análise de aberrações cromossômicas em linhagens de saccharomyces cerevisiae expostas a...

Análise de aberrações cromossômicas em linhagens de Saccharomyces cerevisiae expostas a radiação

Juan Lucas Argueso - Tom Petes’ LabDepartment of Molecular Genetics & Microbiology

Duke University Medical CenterDurham, North Carolina, EUA.

Pesquisa desenvolvida em colaboração com Jim Westmoreland e Mike ResnickChromosome Stability SectionNational Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS)Research Triangle Park, North Carolina, EUA.

Roteiro do seminário:

- Introdução:danos ao DNA através de radiação ionizante;mecanismos de reparo de quebras de fita dupla (DSBs);consequências de erros no reparo: aberrações cromossômicas.

- Descrição do projeto atual:formação de quebras através de radiação e;caracterização de aberrações cromossômicas em S. cerevisiae.

- Planos para o futuro:caracterização do “hotspot” no cromossomo 5;estabilidade genômica durante processos fermentativos;regulação e reparo de quebras durante a recombinação meiótica.

Estudos pioneiros relacionando radiação ionizante a danos no material genético:

Em 1927, Hermann Muller demostrou em Drosophila melanogaster que agentes

externos (raios X) podem causar mutações.

Em 1931, Barbara McClintock foi a primeira a associar alterações cromossômicas a fenótipos específicos em milho, inaugurando a visão de que a mutagênese também pode ter base citogenética.

Fonte: Preston (2005) Health Physics 88:545

Fonte: Preston (2005) Health Physics 88:545

Danos a bases e nucleotídeos Dímeros

Quebra de fita simples“nick”

Quebra de fita dupla“DSB”

Tipos de dano causados ao DNA por radiação ionizante

Proporção aproximada = 60 bases danificadas : 30 nicks : 1 DSB

Quebra de fita dupla“DSB”

“Crosslinks”

Vias alternativas para o reparo de quebras de fita dupla:

União de terminações(NHEJ)

Recombinação homóloga(DSBR)

Erros no reparo de DSBs resultam em aberrações cromossômicas estruturais:Translocações

2 / 8

Cromossômo Filadélfia:Translocação 9/22 presente

em casos de leucemia.

Erros no reparo de DSBs resultam em aberrações cromossômicas estruturais:Translocações, Deleções, Amplificações, etc...

Stratakis et al. (2000) Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 86:3396

Anisomastia:Amplificação no braço

longo do cromossômo 16

Detecção de aberrações cromossômicas geradas através de quebras de dupla fita no DNA em células diplóides

80 krads

3. Irradiação com 137Cs

30% sobrevivência

4. Plaqueamento e obtenção de colônias sobreviventes

1. Cultura de células diplóides em crescimento exponencial2. Sincronização do ciclo celular no estágio G2 (Nocodazole)

Nocodazole

G2(4n DNA)

Análise de aberrações

5. Identificação e análise de aberrações cromossômicas

krads 0 5 10 20 40 60 80

Formação de quebras de dupla fita em células diplóides sincronizadas em G2

cr2 810 kb

cr4 1530 kb

cr1 250 kb

cr45.1 quebras/Mb/80 krad



krads 0 5 10 20 30 40 60 80

Restauração de cromossomos após 80 krads de radiação (~250 DSBs por célula)

cr2 810 kb

cr4 1530 kb

cr1 250 kb

Tempo

(horas) 0 0 0.5 1 1.5 2 3 4

cr4

cr2

cr1

(hours) 0 0 0.5 1 1.5 2 3 4

Colônias individuais sobreviventes apresentam numerosas aberrações cromossômicas após exposição a 80 krads de radiação

12

4

7+15

16+13

21410

11

5+8

9

31+6

cr

75% contém pelo menos uma nova banda cromossômica

Segunda fase:Análise qualitativa das aberrações cromossômicas induzidas por radiação

Microarranjos genômicos - Hibridação Genômica Comparada(Comparative Genomic Hybridization - CGH)

Representação esquemática da análise por CGHPurificação e fragmentação de DNA

genômico da linhagem originalPurificação e fragmentação de DNA genômico da colônia sobrevivente

Incorporação de Cy3(fluorescência verde)

Incorporação de Cy5(fluorescência vermelha)

Mistura e hibridação no microarranjo

Amarelo = razão 1:1Verde = DeleçõesVermelho = Amplificações

Detecção de alterações de dosagem gênica

13,000 sondascobertura completa do

genôma de S. cerevisiae

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

Exemplo de uma análise CGH

Representação gráfica do Log2 da razão Vermelho/Verde do DNA da colônia sobrevivente JW8.

