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ADRIANA COSTA DE SOUZA MARTINS CÂMARA
Natal / RN
2015
ANÁLISE COMPARATIVA DA IMUNOEXPRESSÃO DO
IMP-3 E Ki-67 EM QUEILITES ACTÍNICAS E
CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE LÁBIO INFERIOR
ADRIANA COSTA DE SOUZA MARTINS CÂMARA
Natal / RN
2015
ANÁLISE COMPARATIVA DA IMUNOEXPRESSÃO DO
IMP-3 E Ki-67 EM QUEILITES ACTÍNICAS E
CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE LÁBIO INFERIOR
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
ANÁLISE COMPARATIVA DA IMUNOEXPRESSÃO DO IMP-3 E Ki-67 EM
QUEILITES ACTÍNICAS E CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE LÁBIO INFERIOR
Tese apresentada ao Colegiado do
Programa de Pós-graduação em Patologia Oral
da Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
como parte de requisitos para obtenção do
Título de Doutor em Patologia Oral.
Doutoranda : Adriana Costa de Souza Martins Câmara
Orientadora : Profª Drª Lélia Batista de Souza
NATAL/RN
2015
Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia
Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.
Câmara, Adriana Costa de Souza Martins.
Análise comparativa da imunoexpressão do IMP-3 e Ki-67 em queilites actínicas e
carcinoma epidermóide de lábio inferior/Adriana Costa de Souza Martins Câmara./
Natal, RN, 2015.
115 f. : il.
Orientadora: Profª. Drª.Lélia Batista de Souza.
Tese (Doutorado em Patologia Oral) – Universidade Federal do Rio Grande do
Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral.
1.Quelite – Tese. 2. Neoplasias labiais 4 – Tese. 3.Carcinoma de células escamosas
– Tese. 4. Imuno-Histoquímica – Tese. I. Souza, Lélia Batista de. II. Título.
RN/UF/BSO Black D65
RN/UF/BSO Black D65
1. Quelite – Tese. 2. Neoplasias labiais 4 – Tese. 3.Carcinoma de células escamosas – Tese.
Dedicatória
Dedico este trabalho a toda minha família,
meu sustento, meu amparo, minha fortaleza.
De um modo muito especial,
Ao meu esposo Bago (Carlos Magno), meu nego, meu eterno amor, meu maior
incentivador
À minha filha Mariana, meu chamego mais gostoso, meu tudo
À minha mãe Maria Auxiliadora, meu exemplo de vida
Ao meu pai Paulo Abílio Júnior (in memorian), meu espelho de caráter
Ao meu tio José Dias, um estudioso nato, meu incentivo para ir além
Agradecimentos
Esta é a forma mais sincera de dizer um MUITO OBRIGADA a todos que
colaboraram para a construção do meu saber e deste trabalho.
Não poderia deixar de ser diferente, o primeiro de todos, vai para aquele que me
deu a oportunidade da vida, que me deu uma família, amigos e o que sou hoje. A
minha fé em Ti Senhor e em nossa mãezinha, tornou a caminhada menos dura.
Graças Pai e Nossa Senhora de Fátima!!!!
Aos meus pais, pelo sim dado à minha vida, pela formação do meu caráter, por
não medirem esforços para a minha formação intelectual.
Às minha irmãs, Ana Paula, Amanda e Andira, pelo apoio incondicional,
principalmente como guardiãs do nosso maior tesouro, nossa filha, Mariana.
Ao meu grande amor, Bago, pelo estímulo dado a cada dia, pelas cobranças, pelo
apoio, pela compreensão, pelo carinho, pela paciência, enfim, pelo que você é e
pelo que faz em minha vida. Te amo.
Ao meu tesouro, minha princesa, minha paixão, Mariana, por ser minha mola
propulsora e a ela peço minha desculpas, pelas horas que mamãe se dedicava aos
estudos e deixou de brincar com você.
“Te amo, te aminho, te amão, filha
Ao meu tio José Dias, meu exemplo de homem inteligente, sábio, honesto e
trabalhador. Por acreditar em mim esses anos todos e contribuir imensamente para
a minha formação acadêmica.
Às minhas tias e tios, pela presença marcante em minha vida.
Aos meus cunhados, Breno, Fabinho e Kamisson, por estarem ao lado das minhas
irmãs dando o suporte da guarda do nosso tesouro.
À Maria de Jesus, meu braço direito em casa, pela paciência e por manter meu lar
em ordem.
Aos meus colegas de trabalho, na pessoa de Elione Fernandes, pelos momentos
em que estive ausente e pela compreensão a mim dispensada.
À minha amiga Rossana, por insistir para que eu seguisse a carreira da pós-
graduação. Jamais te esquecerei.
Aos meus amigos de hoje e de ontem, os que estão perto e os distantes, os
presentes e os ausentes. Aqui tem um pouco de cada um de vocês.
A todos os meus professores das duas graduações (Ciências Biológicas e
Odontologia) e das pós-graduações, por todo o conhecimento repassado.
À minha orientadora, Profª Dra. Lélia Batista de Souza, por ter acreditado em mim,
pelas cobranças, pela dedicação e pelo exemplo de profissional que é.
À Roseane Vasconcelos, por ter lembrado de mim no dia da entrevista da seleção.
Será que eu estaria aqui sem a sua ajuda? Valeu, serei eternamente grata.
Aos meus amigos de turma, Emília, Nazareno, Rodrigo e Stefânia, por tornarem o
percusso dessa nossa caminhada menos tortuoso. Com cada um de vocês aprendi
um pouquinho.
Emília, companheira de longa data, um exemplo de profissional que se recicla. Foi
duro esse desafio, mas chegamos ao fim.
Nazareno, mais uma vez os nossos caminhos se cruzaram, uma pessoa que
transmite bondade, um amigo leal;
Ste, valeu pelos ensinamentos, foram fundamentais na minha formação;
Rodrigo, exemplo de determinação, um amigo do bem, muitas dicas foram
repassadas.
A Pedro Carlos, por dedicar um pouquinho do seu tempo em ensinar aqueles que
estavam ainda engatinhando na Patologia. Jamais esquecerei do que você nos
repassou. E sua atitude foi a de um verdadeiro mestre. Te admiro.
Aos meus “irmãos” patológicos, Keilinha, Jamile e Marcelo, por tudo o que vocês
contribuíram. Keilinha, a mais experiente, cheia de dicas para dar, sempre
preocupada com todos. Jamile, uma irmã-amiga, compartilhamos alguns princípios
da vida e Marcelo, pela força dada na conclusão deste trabalho.
À Denise, por contribuir imensamente na elaboração desta tese. Desejo a você
todo o sucesso do mundo e aproveite o México e traga na bagagem mais
conhecimentos do que você já tem.
Aos colegas, que passaram pela Patologia e deixaram marcas na minha vida,
Águida, Emeline, Cida, Fernandinho, Marcelo e Joabe, a este agradeço pela
disponibilidade em fazer a análise estatística deste trabalho.
A todos os funcionários. Gracinha, sempre a disposição, exemplo de dedicação;
Sandrinha e Ricardo, os experts no laboratório da Patologia. Hévio, o biólogo que
domina a imuno-histoquímica. Lurdinha, a cocota mais cocota de todas, a que
distribui simpatia e alegria; Idelzuíte pela disponibilidade.
A todos os funcionários e estagiários da biblioteca, nas pessoas de Cecília, Mônica
e Hadassa. Sou muito feliz quando estou cercada pelos livros e ainda mais quando
encontramos pessoas onde a palavra SOLICITUDE está sempre presente. Admiro
vocês de montão. Muito obrigada por tudo!!!!
Aos colegas do mestrado e doutorado que de uma forma ou de outra me fizeram
aprender alguma coisa : Águida Henriques, Alessandra Barreto, Ana Rafaela
Martins, Ana Luiza Andrade, Andréia do Carmo, Bárbara Monteiro, Clarissa
Demeda, Cyntia Carvalho, Felipe Matos, Maiara Morais, Denise de Oliveira, Edilmar
Santos, Luciana Castro, Luiz Juliasse, Marcelo Nascimento, Maria Luiza Sousa,
Melka Sá, Natália Barbosa, Roseane Vasconcelos, Thâmara Bezerra, Thais Maciel,
Tiago Filho, Viviane Oliveira, Dmitry Sarmento, Lucileide de Oliveira, Marcelo
Vasconcelos, Pedro Paulo Santos.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral : Profa. Dra.
Roseana de Almeida Freitas, Profa. Dra. Hébel Cavalcanti Galvão, Profa. Dra. Lélia
Maria Guedes Queiroz, Prof. Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa, Profa. Dra. Márcia
Cristina da Costa Miguel, Profa. Dra. Éricka Janine Dantas da Silveira e Profa. Dra.
Ana Myriam Costa de Medeiros por tudo que nos foi transmitido e pelo exemplo
de pesquisadores que são. De cada um consegui extrair o de melhor. Em especial
Dr. Leão Pereira Pinto, pela atenção, pelo acolhimento e pela ajuda dada nesta
pesquisa.
À UnP, na pessoa da professora Alice. Lá construí todo o meu saber, todos os
meus conhecimentos. Foram 8 anos maravilhosos onde pude acompanhar o
crescimento desta instituição e um sonho maior foi realizado há 2 anos, fazer parte
do quadro de professores e aí uma nova estória está sendo construída.
Às minhas queridas e mais que especiais amigas de trabalho, com quem divido a
disciplina de Saúde Bucal Coletiva, Fátima Jorge, Ana Larissa Soares e Ligia
Moreno, pelo companheirismo e compreensão.
Aos meus amados alunos com quem aprendi e aprendo diariamente. Sinto-me
completamente realizada quando estou ao lado de vocês.
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte- UFRN, aqui também construí
parte da minha vida acadêmica, 8 anos de pós-graduação.
À Liga Norte-Riograndense contra o câncer, por ceder o material necessário para a
realização desta tese.
“O problema de ganhar ou perder tem uma conotação diferente
para mim da de quem acha que importante é ganhar. Para
mim, o importante é ter honra.”
José Dias
Resumo
RESUMO
Alterações epiteliais observadas em queilites actínicas (QA) e carcinomas
epidermóides de lábio inferior (CELI) são causadas principalmente pela exposição
crônica aos raios ultra-violetas (UV) e são estudadas usando diferentes marcadores
imuno-histoquímicos procurando avaliar o processo da carcinogênese. O objetivo
deste estudo foi avaliar comparativamente a expressão das proteínas Ki-67 e IMP-3
em QA e CELI a fim de contribuir com informações adicionais sobre a carcinogênese
em lábio inferior. Foram estudados 33 casos de QA e 33 casos de CELI, sendo
analisadas as características clínico-patológicas e a imunoexpressão do Ki-67 e
IMP-3. A análise imuno-histoquímica do Ki-67 se deu através da determinação do
índice de proliferação (IP) e subsequente classificação dos casos de acordo com os
escores : 0 (0% de células positivas), +1(≤30%), +2 (>30% a ≤60%) e +3 (>60%).
Para aplicação dos testes estatísticos os casos foram classificados em: sem
marcação (escore 0), baixa expressão (escore +1) e alta expressão (escores +2 e
+3). Para a expressão do IMP-3, foi estabelecido o percentual de células epiteliais
imunomarcadas, sendo atribuídos os escores: 0 (correspondeu a 0%), +1 (até 30%
das células positivas); +2 (entre 30% a 60% de células imunomarcadas) e +3 (acima
de 60% das células positivas). Foram utilizados os testes estatísticos Qui-quadrado
de Pearson, Mann-Whitney e Wilcoxon. O nível de significância adotado foi de 5%. A
maioria dos caos de QA foi do sexo masculino (78,8%), com média de idade de 50
anos e dos casos de CELI também predominou o sexo masculino (69,89%) com
média de 62 anos. O Ki-67 se expressou em todos os casos de QAs bem como nos
casos de CELI, predominando nas duas lesões o escore 2, correspondendo a 81,8%
dos casos nas QAs e 54,5% nos CELI. A expressão do IMP-3 nas QAs ocorreu em
72,7% dos casos, com predominância em 36,3% dos casos do escore 1. Já nos
CELI o IMP-3 se expressou em 60,6% dos casos, com predominância em 27,3% dos
casos do escore 3. Estes resultados nos permite concluir que a expressão do IMP3
e da atividade proliferativa são eventos precoces na carcinogênese de lábio inferior
independente do estado da alteração.
Palavras-chave : queilite, carcinoma epidermóide, imuno-histoquímica, IMP,
proliferação de células, patologia.
Abstract
ABSTRACT
Epithelial changes observed in actinic cheilitis (AC) and squamous cell carcinoma of
the lower lip (LLSCC) are mainly caused by chronic exposure to ultraviolet rays (UV)
and are studied using different immunohistochemical markers trying to evaluate the
process of carcinogenesis. The objective of this study was to comparatively evaluate
the expression of Ki-67 proteins and IMP-3 in AC and LLSCC to contribute with
additional information on carcinogenesis in lower lip. A total of 33 cases of AC and 33
cases of LLSCC were studied, analyzed the clinical and pathological features and
immunostaining of Ki-67 and IMP-3. Immunohistochemical analysis of Ki-67 was
made through the determination of the proliferation index (PI) and subsequent
classification of the cases according to the scores: 0 (0% positive cells) +1 (≤30%) +
2 (> 30% and ≤60%) and +3 (> 60%). For statistical tests cases were classified as
unmarked (score 0), low expression (score +1) and high expression (scores +2 and
+3). For the expression of IMP-3, the percentage of immunostained epithelial cells
was established, and assigned scores: 0 (corresponding to 0%), +1 (up to 30% of
positive cells); +2 (From 30% to 60% of immunostained cells) and +3 (over 60% of
positive cells). Statistical tests chi-square test, Mann-Whitney and Wilcoxon were
used. The significance level was 5%. Most AC chaos was male (78.8%) with mean
age of 50 years and cases of LLSCC also were male (69.89%) with an average of 62
years. The Ki-67 was expressed in all cases of AC and in cases of LLSCC,
predominantly in the two injuries the score 2, corresponding to 81.8% of cases in
ACs and 54.5% in the CELI. The expression of IMP-3 in ACs occurred in 72.7% of
cases, predominantly in 36.3% of LLSCC cases score 1. Already in the IMP-3 was
expressed in 60.6% of cases, especially in 27.3% of the score of the cases 3. These
results allow us to conclude that the expression of IMP3 and proliferative activity are
early events in carcinogenesis independently lower lip state of change.
