análisis antibióticos uhplc hrms - eurolab.org.es · 20 muestras blanco (3 bovino, 3 ovino, 4...
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LABORATORIO SALUD PÚBLICA DE VALENCIA
ANÁLISIS DE ANTIBIÓTICOS
EN TEJIDO ANIMAL
POR LC‐HRMS
Carmen Igualada Cañas
Unidad de Residuos de Medicamentos Veterinarios
Laboratorio Salud Pública Valencia
Jornadas de Referencia 2014: Análisis de Alimentos. Majadahonda 10-12 junio
LABORATORIO SALUD PÚBLICA DE VALENCIA
Jornadas de Referencia 2014: Análisis de Alimentos. Majadahonda 10-12 junio
• Conceptos básicos
• Estrategias trabajo Alta Resolución de masas
• Elaboración Base de Datos
• Método para análisis de antibióticos en tejido LC-HRMS
• Validación. Guia para la validación de Métodos de Screening para Residuos de Medicamentos Veterinarios: (20/1/2010)
• Resultados
• Aplicación en muestras
• “Post-Targeted” análisis
• Fragmentación
• Conclusiones
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CONCEPTOS BÁSICOS
Resolución de masa: (Resolving power):
Capacidad de un espectrómetro de masas de distinguir 2 iones con m/z similares.
‐ Procedimiento de medida
Peak width en unidades de masa
2 puntos pico: 5% altura pico (10% valley definition) o
50% altura pico (Full Width at Half Maximun: FWHM)
mmR∆
=m/z centroid del ión
peak width
en unidades de masa
Procedimiento de medida
Valor m/z de la medida
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MEDIDAS DE RESOLUCIÓN EN ESPECTROMETRÍA DE MASAS
R FWHM 2 x R 10%Valley Definition
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RESOLVING POWER EN ESPECTROMETRÍA DE MASAS
DECISIÓN 2002/657/CE
High resolution
R≥10000 en 10% Valle RFWHM ≥ 20000
En todo el rango de masas
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VARIACIÓN RESOLUCIÓN - m/z
zm
αR 1
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CONCEPTOS BÁSICOS
•Masa Nominal
Masa de un ión calculada usando la masa entera del isótopo más abundante de cada elemento. (H=1, C=12,O=16….)
•Masa Monoisotópica
Masa de un ión calculada usando la masa exacta del isótopo más abundante de cada elemento. (1H=1.0078, 12C=12.0000, 16 O=15.9949
•Abundancia Isotópica
Distribución natural de un mismo elemento con diferentes masas atómicas (12C=12.0000=98.9 % y 13C=13.0034= 1.1 %)
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Masas exactas y abundancias relativas ISOTOPOS
CONCEPTOS BÁSICOS
INTERPRETACIÓN
PATRÓN ISOTÓPICO
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CONCEPTOS BÁSICOS
•Exactitud de masa:
Diferencia (error) entre la masa medida o experimental y la masa calculada o teórica.
miliDaltons (1mDa= 0.001 uma)
ppm=(Dm/m)x 106
Cálculo error Da
Cálculo error mDa
Cálculo error ppm 610xm
mm
true
truemeas −=∆
310xmmm truemeas )( −=∆
)( truemeas mmm −=∆
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ANÁLISIS DE ANTIBIÓTICOS EN TEJIDO ANIMAL POR UHPLC‐HRMS
OBJETIVO
Cubrir las carencias del Método de inhibición del crecimiento bacteriano en placas:
•Falta de especificidad
•Falta de sensibilidad para algunos grupos y compuestos
DESARROLLAR MÉTODO SCREENING CUALITATIVO
MULTI-ANALITO MULTI-FAMILIA MULTI-MATRIZ
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ANÁLISIS DE ANTIBIÓTICOS EN TEJIDO ANIMAL POR UHPLC‐HRMS
Esquema del equipo Exactive-Orbitrap TM
fragmentacion
SOURCE
PSEUDO MS/MS
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Características Equipo Exactive-Orbitrap TM
•Full-Scan: 50-4000 m/z
•Resolución : max.100000 FWHM
•Masa Exacta: <1 ppm (cal. Interna); 2-3 ppm (cal. Externa)
•Pseudo MS/MS: Celda Colisión (HCD). Sin selección de ión precursor.
