pRSA1) y las 12 cepas de A. hydrophila. Los experimentos de transferencia conjugacional se realizaron por triplicado para corroborar que las frecuencias de conjugación obtenidas fueran las correctas, observando consistencias en las frecuencias en los tres ensayos realizados con las doce cepas.

Como se puede observar en el cuadro 5 algunas cepas de la misma especie no lograron

recibir el plásmido conjugativo pRSA1; es decir 4 de 16 cepas. De Gelder y cols. (2005), mencionan que aunque generalmente el rango de hospedero se determina por las características del plásmido, también existen diversas características tanto del donador pero

principalmente del receptor, las cuales podrían influenciar negativa o positivamente el proceso de conjugación.

La estabilidad de los plásmidos es diferente en cada microorganismo, como es el caso de los plásmidos pFEC59, pCOM69 y pHN32, los cuales son estables en E. coli pero inestables en Salmonella typhi (Mendoza-Medellin cols., 2004), por lo que podría suponerse que el plásmido pRSA1 pierde su estabilidad y/o capacidad de replicarse al estar en las cepas de A. hydrophila 6610, 5881, 65 y 3801, como es el caso de los plásmidos antes mencionados. Con relación a la incompatibilidad plasmídica se sabe que los plásmidos pASOT, pASOT2, pASOT3 y pRSA1 pertenecientes al grupo de incompatibilidad U y que han sido identificados en cepas de Aeromonas (Adams cols., 1998), por lo que podría suponerse que los plásmidos identificados en las cepas de A. hydrophila 6610 y 3801 que no lograron recibir el plásmido pRSA1 de A. salmonicida 718 pertenecen a este grupo de incompatibilidad o bien que podría ser uno de ellos, lo que evitaría que el plásmido se estableciera en estas cepas en ausencia de presión selectiva.

Por último, los sistemas de restricción-modificación, son sistemas que impiden el establecimiento de DNA foráneo en la célula huésped, esto es por la presencia de endonucleasas de restricción que cortan el DNA y una metilasa que reconoce la misma secuencia de DNA y la metila (Semenova y cols., 2005). Recientemente Zhang y cols. (2000), identificaron una metiltransferasa en una cepa de A. hydrophila, la cual mostró una alta homología con la metilasa BsuBI de Bacillus subtilis identificada por Xu y Kapfer (1992) y a la de Rizobium leguminosarun (Rochepeau y cols., 1997), por lo que postuló la existencia de un sistema de restricción-modificación tipo II en esa cepa de A. hydrophila. En cuatro de nuestras cepas (6610, 65, 5881 y 3801), replicamos el experimento de conjugación por triplicado, no logrando recuperar transconjugantes, aún cuando se modificaron concentraciones de células donadoras y receptoras (datos no mostrados), por lo que podría sospecharse que en alguna o algunas de estas cuatro cepas existe un sistema de restricción-modificación como el identificado por Zhang y cols. (2000), ya que ellos mencionan que los intentos de introducir DNA plasmídico a A. hydrophila habían fracasado. Por lo que claramente, el sistema restricción-modificación podría representar una barrera para la transferencia horizontal del plásmido pRSA1 en las cepas de A. hydrophila no conjugativas.

Doce mutantes de A. hydrophila fueron generadas por transposición con el operón completo de luxCDABE derivado de Photorhabdus luminiscens y el gen nptII proveniente del transposón miniTn5. La selección inicial de las transposantes fue en el medio suplementado con kanamicina, pero las bacterias mejor etiquetadas se determinaron poniendo en evidencia su actividad de luciferasa observando las placas en la oscuridad.

Cabe mencionar que de las transposantes obtenidas, una gran cantidad de éstas no

emitían luz o bien la luz emitida era mínima en comparación con otras clonas las cuales mostraron una gran actividad de luciferasa, esto es debido a que aunque el transposón se integra al genoma del hospedero, la expresión del operón lux depende del sitio de inserción. Como se puede observar en la figura 4 la expresión del operón lux depende fundamentalmente de la transposición río abajo de una región promotora.

