Analisis proteinMengapa kita menganalisis protein? Protein memainkan peran penting dalam hampir

seluruh proses biologis. Ini banyak fungsi protein adalah hasil dari lipat protein dalam banyak struktur 3D yang berbeda.

Analisis protein mencoba untuk menjelajahi bagaimana sekuens asam amino menentukan struktur protein dan bagaimana protein ini mengikat substrat dan molekul lainnya untuk menjalankan fungsi mereka.

Analisis protein memungkinkan kita untuk memahami fungsi dari protein berdasarkan strukturnya.

Langkah utama dalam Analisis Protein Ekstraksi protein. Pemurnian protein. Karakterisasi struktur protein.

Ekstraksi protein. Melibatkan efisiensi ekstraksi protein dan peptida

dalam bentuk biologis aktif dari jaringan.

Selama proses ini, inaktivasi enzim proteolitik diperlukan. Kenapa? Tidak menyebabkan degradasi protein yang terkandung dalam jaringan.

Ekstraksi protein: menyeragamkan dalam buffer fisiologis (0,05 M NaPO4, PH 7,4) yang mengandung inhibitor enzim proteolitik (EDTA, Pepstatin)

Ekstraksi peptida: rebus jaringan dengan Asam Asetat 1M selama 5 menit menghomogenkan jaringan dalam etanol / 0.1MHCl (rasio 3:1) pada 0 ° C. Ini akan meledak membuka vesikel untuk melepaskan peptida dalam larutan.

Pemurnian proteinProtein dapat dimurnikan sesuai dengan sifat tertentu yang mereka miliki. Properti ini memungkinkan kita untuk menggunakan teknik yang berbeda dalam memurnikan protein.

Protein Property

Technique

Solubility Differential Precipitation

Molecular Size Gel Filtration Chromatography

Molecular Charge

Ion Exchange Chromatography

Hydrophobicity Reversed Phase HPLC

Biological Activity

Affinity Chromatography

diferensial endapan

precipitation : proses pembentukan padat yang sebelumnya dipegang dalam larutan. Padatan dipisahkan dari larutan.

Ketika NH4 SO4 atau polietilen glikol ditambahkan ke dalam larutan protein, sebuah bentuk endapan dan dapat dipisahkan dari larutan setelah sentrifugasi.

Jika konsentrasi NH4 SO4 atau polietilen glikol meningkat, lebih bentuk endapan

Gel Filtrasi Chromatography Juga disebut Gel Permeation Chromatography. Memisahkan molekul protein sesuai dengan

ukuran molekul mereka. Solusinya dimasukkan ke bagian atas kolom

khusus. Kolom ini terdiri dari manik berpori khusus. Molekul kecil protein memasuki manik sementara

molekul besar tidak dapat dan tinggal di ruang antara manik-manik.

Oleh karena itu, molekul besar mengalir lebih cepat melalui kolom dan muncul pertama dari bawah kolom.

Keuntungan: jumlah yang lebih besar dari protein dapat dipisahkan.

Kekurangan: resolusi rendah..Gel Filtration Chromatography

Kromatografi Pertukaran Ion Memisahkan molekul protein sesuai dengan

muatan molekul mereka. Dalam teknik ini, manik-manik kolom memiliki

muatan tertentu pada mereka. Ini adalah hasil dari sebuah molekul yang melekat pada manik-manik ini.

Manik-manik mungkin ve dibebankan dengan melampirkan mereka untuk DEAE (diethylaminoethyl) selulosa atau-ve diisi dengan melampirkan mereka untuk karboksimetil selulosa.

Manik-manik di kolom tergantung pada protein yang Anda inginkan untuk memurnikan.

Jika protein-ve diisi maka Anda harus menggunakan manik-manik bermuatan positif dan sebaliknya.

bagaimana cara kerjanya?

Sebagai contoh, jika protein bunga bermuatan negatif, maka Anda akan menggunakan kolom DEAE-selulosa.

Protein akan mengikat manik-manik bermuatan positif.

Protein ini yang melekat pada manik-manik bisa dilepaskan dengan meningkatkan konsentrasi NaCl (garam atau lainnya).

The + ion Na (atau kation lainnya) akan bersaing dan mengikat manik-manik di kolom bukan protein.

Protein yang sangat bermuatan positif akan muncul pertama karena mereka akan ditolak oleh manik-manik.