•Polarity switching: 1s
•Modo positivo, negativo, MS y MS/MS en 1 run
•Hasta 10 scan/s
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ESTRATEGIAS
“TARGETED” ANÁLISIS. SCREENING DE COMPUESTOS CONOCIDOS•Tenemos standards.•Se obtienen XIC de ión específico: ión molecular, isótopos, fragmentos.•RT o RRT•A menor ventana de extracción de masa, menos compuestos isobáricos interferentes
“POST-TARGETED” ANÁLISIS. SCREENING DE COMPUESTOS CONOCIDOS•No tenemos standards.•Se obtienen XIC de ión específico: ión molecular, isótopos, fragmentos.•Información BASE DE DATOS•RT o RRT ??•A menor ventana de extracción de masa, menos compuestos isobáricos interferentes•Tras la identificación se requiere obtener standards para completar estudio.
“NON-TARGETED” ANÁLISIS. SCREENING DE COMPUESTOS DESCONOCIDOS•Se obtienen XIC de iones inespecíficos. •Se estudian señales discriminatorias: Grupo control, grupo “incurred”•Elucidación estructural, Metabolómica, Biomarcadores.•Ultra high Resolution y <<error de masa (internal calibration: lock mass)
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Elaboración BASE DE DATOS
•Base de datos para “Targeted” Análisis
- Establecer condiciones Cromatografia Liquida (LC/ UHPLC)
- Establecer condiciones Espectrometría Masas: General.
- Adquisición MS : Polaridad: + y –
- Conocer Fórmula molecular de los compuestos
•Añadir “Non-Targeted” compuestos:
- Conocer Fórmula molecular de los compuestos
•Completar toda la información posible: -Aductos
- Fragmentos
- Conocer Fórmula molecular de los fragmentos
RT
Ión molecular oIón diagnostico
Patrón Isotópico
Fragmentos
Iones adicionales
!!complejo¡¡
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Elaboración BASE DE DATOS
Isótopos, aductos, fragmentos…
Fórmula empírica neutra
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BASE DE DATOS
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Lista de Targeted Compuestos y Familias
TETRACICLINAS: Epi-tetraciclina, Tetraciclina, Epi-oxitetraciclina, Oxitetraciclina, Epi-clortetraciclina, Clortetraciclina, Doxiciclina.PENICILINAS: Amoxicilina, Ampicilina, Penicilina G, Penicilina V, Oxacilina, Cloxacilina, Dicloxacilina, Nafcilina.CEFALOSPORINAS: Cefalexina, Ceftiofur, Desfuroylceftiofur, Cefoperazona.QUINOLONAS: Ac. Oxolínico, Flumequina, Danofloxacina, Ciprofloxacina, Enrofloxacina, Difloxacina.SULFONAMIDAS: Sulfatiazol, Sulfapiridina, Sulfametoxipiridazina, Sulfametazina, Sulfaquinoxalina, Sulfadimetoxina, Sulfadiazina, Sulfamerazina, Sulfacetamida.MACRÓLIDOS: Tilosina, Eritromicina, Tilmicosina, Espiramicina, Neospiramicina, LINCOSAMIDAS: Lincomicina
PATRONES INTERNOS: Demeclociclina, Penicilina G-D7, Amoxicilina-D4, Norfloxacina-D5, Roxitromicina, Sulfadimetoxina-D6
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1g muestra homogeneizada en tubos de 50
mL
UHPLC-HRMS. Orbitrap ExactiveTM
Filtrar por 0.2 µm PTFE
100 µL ISTDs+ 2 mL H2O ultrapura
+ 8 mL ACN
Agitar 10 min
centrifugar 5000 rpm, 5 minPasar el extractoa tubo
con 0.5 g de C18 y agitar 5 min.