Varias aplicaciones en el uso del transposón miniTn5luxCDABE han sido demostradas,

por ejemplo, para monitorear en tiempo real la sobrevivencia de Yersinia enterocolitica en queso Camembert (Maoz y cols., 2002), como sonda para promotores en A. hydrophila y Chromobacterium violaceum (Winson y cols., 1998), en la sobrevivencia frente a cambios térmicos en E. coli O157:H7 (Ritchie y cols., 2003) y para la identificación de genes regulados diferencialmente en Pseudomonas aeruginosa (Lewenza cols., 2006).

El transposón miniTn5luxCDABE utilizado en esta investigación contiene las secuencias IR necesarias para el reconocimiento de la transposasa, así como el operón completo de luxCDABE sin promotor y el gen nptII, que codifica una neomicina fosfotransferasa, la cual confiere resistencia a kanamicina. Este transposón al contener genes que carecen de promotor, al insertarse en el cromosoma del hospedador, podrá o no fusionarse con un promotor el cual

como ya se mencionó le permite la expresión de luminiscencia (Winson y cols., 1998). Otros factores que pueden afectar la emisión de luz son: temperatura, disponibilidad de oxígeno, concentración de cloruro de sodio, y nutrientes (opt. cit.).

Los transposones ofrecen significantes ventajas para ser usados como herramientas

moleculares como: marcadores de selección (Goryshin y cols., 2000), como es en el caso del miniTn5luxCDABE, el cual también provee un gen reportero de luminiscencia. Aunque la transposición es un evento al azar, que puede generar un número elevado de inserciones en una misma reacción, una de las ventajas que ofrece el uso del transposón miniTn5luxCDABE es que produce transposiciones estables en el cromosoma del hospedador, ya que la secuencia que codifica la transposasa, queda fuera de las secuencias de inserción del transposón y por supuesto del gen reportero y el de resistencia al antibiótico.

Nauman y Reznikoff (2002) mencionan que la recuperación de transposantes utilizando el transposón Tn5 ocurre en muy bajas frecuencias, posiblemente porque los eventos de transposición en una sola célula son elevados, lo cual podría apagar genes esenciales para la sobrevivencia celular. Es por esto que cuando utilizamos el transposón miniTn5luxCDABE para introducir el gen reportero y el gen de selección, el número de transposantes fue menor al esperado, aún cuando se modificaron hasta 10:1 las proporciones de células receptoras de A. hydrophila y E. coli S17-1 λpir, las donadoras del transposón (Datos no mostrados).

El aislamiento de cepas resistentes a múltiples fármacos en el medio ambiente se ha incrementado drásticamente como consecuencia del uso desmedido e indiscriminado de estos antibióticos en estos sistemas. La transferencia de plásmidos R que codifican resistencia a agentes antimicrobianos constituye por lo tanto un problema de salud pública, por lo que la posibilidad de transferencia de genes que codifican resistencia a antimicrobianos en la naturaleza entre bacterias ha llamado la atención para su estudio en los últimos años.

El género Aeromonas spp. es considerado un grupo microbiano nativo de ambientes acuáticos, por lo que el modelo biológico ideal para demostrar el proceso natural de transferencia de material genético por conjugación fue Ciprinus carpio (carpa platino) ya que existe bastante documentación que indica que esta carpa de agua dulce es susceptible a la infección por A. salmonicida y A. hydrophila (Sampson, 2001).

Las condiciones de los experimentos para la demostración de la transferencia del plásmido conjugativo pRSA1 entre A. salmonicida y A. hydrophila miniTn5luxCDABE fueron diseñados con el objetivo de simular, en medida de lo posible las condiciones naturales del medio ambiente en donde se encuentran habitando estas dos especies bacterianas, dando lugar posiblemente a la transferencia de material genético por conjugación si ambas estuvieran presentes en el mismo lugar, ya sea colonizando piel, agallas o el tracto intestinal de un pez.

La estrategia inicial seguida para inducción de la colonización por A. salmonicida 718 (pRSA1) en el modelo biológico fue por inoculación en el peritoneo y por contaminación ambiental, es decir, por ingestión y la entrada en branquias del microorganismo en cuestión, esto es, dado que existe documentación que indica que tanto las superficies branquiales como intestinales son importantes zonas de colonización de A. hydrophila y A. salmonicida en los peces (O´Farrel y cols., 1999).