Keywords: cheilitis, squamous cell carcinoma, immunohistochemistry, IMP,
cell proliferation disorder.
Lista de Ilustrações
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Relação entre os vários fatores de risco para a queilite actínica, incluindo aqueles que estão diretamente relacionados (fatores de risco principais), e aqueles que estão associados com a progressão da queilite para carcinoma epidermóide (fatores de risco menores).................................................................................
33
Figura 2. Representação esquemática da indução da carcinogênese pela radiação UV.....................................................................
45
Figura 3. Fotomicrografia evidenciando as características histopatológicas da QA de baixo risco de transformação maligna (Pannoramic Viewer, H/E, Barra = 100µm)...............
88
Figura 4. Fotomicrografia evidenciando as características histopatológicas da QA de alto risco de transformação maligna (Pannoramic Viewer, H/E; Barra = 100µm)...............
88
Figura 5. Fotomicrografia evidenciando as características histopatológicas do CELI de baixo grau de malignidade (Pannoramic Viewer, H/E; Barra = 500µm).............................
89
Figura 6. Fotomicrografia evidenciando as características histopatológicas do CELI de alto grau de malignidade (Pannoramic Viewer, H/E; Barra = 500µm).............................
89
Figura 7. Fotomicrografia demonstrando imunoexpressão nuclear do Ki-67 em QA (Pannoramic Viewer, LSAB; Barra = 50µm.......
90
Figura 8. Fotomicrografia demonstrando imunoexpressão nuclear do Ki-67 em CELI (Pannoramic Viewer, LSAB; Barra = 200µm).
90
Figura 9. Fotomicrografia demonstrando imunoexpressão citoplasmática do IMP-3 em QA (Pannoramic Viewer, Envision; Barra = 100µm)......................................................
91
Figura 10. Fotomicrografia demonstrando imunoexpressão citoplasmática do IMP-3 em CELI (Pannoramic Viewer, Envision; Barra = 100µm).......................................................
91
Gráfico 1. Box-plot relativo aos escores da expressão do Ki-67 de acordo com a gradação histológica das QAs. Natal/RN 2015.....................................................................................
75
Gráfico 2. Box-plot relativo aos escores da expressão do Ki-67 de acordo com o estadiamento clínico dos CELI. Natal/RN 2015.....................................................................................
77
Gráfico 3. Box-plot relativo aos escores da expressão do Ki-67 de acordo com a classificação histológica dos CELI. Natal/RN 2015.....................................................................
78
Gráfico 4. Box-plot relativo aos escores da expressão do IMP-3 de acordo com a gradação histológica das QAs. Natal/RN 2015....................................................................................
80
Gráfico 5. Box-plot relativo aos escores da expressão do IMP-3 de acordo com o estadiamento clínico dos CELI. Natal/RN 2015.....................................................................................
82
Gráfico 6. Box-plot relativo aos escores da expressão do IMP-3 de acordo com a classificação histológica dos CELI. Natal/RN 2015.....................................................................
84
Gráfico 7. Box-plot relativo aos escores da expressão do Ki-67 nos casos de QAs e CELI. Natal/RN 2015................................
86
Gráfico 8. Box-plot relativo aos escores da expressão do IMP-3 nos casos de QAs e CELI. Natal/RN 2015................................
87
Lista de Quadros e Tabelas
LISTA DE QUADROS E TABELAS
QUADROS
Quadro 1. Sistema de estadiamento clínico TNM para o CE de lábio..................................................................................
57
Quadro 2. Categorias de estadiamento clínico TNM para o CE de lábio..................................................................................
58
Quadro 3. Critérios arquiteturais e citológicos preconizados pela OMS..................................................................................
59
Quadro 4. Critérios e pontuações do Sistema de Gradação de Malignidade de Bryne.......................................................
60
Quadro 5. Especificidade, clone, fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação dos anticorpos primários a serem utilizados no estudo...............................................................................
62
Quadro 6. Classificação por escore do IMP-3................................... 63
Quadro 7. Classificação por escore do Ki-67.................................... 65
TABELAS
Tabela 1 Perfil da amostra das QAs (sexo, idade, raça, atividades profissionais, aspecto clínico e gradação histológica). Natal/RN 2015......................................................................
69
Tabela 2 Distribuição absoluta e relativa dos casos de QAs quanto ao sexo, idade e aspecto clínico de acordo com a gradação histológica. Natal/RN 2015...................................
70
Tabela 3 Perfil da amostra de CELI (sexo, idade, raça, atividades profissionais, aspecto clínico, gradação histológica e TNM). Natal/RN 2015...........................................................
72
Tabela 4 Valores absolutos e percentuais dos casos de CELI quanto às características clínicas e a gradação histológica. Natal/RN 2015......................................................................
73
Tabela 5 Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância para os escores de expressão do Ki-67 nos grupos histológicos das QAs. Natal/RN 2015......................................................................
74
Tabela 6 Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância para os escores de expressão do Ki-67 e estadiamento clínico dos casos de CELI. Natal/RN 2015............................................................
76
Tabela 7 Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância para os escores de expressão do Ki-67 de acordo com a gradação histológica dos CELI. Natal/RN 2015......................................................
77
Tabela 8 Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância para os escores de expressão do IMP-3 nos grupos histológicos das QAs. Natal/RN 2015......................................................................
79
Tabela 9 Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância para os escores de expressão do IMP-3 e estadiamento clínico dos CELI. Natal/RN 2015......................................................................
81
Tabela 10 Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância para os escores de expressão do IMP-3 de acordo com a gradação histológica dos CELI. Natal/RN 2015......................................................
83
Tabela 11 Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75 e significância para os escores de expressão do Ki-67 e IMP-3 nas QAs e nos CELI. Natal/RN 2015.........................
85
Tabela 12 Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância para os escores de expressão do Ki-67 nos casos de QAs e de CELIs. Natal/RN 2015......................................................................
85
Tabela 13 Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância para os escores de expressão do IMP-3 nos casos de QAs e de CELIs. Natal/RN 2015......................................................................
87
Lista de Abreviaturas e Siglas
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ag BAX bcl-2 CE CEL CELI CELS
Antígeno Do inglês Bcl-2-associated X protein, traduzido proteína X associada a bcl-2 Do inglês B-cell lymphoma 2, traduzido linfoma de célula B2 Carcinoma Epidermóide Carcinoma Epidermóide de lábio Carcinoma Epidermóide de lábio inferior Carcinoma Epidermóide de lábio superior
CCEO Carcinoma de Células Escamosas Orais CEO Carcinoma Epidermóide Oral CCLI Carcinoma Epidermóide de Lábio Inferior CONEP Comissão Nacional de Ética em
Pesquisa CNS Conselho Nacional de Saúde CPDs Dímeros de pirimidina-ciclobutanos DNA Do inglês Deoxyribonucleic Acid,
traduzido ácido desoxirribonucléico. EBV Do inglês Epstein-Barr vírus, traduzido
vírus Epstein-Barr HE Hematoxilina e Eosina HPV Do inglês human papilloma vírus,
traduzido Papiloma Vírus Humano IMP1, IMP2, IMP3 Refere-se aos antígenos IMP1,IMP2 e
IMP3 ou anticorpos anti-IMP1,IMP2 e IMP3
INCA Instituto do Câncer KI-67 Refere-se ao antígeno celular Ki-67 ou
anticorpo anti-Ki-67 LIGA Liga Norteriograndense contra o Câncer µm Do inglês micrometer, traduzido
micrômetro OMS p27
Organização Mundial da Saúde Do inglês protein 27, refere-se ao gene p27 ou à proteína p27
p53 Do inglês protein 53, refere-se ao gene p53 ou à proteína p53
QA RNAm ROS SGHM TGF-β
Queilite Actínica Do inglês messenger ribonucleic acid, traduzido ácido ribonucleico mensageiro Espécies reativas de oxigênio Sistema de gradação histológica de malignidade Do inglês transforming growth factor
beta, traduzido fator de transformação do crescimento beta
U UVA
Teste de Mann-Whitney Do inglês ultravioleta A, traduzido ultravioleta A
UVB UVC
Do inglês ultravioleta B, traduzido ultravioleta B Do inglês ultravioleta C, traduzido ultravioleta C
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte
USA Do inglês United State of America, traduzido Estados Unidos da América
Sumário
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 29 2 REVISÃO DA LITERATURA 32
2.1 QUEILITES ACTÍNICAS 32 2.2 CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE LÁBIO INFERIOR 37 2.3 CARCINOGÊNESE 42 2.4 PROLIFERAÇÃ CELULAR/Ki-67 46 2.5 IMP-3 48
3 PROPOSIÇÃO 53 4 MATERIAIS E MÉTODO 55
4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS 55 4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO 55 4.3 POPULAÇÃO 55 4.4 AMOSTRA 55 4.5 ESTUDO CLÍNICO-DEMOGRÁFICO 56 4.6 ESTUDO MORFOLÓGICO 58 4.7 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO 60
4.7.1 Técnica 60 4.7.2 Análise do perfil Imuno-histoquímico 63
4.7.2.1 IMP-3 63 4.7.2.2 Ki-67 63
4.8 CALIBRAÇÃO INTRA-EXAMINADOR 65 4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA 65
5 RESULTADOS 68 5.1 ANÁLISE CLÍNICA E MORFOLÓGICA 68
5.1.1 Queilites Actínicas 68 5.1.2 Carcinoma Epidermóide de Lábio Inferior 70
5.2 ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DO Ki-67 74 5.2.1 Queilites Actínicas 74 5.2.2 Carcinoma Epidermóide de Lábio Inferior 75
5.3 ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DO IMP-3 79 5.3.1 Queilites Actínicas 79 5.3.2 Carcinoma Epideremóide de Lábio Inferior 80
5.4 COMPARAÇÃO DAS IMUNOEXPRESSÕES DO Ki-67 E IMP-3 84 5.5 IMUNOEXPRESSÕES ENTRE AS QAs E CELI 85
6 DISCUSSÃO 93 7 CONCLUSÕES 101
REFERÊNCIAS 103 APÊNDICE 111 ANEXOS 114
Introdução
29
1 INTRODUÇÃO
Os cânceres orais incluem os de cavidade oral e de lábios. A última estimativa
mundial apontou que ocorreriam cerca de 300 mil casos novos de câncer e 145 mil
óbitos, para o ano de 2012, por câncer de boca e lábio (C00-08). Foram estimados,
para o Brasil, no ano de 2014, 11.280 casos novos de câncer da cavidade oral em
homens e 4.010 em mulheres. Tais valores correspondem a um risco estimado de
11,54 casos novos a cada 100 mil homens e 3,92 a cada 100 mil mulheres. No
estado do Rio Grande do Norte, esses valores correspondem a 8,90 casos a cada
100 mil homens e 5,27 casos a cada 100 mil mulheres (INCA, 2014).
Os dados epidemiológicos relativos à localização mais frequente do
carcinoma epidermóide (CE), que é o subtipo histológico mais comum, variam de
acordo com a localização geográfica. Países como Canadá, Espanha, Finlândia e
Austrália (MOORE et al., 1999), assim como o Iraque (AL-RAWI; TALABANI, 2008) e
Israel (CZERNINSKI; ZINI; SGAN-COHEN, 2010) relatam o carcinoma epidermóide
de lábio (CEL) como tipo de câncer oral mais comum. Esta lesão pode surgir a partir
de uma lesão potencialmente maligna chamada queilite actínica (QA) (BERNARDES
et al., 2014).
A QA é um processo inflamatório crônico que afeta o lábio inferior. Seu
principal agente etiológico é a exposição crônica aos raios solares ou radiação
ultravioleta artificial. Ela ocorre principalmente em pessoas de pele clara com história
de exposição crônica ao sol e é frequente a partir da quinta década de vida (VIEIRA
et al., 2012).
A compreensão em relação ao processo de transformação maligna de QA em
CEL é importante já que pode favorecer ferramentas em relação ao diagnóstico
precoce e terapêutico.
O comportamento biológico de algumas lesões patológicas encontra-se
relacionado em parte pela sua atividade proliferativa (REZVANI et al., 2010;
RANJBARI; RAHIM, 2013). Os marcadores de proliferação celular referem-se a
proteínas específicas presentes na divisão celular. Dentre os biomarcadores
utilizados, encontra-se o Ki-67, um marcador encontrado no núcleo das células em
proliferação e é usado para predizer o estado de crescimento de um tecido ou órgão
específico (MARTINEZ et al., 2005, BOLOGNA-MOLINA et al., 2012). Alguns
30
estudos tem demonstrado que a expressão do Ki-67 é aumentada em lesões pré-
malignas e malignas da cavidade oral (MARTINEZ et al., 2005; BOLOGNA-MOLINA
et al., 2012, VERMA et al., 2014).
A IMP3 é uma importante proteína oncofetal que pode desempenhar um
papel crítico na transformação maligna e na progressão tumoral (JIANG et al., 2008).
Sua expressão é encontrada em vários tipos de câncer como : adenocarcinoma
gástrico (LIN et al, 2010), lesões malignas de pâncreas, carcinomas renais e
endometriais (JIANG et al, 2008; LU et al., 2009; YUAN et al., 2009; CHEN et al.,
2013). Na pesquisa de Li et al (2011a), o IMP3 foi considerado um fator prognóstico
independente em CEO.