Pasar el extractoa tubo de 15 ml y evaporar a sequedad 45ºC con N2
centrifugar 5000 rpm, 5 min
1000 µL 0.1% HCOOH:MeOH
(90:10)
ANÁLISIS DE ANTIBIÓTICOS EN TEJIDO ANIMAL POR UHPLC‐
HRMS
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Sistema LC:Autosampler: Accela Open ASUHPLC: Accela 1250 pump
Condiciones LC
Composición fase móvil: Fase móvil A: HCOOH 0.1%
Fase móvil B: Metanol (0.1% HCOOH)
Columna: Kinetex C18 XB (100 x 3.00 mm, 2.6 µ)
Modo Elución: Gradiente
Flujo: 400 µL/min
Volumen inyeccion: 10 µL
Condiciones HRMS
Sistema HRMS:Interfase: HESI IIAnalyzer: Orbitrap ExactiveTM
Automatic gain control : 106(Balanced) AGC
Resolving power (FWHM): 50.000 (High)
Switching polarity, mass range (m/z):
positive mode: 80-1200
negative mode: 80-1200
Spray voltage: 3.0 kV(+); 2.5kV(-)
Sheath gas flow rate: 45
Auxiliary gas flow rate: 10
Skimmer voltage: 20 V
Heater temperature: 225 ºC
Capillary temperature: 260 ºC
Capillary Voltage: 40V
Tube lens voltage: 110V
686M_LQ2 #87 RT: 1.00 AV: 1 NL: 4.19E6T: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00]
160 180 200 220 240 260 280 300 320 340m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
268.13986
349.05368
229.15434
248.14877213.12303150.05807
175.00140 259.09335241.12912
288.16614159.02751204.12271
273.08392219.13354
308.09061187.10741162.11221 336.22757193.00163 318.16562
CONDICIONES LC-HRMS. Orbitrap ExactiveTM
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ANÁLISIS DE ANTIBIÓTICOS EN TEJIDO ANIMAL POR UHPLC‐HRMS
VALIDACIÓN
• Decisión 2002/657/CE:
•Guia para la validación de Métodos de Screening para Residuos de Medicamentos Veterinarios: •Especificidad/Selectividad
•CCβ
•Cut-Off level
•Cut-off factor Fm
•Threshold value T
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Guia para la validación de Métodos de Screening para Residuos de Medicamentos Veterinarios: (20/1/2010)(compuestos con MRL)
•Habla de Validación Abreviada por Laboratorio Receptor. Indica Requisitos para el Laboratorio Receptor.•Screening Target Concentration (SCT): Concentración a partir de la cual el resultado del screening es “Positivo”. Debería ser ½ MRL.
•CCβ o Detection Capability: Contenido mínimo de un analito que podría ser detectado, identificado y/o cuantificado con una probabilidad de error de β. (βerror: probabilidad de falso negativo. Debe ser < 5 %). CCβ ≤ MRL
•Cut-Off level: Respuesta que indica que un analito está presente a la Screening Target Concentration o por encima de ésta.
•20 muestras blanco+ 20 muestras adicionadas a STC: si STC ≤ ½ LMR
•Cut-Off Level: Respuesta más baja de las muestras adicionadas a STC.
•Cálculo Threshold value T y Cut-off factor Fm
•SCT=CCβ si falsos negativos ≤ 5 %
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Guia para la validación de Métodos de Screening para Residuos de Medicamentos Veterinarios: (20/1/2010)(compuestos con MRL)
• Threshold value: T
donde, B = respuesta rel. media en los blancos
SDb= desviación Standard de esas respuestas
• Cut-Off factor: Fm
Según Decisión 202/657/CE CCβ está validado si:Fm > B
Además, si Fm > T, nº falsos positivos < 5%
T=B+(1.64 x SDb) Fm=M-(1.64 x SD)
Cálculo T y Fm
donde, M = respuesta rel. media en las muestras adicionadas a STC
SD= desviación Standard de esas respuestas
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Jornadas de Referencia 2014: Análisis de Alimentos. Majadahonda 10-12 junio
Validación Antibióticos Músculo y Riñón
Músculo
Riñón
Selección de Blancos: Procedentes de muestras “negativas” al Test de las 5 placas. Positivas a: Tetras, QNs, Penic, Sulf, Macr
Estudios previos: Se estimó experimentalmente Screening Level Concentration : 20 µg/Kg (Excepto: 13 µg/Kg PenG, AMX, AMP, TILM, y 6 µg/Kg PenV)
En todos los casos: ≤ ¼ LMR
20 muestras Blanco (3 bovino, 3 ovino, 4 ave, 4 conej, 1 equi, 1 porcino)
20 muestras adicionadas a SLC
20 muestras Blanco (4 bovino, 9 ovino, 7 porcino)
20 muestras adicionadas a SLC
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Jornadas de Referencia 2014: Análisis de Alimentos. Majadahonda 10-12 junio
Ejemplo Validación Enrofloxacina Músculo
T=B+(1.64 x SDb)
T=0,005+(1.64 x0,016)=0,031
Fm=M-(1.64 x SD)
Fm=1,664+(1.64 x0,416)=0,982
Fm>B
Fm>T
VALIDADO
SCREENING TARGET CONCENTRATION 20 µg/Kg
Cut-Off level
CCβ= 20 µg/Kg
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Ejemplo Validación Enrofloxacina Riñón
SCREENING TARGET CONCENTRATION 20 µg/Kg
T=B+(1.64 x SDb)
T=0,000+(1.64 x0,000)=0
Fm=M-(1.64 x SD)
Fm=2.255+(1.64 x0,471)=1.483
Fm>B
Fm>T
VALIDADO
CCβ= 20 µg/Kg
Cut-Off level
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Validación. Blanco Músculo Ave y adición al CCβ.