Las branquias tienen algunas características anatómicas que facilitan la colonización y el

ingreso de las bacterias. Entre las particularidades que contribuyen a que las branquias sean probablemente el sitio de entrada más común, se pueden mencionar: a) una gran superficie de interacción con el medio externo, b) una gran irrigación sanguínea y c) el permanente flujo de agua que pasa a través de ellas. En efecto, se ha demostrado que las branquias son el sitio de entrada de partículas inertes y de agentes patógenos bacterianos y virales. Se ha observado en experimentos con A. salmonicida que estas bacterias tanto vivas como muertas son incorporadas en las branquias (Smith, 1991).

La inducción de la colonización por la ruta gastrointestinal e intraperitoneal ha demostrado ser eficaz en truchas, carpas y salmones pero probablemente no es la ruta que emplea normalmente en la naturaleza (O´Farrel y cols., 1999). Asimismo tomando en cuenta lo anterior se consideró utilizar la vía de infección ambiental ya que habitualmente es la forma natural en que los peces son colonizados por los microorganismos.

Tomando en cuenta este antecedente, los sitios en donde se inició la búsqueda de transconjugantes fueron: branquias (superficies branquiales) e intestinos (contenido intestinal) siendo así considerados como lugares de colonización y posible conjugación entre A. salmonicida 718 y A. hydrophila miniTn5luxCDABE.

Sampson (2001), Esch y Hasen (1980), Walter y Plumb (1980), indican que las carpas, salmones y truchas en su estado juvenil sometidas a temperaturas de 32oC e inanición presentan mayor susceptibilidad a la infección por A. salmonicida. En nuestra investigación se pretendió aplicar estos mismos factores productores de estrés, después de haber infectado artificialmente por inoculación intraperitoneal y por contaminación ambiental; sin embargo una vez aplicadas las condiciones durante siete días (tiempo máximo en el que se hacen evidentes los signos de la de enfermedad en los peces) no se logró hacer evidente algún signo que indicara que A. salmonicida había colonizado y por lo tanto que la infección se había establecido.

Esta información sirvió para decidir llevar a cabo infecciones sucesivas a tiempos cortos

(de dos y cuatro h respectivamente) por contaminación ambiental con la cepa A. salmonicida 718 (pRSA1), donadora del plásmido conjugativo, durante dos h, después de las cuales se eliminaron las bacterias libres por lavados y posteriormente se contaminó de manera ambiental con cada una de las cepas receptoras de A. hydrophila miniTn5lux por separado, las cuales fueron las receptoras del plásmido pRSA1 con el mismo tiempo de exposición ambiental que la cepa donadora de pRSA1 (dos horas). Las transconjugantes pudieron identificarse tanto en branquias como en contenido intestinal. Los resultados del conteo de transconjugantes y receptoras indicaron una mayor frecuencia de conjugación en las superficies branquiales. Las características anatómicas y fisiológicas de las branquias descritas en párrafos anteriores, así como una menor competencia con la flora autóctona creemos que fueron las mas importantes y que pudieron influir en la conjugación entre A. salmonicida y A. hydrophila.

El uso del medio modificado AASBVB (agar-almidón-sales biliares-verde brillante) suplementado con los antibióticos de contraselección (ampicilina, tetraciclina, trimetoprim, sulfametoxasol y kanamicina), mostró ser altamente selectivo al eliminar gran parte de la microbiota presente en las branquias e intestinos de los peces como al grupo de los coliformes. Permitiendo identificar a las transconjugantes de A. hydrophila miniTn5luxCDABE eliminando a gran parte de la microbiota. La modificación de este medio consistió en incrementar la concentración original de verde brillante en el medio de AASBVB de 2 μg/mL hasta 20 μg/mL de medio de cultivo.