Desta forma, torna-se importante verificar se esta proteína encontra-se
relacionada ao processo carcinogênese de lábio inferior já que na pesquisa de
Soddu et al (2013) foi encontrado que a IMP3 pode auxiliar na detecção de
ceratoacantomas e melanomas de pele.
31
Revisão da Literatura
32
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 QUEILITE ACTÍNICA
A QA, também chamada de queilose solar, é uma reação inflamatória crônica,
potencialmente maligna, com potencial de transformação maligna que varia entre
10% a 20% dos casos, causada pela exposição progressiva excessiva aos raios
solares ultravioletas. A exposição constante a esta radiação pode levar a mutações
oncogênicas em ceratinócitos, especialmente no gene supressor de tumores p53.
(SCHUSSEL et al., 2011; EDER et al., 2014). Acomete quase que exclusivamente o
lábio inferior e é mais frequente nos indivíduos de cor branca, do sexo masculino,
em uma razão homem/mulher de 10:1, com idade acima dos 50 anos (NEVILLE et
al., 2009). É mais frequente em pessoas que trabalham ao ar livre ou que passam
muito tempo expostas ao sol (MARTINS-FILHO; SILVA; PIVA, 2011).
Segundo, Jadotte e Schwartz (2012a), a latitude geográfica vai determinar a
intensidade da radiação ultra-violeta, portanto os países mais próximos a linha do
equador apresentarão mais riscos, particularmente nas populações que apresentem
ocupações com maior exposição solar. Os autores ainda referem que algumas
condições genéticas aumentam a suscetibilidade aos danos causados pelo sol e,
subsequentemente, probabilidade de sofrer transformação maligna, tais como o
xeroderma pigmentoso, a porfiria cutânea tardia e o albinismo. Outros fatores de
risco também foram incluídos como cicatrizes crônicas no lúpus eritematoso e
transplante de órgãos. Na figura 1, adaptada de Jadotte e Schwart (2012a), pode-se
observar um organograma com a relação entre os vários fatores de risco da QA.
33
Figura 1. Relação entre os vários fatores de risco para a queilite actínica, incluindo aqueles que estão diretamente relacionados (fatores de risco principais), e aqueles que estão associados com a progressão da queilite para carcinoma epidermóide (fatores de risco menores).
Fonte : Adaptado de JADOTTE e SCHWARTZ (2012a )
Kaugars et al. (1999) realizaram um estudo clínico e histopatológico de 152
casos de QA na Universidade da Virgínia, no período de 1989 até 1998. Os homens
foram bem mais afetados que as mulheres (81,3% vs 18,7%), com idade média de
62 anos, e 99,3% dos pacientes eram caucasianos.
Markopoulos Albanidou-Farmaki e Kayavis (2004) realizaram um estudo
clínico, demográfico e histopatológico com 65 pacientes portadores de QA atendidos
na clínica de medicina oral na Grécia, por um período de 10 anos. Dos 65 casos
avaliados, 60 casos eram do sexo masculino (92,3%), 60% eram fumantes, 66, 2%
trabalhavam ao ar livre e todos os pacientes eram da raça branca com uma idade
média de 53,1 anos.
Piñera-Marques et al. (2010) realizaram um estudo com 125 pescadores da
cidade de Florianópolis/Brasil observando as características clínicas, citopatológicas
e histológicas das lesões de lábio inferior relacionadas com a exposição crônica ao
sol. A maioria dos pescadores era homens (121 homens e 4 mulheres), todos
caucasianos, com idade média de 50 anos e tempo médio de exposição ao sol de 32
anos, com uma média de 7,7 horas por dia; 92,8% não usavam qualquer tipo de
proteção solar. O consumo de álcool foi observado em 32% dos pescadores e o
Queilite Actínica
Carcinoma
Epidermóide de
lábio
Lupus Discóide
34
fumo em 38,4%. Apenas 2% dos pescadores eram conscientes do potencial maligno
das lesões de lábio.
Um outro estudo avaliou a prevalência de QA em trabalhadores rurais na
região semi-árida do Nordeste brasileiro. A prevalência de queilite foi de 16,7% com
associação significativa para o sexo masculino, a idade acima de 50 anos e com
exposição solar diária de mais de 8h. Foi mais prevalente entre fumantes e ex-
fumantes, com uma média de consumo de 10 cigarros por dia (MARTINS-FILHO et
al., 2011).
Nolan et al. (2011) observaram que a prevalência de lesões displásicas e
malignas em lábio é significativamente maior em pacientes transplantados, sob
terapia imunossupressora há pelo menos 3 meses, quando comparados a pacientes
saudáveis com mesma idade e sexo.
De Souza Lucena et al. (2012) avaliaram a prevalência e os fatores
associados a QA em 362 indivíduos que trabalhavam em praias urbanas de uma
cidade do Nordeste brasileiro e verificaram que a prevalência de indivíduos
diagnosticados com QA foi de 15,5% (56 casos), sendo a maioria do sexo masculino
(86%) com idade acima dos 37 anos e pele clara (52,6%). A maioria dos
trabalhadores relatou o uso de alguma forma de foto-proteção, sendo o uso de boné
ou chapéu a mais comum (87,7%), mas, muitos não usavam o protetor solar
(57,9%) ou proteção labial (82,5%).
A QA pode apresentar-se clinicamente de forma localizada ou como lesões
difusas. Geralmente são assintomáticas (SARMENTO et al., 2014). Pode ainda
apresentar-se sob a forma aguda ou crônica, sendo a aguda mais comum em
indivíduos jovens expostos ao sol durante o verão. No momento em que o paciente
não se expõe a luz solar, a QA aguda desaparece, reaparecendo no ano seguinte,
quando as mesmas condições se apresentam (PICASCIA; ROBINSON, 1987). A
forma aguda é caracterizada por exibir vermelhidão, edema, bolhas e ulcerações no
lábio que logo cicatrizam (SAVAGE; MCKAY; FAULKNER, 2010).
A forma crônica persiste durante todas as estações do ano e acomete
indivíduos com mais de 40 anos, geralmente é assintomática, caracterizada por
exibir atrofia da borda do vermelhão do lábio inferior que exibe superfície lisa e áreas
pálidas com erupções. A perda de definição da margem entre o vermelhão e a
porção cutânea do lábio é tipicamente visto. Com a progressão da lesão, áreas
ásperas e escamosas desenvolvem-se nas porções mais ressecadas do vermelhão.
35
Estas áreas tornam-se espessadas e podem se assemelhar com lesões
leucoplásicas (NEVILLE et al, 2009). Caso sejam observadas áreas de ulcerações
ou erosões crônicas, nódulos, atrofia, sangramento, borda do vermelhão do lábio
indistinta, endurecimento, crostas, descamação, leucoplasia ou eritroplasia que
persistem por longos períodos de tempo, sugere-se progressão para o CE de lábio
(SARMENTO et al., 2014).
Áreas de endurecimento, espessamento e ulceração já podem estar
associadas com o estabelecimento do fenótipo maligno. Por isso, vem sendo
enfatizada a importância da palpação no exame clínico como parte do diagnóstico
diferencial entre QA e CE de lábio (MARKOPOULOS; ALBANIDOU-FARMAKI;
KAYAVIS, 2004; NEVILLE, 2009; HUBER, 2010). O diagnóstico diferencial inclui,
entre outras, queimaduras solares, líquen plano, lúpus eritematoso, queilite
glandular, queilite angular, queilite granulomatosa (JADOTTE; SCHAWARTZ,
2012b).
No estudo de Markopoulos, Albanidou-Farmaki e Kayavis (2004), a QA foi
detectada em 29,2% dos pacientes na forma de lesões brancas, não-ulceradas. Em
47,7% se manifestou como erosões ou úlceras, enquanto que em 23,1%
apresentaram erosões e úlceras concomitante com lesões brancas e áreas de
atrofia no lábio inferior. As lesões brancas ou erosões foram restritas ao lado direito
do lábio em muitos casos (46,1%). Os autores justificam esta ocorrência,
provavelmente porque o lábio tem menos proteção que a pele, por ser o epitélio
mais fino e a falta do revestimento mais espesso da queratina da pele. Além disso, a
população de pele clara possui menos melanina e por ser o lado direito, o lado em
que os pacientes fumantes do estudo justificaram preferir para segurar o cigarro.
Cavalcante, Anbinder e Carvalho (2008) avaliaram um grupo de 29 pacientes
com QA e, clinicamente, todos apresentaram lesões multifocais. Foi possível
observar ainda, ressecamento, atrofia, lesões
escamosas, inchaço do lábio, eritema, ulceração, manchas brancas ou placas,
crostas e áreas de palidez. Sintomas como queimação e prurido foram observados
em 34,48% dos casos.
A QA é caracterizada histologicamente por alterações no tecido epitelial e no
conjuntivo. No epitélio, pode ser observado espessamento da camada de ceratina
(paraceratose ou ortoceratose), hiperplasia, acantose ou atrofia, bem como área de
ulceração e/ou presença de displasia que pode variar de leve à severa. No tecido
36
conjuntivo, encontra-se a degeneração basofílica das fibras colágenas, denominada
de elastose solar, infiltrado inflamatório, composto principalmente por linfócitos e
plasmócitos e vasodilatação (ABREU et al., 2006).
Nos estudos de Cavalcante, Anbinder e Carvalho (2008) e Sarmento et al.
(2014), em todos os pacientes, foi evidenciada a presença da elastose solar, do
infiltrado inflamatório crônico e da vasodilatação.
Com relação a presença de displasia epitelial, há uma variedade de
resultados nos estudos. Nos estudos de Kaugars et al. (1999), Sarmento et al.
(2014) e Alves et al. (2014) prevaleceu o diagnóstico de displasia leve. No primeiro
estudo, 40% dos casos de queilites não apresentaram displasia e 25% havia
displasia leve. No estudo de Markopoulos Albanidou-Farmaki e Kayavis (2004)
apenas 27,7% dos pacientes apresentavam quadro histológico de displasia epitelial
leve, enquanto o restante (72,3%) exibiu displasia moderada a CE invasivo. No
estudo de Cavalcante, Anbinder e Carvalho (2008), foram diagnosticados 10,34%
dos pacientes com displasia leve, 27,59% com displasia moderada e 62,07% com
displasia severa. A severidade da displasia vai estar diretamente relacionada com a
progressão para malignidade (WARNAKULASURIYA et al., 2008).
O estabelecimento do grau de severidade em displasias epiteliais se faz
necessário para estabelecer um tratamento e prognóstico apropriados. Embora a
interpretação histopatológica da displasia ainda seja considerada um campo
subjetivo, em 2005 a Organização Mundial da Saúde (OMS), usando como base
critérios citológicos e arquiteturais, classificou a displasia epitelial em leve,
moderada e severa (BARNES et al., 2005).
Kujan et al. (2006) propuseram um novo sistema para classificar as
displasias, denominado de sistema binário de gradação. Este sistema se baseia nos
mesmos critérios morfológicos usados pela classificação da OMS (mudanças
arquiteturais e citológicas) e gradua as lesões em “baixo-risco” ou “alto-risco” de
transformação maligna.
Jadotte e Schwartz (2012b) destacam que a escolha da terapia deve levar em
consideração o diagnóstico histológico, a experiência do dentista, o aspecto estético
de acordo com o desejo do paciente e possíveis efeitos colaterais.
As áreas de endurecimento, espessamento, ulceração ou leucoplasia devem
ser submetidas à biópsia para descartar a possibilidade de transformação maligna.
Em casos com quadro microscópico grave, com transformação maligna clara,
37
métodos terapêuticos como a excisão cirúrgica (vermelhectomia), criocirurgia e
cirurgia a laser podem ser adotados (NEVILLE et al., 2009; SHAH; DORERTY;
ROSEN, 2010).
Tratamentos alternativos incluem o uso de diclofenaco em ácido hialurônico
gel, o uso tópico de quimioterápico, imuno-estimulante Imiquimod, ablasão a laser
de CO2 ou de érbio, quimioexfoliação com ácido tricloroacético (NEVILLE et al.,
2009; JADOTTE, SCHWARTZ, 2012b).
O prognóstico em QA é variado e depende de três fatores: do diagnóstico
histológico, das mudanças de hábitos do paciente e dos cuidados adotados pelo
paciente. Porém, a prevenção ainda é a medida mais efetiva para evitar os danos
causados pela radiação UV, através do uso de protetores solares e redução dos
efeitos dos raios solares. É de responsabilidade do dentista, o diagnóstico, a
orientação nos cuidados preventivos e o monitoramento dos casos de QA, para que
as mesmas não sofram transformação maligna para o Carcinoma Epidermóide de
Lábio (CEL) (SARMENTO et al., 2014).
2.2 CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE LÁBIO INFERIOR
O câncer de boca, também intitulado câncer oral, encontra-se entre o sexto e
oitavo tipo de câncer mais comum em todo o mundo, apresentando uma grande
variabilidade de incidência entre os diversos países (SCULLY; BAGAN, 2009). No
Brasil, este câncer é o quinto mais incidente em homens e o sexto em mulheres,
sendo que a estimativa para o câncer de boca em 2014 foi de 11.280 casos novos
de câncer da cavidade oral em homens e 4.010 em mulheres. Tais valores
correspondem a um risco estimado de 11,54 casos novos a cada 100 mil homens e
3,92 a cada 100 mil mulheres. No estado do Rio Grande do Norte, esses valores
correspondem a 8,90 casos a cada 100 mil homens e 5,27 casos a cada 100 mil
mulheres (INCA, 2014).
O carcinoma epidermóide oral (CEO) é a mais comum neoplasia maligna oral
representando mais de 90% de todos os cânceres orais (KHAMMISSA et al., 2014).