BlancoRT: 2.00 - 9.00
2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0Time (min)
0
50
1000
50
1000
50
1000
50
100
Rel
ativ
e A
bund
ance 0
50
1000
50
100 RT: 3.27
RT: 2.13
RT: 5.46
RT: 5.65
RT: 6.77
RT: 3.02 RT: 3.32
RT: 3.32
RT: 3.13
RT: 5.23
RT: 4.33
RT: 8.03RT: 6.60RT: 2.15 RT: 2.61
NL: 2.91E4m/z= 215.03773-215.05923 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS BM_221
NL: 3.20E4m/z= 366.09351-366.13013 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS BM_221
NL: 6.17E4m/z= 350.09939-350.13441 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS BM_221
NL: 7.68E5m/z= 422.24316-422.28538 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS BM_221
NL: 6.36E4m/z= 332.12339-332.15661 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS BM_221
NL: 1.47E4m/z= 349.06891-349.10381 F: FTMS {1,2} - p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS BM_221
RT: 2.00 - 9.00
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1000
50
1000
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ativ
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bund
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50
1000
50
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RT: 2.65
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NL: 7.57E4m/z= 366.09351-366.13013 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS E_20_221
NL: 2.87E5m/z= 350.09939-350.13441 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS E_20_221
NL: 3.58E5m/z= 422.24316-422.28538 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS E_20_221
NL: 2.67E5m/z= 332.12388-332.15710 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS E_20_221
NL: 9.78E4m/z= 349.06891-349.10381 F: FTMS {1,2} - p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS E_20_221
Adición CCβ
Sulfacetamida
Amoxicilina
Ampicilina
Espiramicina
Ciprofloxacina
Penicilina V
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Validación. Blanco Riñón Bovino y adición al CCβ.
Blanco Adición CCβ
Sulfacetamida
Amoxicilina
Ampicilina
Espiramicina
Ciprofloxacina
Penicilina V
RT: 2.00 - 9.00
2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0Time (min)
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e A
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50
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RT: 4.46
RT: 3.11
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RT: 4.35
RT: 5.36RT: 3.34
RT: 5.92
RT: 5.91
RT: 7.58
RT: 3.78RT: 3.61 RT: 4.45RT: 2.96
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NL: 3.90E4m/z= 366.09351-366.13013 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS E_20_2884
NL: 1.94E5m/z= 350.09939-350.13441 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS E_20_2884
NL: 3.78E4m/z= 422.24316-422.28538 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS E_20_2884
NL: 1.33E5m/z= 332.12388-332.15710 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS E_20_2884
NL: 1.84E5m/z= 349.06891-349.10381 F: FTMS {1,2} - p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS E_20_2884
RT: 2.00 - 9.00
2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0Time (min)
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50
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RT: 4.71
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RT: 5.42
RT: 5.96
RT: 5.74
RT: 3.33RT: 5.36
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RT: 5.90
RT: 4.39RT: 3.76RT: 2.97
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NL: 7.75E3m/z= 366.09351-366.13013 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS BM_2884
NL: 7.79E4m/z= 350.09939-350.13441 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS BM_2884
NL: 3.06E4m/z= 422.24316-422.28538 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS BM_2884
NL: 7.17E4m/z= 332.12388-332.15710 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS BM_2884
NL: 1.63E5m/z= 349.06891-349.10381 F: FTMS {1,2} - p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS BM_2884
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Interpretación resultados
IDENTIFICACION(Validación)
CONFIRMACIÓN
•RT o RRT
•Masa exacta [M+H]+ o [M-H]-
(mass window 5 ppm)
•RT o RRT
•Masa exacta [M+H]+ o [M-H]-
•Patrón Isotópico
•Aductos
•Fragmentos (HCD)