Los criterios para identificar a las transconjugantes obtenidas de los ensayos in vivo fueron: la resistencia al medio de selección con altas cantidades de sales biliares y verde brillante, las resistencias adquiridas por el plásmido conjugativo pRSA1 (tetraciclina, trimetoprim y sulfametoxasol), por su resistencia intrínseca a ampicilina (125 μg/mL), resistencia a kanamicina (30 μg/mL) la cual fue conferida por el miniTn5lux y principalmente por la emisión de luz de las mismas.

La emisión de luz debida a la actividad de luciferasa fue una herramienta de gran ayuda

para identificar a las transconjugantes de los ensayos de conjugación in vivo ya que aunque se suplementó el medio modificado AASBVB (agar-almidón-sales-biliares-verde-brillante) con los

antibióticos necesarios de contraselección (ampicilina, tetraciclina, trimetoprim, sulfametoxasol y kanamicina), se desarrollaron sobre este medio colonias resistentes a todos los antibióticos y con características pertenecientes al género Aeromonas (morfología colonial característica, bacilos cortos Gram negativos, reacción positiva a la prueba de oxidasa e hidrólisis del almidón) y a otros grupos microbianos incluyendo levaduras, por lo que la cuenta de colonias totales y el recuento diferencial de colonias luminiscentes en oscuridad, permitió descartar aquellas colonias que a la luz presentaban una morfología colonial semejante a la de las transconjugantes pero que observar en la oscuridad se detectó la emisión de luz de las colonias lo que permitió diferenciarlas.

Para comprobar que las resistencias adquiridas fueron conferidas por el plásmido pRSA1, y no por alguna mutación espontánea o por un elemento genético ajeno al plásmido conjugativo pRSA1, se decidió amplificar por PCR una región especifica de pRSA1 (Int), el cual correspondió al extremo 5´ del integrón de clase 1 que posee este plásmido, el cual codifica una integrasa de clase 1, logrando así identificar un amplicón de una talla molecular de 923 pb a partir de preparaciones plasmídicas de las transconjugantes obtenidas. Por otro lado identificando por PCR el amplicón de 1000 pb de origen cromosómico el cual correspondió al elemento genético luxE-ntpII, el cual es parte del transposón miniTn5luxCDABE con el cual se indujo la mutagénesis, esta amplificación aportó información suficiente para determinar que las transconjugantes recuperadas de los ensayos in vivo fueron las mismas que se introdujeron al sistema y que no corresponden a otra A. hydrophila resistente a tetraciclina y kanamicina que no se derivara de la conjugación ensayada.

En lo que se refiere a las frecuencias de conjugación obtenidas en los primeros ensayos in vivo con respecto a las obtenidos in vitro, se puede observar claramente ocurrió una disminución importante de hasta tres logaritmos en las frecuencias de conjugación. Estos resultados se obtuvieron de manera consistente en la mayoría de las cepas probadas, esto es atribuible a los múltiples factores que podrían influenciar negativamente la transferencia natural de plásmidos en estos sistemas, la disminución en la recuperación de transconjugantes puede ser afectada por la microbiota nativa del sistema acuático y del modelo biológico, la presencia de grandes cantidades de materia orgánica, pH, temperatura, concentración de las células donadoras y receptoras, la competencia que podría existir por el lugar de colonización con la microbiota presente lo cual resulta en un decremento en la recuperación de transconjugantes (Fernández-Astorga y cols., 1992; Sandt & Herson, 1991). Sin embargo la biota asociada también podría ejercer el efecto opuesto, facilitando la trasnsmisibilidad del plásmido, así la gran cantidad de coliformes podría actuar como intermediarios en cruzas triparentales.

Resultados similares sobre el efecto que ejerce la microbiota presente en estos sistemas para la transferencia natural del plásmidos son reportadas por O´Morchoe y cols. (1988). Otro factor a considerar en la reducción de la recuperación de transconjugantes es el modelo en donde se estudia el fenómeno de conjugación, se debe de recordar que en trabajos previos (Bale y cols., 1987b; Hausner & Wuertz, 1999; Sandaa & Enger, 1996a) se demuestra la transferencia conjugacional in situ en sistemas estáticos, es decir modelos en donde no existe algún factor que pudiera minimizar las posibilidades de contacto entre las células. Podemos considerar a nuestro modelo como un sistema dinámico que esta sujeto a una serie de variables que son propias de un organismo vivo incluyendo la inmunidad innata y adquirida, lo cual podría resultar en una disminución en el contacto entre las células y en consecuencia en una reducción en la frecuencia de conjugación.