O CEO apresenta vários fatores relacionados com a sua etiologia. No entanto,
nenhum fator etiológico único tem sido aceito e sim a associação entre vários
agentes, podendo eles serem extrínsecos ou intrínsecos. Entre os fatores
38
extrínsecos estão o tabaco, álcool, vírus e a radiação UV. Os fatores intrínsecos
incluem alterações genéticas, hábitos alimentares, estado imunológico e saúde oral
geral (NEVILLE et al., 2009; AMTHA et al., 2009).
Os homens apresentam uma maior prevalência entre a sexta e sétima década
de vida, por este grupo ser mais exposto, ao passar dos anos, aos fatores de risco
(PIRES et al., 2014; AL-RAWI, TALABANI, 2008). Estudos recentes têm mostrado
aumento no número de mulheres afetadas e em grupos de jovens, provavelmente
devido as mudanças sociais e atividades diárias associadas ao perfil social moderno
da mulheres, permitindo uma maior exposição aos agentes carcinogênicos, tais
como o fumo e o consumo de álcool e a exposição a agentes biológicos, como o alto
risco aos subtipos de papiloma vírus humano (HPV), sendo este um dos principais
fatores associados com o aumento no grupo de jovens (PIRES et al., 2014).
Um estudo realizado na cidade de São Paulo, avaliou um total de 1.564 casos
de CEO no período de 1968 a 2008 com o objetivo de detectar possíveis alterações
ocorridas em relação aos dados epidemiológicos desta lesão publicados ao longo
dos anos na literatura mundial. A amostra foi dividida em 4 períodos (1961-1980;
1981-1990; 1991-2000; 2001-2008). Os resultados demonstraram que ainda
prevalece uma incidência maior entre os homens comparativamente às mulheres
(3:1); contudo, quando foi comparado o primeiro período com o último período,
observa-se que a razão entre os grupos diminuiu significativamente (5.8:1 para 3:1),
havendo um aumento na incidência entre as mulheres nas últimas duas décadas.
Observou-se ainda aumento significativo na incidência de CEO em pacientes acima
de 80 anos nos dois últimos períodos, um fato justificado pelo aumento na
expectativa de vida da população em São Paulo. Com relação a localização, a
gengiva foi o sítio mais afetado, porém o envolvimento do lábio inferior aumentou
(MAROCCHIO et al., 2010).
Al-Rawi e Talabani (2008) realizaram um estudo com 1.425 casos de CEO no
Iraque. Os pacientes mais afetados foram os homens numa proporção de 2:1 em
relação as mulheres, na quinta década de vida e o sítio anatômico mais afetado foi o
lábio inferior, seguido da língua.
O CEL é uma lesão maligna frequente na cavidade oral correspondendo a
aproximadamente 30% de todos os CEOs, ocorrem no lábio inferior em
aproximadamente 80% dos casos e resulta principalmente de exposição crônica
aos raios solares ultravioletas, especialmente o UVB associado com atividades ao ar
39
livre e a cor da pele (SOUZA et al., 2011; SALIHU et al., 2014). Outros fatores
importantes também podem estar associados, com o fumo, ingestão de álcool,
imunossupressão crônica, susceptibilidade genética e o papiloma vírus humano
(SALIHU et al., 2014). Batista et al. (2010) encontraram que a exposição solar
crônica estava associada com o consumo de tabaco e álcool nos casos de
carcinoma epidermóide de lábio inferior (CELI), analisados em seu estudo.
Os dados epidemiológicos relativos à incidência e prevalência do CELI
demonstram divergências ao redor do mundo, com altas taxas relatadas no sul da
Austrália e em algumas regiões do Canadá, Espanha e Finlândia (MOORE et al.,
1999). O estudo de Costa et al. (2002) encontraram o lábio inferior como a
localização anatômica mais acometida (31,67%) em 120 casos analisados no Rio
Grande do Norte. Pietersma et al (2015) também encontraram em seu estudo com
979 casos de CEL que 72,5% da amostra era de CELI em pacientes do sexo
masculino e que as mulheres são mais acometidas por CE de lábio superior (CELS).
Souza et al. (2011) realizaram um estudo no Nordeste de Minas Gerais-Brasil,
com o objetivo de avaliar os aspectos epidemiológicos de carcinomas de lábio em
uma amostra de 30 casos e verificaram que o lábio inferior foi o principal sítio
envolvido (83,3%). A distribuição homem-mulher foi de 5:1, com média de 59 anos
no momento do diagnóstico. Os autores relacionaram a elevada razão entre homens
e mulheres ao fato da maioria dos trabalhadores que desenvolvem suas atividades
ao ar livre serem homens. Este achado também tem sido associado ao frequente
uso de protetor labial ou batom pelas mulheres, o que protegeria o lábio da atuação
dos raios UVB, fato este também discutido no trabalho de Pagoda e Preston-Martin
(1996).
Czerninski, Zini e Cohen (2010) realizaram um estudo em Israel analisando
dados de CEL registrados entre 1970 e 2006, em um total de 4337 casos e
observaram um aumento na incidência com o aumento da idade, justificada pelo
acúmulo de mudanças moleculares devido a exposição a fatores externos tais como
o tabaco, outros carcinógenos, ou como parte do processo de envelhecimento
biológico que está relacionado com o acúmulo de danos ao DNA.
O CEL pode se desenvolver a partir de condições pré-malignas, como a QA,
mas também, de mucosa labial saudável (SALIHU et al., 2014; RIVERA; VENEGAS,
2014). Clinicamente, apresenta-se como uma ulceração endurecida, indolor,
crostosa e exsudativa que apresenta geralmente menos de 1 cm no seu maior
40
diâmetro no momento do diagnóstico (NEVILLE et al., 2009). Pode ocorrer em
qualquer parte do lábio inferior e pode ainda apresentar-se exofítico, úlcero
infiltrativo ou verrucoso exibindo, na sua grande maioria, crescimento do tipo
exofítico (ANTUNES; ANTUNES, 2004).
A visibilidade de alterações no lábio inferior possibilita o diagnóstico precoce
do CEL. Quando diagnosticado em seus estágios iniciais, um prognóstico favorável
é esperado, com taxa de sobrevida de cinco anos, superior a 90%. Contudo, podem
ocorrer metástases para os linfonodos cervicais em cerca de 5% a 20% dos casos.
Nestes pacientes, nos quais o envolvimento cervical é diagnosticado tardiamente,
apresenta o pior prognóstico, com uma taxa de sobrevida de 5 anos em torno de
30% a 70% (HASSON, 2008).
Onerci, Yilmaz e Gediloglu (2000) relataram que de 27 pacientes
diagnosticados com CELI, 13 apresentaram metástase cervical. A espessura média
do tumor em pacientes com metástases foi de 5,6 milímetros em comparação com
3,6 milímetros em pacientes que não apresentaram metástases cervicais.
De acordo com Souza et al. (2011), o tamanho do tumor, gradação histológica
de malignidade, metástase em linfonodo regional e recorrência da doença são os
principais fatores relacionados à sobrevida dos pacientes com CELI.
O CE é caracterizado histologicamente pela invasão de ilhas e cordões de
células epiteliais malignas através da camada basal para o interior do tecido
conjuntivo. As células tumorais, na maioria das vezes, apresentam citoplasma
eosinofílico em quantidade variada, podendo observar-se hipercromatismo nuclear e
perda da relação núcleo-citoplasma, bem como disceratose e formação de pérolas
de ceratina em tumores bem diferenciados. Em casos onde o tumor ainda se
encontra em estágios iniciais, costuma-se denomina-lo superficialmente invasivo ou
microinvasivo. Em casos mais avançados, as células malignas podem se estender
profundamente atingindo tecido muscular, nervoso, adiposo e/ou ósseo e invadir
vasos sanguíneos (REGEZI; SCIUBBA; JORDAN, 2008). Segundo Souza et al.
(2011), a maioria dos carcinomas de lábio inferior é bem diferenciado.
A agressividade desses tumores está relacionada com diferentes fatores,
incluindo tamanho, localização anatômica e grau histológico do tumor, nível de
envolvimento dos tecidos vizinhos e presença de metástase no momento do
diagnóstico (SILVEIRA et al., 2007). Logo, a padronização de dados que possibilitem
a classificação dos tumores de uma determinada localização anatômica e norteiem a
41
conduta terapêutica para as diferentes apresentações dos cânceres em geral, são
de grande valia para a seleção e avaliação do tratamento bem como
estabelecimento do prognóstico dos tumores.
O sistema de estadiamento clínico de tumores (TNM) tem sido o padrão de
classificação adotado para caracterizá-los e propor a terapia mais adequada, assim
como, estimar a sobrevida dos pacientes (LOURENÇO et al., 2007). Este sistema
está baseado na avaliação de três componentes para descrever a extensão
anatômica da doença: T - extensão do tumor primário; N - ausência ou presença e a
extensão de metástase em linfonodos regionais e M - ausência ou presença de
metástase à distância. A adição de números a estes três componentes indica a
extensão da doença maligna. Assim temos: T0, T1, T2, T3, T4 | N0, N1, N2, N3 | M0,
M1. Após definir as categorias T, N e M, elas podem ser agrupadas em estádios
(SOBIN; WITTEKIND, 2002; WITTEKIND et al., 2002). Para o CEO grupamento por
estádios inclui os níveis I, II, III, IVa, IVb e IVc. Os estádios I e II são considerados
de melhor prognóstico em comparação aos estádios III e IV que representam a
doença avançada (AMAR et al., 2003).
Entretanto, a existência de casos diagnosticados em estádios iniciais, tratados
corretamente, e que, contudo, evoluíam rapidamente ao óbito, não condizendo com
a indicação clínica do TNM, suscitou a instituição de outros fatores prognósticos
para suplementar o sistema (LOURENÇO et al., 2007; COSTA; ARAÚJO; RAMOS,
2005).
Assim, os sistemas de gradação histológica de malignidade (SGHM) para o
CEO surgiram com o intuito de fornecer conhecimentos adicionais que pudessem
explicar o comportamento biológico discrepante de tumores com características
clínicas semelhantes (LOURENÇO et al., 2007).
Bryne et al. (1989) ao estudarem 68 casos de CEO, recomendaram a
gradação por meio da área mais invasiva do tumor, posteriormente denominada
front de invasão (BRYNE, 1998). Os autores sugeriram que as células desta
localização mostram alterações semelhantes às células metastáticas. Cada variável
foi categorizada em escores de 1 a 4 e o escore total de malignidade do tumor foi o
somatório dos escores individuais. Os valores de 5 a 10 foram considerados de
baixo escore de malignidade e os superiores a estes, de alto escore. Os resultados
mostraram que o sistema de gradação do front de invasão é um fator de prognóstico
altamente significativo nos CEOs e que as características histológicas nessas áreas
42
são importantes na predição do comportamento clínico dos tumores. Para Bryne
(1998), as características morfológicas e moleculares na área do front de invasão do
CEO, podem refletir melhor o prognóstico destes tumores, já que vários eventos
moleculares importantes ocorrem na interface tumor-hospedeiro, citando-se
aumento da proliferação celular, perdas e ganhos de moléculas de adesão, secreção
de enzimas proteolíticas e angiogênese.
A partir destes sistemas de gradação, alguns trabalhos foram realizados com
objetivo de tentar identificar que sistema de gradação histológica de malignidade
seria mais fidedigno em associar-se ao prognóstico desta neoplasia. Neste contexto,
Santos et al (2014) avaliaram sistemas de gradação histológica de malignidade em
59 casos de CELI e encontraram que o sistema desenvolvido por Brandwein-
Gensler et al (2005) foi o mais relacionado ao prognóstico nestes tumores. Porém,
neste estudo, o sistema proposto por Bryne et al (1998) foi associado com
metástase em linfonodos regionais e estágio único da doença.
O tratamento de escolha para o CELI é a excisão cirúrgica, a depender da
extensão (NEVILLE et al, 2009). A terapia coadjuvante com radioterapia é requerida
nos casos recorrentes e metastáticos, tanto regionais quanto à distância (HANSON,
2008).
2.3 CARCINOGÊNESE
A carcinogênese é caracterizada pela transformação das células normais em
células malignas. Ela está associada com alterações genéticas cumulativas,
influenciadas pela predisposição genética do paciente, bem como por influências
ambientais, incluindo o tabaco, o álcool, inflamação crônica e infecções virais (CHOI;
MYERS, 2008). A partir dessas alterações, surgem as mutações genéticas, que
podem levar a erros na replicação do DNA, instabilidades químicas intrínsecas de
certas bases de DNA ou a partir do ataque de radicais livres, geralmente durante o
metabolismo celular. Essas alterações também podem resultar da ação de agentes
exógenos, como a radiação ionizante e a radiação UV, que está envolvida na
carcinogênese de lábio inferior (BERTRAM, 2000).
Os carcinógenos são estímulos que iniciam o processo da carcinogênese. Os
principais carcinógenos orais são classificados em: agentes químicos, representados
pelo fumo e álcool; agentes físicos, como a radiação UV; e por último, os
43
infecciosos, relacionados com os vírus oncogênicos como o HPV e Epstein-Barr
(EBV). A exposição crônica a estes agentes pode danificar os genes, bem como as
porções maiores do material genético, como os cromossomos, levando ao
surgimento de lesões pré-cancerígenas e posteriormente ao carcinoma invasivo
(NAGPAL; DAS, 2003; CHOI; MYERS, 2008).
A instabilidade genômica reflete a propensão e a suscetibilidade do genoma
adquirir várias alterações, dentre elas citam-se, a ativação de mutações ou a
amplificação de oncogenes que promovem a sobrevivência e proliferação das
células tumorais, bem como a inativação de genes supressores de tumores,
envolvidos na inibição da proliferação celular (CHOI; MYERS, 2008).