(mass window 5 ppm)
•RIA (Relative Isotopic Abundance)
LABORATORIO SALUD PÚBLICA DE VALENCIA
Jornadas de Referencia 2014: Análisis de Alimentos. Majadahonda 10-12 junio
RT: 2.51 - 6.01 SM: 7G
2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0Time (min)
0
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Rel
ativ
e A
bund
ance
ENROFLOXACIN
RT: 4.33AA: 531429
NL: 1.05E5m/z= 360.16999-360.17359 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS 621M
355 360 365 370 375 380 385m/z
0
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0
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90
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
360.17114C 19 H23 O3 N3 F
-1.81500 ppm
378.16541361.17456 385.24396357.21405 364.18552 389.18121382.15298
359.22827
366.10559 379.16885352.63034 376.19733370.05508 387.21664
360.17180C 19 H23 O3 N3 F
0.00000 ppm
361.17515
362.17851 365.18611
NL:1.73E5621M#383 RT: 4.33 AV: 1 T: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00]
NL:7.98E5C 19 H22 FN3 O3 +H: C 19 H23 F 1 N3 O3pa Chrg 1
Muestra Músculo ave
350 355 360 365 370 375 380 385 390m/z
0
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Rel
ativ
e A
bund
ance
360.17102C 19 H23 O3 N3 F
-2.15393 ppm
361.17453382.15259362.20633 378.16489 385.24384 389.18030369.11145357.21356 377.22806353.67056 380.61691373.24225
360.17180C 19 H23 O3 N3 F
0.00000 ppm
361.17515
362.17851 366.18946
NL:1.54E5E20_M1#383 RT: 4.33 AV: 1 T: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00]
NL:7.98E5C 19 H22 FN3 O3 +H: C 19 H23 F 1 N3 O3pa Chrg 1
RT: 2.50 - 6.00 SM: 7G
2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8Time (min)
0
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Rel
ativ
e A
bund
ance
RT: 4.33AA: 539456
NL: 9.88E4m/z= 360.16999-360.17359 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS E20_M1
Músculo ave adicionado20 ppb
APLICABILIDAD. Ej. ENROFLOXACINA
Patrón Isotópico Teórico
Patrón Isotópico Experimental
Area Ratio 0.618
Area Ratio 0.725
Screening positiva
C19H22FN3O3
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Jornadas de Referencia 2014: Análisis de Alimentos. Majadahonda 10-12 junio
460 462 464 466 468 470 472 474 476 478m/z
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Rel
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e A
bund
ance
461.15454C 22 H25 O9 N2-1.98574 ppm
462.15814
467.17593464.22525 474.29178460.73221
461.15546
462.15881
463.16217 465.16641 467.17066 469.17490
NL:9.76E4937R#363 RT: 4.13 AV: 1 T: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00]
NL:7.64E5C 22 H24 N2 O9 +H: C 22 H25 N2 O9pa Chrg 1
APLICABILIDAD. Ej. OXITETRACICLINART: 3.00 - 5.04 SM: 7G
3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0Time (min)
0
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Rel
ativ
e A
bund
ance
RT: 4.13AA: 448422
RT: 3.88AA: 20383
NL: 7.57E4m/z= 461.15315-461.15777 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS 937R
RIÑÓN OVINO Screening positivoOTC
460 462 464 466 468 470 472 474 476m/z
0
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ance
461.15527C 22 H25 O9 N2-0.39751 ppm
462.15814
467.17828470.27286468.18134
461.15546
462.15881C 21 13C H25 O9 N2
0.00000 ppm
463.16217 465.16641 467.17066 469.17490
NL:8.78E4E40_R1#365 RT: 4.14 AV: 1 T: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00]
NL:7.64E5C 22 H24 N2 O9 +H: C 22 H25 N2 O9pa Chrg 1
RT: 3.00 - 5.04 SM: 7G
3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0Time (min)
0
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Rel
ativ
e A
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ance
RT: 4.14AA: 281656
RT: 3.89AA: 93937
NL: 5.08E4m/z= 461.15315-461.15777 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS E40_R1
RIÑÓN PORCINOadicionado20 ppb
Area Ratio 5.699 OTC
Area Ratio 1.926 Epi-OTC
Area Ratio 6.690 OTC
Area Ratio 0.303 Epi-OTC
Confirmación OTC
C22H24N2O9
Patrón Isotópico Experimental
Patrón Isotópico Teórico
LABORATORIO SALUD PÚBLICA DE VALENCIA
Jornadas de Referencia 2014: Análisis de Alimentos. Majadahonda 10-12 junio
Criterios Confirmación Decisión 2002/657/CE
•Define alta resolución en masas: > 20000 FWHM
•Full Scan : Iones diagnóstico: ión molecular, iones aductos, iones fragmentos e iones isótopos con Intensidad Relativa > 10%.