JW8

Amplificação interna no cromossomo 5 entre

dois elementos Ty e suas LTRs ()

Ty1 Ty1

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

JW8

Amplificação terminal no braço

esquerdo do cromossomo 7a partir de um grupo de

LTRs ( e )



1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

JW8

Ty1

Deleção termimal no braçodireito do cromossomo 13 a

partir de um Ty1 e suas LTRs



1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

JW8

Deleção terminal no braço esquerdo do cromossomo 5 a partir do gene HXT13

HXT13



1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

JW8

Amplificação terminal no braço esquerdo do

cromossomo 4 a partir do gene HXT15

HXT15



Elementos retrotransponíveis Ty no genoma de Saccharomyces cerevisiae

Kim et al. (1998) Genome Research 8:464 Inserções completas

Inserções ancestrais

32 217

13 34

2 41

3 32

1 7

Distribuição de aberrações cromossômicas e pontos de resolução (Breakpoints) detectados através de CGH em 37 colônias sobreviventes.

Aberrações numéricas (aneuploidias):(cr1, cr1, cr6 e cr6)4 Monossomias(cr1, cr1, cr5, cr8, cr9, cr9, cr11, cr12, cr13)9 Trissomias

(34.8%)32 Ty ancestrais (LTRs)(6.5%)(7.6%)

67

outros sítios homeólogos sítios heterólogos

(51.1%)47 Ty completos“Breakpoints” posicionados em:

(6.7%)5 Amplificações internas(17.6%)13 Deleções internas(39.2%)29 Amplificações terminais(36.5%)27 Deleções terminais

Aberrações estruturais:

40 deleções : 34 amplificações

86% em Ty’s ou LTRs92% em sítios homeólogos

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

JW81

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

Ref JW8

12

4

7+15

16+13

2

14

10

11

5+8

9

3

1+6

Translocaçãonão-recíproca

do cr7 para o cr13(~460Kb)

Análise de aberrações cromossômicas específicas e modelos moleculares para o reparo das quebras no DNA.

Análise da translocação of cr7 - cr13 em JW8 por PCR:

7L

POX1 KEX1

13L

NUP116 IOC4Ty1

JAO125 JAO126

JAO124 JAO123

Ref

JW8

125+126R

ef

JW8

124+123

Ref

JW8

125+123

Ref

JW8

124+126

DNA

Primers

7

13

1. Raios causando quebras em um diplóide em G2.

Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocas com “Breakpoints” em sítios homeólogos: Permuta mitótica

7

13

2. Recombinação ectópica entre sítios homeólogos.


7

13

3. Recombinação ectópica entre sítios homeólogos.


7

13

4. Segregação cromossômica durante a divisão celular seguinte.


4a. Segregação cromossômica durante a divisão celular seguinte: Balanceada


7

13/7

7

7/13

7

13

13

13

Diplóide com cariótipo normal

Translocação balanceada

4b. Segregação cromossômica durante a divisão celular seguinte: Desbalanceada.


7

13/7

7

7/13

7

13

13

13

Translocação desbalanceada

Translocação desbalanceada

7

13

Mecanismos alternativos para geração de translocações não-recíprocascom “Breakpoints” em sítios homeólogos: “Break-Induced Replication” (BIR)


7

13


1. Raios causando quebras em um diplóide em G2, quebra no cromossomo 13.

7

13


2. Ressecção exonucleolítica 5’ - 3’ no DNA quebrado

7

13


3. Invasão da sequência doadora no cromossomo 7

7

13


4. Clivagem endonucleolítica das sequências 3’ não-homólogas

7

13


5. Replicação da fita contínua

7

13


6. Dissociação do cromossomo doador e replicação da fita descontínua

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

Recombinação entre outros sítios homeólogos (HXT13/15)

JW8

HXT13

HXT15

90% de identidade

Translocação não-reciproca do cr5 para o cr4 mediada pelos loci HXT13 e HXT15

HXT13

HXT15

Ref

JW8

5F+5R

Ref

JW8

4F+4R

Ref

JW8

4F+5R

Ref

JW8

5F+4R

DNA

Primers

4F 4R

5F 5R

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

Ref JW8

12

4

7+15

16+13

2

14

10

11

5+8

9

3

1+6

Amplificação interna no cromossomo 5

(~630Kb)

JW8Análise de aberrações cromossômicas específicas e modelos moleculares para o reparo das quebras no DNA.