Reversed Phase HPLC (Fase Terbalik HPLC) Teknik ini memurnikan protein sesuai dengan

hidrofobik mereka. HPLC - High Pressure Liquid Chromatography Kromatografi fase terbalik adalah bentuk

kromatografi di mana fase stasioner hidrofobik dan fase gerak lebih hidrofilik dari fase diam. Ini adalah "terbalik" dari kromatografi fase normal, di mana sebaliknya terjadi.

Larutan protein dipompa ke kolom yang berisi manik-manik silika dengan terlampir kelompok rantai hidrokarbon.

Kelompok-kelompok hidrokarbon mungkin berbeda. Contoh: Octacecyl, Butil, Propyl, Phenyldimethyl.

Kelompok-kelompok hidrofobik protein akan mengikat manik-manik.

Protein hidrofilik akan muncul dari kolom pertama. Ada berbagai ukuran kolom dengan lebar yang

bervariasi: Preperative (2,5-5cm) Analytical (0,4-1cm)

microbore (0.1-0.2cm) Pelarut yang digunakan: Tahap encer: Air + 0,1% asam Triflouroacetic Tahap Organik: AcetonitrileAffinity Chromatography Ini adalah cara yang paling ampuh dari protein

memurnikan. Dibutuhkan keuntungan dari afinitas tinggi banyak

protein untuk kelompok kimia tertentu atau molekul.

contoh: Concavalin A adalah protein yang mengikat

glukosa. Hal ini dapat dimurnikan dengan melewatkannya melalui kolom yang memiliki manik-manik khusus. Manik-manik memiliki glukosa yang menyertainya.

Glukosa binding protein mengikat manik-manik dan protein lain tidak.

Protein dapat dilepaskan dari manik-manik dengan meningkatkan konsentrasi glukosa. Ini akan

menggantikan protein glukosa mengikat dari manik-manik.

Protein CharacterizationKarakterisasi protein dan peptida melibatkan tiga proses yang berbeda:

Menentukan Komposisi Asam AminoMelibatkan mengetahui asam amino yang membentuk protein dan jumlah mereka.

Menentukan Urutan Asam Amino Melibatkan mengetahui urutan asam amino dari protein dalam pesanan mereka.

Menentukan massa Molekuler Protein tersebutMenentukan Komposisi Asam Amino

Peptida adalah pertama dihidrolisis menjadi asam amino penyusunnya dengan pemanasan dalam 6M HCl pada 110 º C selama 24 jam. Hal ini dilakukan di bawah vakum atau dalam suasana argon.

Asam-asam amino kemudian dipisahkan dengan HPLC.

Mereka diukur dengan mereaksikan mereka dengan senyawa yang disebut ninhidrin. Asam amino Alpha akan diberikan warna biru intens sementara asam imino (prolin, hydroproline) akan diberi warna kuning.

Konsentrasi asam amino tunggal sebanding dengan absorbansi cahaya dari solusi setelah menambahkan ninhidrin.

Profil elusi asam amino diperoleh. Eluting adalah pemisahan, dengan mencuci, satu padat dari yang lain.

Identitas asam amino terungkap volume elusi, yang merupakan volume penyangga yang diperlukan untuk menghapus aa dari kolom.

Menentukan Urutan Asam Amino Pehr Edman menemukan metode untuk pelabelan

amino-terminal peptida dan membelah itu dari peptida tanpa distrupting ikatan peptida antara lain aa residu.

Metode ini disebut degradasi Edman. Ini berurutan menghapus satu residu pada waktu

dari ujung amino dari peptida. Phenylisothiocyanate Pertama bereaksi dengan

gugus amino terminal untuk membentuk turunan phenylthiocarbamoyl.

Residu ini cyclizes dalam kondisi asam untuk memberikan asam amino PTH dan peptida dipersingkat oleh salah satu residu asam amino.

Ini asam amino-PTH diidentifikasi dengan HPLC. Otomatis mengulangi degradasi Edman oleh

sequenator yang dapat menganalisis urutan dari sekitar 50 asam amino panjang.

Komposisi asam amino dari peptida dipersingkat dapat dibandingkan dengan peptida asli.

Menentukan massa Molekuler Protein tersebut Spektrometri: Prosedur mengamati dan mengukur

panjang gelombang emisi elektromagnetik lain atau cahaya.

Massa Spektrometri melibatkan sumber ionisasi, penganalisis massa dan detektor. The terionisasi memukul analyzer massa. Waktu ion mengambil dalam penerbangan dicatat oleh memicu pulsa laser.

Hal ini tergantung pada satu prinsip Ion-ion yang lebih kecil akan terbang lebih cepat

dan tekan detektor pertama maka ion yang lebih besar mencapai. Ion-ion memukul detektor agar massa.