•Criterios Tolerancias Intensidades Relativas: Tabla 4 Decisión
•Full Scan: Mínimo de 4 iones diagnóstico (>10%). ¿También en HRMS?
•HRMS: 2 IPs / ión
•Tabla 6: HRMS: nº de iones : N ; nº de IPs: 2N
•4 IPs grupo A y 3 IPs grupo B
Faltaría revisar y/o incluir :
-Criterio RRT para UHPLC - Full Scan: nº iones diagnóstico HRMS
-Criterio Masa exacta (¿5 ppm?) - Criterio para Pseudo-fragmentación
-Criterio para Patrón Isotópico
LABORATORIO SALUD PÚBLICA DE VALENCIA
Jornadas de Referencia 2014: Análisis de Alimentos. Majadahonda 10-12 junio
RT: 5.00 - 8.00 SM: 7G
5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0Time (min)
0
50
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RT: 6.22AA: 34820
RT: 6.22AA: 246418
RT: 7.33AA: 18782
RT: 6.82AA: 6420
RT: 6.22AA: 38182
RT: 6.22MA: 5887
NL: 4.69E3m/z= 524.03366-524.03890 F: FTMS {1,2} + p ESI Full ms2 [email protected] [80.00-1200.00] MS ICIS LQ_2001
NL: 3.09E4m/z= 241.03778-241.04020 F: FTMS {1,2} + p ESI Full ms2 [email protected] [80.00-1200.00] MS ICIS LQ_2001
NL: 5.30E3m/z= 285.00963-285.01249 F: FTMS {1,2} + p ESI Full ms2 [email protected] [80.00-1200.00] MS ICIS LQ_2001
NL: 7.62E2m/z= 396.04111-396.04507 F: FTMS {1,2} + p ESI Full ms2 [email protected] [80.00-1200.00] MS LQ_2001
RT: 5.00 - 8.00 SM: 7G
5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0Time (min)
0
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5.30
7.407.53
7.947.216.22 6.986.796.385.87 6.03
5.21 5.575.15 5.40
6.826.41 6.985.90 7.21 7.626.09 7.46 7.816.63
NL: 0m/z= 524.03366-524.03890 F: FTMS {1,2} + p ESI Full ms2 [email protected] [80.00-1200.00] MS ICIS BM_2186
NL: 2.66E3m/z= 241.03778-241.04020 F: FTMS {1,2} + p ESI Full ms2 [email protected] [80.00-1200.00] MS BM_2186
NL: 1.68E3m/z= 285.00963-285.01249 F: FTMS {1,2} + p ESI Full ms2 [email protected] [80.00-1200.00] MS ICIS BM_2186
NL: 0m/z= 396.04111-396.04507 F: FTMS {1,2} + p ESI Full ms2 [email protected] [80.00-1200.00] MS BM_2186
CEFTIOFUR
C9 H
9 N4 O
3 S2 +285.01106
396.04309
C14H14N5O5S2+
C8H9N4O3S+
241.03898
C19H18N5O7S3+
CEFTIOFUR
524.03628
Fragmentación: sin selección Ión Precursor
Riñon porcino Blanco
Riñon porcino adicionado 20 ppb
LABORATORIO SALUD PÚBLICA DE VALENCIA
Jornadas de Referencia 2014: Análisis de Alimentos. Majadahonda 10-12 junio
“Post-targeted” analisis. Pirlimycin
Grupo Lincosamidas
C17H31ClN2O5S Masa Exacta: 410,16367
[M+H]+ Masa Exacta: 411,17149
LABORATORIO SALUD PÚBLICA DE VALENCIA
Jornadas de Referencia 2014: Análisis de Alimentos. Majadahonda 10-12 junio
411.0 411.5 412.0 412.5 413.0 413.5 414.0 414.5m/z
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Relative Abu
ndan
ce
411.16962C 17 H32 O5 N2 Cl S
-4.57296 ppm
413.16653C 17 H32 O5 N2 37Cl S
-4.87076 ppm412.17313C 16 13C H32 O5 N2 Cl S
-4.18644 ppm 414.17035C 16 13C H32 O5 N2 37Cl S
-3.74855 ppm413.26453 413.69876411.17150
C 17 H32 O5 N2 Cl S0.00000 ppm
413.16855C 17 H32 O5 N2 37Cl S
0.00000 ppm412.17485C 16 13C H32 O5 N2 Cl S
0.00000 ppm 414.17190C 16 13C H32 O5 N2 37Cl S
0.00000 ppm
NL:1.26E64865A#507 RT: 5.80 AV: 1 T: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00]
NL:5.85E5C 17 H31 ClN2 O5 S +H: C 17 H32 Cl1 N2 O5 S 1pa Chrg 1