Segundo Xavier et al. (2009), o CELI surge inicialmente e com maior
frequência de uma QA, proveniente de uma exposição prolongada a radiação
ultravioteta, especialmente aos raios UVB, caracterizando assim um modelo de
fotocarcinogênese.
A radiação solar é constituída por espectros de radiação eletromagnética que
é dividida em 3 principais comprimentos de ondas : ultravioleta, visível e infra
vermelha. Quanto menor o comprimento de onda, maior a energia de radiação. Os
raios UV estão na faixa de 200nm a 400nm. A radiação UV estimula reações
fotoquímicas que têm efeitos importantes sobre a pele humana, dependendo do
comprimento de onda e da quantidade de energia. O espectro eletromagnético solar
pode ser subdividido em três regiões : UV-A (320-400nm), UV-B (290-320nm) e a
UV-C (˂290nm). A radiação UV-A, corresponde a mais de 90% da radiação solar,
tem o maior comprimento de onda e uma baixa quantidade de energia UV e tem
como principais efeitos na pele, o ressecamento e o envelhecimento precoce. A
radiação UV-B tem um comprimento de onda menor e uma quantidade de energia
maior que a radiação UV-A, causando maiores danos a pele, tais como pigmentação
profunda, ressecamento, envelhecimento precoce e câncer de pele. A radiação UV-
C não atravessa a camada de ozônio (NARAYANAN; SALADI; FOX, 2010;
IKEHATA; ONO, 2011; SGARBI; CARMO; ROSA, 2007).
Embora, a radiação UV-B seja a principal responsável pelo efeito
carcinogênico dos raios solares, a radiação UV-A também contribui para este
processo com 10-20%. A UV-A causa danos indiretos ao DNA, através da formação
de espécies reativas de oxigênio (ROS), as quais criam interrupções no DNA,
enquanto a UV-B é diretamente absorvida pelo DNA e causa danos estruturais a
44
essa molécula (PFEIFER; YOU; BESARATINIA, 2005; NARAYANAN; SLADI; FOX,
2010).
A principal característica da mutagênese via UV-B é a alta frequência de
mutações de transição em sequências dipirimidinas contendo citosina, formando
dímeros de pirimidina-ciclobutanos (CPDs) e fotoprodutos 6-4 pirimidina-pirimidona
(64PP). Outros fotoprodutos também são formados em menor proporção, tais como
os dímeros de purina. Essas lesões são formadas exclusivamente em resíduos de
pirimidina, que constituem regiões altamente susceptíveis para mutações e lesões
no DNA e podem dar lugar a mutações específicas que compreendem a transição
citosina---timina e CC—TT nas sequências dipirimidinicas, isso se não forem
reparadas (PFEIFER; YOU; BESARATINIA, 2005; NARAYANAN; SALADI; FOX,
2010). A Figura 2 demonstra um modelo de carcinogênese induzido pela radiação
UV.
Os raios UV podem provocar o rompimento da dupla hélice do DNA, bloquear
a replicação e a transcrição e causar as mutações específicas nos proto-oncogenes
e nos genes supressores tumorais, acarretando no desenvolvimento do câncer. O
defeito no gene supressor de tumor tp53 é a forma mais comum de alteração
genética em neoplasias humanas. A indução da proteína p53, que funciona como
fator de transcrição, pode ser vista logo nos primeiros trinta minutos de exposição
aos raios UV (MALTZMAN; CZYZYK, 1984).
45
Figura 2. Representação esquemática da indução da carcinogênese pela radiação UV (adaptado de
EDER et al., 2014).
“Iniciação” UVB
Ceratinócito
normal
Dano ao DNA
Desenvolvimento epigenético e troca
genética do DNA dos ceratinócitos Ciclo celular
interrompido
Gene supressor tumoral
p53 interrompe o ciclo
celular
Gene supressor tumoral p53
mutado pela UVB, portanto
não para o ciclo celular.
Ciclo celular – propagação dos
ceratinócitos transformados
com instabilidade genômica.
Clone de ceratinócitos transformados
com instabilidade genômica
Mais alterações genômicas
Dano crítico ao DNA
Pré-cancerização Ciclo celular – replicação dos
ceratinócitos pré-cancerizado
s.
EXPOSISÃO ADICIONAL DE
UVB (Promoção)
Clone de ceratinócitos
cancerizados Curso estável
Expansão clonal
Campo de ceratinócitos pre-
canzerizados
Alterações genômicas
adicionais
Carcinoma Epidermóide
Replicação dos ceratinócitos
normalizados
Ciclo celular
normal resumido
Dano ao DNA
reparado
Apoptose
Dano ao DNA
irreparável
46
2.4 PROLIFERAÇÃO CELULAR / KI-67
A proliferação celular é um processo biológico essencial para todos os seres
vivos, controlada por mecanismos altamente coordenados e exerce o seu papel no
crescimento e na manutenção da homeostase tecidual. O controle desse processo é
completamente desregulado em alguns tipos de neoplasias e a avaliação da
atividade e proliferação celular em tumores tornou-se uma ferramenta para fornecer
informações sobre o diagnóstico, comportamento clínico e terapia destas lesões
(BOLOGNA-MOLINA et al., 2013)
O ciclo celular consiste de várias fases, durante as quais existem mudanças
que levam a divisão celular. Genes de células regulatórias modulam o ciclo celular
por meio de uma variada quantidade de proteínas (SCULLY; FIELD; TANZAWA,
2000). Análises imuno-histoquímicas das proteínas regulatórias do ciclo celular são
utilizadas para distinguir neoplasias malignas de lesões reativas e para predizer
seus comportamentos biológicos (MARTINEZ et al., 2005).
Os marcadores de proliferação celular referem-se a proteínas específicas ou
outros fatores cuja presença no crescimento e na divisão celular serve como um
indicador para tais células (BOLOGNA-MOLINA et al., 2013).
O Ki-67 é um marcador de proliferação celular que se expressa durante as
fases G1, S, G2 e M do ciclo celular, contudo está ausente na fase de G0
(MARTINEZ et al., 2005).
Na fase G1, o antígeno Ki-67 localiza-se na região perinuclear e, nas últimas
fases do ciclo celular, é detectado também em todo interior nuclear. Na mitose, está
presente em todos os cromossomos e aparece em uma estrutura reticulada que
envolve os cromossomos metafásicos. Diferente do que acontece com outras
proteínas associadas com o ciclo celular, o Ki-67 está ausente em células
quiescentes e não é detectável durante os processos de reparação do DNA
(SCHLUTER et al., 1993).
Gonzalez-Moles et al. (1999) realizaram um estudo para avaliar a expressão
suprabasal do Ki-67 como um marcador para a displasia epitelial oral. O estudo
envolveu epitélio neoplásico não adjacente de 74 CEOs. Todos os casos de
displasia de moderada a grave expressaram Ki-67 em camadas suprabasais.
47
Observou-se uma associação significativa entre a presença (p <0,0001) e a
severidade (p <0,007) da displasia e a expressão suprabasal de Ki-67.
Kurokawa et al. (2003) avaliaram o potencial de associação entre a perda da
expressão da sindecan-1 e a expressão da proteína p53 e o antígeno Ki-67 em 43
casos de leucoplasias com ou sem displasia epitelial e encontraram mudanças
significativas na marcação da p53 e do Ki-67 em leucoplasias com displasia epitelial
progredindo de leve a moderada ou severa. Os autores cocluiram que no epitélio
oral, a super expressão da proteína p53 e do antígeno Ki-67, e a baixa regulação da
expressão da sindecan-1 na camada basal estão associadas com mudanças
displásicas.
Martínez et al. (2005) realizaram um estudo avaliando as proteínas
apoptóticas p53, bax, bcl-2 e o marcador de proliferação celular Ki-67, em 13 casos
de QA e compararam com mucosa labial normal e mucosa oral. Os resultados
mostraram que a expressão do Ki-67 foi significativamente aumentada nas QAs e na
mucosa labial normal, quando comparadas com a mucosa oral (p˂0,05).
Dwivedi et al. (2013), avaliaram a expressão do Ki-67 nas camadas epiteliais
(basal, parabasal e suprabasal) em displasias orais e em CCEO. A expressão do Ki-
67 aumentou nas camadas basal e suprabasal de acordo com a severidade da
displasia epitelial, apresentando diferença estatisticamente significativa entre elas,
desde as de baixo risco até os CCEOs.
Birajadar et al. (2014), realizaram um estudo avaliando a expressão do Ki-67
em epitélio normal, em epitélios displásico e em CEOs e chegaram a conclusão de
que o índice de positividade do Ki-67 foi maior nos casos de displasia de alto risco
do que nos de baixo risco e para os carcinomas, foi encontrada uma maior
positividade entre os casos bem diferenciados e os pobremente diferenciados, mas
não nos moderadamente diferenciados.
Verma et al. (2014) avaliaram a expressão das proteínas p53 e Ki-67 no front
invasivo de 30 casos de CEO e correlacionaram a imunomarcação com os graus
histológicos de malignidade. Do total de 30 casos de CEO, a expressão do Ki-67 foi
positiva em 21 casos (70%) e da p53 em 20 casos. Foi observada diferença
estatisticamente significativa entre o grupo controle e os vários graus de CEO. Os
resultados enfatizam o potencial do Ki-67 e p53 como biomarcadores da
carcinogênese em CEO.
48
Salvadori et al. (2014), realizaram um estudo para analisar o Ki-67, TGF-β e
elastina em QAs e em CELI para determinar o possível papel destas proteínas na
carcinogênese de lábio. Diferentes porcentagens de células positivas para o Ki-67
foram encontradas nas QAs, variando conforme o grau de displasia epitelial. Uma
associação também foi encontrada entre a porcentagem de células positivas para o
Ki-67 e os graus tumorais em CELI. Uma correlação inversa foi encontrada entre o
Ki-67 e TGF-β1 em QA and CELI (p<0,01). Os achados indicam que mudanças na
expressão do Ki-67 e TGF-β1 contribuem para a carcinogênese de lábio.
No estudo de Lameira et al. (2014) foi feita a comparação da expressão da
MCM3, do Ki-67 e da p27 em mucosa normal, leucoplasias e CEO e determinaram
se a expressão alterada destas proteínas serviria como um marcador de prognóstico
de progressão maligna de lesões displásicas. Não houve diferença estatisticamente
significativa entre os graus de displasia (leve, moderada e severa) na expressão do
Ki-67. A expressão da MCM3 foi mais baixa em displasia leve do que nas severas e
nos CEOs (p<0,01). Quando as amostras foram correlacionadas com os CEO,
houve uma significância estatística no aumento da expressão do Ki-67 somente
quando comparado com as displasias leves. O estudo mostrou que a MCM3 pode
ser um melhor marcador que o Ki-67 para avaliação de displasias orais.
2.5 IMP-3
A proteína oncofetal IMP3 é um membro do fator II de crescimento
semelhante à insulina da família das proteínas de ligação do RNAm e é membro da
família IMP, a qual inclui: IMP1, IMP2 e IMP3. Elas desempenham um importante
papel nos estágios iniciais da embriogênese, participando do crescimento celular,
migração celular e no transporte e estabilização do RNA (JIANG et al., 2008). Ela foi
originalmente clonada do cDNA de um tumor pancreático e é idêntica as proteínas
KOC (proteína com domínio homólogo K super expressa em câncer) e L523S. Seu
gene está localizado no cromossomo 7p11.2. Ela é constituída de 580 resíduos de
aminoácidos e é codificada por 4350-nucleotídeos transcritos pelo RNAm (LI et al.,
2011b). IMP3 é normalmente expressa no desenvolvimento epitelial, muscular e
placentário durante os estágios iniciais da embriogênese humana e de ratos, mas
em tecidos adultos apresenta níveis baixos ou indetectáveis. A expressão da IMP3 é
também encontrada em tumores malignos como de pâncreas, pulmão, estômago, câ
49
cólon e sarcomas de tecidos moles, mas não é detectada em tecidos benignos
adjacentes (LU et al., 2009). Anticorpo específico para IMP-3 tem sido usado com
frequência em pesquisas que utilizam o método imuno-histoquímico (LI et al.,
2011b).
Alguns estudos têm demonstrado que a IMP3 é uma importante proteína na
proliferação e invasão tumoral, logo ela pode desempenhar um papel crítico na
transformação maligna e na progressão tumoral, tendo assim, um importante papel
como fator de prognóstico em várias lesões (JIANG et al, 2008; LU et al., 2009;
YUAN et al., 2009; CHEN et al., 2013).
A super expressão em adenocarcinoma ductal pancreático correlaciona-se
com baixa sobrevida, e com isso a expressão do IMP3 parece ser um marcador de
prognóstico desvaforável em diferentes tipos tumorais, embora em câncer de ovário
humano, ela está associada com um melhora na sobrevida. Estes dados mostram
que o exato papel da IMP3 ainda não está claro. (RIENER et al., 2009; NOSKE et
al., 2009).
Riener et al. (2009), realizaram um estudo para verificar a expressão do IMP-
3 como marcador para displasias de alto grau e como um fator de prognóstico
independente em carcinomas do ducto biliar. Eles analisaram a expressão do IMP-3
em ducto biliar normal, ducto biliar com inflamação aguda e mudanças epiteliais,
com baixo grau de displasia e alto grau de displasia. Os resultados demonstraram
uma forte marcação do IMP-3 em todas as displasias de alto grau e nos carcinomas
do ducto biliar e estes ainda apresentaram uma correlação com alta taxa de
proliferação celular e positividade para a p53.
No estudo de Findeis-Hosey et al. (2010), foi analisado se a expressão do
IMP-3 estava correlacionada com os graus histológicos de adenocarcinoma de
pulmão. O IMP-3 foi fortemente expresso em uma grande proporção dos
adenocarcinomas moderadamente e pobremente diferenciados e foi menos
frequente em bem diferenciados, sugerindo assim que a expressão do IMP-3 pode
estar associada com o comportamento biológico agressivo das lesões.