La concentración de bacterias que participan en una matriz de conjugación es un criterio importante para la obtención de transconjugantes ya que de éste dependen las frecuencias de conjugación que se obtengan. Piper y cols. (1999) demostraron que la proporción óptima de células donadoras y receptoras (en fase logarítmica), para la conjugación in situ de Agrobacterium tumefaciens fue de 103 a 108 células/mL. Así también para Hausner y Wuertz (1999) demostraron que Alcaligenes eutrophus conjuga con bastante eficiencia cuando se encuentra en una concentración celular de 108 bacterias/mL. Bajo esta premisa decidimos lograr infecciones de A. salmonicida 718 (pRSA1) y A. hydrophila miniTn5lux con inóculos de

105 células/mL para así realizar la recuperación de transconjugantes, considerando esta concentración celular como la más adecuada para los ensayos de conjugación in vivo.

En la transferencia in vivo del plásmido pRSA1 el tiempo de contacto de las células

donadoras y receptoras fue de 2 h después de haber realizado la primera infección por contaminación ambiental con la cepa donadora del plásmido, tiempo necesario para su transferencia puesto que en un trabajo de Andrup y cols. (1998) demostraron que el plásmido pXO16, una estructura genética de 200 kb en Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, es capaz de transferirse en un tiempo final de 3.5 a 4 min, lo que resulta en una transferencia de 1 kb por segundo. Siendo también este plásmido movilizador de otros plásmidos no conjugativos, se demostró que a concentraciones de 4 X106 células receptoras de este plásmido se obtienen mejores frecuencias de conjugación. Siendo así tiempo y concentraciones y tiempos adecuados de A. salmonicida y A. hydrophila miniTn5luxCDABE para la transferencia exitosa del plásmido pRSA1 y la máxima recuperación de transconjugantes.

Trabajos previos han demostrado que las frecuencias de conjugación obtenidas de ensayos in vivo en intestino de ratón, intestino de lepidópteros, intestino de pollos son generalmente mas bajas que las obtenidas in vitro (Jarret & Stephenson, 1990). Los mismos resultados de disminución de las frecuencias de conjugación bajo las dos condiciones probadas fueron observados en la presente investigación.

Se ha demostrado que un gran número de componentes asociados al mucus intestinal y

de piel de truchas arcoiris en particular, aminoácidos (acido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, serina y treonina), carbohidratos (fucosa y galactosa), mono y diacilgliceroles y fosfolípidos (fosfatidil colina y fosfatidil inositol), actúan como quimioatrayentes para Vibrio anguillarum, importante patógeno de peces y anguilas (O´Toole y cols., 1999), por lo que no es difícil suponer que A. salmonicida y A. hydrophila, responden igual frente a la misma actividad quimiotáctica en estas superficies del modelo biológico utilizado, incluyendo superficies branquiales, en las cuales se encontró una mayor frecuencia de conjugación, quizás por la presencia de componentes antes mencionados pudieran actuar como agentes quimiotácticos para A. salmonicida y A. hydrophila.

La presencia de múltiples quimioatrayentes en las superficies mucoides del hospedero tiene implicaciones para la relación en la quimiotaxis y la virulencia bacteriana, y en nuestro caso en particular sobre la conjugación in situ.

Con la cepa 6504 se observó relativamente una alta frecuencia de conjugación bajo las dos condiciones probadas, tanto in vitro como in vivo, esta cepa resultó de gran interés para diseñar un experimento que permitiera establecer el número mínimo de bacterias donadoras y receptoras necesarias para una conjugación exitosa. Los resultados demostraron que la detección de transconjugantes se hace presente cuando se introducen al sistema al menos 104

UFC/mL. Creemos que no se lograron detectar transconjugantes a concentraciones menores,

puesto que las posibilidades de conjugación en el tracto intestinal o bien sobre la superficie de las branquias de los peces se minimizan al estar en cantidades bajas, ya que además de estar en mínimas concentraciones las posibilidades de encontrarse y estar en contacto para conjugar se reducen dramáticamente.