Análise estrutural do cromossomo 5 de JW8 por Southern blot

5L

AflIIAflII

AflIIAflII

AflII

AflII AflII AflII

sonda

sondasonda

17.1kb 13.4kb

17.1kb

Ref

JW8

Ref

JW8

Parental 17.1kbDuplicação 13.4kb

23.1kb

9.4kb

6.5kb

4.3kb

2.3kb2.0kb

RefTy1 Ty1

JW8 Ty1 Ty1 Ty1

Região duplicada no cromossômo 16 humano: ~15 MbGenôma de S. cerevisiae: ~13 Mb

5


Permuta mitótica desigual como mecanismo de criação de aberrações cromossômicas estruturais

5

2. Reparo por conversão gênica ou permuta no locus: Reparo correto.


5

5

3. Reparo por permuta desigual: Duplicação e deleção.


5

JW8

Observações principais:

- As quebras de fita dupla (DSBs) foram reparadas principalmente através recombinação homóloga em células diplóides sincronizadas em G2;

- Entretanto, a maioria dos indivíduos sobreviventes apresentou aberrações cromossômicas estruturais formadas provavelmente por recombinação homóloga ectópica;

- A maioria dos sítios de resolução (breakpoints) foi detectada em regiões de sequência repetitiva incluindo inserções Ty completas e ancestrais, além de famílias de genes (HXT e FLO);

- Aberrações numéricas tanto de ganho como de perda de cromossômos completos foram detectadas entre os sobreviventes;

- Uma região de aproximadamente 50kb no cromossômo 5 apresentou a maior concentração de aberrações estruturais, representando 25% do total de “breakpoints”.

Planos para o futuro 1: Análise do “hotspot” no cromossomo 5

~ 50kb Ty1 Ty1

- Aberrações detectadas em 8 das 37 colônias sobreviventes analizadas

JW2

A2

JW5

JW12

A24

JW3

JW8

JW9

~ 50kb Ty1 Ty1

- Esta região contém12 dos 47 “breakpoints” (~25%) posicionados em inserções Ty.

- A frequência de aberrações nessa região é muito superior à incidência esperada para a inserção Ty média ( p = 0.002 ).

Número de “breakpoints” por sítio

Núm

ero

de s

ítios

21

14

7

12

1

0

10

20

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Distribuição dos 47 “breakpoints” nas 46 inserções Ty completas do genôma de S. cerevisiae

Planos para o futuro 1: Análise do “hotspot” no cromossomo 5

Colaboração com Duke e NIEHS$$$

Planos para o futuro 2: Análise de aberrações cromossômicas durante processos fermentativos.

Inóculo inicial no começo da safra

Reutilização do inóculo por vários meses

Acumulação de rearranjos cromossômicos

Caracterização dos eventos por campo pulsado, microarranjos e mapeamento físico

Implicações tecnológicas Estudo da dinâmica de populações durante o processo

fermentativo

Planos para o futuro 3: Regulação e reparo de quebras de fita dupla durante a recombinação meiótica.

- Análise do papel de enzimas modificadoras de histonas no controle da formação de quebras meióticas.

- Papel de mecanismos de reparo de bases mal pareadas “Mismatch repair” no controle da conversão gênica meiótica.

Agradecimentos

- Jim Westmoreland and Mike Resnick (NIEHS)

- Gosia Gawel, Piotr Mieczkowski, e Tom Petes (Duke)

- Membros do Petes Lab.

Suporte Financeiro: National Institues of Health

Duke University Medical Center

124

7+15

16+13

21410

11

5+8

9

3

1+6

Ref A3

A31

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

Possível translocação balanceada na colônia A3

Erros no reparo de DSBs resultam em aberrações cromossômicas estruturais:Translocações, Deleções

Síndrome cri-du-chat:Deleção no braço curto do

cromossômo 5

análise de aberrações cromossômicas em linhagens de saccharomyces cerevisiae expostas a...

Documents