Lin et al. (2010), realizaram um estudo para detectar a expressão do IMP-3
em adenocarcinoma gástrico correlacionando com as características clínicas e o
marcador de proliferação celular Ki-67. Eles utilizaram ainda casos de mucosa
gástrica normal adjacente, de lesões primárias e de lesões metastáticas. Os
resultados demonstraram que a alta expressão do IMP-3 estava relacionada com as
50
metástases linfonodais e com o alto índice de proliferação celular.Nestes tumores os
autores sugeriram que o IMP-3 pode ser considerado o indicador de prognóstico e
de proliferação em adenocarcinomas gástricos.
Soddu et al. (2013), analisaram a expressão do IMP-3 em ceratoacantomas e
carcinomas de células escamosas de pele para determinar se o IMP-3 poderia
auxiliar no diagnóstico diferencial destas lesões. Os autores observaram que a
maioria dos casos de ceratoacantomas não expressou o IMP-3, enquanto que nos
carcinomas a imunomarcação foi positiva em 57% dos casos.
No estudo realizado por Yorukoglu et al. (2015), foi investigado o valor
diagnóstico da expressão do IMP-3, nucleofosmina e Ki-67 em carcinoma papilífero
da tireóide e neoplasias benignas da tireóide, além disso, eles analisaram se existia
diferença entre carcinomas papilífero e micropapilífero levando em consideração
parâmetros clínicos patológicos e os 3 marcadores. Os resultados demonstraram
não haver correlação da expressão do IMP-3 e Ki-67 com os parâmetros clínicos.
Em CE de cabeça e pescoço, incluindo os orais alguns estudos já foram
realizados, porém em lábio inferior, o IMP3 ainda não foi estudado.
Li et al. (2011a), realizaram estudo para investigar se o IMP-3 podia ser usado
como um biomarcador de prognóstico em CEO, correlacionando a sua expressão
com fatores clínico-patológicos e a sobrevida. Os resultados demonstraram haver
uma correlação entre a expressão da IMP3 com o alto grau de malignidade,
metástase linfonodal, avanço tumoral e o estadiamento clínico.
Li et al (2011b) investigaram a expressão da IMP-3 em 65 casos de CE de
língua e em 19 casos de leucoplasia oral, correlacionando com os aspectos clínico-
patológicos. A imunomarcação foi positiva em 50 casos de CE (77%) e quando
comparada com a expressão nos casos de leucoplasia, os carcinomas de língua
marcaram mais intensamente. Essa forte expressão foi associada com metástase
linfonodal nos casos de CCE de língua. Segundo os autores, o IMP-3 pode auxiliar
no desenvolvimento de metástase de língua, facilitando a migração celular e
favorecendo a carcinogênese e progressão desta neoplasia.
Lin et al. (2011) realizaram estudo com o objetivo de investigar a significância
clínica e o papel funcional da expressão do IMP-3 em 93 casos de CEO. A
expressão desta marcador foi correlacionada com parâmetros clínicos e a sobrevida
dos pacientes. Além disso, foi avaliada a influência do IMP-3 na invasão celular
através da interferência do RNA em uma cultura de células. Os resultados
51
demonstraram uma alta expressão da IMP-3 nos CEOs, associada
significativamente com o tamanho tumoral e com a mestástase linfonodal. Foi visto
ainda que esta proteína suprimiu a habilidade de invasão dos carcinomas in vitro,
como também inibiu a formação tumoral in vivo.
Clauditz et al. (2013) realizaram uma análise imuno-histoquímica da IMP-3 em
453 carcinomas de cabeça e pescoço (cavidade oral, orofaringe e laringe), sendo a
maioria dos casos, localizados na cavidade oral (n= 222) e realizaram a correlação
entre a expressão da proteína e os parâmetros clínicos-patológicos. A expressão da
IMP-3 apresentou uma relação estatisticamente significativa com o estadiamento
clínico dos carcinomas de cabeça e pescoço. Na análise feita de acordo com a
localização do tumor, foi observada uma alta correlação da expressão do IMP-3 com
o estadiamento clínico e com a atividade proliferativa nos tumores localizados na
cavidade oral. No grupo dos tumores localizados na orofaringe não houve
associação significativa da expressão do IMP-3 com parâmetros clínicos-
patológicos. Os autores explicam que isso pode ser decorrente da influência do
sistema imune na expressão do IMP-3 de acordo com a região anatômica.
52
Proposição
53
3 PROPOSIÇÃO
Esta pesquisa teve como objetivo avaliar comparativamente a expressão
imuno-histoquímica das proteínas Ki-67 e IMP-3 em CEL e QAs e, desse modo,
contribuir com informações adicionais sobre a carcinogênese em lábio inferior.
54
Material e Métodos
55
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
Este projeto foi cadastrado na Comissão Nacional de Ética em Pesquisa
(CONEP), através da Plataforma Brasil e submetido ao Comitê de Ética em
Pesquisa da Liga Norteriograndense contra o Câncer (LIGA) para sua avaliação de
acordo com a Resolução 466/12 do Conselho Nacional de Saúde (CNS) (BRASIL,
2012), sendo aprovado através do parecer Nº 923.018 em 19/12/2014 (Anexo A).
4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO
A presente pesquisa consistiu em estudo descritivo e transversal com análise
comparativa das características clínico-morfológicas e da expressão imuno-
histoquímica do Ki-67 e IMP-3 em uma série de casos de QAs e CELI.
4.3 POPULAÇÃO
Para a realização dessa pesquisa, foram utilizados casos de QAs
diagnosticados e arquivados no Serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de
Patologia Oral do Curso de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte (UFRN) e casos de CELI registrados no Serviço de Anatomia e Patologia da
LIGA.
4.4 AMOSTRA
A seleção da amostra foi intencional e compreendeu 33 casos de QAs e 33
casos de CELI.
56
4.5 ESTUDO CLÍNICO-DEMOGRÁFICO
A partir das fichas clínicas de requisições de biópsias arquivadas no
Laboratório de Anatomia Patológica do Departamento de Odontologia da UFRN e na
LIGA, foram obtidas informações referentes ao sexo, idade, raça e profissão, assim
como dados relacionados aos aspectos clínicos das QAs e CELI, anotados em
fichas elaboradas para a presente pesquisa (Apêndices A e B).
Para o estadiamento clínico dos CELIs, foram utilizados os parâmetros
elencados na sexta edição da Classificação TNM dos Tumores Malignos (SOBIN;
WITTEKIND, 2002), os quais são apresentados nos Quadros 2 e 3. Os dados
inerentes ao estadiamento clínico TNM foram coletados nos prontuários médicos
dos pacientes tratados no Hospital Dr. Luiz Antônio, Natal-RN e anotados em fichas
apropriadas (Apêndice B).
57
Quadro 1 - Sistema de estadiamento clínico TNM para o CE de lábio, preconizado por SOBIN, WITTENKIND (2002).
TAMANHO DO TUMOR PRIMÁRIO (T)
TX O tumor primário não pode ser avaliado
T0 Não há evidência de tumor primário
Tis Carcinoma in situ
T1 Tumor com 2cm ou menos em sua maior dimensão
T2 Tumor com mais de 2cm e até 4cm em sua maior dimensão
T3 Tumor com mais de 4cm em sua maior dimensão
T4a Tumor que invade estruturas adjacentes: cortical óssea, nervo alveolar
inferior, assoalho da boca, ou pele da face (queixo ou nariz)
T4b Tumor que invade o espaço mastigador, lâminas pterigoides ou base do
crânio ou envolve artéria corótida interna
ENVOLVIMENTO DE LINFONODO REGIONAL (N)
NX Os linfonodos regionais não podem ser avaliados
N0 Ausência de metástase em linfonodos regionais
N1 Metástase em um único linfonodo homolateral, com 3 cm ou menos em sua
maior dimensão.
N2 N2a – Metástase em um único linfonodo homolateral com mais de 3cm e
até 6cm em sua maior dimensão
N2b – Metástase em linfonodos homolaterais múltiplos, nenhum deles com
mais de 6cm em sua maior dimensão.
N2c – Metástase em linfonodos bilaterais ou contralaterais, nenhum deles
com mais de 6cm em sua maior dimensão
N3 Metástase em linfonodo com mais de 6cm em sua maior dimensão
ENVOLVIMENTO POR METÁSTASE DISTANTES (M)
MX A presença de metástase à distância não pode ser avaliada
M0 Ausência de metástase à distância
M1 Metástase à distância
58
Quadro 2 - Categorias de estadiamento clínico TNM para o CE de lábio, preconizado por SOBIN, WITTENKIND (2002).
ESTÁDIO CLASSIFICAÇÃO TNM
Estádio 0 Tis N0 M0
Estádio I T1 N0 M0
Estádio II T2 N0 M0
Estádio III T1, T2 N1 M0
T3 N0,N1 M0
Estádio IVA T1,T2, T3 N2 M0
T4a N0, N1, N2 M0
Estádio IVB Qualquer T N3 M0
T4b Qualquer N M0
Estádio IVC Qualquer T Qualquer N M1
4.6 ESTUDO MORFOLÓGICO
A amostra selecionada, fixada em formol a 10% e incluída em parafina, foi
submetida a cortes com 5µm de espessura, os quais, por sua vez, foram estendidos
em lâminas de vidro e submetidos à coloração de rotina da hematoxilina e eosina e
analisados sob microscopia de luz (Olympus CX31, Olympus Japan Co., Tokyo,
JPN).
Para os casos de QA, os espécimes foram analisados conforme os critérios
morfológicos preconizados pela OMS para diagnóstico (Quadro 4) (BARNES et al.
2005). Para classificar as QAs foi utilizado o sistema binário de gradação, onde as
lesões foram classificadas em de baixo risco de transformação maligna ou alto risco.
As lesões de baixo risco foram classificadas baseadas na observação de menos de
4 alterações arquiteturais ou menos de 5 alterações celulares. As lesões de alto
risco foram baseadas na observação de pelo menos 4 alterações arquiteturais e 5
alterações celulares (KUJAN et al, 2006).
59
Quadro 3 - Critérios arquiteturais e citológicos preconizados pela OMS (BARNES et al., 2005).
CRITÉRIOS PARA DIAGNÓSTICO DE DISPLASIA EPITELIAL
Alterações arquiteturais Alterações celulares
Estratificação epitelial irregular;
Hiperplasia da camada basal;
Projeções epiteliais em gota;
Número aumentado de figuras de mitose;
Mitoses superficiais;
Disceratose (ceratinização prematura das
células);
Pérolas de ceratina.
Anisonucleose (tamanho anormal do núcleo);
Pleomorfismo nuclear (forma anormal do
núcleo);
Anisocitose (tamanho anormal da célula);
Pleomorfismo celular (forma anormal da
célula);
Aumento da proporção núcleo-citoplasma;
Mitoses atípicas;
Hipercromatismo nuclear;
Aumento do número e/ou tamanho dos
nucléolos.
Foi realizada análise da gradação histológica de malignidade dos espécimes
de CELI, no front de invasão tumoral, de acordo com o sistema proposto por Bryne
(1998) (Quadro 4). Os escores obtidos em cada um dos parâmetros foram somados,
obtendo-se, dessa forma, o escore final de malignidade do caso. As lesões que
apresentaram escores finais entre 4 e 8, foram classificadas como de baixo grau de
malignidade. Por sua vez, os tumores com escore final igual ou superior a 9, foram
classificados como de alto grau de malignidade (SILVEIRA et al., 2007). Destaca-se
que a gradação histológica de malignidade foi realizada por dois examinadores,
previamente calibrados. Os casos cujas classificações de malignidade,
determinadas pelos examinadores, foram discordantes, foram resolvidos por
consenso. Os dados referentes aos aspectos clínicos e gradação histológica de
malignidade foram anotados em fichas apropriadas (APÊNDICE B)
60
Quadro 4 - Critérios e pontuações do Sistema de Gradação de Malignidade de Bryne (1998).
ESCORES DE MALIGNIDADE
1 2 3 4
Grau de
ceratinização
Altamente
ceratinizado (>50%
das células)
Moderadamente
ceratinizado (20 a
50% das células)
Mínima
ceratinização (5 a
20% das células)
Nenhuma
ceratinização (0-
5% das células)
Pleomorfismo
Nuclear
Pouco
pleomorfismo (>
75% de células
maduras)
Moderado
pleomorfismo (50-
75% de células
maduras)
Pleomorfismo
intenso (25-50%
de células
maduras)
Pleomorfismo
extremo (0-25%
de células
maduras)
Padrão de invasão Bordas infiltrativas
bem delimitadas
Cordões, bandas
e/ou trabéculas
sólidas infiltrativas
Pequenos grupos
ou cordões de
células infiltrativas
(nº de células por
grupo > 15)
Dissociação
celular espraiada
e pronunciada, em
pequenos grupos
e/ou células
individuais (nº de
células por grupo
<15)
Infiltrado
Inflamatório
Intenso Moderado Escasso Ausente
4.7 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO
4.7.1 Técnica
A amostra selecionada, fixada em formol a 10% e incluída em parafina, foi
submetida a cortes com 3 µm de espessura, os quais, por sua vez, foram estendidos
em lâminas de vidro devidamente preparadas com adesivo à base de organosilano
(3-aminopropiltrietoxisilano, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA).