La transferencia de plásmidos en sistemas acuáticos ha sido demostrada anteriormente por Bale y cols. (1987b). Ellos observaron la transferencia natural de un plásmido de gran tamaño entre cepas de Pseudomonas aeruginosa sobre filtros en superficie de piedras no estériles de río. En un trabajo de Sandaa y Enger (1996b) las frecuencias de transferencia del plásmido pRSA1 desde A. salmonicida a bacterias receptoras nativas de sedimentos marinos fueron de 3.3 X 10-4, detectadas por plaqueo selectivo e hibridación colonial con una sonda de 4.3 Kb, dirigida a una región especifica del plásmido pRSA1. Siendo esto información la que sustenta que la transferencia de material genético por conjugación en ambientes naturales, incluyendo el acuático se puede llevar a cabo con éxito.

Kruse y Sorum (1994) demostraron que las frecuencias de transferencia de plásmidos

entre A. salmonicida y E. coli bajo condiciones estandarizadas de laboratorio y bajo condiciones naturales es decir, in vivo en salmones juveniles (Salmo salar) infectados artificialmente por A. salmonicida eran del mismo orden de magnitud (10-3), estos resultados no coinciden con los obtenidos en el presente trabajo, puesto que existen en el sistema in vivo múltiples factores que pudieron afectar el proceso de conjugación.

Debido a la pronunciada promiscuidad del plásmido pRSA1 (Sandaa & Enger, 1996a), esto resulta en una amplia variedad de bacterias que podrían participar como potenciales donadores en posteriores conjugaciones; esto podría ser la razón de haber encontrado flora resistente a tetraciclina, trimetoprim, sulfametoxasol y kanamicina, que presentaron características bioquímicas diferentes e iguales al género Aeromonas, estas características bioquímicas correspondían a comportamiento de enterobacterias (datos no mostrados).

Esta promiscuidad ha sido demostrada en un trabajo de Sandaa & Enger (1996a), en donde determinaron que este plásmido puede ser transferido a 46 biotipos microbianos diferentes, por lo que no es extraño haber encontrado microorganismos diferentes al género Aeromonas que pudieran haber recibido el plásmido conjugativo pRSA1.

Por otro lado existen estudios sobre aislamientos ambientales de cepas poseedoras de plásmidos donde se observó que estas cepas presentan una mayor frecuencia de conjugación que aquellas que no son nativas de ese ambiente (Fry & Day, 1990). Otro factor muy importante que contribuye a la alta frecuencia de transferencia encontrada en otros trabajos de conjugación in situ fue que la cepa de A. salmonicida poseedora del plásmido pRSA1 fue originalmente aislado de un ambiente marino (Sandaa & Enger 1996b).

Los resultados obtenidos en esta investigación revelan que la transferencia de material genético in vivo por conjugación del plásmido pRSA1 entre A. salmonicida y A. hydrophila, se lleva a cabo con éxito, lo cual explicaría una de las rutas de diseminación y surgimiento de bacterias patógenas del hombre resistentes a múltiples fármacos en la naturaleza y en este caso en sistemas acuáticos, y representa un peligro potencial para la Salud Pública si estas llegaran a estar en contacto con el hombre a través del consumo de pescado crudo o insuficientemente cocinado o durante la manipulación de otro tipo de alimentos por contaminación cruzada.

IX. CONCLUSIONES

1. La transferencia in vivo del plásmido pRSA1 entre A. salmonicida 718 y A. hydrophila se realiza con éxito en contenido intestinal y en superficies branquiales con frecuencias que varían de 10-4 a 10-6.

2. La detección de transconjugantes entre A. salmonicida 718 y A. hydrophila miniTn5lux en el sistema in vivo utilizado requirió de al menos 104 UFC/mL, con frecuencias de 10-

6. 3. El uso del transposon miniTn5luxCDABE, fue útil en la identificación de

transconjugantes obtenidas de los ensayos in vivo. 4. La identificación del extremo 5´ del integrón de pRSA1 mediante PCR mostró ser

altamente eficiente en la identificación de transconjugantes.