RT: 5.50 - 8.00
5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0Time (min)
0
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Relative Abu
ndan
ce
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100RT: 5.80
RT: 7.80RT: 7.41RT: 5.80
RT: 6.36RT: 5.80
RT: 7.64RT: 7.45RT: 6.47RT: 6.03 RT: 6.24RT: 5.55RT: 5.80
RT: 6.50RT: 6.17 RT: 7.77RT: 6.64 RT: 7.38RT: 6.94RT: 5.62 RT: 7.06
NL: 1.26E6m/z= 410.67-411.67 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS 4865A
NL: 2.14E5m/z= 411.67-412.67 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS 4865A
NL: 4.46E5m/z= 412.66-413.66 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS 4865A
NL: 6.56E4m/z= 413.67-414.67 F: FTMS {1,1} + p ESI Full ms [80.00-1200.00] MS ICIS 4865A
“Post-targeted” analisis. Pirlimycin. Músculo Bovino.
[M+H]+
[M+1]+
[M+2]+
[M+3]+
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Jornadas de Referencia 2014: Análisis de Alimentos. Majadahonda 10-12 junio
Conclusiones
•El método propuesto es adecuado como método de screening cualitativo para el control de antibióticos en tejido animal.
•Se ha validado con criterios de identificación: RRT y Exactitud masa < 5 ppm
•Para todos los analitos y ambas matrices se cumple Fm>B y Fm>T
•El uso de Alta Resolución en masas y masa exacta confiere una alta selectividad.
•CCβ obtenido es 20 µg/Kg para todos los analitos excepto AMX, AMP, PENG, TILM (13 µg/Kg) y PEN V (6 µg/Kg)
•Información Patrón Isotópico, RIA, aductos y fragmentos le confieren caracteristicas de método de confirmación. Necesaria Revisión Decision 2002/ 657/CE
• Posibilidad de análisis retrospectivo: “Post-Targeted”
• Posibilidad de elucidación estructural y estudio biomarcadores: “Non-Targeted”
• Si picos cromatográficos muy estrechos (UHPLC): pocos scans/pico
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Jornadas de Referencia 2014: Análisis de Alimentos. Majadahonda 10-12 junio
Perspectivas
• Mucho trabajo por hacer. Esta tecnología tiene un gran potencial en la identificación y confirmación de moléculas.
• Estudiar inclusión aminoglucósidos.
• Desarrollar mismo método para MS/MS (Triple Cuadrupolo) Hasta Actualización Decisión 657. Estudio Estrategia confirmación.
• Completar la Base de datos a todos los Antibióticos de interés incluyendo Fragmentos. Estrategia “Post-Targeted” Análisis.
• Estudiar comportamiento de Patrón Isotópico en distintas matrices.
• Actualmente se ha finalizado la validación de un método de Screening cuantitativo para análisis de 86 compuestos en piensos: β-agonistas, hormonas, corticosteroides, tranquilizantes, nitroimidazoles, anfenicoles, micotoxinas, toxinas de plantas, alcaloides del ergot, carbadox, olaquindox, virginiamicina y otros.
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Jornadas de Referencia 2014: Análisis de Alimentos. Majadahonda 10-12 junio
Publicaciones HRMS Res. Medicamentos Veterinarios
•Residuos en piensos: En fase de elaboración.
> 100 compuestos
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Jornadas de Referencia 2014: Análisis de Alimentos. Majadahonda 10-12 junio
GRACIAS POR VUESTRA ATENCIÓN
e-mail: [email protected]