Posteriormente, as amostras foram submetidas a uma temperatura de 60ºC em
estufa para uma desparafinização antes de serem submetidas à técnica imuno-
histoquímica, utilizando os anticorpos monoclonais anti-Ki-67 e anti-IMP3 (Quadro 5)
Como controle positivo para os anticorpos anti-Ki-67 e anti-IMP3 foi utilizado
cortes histológicos de tonsila. O controle negativo consistiu na substituição dos
anticorpos primários por albumina de soro bovino a 1% (BSA - Bovine Serum
61
Albumin) em solução tampão. A técnica utilizada seguiu o protocolo descrito a
seguir:
Desparafinização: 2 banhos em xilol, à temperatura ambiente (10 minutos
cada);
Re-hidratação em cadeia descendente de etanóis:
• Álcool etílico absoluto I (5 minutos);
• Álcool etílico absoluto II (5 minutos);
• Álcool etílico absoluto III (5 minutos);
• Álcool etílico 95°GL (5 minutos);
• Álcool etílico 80°GL (5 minutos);
Remoção de pigmentos formólicos com hidróxido de amônia a 10% em etanol
95°, à temperatura ambiente (10 minutos);
Lavagem em água corrente (10 minutos)
Passagens rápidas em água destilada (2 trocas);
Recuperação antigênica de acordo com as especificações sugeridas pelo
fabricante de cada anticorpo;
Lavagem em água corrente (10 minutos);
Passagens rápidas em água destilada (2 trocas);
Duas incubações dos cortes em solução de peróxido de hidrogênio 3% 10
volumes, em proporção de 1/1, para o bloqueio da peroxidase endógena
tecidual (10 minutos cada);
Lavagem em água corrente (10 minutos);
Passagens rápidas em água destilada (2 trocas);
Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 (5
minutos cada);
Incubação dos cortes com anticorpos primários anti-Ki-67 e anti-IMP3, em
solução diluente (Antibody diluent with background reducing components,
Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA);
Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 (5
minutos cada);
Para o Ki-67 foi utilizado o sistema LSAB + system-HRP (Dako) – aplicação
do anticorpo secundário Biotinylated Link Universal por 30 min. em
temperatura ambiente (T.A)
62
Para o IMP-3 foi utilizado como anticorpo secundário o sistema Envision +
Dual Link System-HRP (Dako) por 30 min em TA.
Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,5 (5
minutos cada);
Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 (5
minutos cada);
Revelação da reação com solução cromógena de 3,3-diaminobenzidina
(Liquid DAB+ Substrate, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA) (7
minutos);
Lavagem em água corrente (10 minutos);
Passagens rápidas em água destilada (2 trocas);
Contracoloração com hematoxilina de Mayer, à temperatura ambiente (5
minutos);
Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:
• Álcool etílico 80°GL (2 minutos);
• Álcool etílico 95°GL (2 minutos);
• Álcool etílico absoluto I (5 minutos);
• Álcool etílico absoluto II (5 minutos);
• Álcool etílico absoluto III (5 minutos);
Passagens rápidas em xilol (3 trocas);
Montagem em resina Permount® (Fisher Scientific Inc., Fair Lawn, NJ, USA).
Quadro 5 - Especificidade, clone, fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação dos anticorpos primários utilizados no estudo.
Especificidade Clone Fabricante Diluição Recuperação
Antigênica
Incubação
Ki-67
(MIB-1)
Dako
North
America
1:200 Citrato
pH6,0
Pascal, 3’
60’
IMP-3
69.1 Dako
North
America
1:50 Citrato
pH6,0
Pascal, 3’
18h
(overnight)
63
4.7.2 Análise do perfil Imuno-histoquímico
4.7.2.1 IMP-3
A marcação positiva para o IMP-3 foi considerada a citoplasmática de
coloração acastanhada, independente da intensidade, nas células epiteliais das QAs
e células tumorais dos CELI e observadas em microscópio óptico em um aumento
de 40x. A análise foi realizada por um único examinador em um estudo cego. A
análise foi adaptada da metodologia do estudo de Li et al. (2011a) (Quadro 6), onde
a porcentagem de células imunomarcadas foram avaliadas de acordo com a
seguinte escala : de 0 a +3, onde o escore 0 correspondeu a (0%); +1, (até 30% das
células marcadas); +2, (entre 30% a 60% das células marcadas) e +3, (acima de
60% das células marcadas). Posteriormente, os casos foram classificados em sem
marcação (escore 0), baixa expressão (escore +1) e alta expressão (escores +2 e
+3), conforme realizado por Clauditz et al (2013).
Quadro 6 - Classificação por escore do IMP-3 adaptada de Li et al (2011a).
Anticorpo Percentual de
Imunoexpressão
Escore
IMP-3
0% 0
≤30% +1
>30% a ≤60% +2
>60% +3
4.7.2.2 Ki-67
Os espécimes foram escaneados pelo Scanner Panoramic MIDI
(3DHISTECH® Kft.29-33, Konkoly-Thege M. str.Budapest, Hungary, H-1121) e as
imagens obtidas foram observadas através do programa de visualização Panoramic
Viewer 1.15.2 (3DHISTECH® Kft.29-33, Konkoly-Thege M. str.Budapest, Hungary,
H-1121). Com o auxílio desse programa foi possível observar toda a extensão do
64
espécime. A imagem foi aumentada em 40x, de acordo com as especificações do
programa, onde foram fotografados vários campos consecutivos de cada caso com o
auxílio do mesmo programa de visualização anteriormente citado. Em lesões
ulceradas, estas áreas foram evitadas. Com auxílio do programa Imaging Processing
and Analysis in Java (ImageJ®, National Institute of Mental Health, Bethesda,
Maryland, USA) foi realizada então uma análise quantitativa da imunomarcação para
o Ki-67, sendo contadas 1.000 células epiteliais positivas e negativas para o
anticorpo nas células neoplásicas do front de invasão para os casos de CEL e
células epiteliais para os casos de QA. Foram consideradas células positivas
aquelas que apresentaram coloração acastanhada nuclear, independente da
intensidade da coloração. De posse do número de células positivas neoplásicas e
epiteliais, foi estabelecido um índice de positividade (IP) para o Ki-67. Para isso, o
número de células neoplásicas e epiteliais positivas foi multiplicado por 100 e
dividido por 1.000, culminando com a obtenção de resultados percentuais. Essa
avaliação foi uma adaptação da metodologia preconizada por Kurokawa et al.
(2005). No sentido de correlacionar a expressão do IMP-3 com o índice de
proliferação celular, estabeleceu-se escores semelhantes ao utilizado para o IMP-3,
transformando os percentuais obtidos na análise do Ki-67 em escores. Após
estabelecer o IP para cada caso, os mesmos foram gradados utilizando os escores
0, +1, +2 e +3, para as lesões que apresentaram um IP de 0%, ≤30%, >30% a
≤60% e >60%, respectivamente e classificados em sem marcação (escore 0), baixa
expressão (escore +1) e alta expressão (escores +2 e +3) (Quadro 7). O estudo foi
do tipo cego onde o examinador não teve acesso às informações clínico patológico
dos casos.
IP = Número de Células Positivas × 100
1000
65
Quadro 7 - Classificação por escore do Ki-67 adaptada de Li et al (2011a)
4.8 CALIBRAÇÃO INTRA-EXAMINADOR
Para diminuir a variação e os erros na análise dos dados é importante que
haja uma padronização para assegurar a fidedignidade dos achados. Então fez-se
necessário a calibração com o objetivo de obter a confiabilidade do estudo. Portanto,
foi realizada a calibração intra-examinador para o estudo imuno-histoquímico,do
anticorpo IMP-3 em que o examinador avaliou 20 casos iguais e a partir dos dados
obtidos foi calculado o coeficiente Kappa. O valor obtido foi de 0.918. Dessa forma
ficou comprovada a reprodutibilidade intra-examinador.
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Após a coleta dos dados, os resultados obtidos da análise imuno-
histoquímica foram digitados em planilha eletrônica Excel (Microsoft Office 2007®) e
posteriormente exportados para o programa estatístico SPSS (Statistical Package for
the Social Sciences) na versão 20.0 e submetidos inicialmente à análise descritiva,
com intuito de testar as hipóteses levantadas. As variáveis qualitativas foram
apresentadas na forma de frequências absolutas e relativas, utilizando-se o teste
Qui-quadrado de Pearson, enquanto a variável quantitativa foi descrita por meio de
mediana e intervalos interquartis (percentil 25 e 75). Posteriormente, para avaliar se
existia diferença estatisticamente significativa entre as variáveis independentes, os
dados foram submetidos ao teste estatístico não-paramétrico de Mann-Whitney, para
relacionar com até 2 variáveis. Foi adotado nível de significância de 5% para todos
os testes, sendo considerados significativos os valores de p≤0,05.
Anticorpo IP Escore
Ki-67
0% 0
≤30% +1
>30% a ≤60% +2
>60% +3
66
Para comparar as variáveis dependentes entre si foi aplicado o teste
estatístico de Wilcoxon.
67
Resultados
68
5 RESULTADOS
5.1 ANÁLISE CLÍNICA E MORFOLÓGICA
5.1.1 Queilites Actínicas
Foram analisados clinicamente e microscopicamente 33 casos de QA. Destes
casos, 78,8% eram de pacientes do sexo masculino (n=26) e 21,2% do sexo
feminino (n=7), com idade média de 50 anos. No que se refere a atividade
ocupacional, houve predominância de atividades relacionadas à exposição solar
como agricultor (n= 14), motorista (n=2), pedreiro (n=1), operador de guincho (n=1)
e pescador (n=1). Algumas outras atividades foram relacionadas, porém não havia
relação com a exposição solar, como de aposentado (n=2), professora (n=1),
carpinteiro (n=1), autônomo (n=1), borracheiro (n=1) e veterinário (n=1) e em 7
casos, não havia informação a respeito da profissão exercida. Clinicamente, a
maioria das QAs apresentaram aspecto leucoplásico (n=15).
Na avaliação morfológica, encontrou-se aspectos histopatológicos inerentes
ao quadro de QAs, sendo evidenciada a presença de epitélio escamoso estratificado
atrófico, frequentemente demonstrando uma marcante produção de ceratina
(hiperceratose), graus variados de displasia epitelial, variando desde uma displasia
leve, moderada ou severa, ou até mesmo um epitélio sem displasia. Presença de um
leve infiltrado inflamatório subjacente ao epitélio e o tecido conjuntivo apresentando
uma faixa de alteração basofílica amorfa e acelular das fibras colágenas,
caracterizando a elastose solar. Os casos que não apresentaram alteração
displásica ou apenas displasia epitelial leve foram classificados como de baixo risco
de malignidade (Figura 3), correspondendo a 22 casos (66,7%), enquanto 11 casos
(33,3%) apresentaram um alto risco (Figura 4)..
Das 19 ocupações profissionais com exposição solar, apenas em 3 delas não
foram encontradas alterações displásicas, nas outras 16, as alterações variaram de
displasia epitelial leve a severa.
Os perfis clínico e morfológico da amostra de QAs encontram-se
caracterizados na Tabela 1.
69
Tabela 1 - Perfil da amostra das QAs (sexo, idade, raça, atividades profissionais, aspecto clínico e gradação histológica). Natal/RN 2015.
VARIÁVEIS n %
SEXO
Masculino 26 78,8
Feminino 7 21,2
IDADE
˂ 40 anos 5 15,2
≥ 40 anos 28 84,8
RAÇA
Branca 20 60,6
Parda 8 24,2
Não informada 5 15,2
ATIVIDADES PROFISSIONAIS
Com exposição solar 19 57,6
Sem exposição solar 7 21,2
Não informado 7 21,2
ASPECTO CLÍNICO
Leucoplásico 15 45,4
Eritroplásico 6 18,2
Eritroleucoplásico 12 36,4
GRADAÇÃO HISTOLÓGICA
Baixo risco 22 66,7
Alto risco 11 33,3
TOTAL 33 100
Fonte: Seviço de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral – Departamento de Odontologia/UFRN.
As variáveis, sexo, idade e aspecto clínico foram relacionadas com a
gradação histológica das QAs sendo evidenciado que os pacientes do sexo
masculino, com idade igual ou acima de 40 anos apresentando lesões com aspecto
eritroplásico/eritroleucoplásico apresentaram-se com baixo risco de malignização,
porém o teste do Qui-quadrado demonstrou não existir diferença estatisticamente
significativa entre os grupos (p > 0,05), (Tabela 2).
70
Tabela 2 - Distribuição absoluta e relativa dos casos de QAs quanto ao sexo, idade e aspecto clínico de acordo com a gradação histológica. Natal/RN 2015.
Gradação QAs
Variável Baixo Risco Alto Risco TOTAL p(1)
n (%) n (%) n (%)
Sexo Masculino 14 (53,8) 12 (46,2) 26 (100) 0,131
Feminino 6 (85,7) 1 (14,3) 7 (100)
TOTAL 20 (60,6) 13 (39,4) 33 (100)
Idade ˂ 40 anos 4 (80,0) 1 (20,0) 5 (100) 0,343
≥40 anos 16 (57,2) 12 (42,8) 28 (100)
TOTAL 20 (60,6) 13 (39,4) 33 (100)
Aspecto Leucoplásico 9 (60,0) 6 (40,0) 15 (100) 0,949
Clínico Eritroplásico/ 11 (61,1) 7 (38,9) 18 (100)
Eritroleucoplásico
TOTAL 20 (60,6) 13 (39,4) 33 (100)
Fonte : Serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral – Departamento de Odontologia/ UFRN. (1)Teste Qui-quadrado de Pearson
5.1.2 Carcinoma Epidermóide de Lábio Inferior
A amostra consistiu de 33 casos de CELI, sendo 23 casos em pacientes do
sexo masculino (69,69%) e 9 do sexo feminino (30,31%), com idade média de 62
anos. Em um caso, não havia na ficha clínica, informação sobre o sexo do paciente.
No que se refere a atividade ocupacional, das 16 fichas clínicas que continham essa
informação, 8 pacientes eram agricultores e os outros 8, desempenhavam atividades
distintas (aposentado, autônomo, do lar, motorista, contador, radialista e militar).
Em relação ao parâmetro estadiamento clínico TNM, só foi encontrada essa
informação no prontuário de 13 pacientes. O estágio II foi o mais prevalente,
correspondendo a 8 casos.
A avaliação morfológica dos casos demonstrou os aspectos histopatológicos
inerentes ao CEO, destacando-se a invasão em ilhas, cordões e lençóis de células
71
epiteliais malignas, exibindo pleomorfismo, figuras de mitose típicas e atípicas,
nucléolos proeminentes, áreas de disceratose e formação de pérolas de ceratina. O
infiltrado inflamatório mononuclear variou do escasso a intenso. Dos 33 casos de
CELI avaliados utilizando a gradação histológica de malignidade proposta por Bryne
(1998), a maioria foi classificada como alto grau de malignidade (n =18) (Figura 6);
enquanto que 15 casos se apresentaram como de baixo grau de malignidade (Figura
5).
A amostra dos casos de CELI está caracterizada conforme a Tabela 3.
72
Tabela 3 - Perfil da amostra de CELI (sexo, idade, raça, atividades profissionais, aspecto clínico, gradação histológica e TNM). Natal/RN 2015.
VARIÁVEIS n %
SEXO
Masculino 23 69,7
Feminino 9 27,3
Não informado 1 3,0
IDADE
˂ 40 anos 3 9,0
≥ 40 anos 30 91,0
RAÇA
Branca 6 18,2
Parda 11 33,3
Não informada 16 48,5
ATIVIDADES PROFISSIONAIS
Com exposição solar 9 27,8
Sem exposição solar 7 21,2
Não informado 17 51,0
GRADAÇÃO HISTOLÓGICA
Baixo Grau 15 45,5
Alto Grau 18 54,5
TNM
Estádio I 4 12,1
Estádio II 8 24,3
Estádio IVA 1 3,0
Não informado 20 60,6
TOTAL 33 100
Fonte : Prontuários do Hospital Dr. Luiz Antônio. Natal-RN
As variáveis sexo, idade e estadiamento clínico foram relacionadas com a
gradação histológica dos CELIs. A maioria dos casos correspondeu a pacientes
apresentando alto grau de malignidade, do sexo masculino, com idade igual ou
acima dos 40 anos com estágio II no estadiamento TNM, porém não houve
73
nenhuma relação estatisticamente significativa entre as características clínicas e a
gradação (p > 0,05) Os dados encontram-se relacionados na Tabela 4.
Tabela 4 - Valores absolutos e percentuais dos casos de CELI quanto às características clínicas e a gradação histológica. Natal/RN 2015.
Gradação CELI
Variável Baixo Grau Alto Grau TOTAL p(1)
n (%) n (%) n (%)
Sexo Masculino 10 (43,5) 13 (56,5) 23 (100) 0 ,961
Feminino 4 (44,5) 5 (55,5) 9 (100)
TOTAL* 14 (43,8) 18(56,2) 32 (100)
Idade ˂ 40 anos 1 (33,3) 2 (66,7) 3 (100) 0 ,663
≥40 anos 14 (46,7) 16 (53,3) 30 (100)
TOTAL 15 (45,4) 18 (54,6) 33 (100)
TNM Estágio I 2 (50) 2 (50) 4 (100) 1,000
Estágio II 4 (50) 4(50) 8 (100)
TOTAL* 6 (50) 6 (50) 12 (100)
Fonte : Prontuários do Hospital Dr. Luiz Antônio. Natal-RN *Um caso não havia informação (1)Teste Qui-quadrado de Pearson
74
5.2 ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DO Ki-67
5.2.1 Queilites Actínicas
A análise da imunoexpressão do Ki-67 revelou expressão nuclear nas células
epiteliais, conforme ilustrada na Figura 7. Para o grupo das QAs, a expressão do Ki-
67 foi detectada em todos os casos estudados com índices de positividade que
variaram de 28,1% a 78,9%. A maioria dos casos exibiu escore 2, correspondendo a
81,8% dos casos. Os dados referentes a imunoexpressão do Ki-67 nos casos de
QAs relacionados com os grupos de risco de transformação maligna estão
expressos na Tabela 5 e no Gráfico 1.
Tabela 5 - Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância para os escores de expressão do Ki-67 nos grupos histológicos das QAs. Natal/RN 2015.
Grupos n Mediana Q25-Q75 Média dos U p(1)
Postos
Baixo risco 20 2 2 – 2 16,70 124 ,00 0,742
Alto risco 13 2 2 – 2 17,40
Fonte : Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral - UFRN (1)Teste de Mann-Whitney
A partir da análise dos dados contidos na Tabela 5, observa-se que a
mediana dos escores da expressão do Ki-67 foi igual tanto no grupo de baixo risco
de malignização quanto no de alto risco, ou seja, em ambos os grupos, a mediana
ficou no escore 2, demonstrando uma elevada expressão do Ki-67, embora não
tenha sido observada diferença estatisticamente significativa entre os grupos (p >
0,05).
75
Gráfico 1 - Box-plot relativo aos escores da expressão do Ki-67 de acordo com a gradação histológica das QAs. Natal/RN 2015.
5.2.2 Carcinoma Epidermóide de Lábio Inferior
No grupo dos CELI, evidenciou-se expressão do Ki-67 com imunoexpressão
nuclear nas células neoplásicas do front de invasão (Figura 8) em todos os casos
com índices de positividade variando de 1,7% a 76,3%. A maioria dos casos exibiu
escore 2, correspondendo a 54,5% dos casos. Os dados referentes a
imunoexpressão do Ki-67 dos casos de CELI relacionados com o estadiamento
clínico e a gradação histológica estão expressos nas Tabelas 6 e 7 e nos Gráficos 2
e 3, respectivamente.
76
Tabela 6 - Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância para os escores de expressão do Ki-67 e estadiamento clínico dos casos de CELI. Natal/RN 2015.
Estadiamento n Mediana Q25-Q75 Média dos U p(1)
Postos
Estádio I 4 1 1 – 1,7 3,88 5,5 0,042
Estádio II 8 2 2 – 2 7,81
Fonte : Prontuários do Hospital Dr. Luiz Antônio. Natal-RN (1)Teste de Mann-Whitney
A análise da Tabela 6, revelou que a mediana dos escores da expressão do
Ki-67 no estágio I ficou no escore 1, ou seja, uma mediana de baixa expressão do
Ki-67 enquanto que no estágio II, a mediana ficou no escore 2, ou seja,
apresentando uma elevada expressão e apresentando diferença estatisticamente
significativa entre os grupos (p > 0,05).
77
Gráfico 2 - Box-plot relativo aos escores da expressão do Ki-67 de acordo com o estadiamento clínico dos CELI. Natal/RN 2015.
Tabela 7 - Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância para os escores de expressão do Ki-67 de acordo com a gradação histológica dos CELI. Natal/RN 2015.
Gradaçao n Mediana Q25-Q75 Média dos U p(1)
Postos
Baixo Grau 15 2 1 – 2 16,97 134 ,50 0,984
Alto Grau 18 2 1 – 2 17,03
Fonte : Prontuários do Hospital Dr. Luiz Antônio. Natal-RN (1)Teste de Mann-Whitney
78
A análise da Tabela 7, revelou que a mediana dos escores da expressão do
Ki-67 tanto no CELI de baixo grau, quanto nos de alto grau, ficou no escore 2, ou
seja, de alta expressão do marcador, embora sem diferença estatística significativa
entre os grupos (p > 0,05).
Gráfico 3 - Box-plot relativo aos escores da expressão do Ki-67 de acordo com a classificação histológica dos CELI. Natal/RN 2015.
79
5.3 ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DO IMP-3
5.3.1 Queilites Actínicas
Na análise da imunoexpressão do IMP-3 foi observada expressão no
citoplasma das células epiteliais nas QAs (Figura 9). Embora em 9 casos não
houvesse expressão; em 12 casos, houve uma baixa expressão; e em 12 casos
ocorreu elevada expressão, compreendendo 5 casos com escore 2 e 7, com escore
3. Dos 19 pacientes que desempenhavam atividade com exposição solar, em 17 foi
observada expressão do IMP-3, 7 com baixa expressão e 10 com elevada
expressão. Os dados referentes a imunoexpressão do IMP-3 nos casos de QAs
relacionados com os grupos de risco de transformação maligna estão expressos na
Tabela 8 e no Gráfico 4.
Tabela 8 - Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância para os escores de expressão do IMP-3 nos grupos histológicos das QAs. Natal/RN 2015.
Grupos n Mediana Q25-Q75 Média dos U p(1)
Postos
Baixo risco 21 1 0 – 2 16,23 114 ,50 0 ,551
Alto risco 12 1 0,5 – 3 18,19
Fonte : Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral - UFRN (1)Teste de Mann-Whitney
Foi observado que a mediana dos escores da expressão do IMP-3 foi igual
tanto nos grupos de baixo risco de malignização quanto no de alto risco. A análise
estatística revelou não haver diferença estatisticamente significativa entre os grupos
(p > 0,05).
80
Gráfico 4 - Box-plot relativo aos escores da expressão do IMP-3 de acordo com a gradação histológica das QAs. Natal/RN 2015.
5.3.2 Carcinoma Epidermóide de Lábio Inferior
A análise da imunoexpressão do IMP-3 nos casos de CELI, demonstrou
marcação citoplasmática nas células neoplásicas do front de invasão (Figura 10)
embora não tenha ocorrido expressão em 13 casos. Nos casos que apresentaram
expressão (n=20), 7 corresponderam ao escore 1, logo uma baixa expressão e nos
demais casos (n=13), houve uma elevada expressão, sendo a maioria de escore 3
(n=9). Dos 8 casos relacionados com a atividade ocupacional com exposição solar, o
IMP-3 se expressou em 6 casos, sendo 3 com baixa expressão e 3 com elevada
expressão. Com relação ao estadiamento TNM, dos 4 casos com estágio I, metade
81
deles não apresentou imunomarcação para o IMP-3 e no estágio II, dos 8 casos, 6
não apresentaram marcação. O caso que apresentava estágio IVA foi excluído da
análise estatística, o qual apresentou baixa expressão do IMP-3 (escore 1). Os
dados referentes a imunoexpressão do IMP-3 nos casos de CELI relacionados com
o estadiamento clínico estão expressos na Tabela 9 e no Gráfico 5 e com a
gradação histológica estão expressos na Tabela 10 e no Gráfico 6.
Tabela 9 - Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância para os escores de expressão do IMP-3 e estadiamento clínico dos CELI. Natal/RN 2015.
Estadiamento n Mediana Q25-Q75 Média dos U p(1)
Postos
Estádio I 4 0,5 0 – 2,5 7,75 11,0 0 ,307
Estádio II 8 0 0 – 0,7 5,88
Fonte : Prontuários do Hospital Dr. Luiz Antônio. Natal-RN (1)Teste de Mann-Whitney
A mediana dos escores da expressão do IMP-3 foi maior no grupo em
estadiamento clínico I, porém não foi observada diferença estatisticamente
significativa entre os grupos (p > 0,05).
82
Gráfico 5 - Box-plot relativo aos escores da expressão do IMP-3 de acordo com o estadiamento clínico dos CELI. Natal/RN 2015.
83
Tabela 10 - Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância para os escores de expressão do IMP-3 de acordo com a gradação histológica dos CELI. Natal/RN 2015.
Gradação n Mediana Q25-Q75 Média dos U p(1)
Postos
Baixo Grau 15 1 0 – 2 14,23 93,5 0,115
Alto Grau 18 1,5 0 – 3 19,31
Fonte : Prontuários do Hospital Dr. Luiz Antônio. Natal-RN (1)Teste de Mann-Whitney
A análise da Tabela 10, revelou que a mediana dos escores da expressão do
IMP-3 tanto no CELI de baixo grau, quanto nos de alto grau, apresentaram uma
baixa expressão, porém não havendo diferenças estatisticamente significativas entre
os grupos (p > 0,05).
84
Gráfico 6 - Box-plot relativo aos escores da expressão do IMP-3 de acordo com a classificação histológica dos CELI. Natal/RN 2015.
5.4 COMPARAÇÃO DAS IMUNOEXPRESSÕES DO KI-67 E IMP-3
Por meio do teste de Wilcoxon observou-se diferença estatisticamente
significativa entre os escores de imunormarcação do IMP-3 e do Ki-67 nas QAs,
(p˂0,05) (Tabela 11).
A avaliação entre os escores de imunomarcação do IMP-3 e do KI-67 nos
casos de CELIs, revelou não existir diferença estatisticamente significativa entre os
marcadores (p>0,05) (Tabela 11).
85
Tabela 11 - Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75 e significância para os escores de expressão do Ki-67 e IMP-3 nas QAs e nos CELI. Natal/RN 2015.
Lesão n IMP-3 Ki-67 p(1) Md (Q25-Q75) Md (Q25-Q75)
QA 33 1 (0-2) 2 (2-2) 0,000* CELI 33 1 (0-3) 2 (1-2) 0,133 Fonte : Serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral/UFRN e prontuários do Hospital Dr. Luiz Antônio. Natal-RN (1): Teste Wilcoxon * Diferença estatisticamente significativa a 5,0%
5.5 IMUNOEXPRESSÕES ENTRE AS QAs E CELI
Avaliando a imunoexpressão do Ki-67 entre os casos de QAs e CELIs, foi
observada diferença estatisticamente significativa entre os grupos (p ˂ 0,05). Os
dados referentes a correlação da imunoexpressão do Ki-67 nos casos de QAs e
CELI estão expressos na Tabela 12 e no Gráfico 7.
Tabela 12 - Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância para os escores de expressão do Ki-67 nos casos de QAs e de CELIs. Natal/RN 2015.
Variável n Mediana Q25-Q75 Média dos U p(1)
Postos
QAa 33 2 2 – 2 40,05 328,50 0,001*
CELIb 33 2 1 – 2 26,95
Fontes : aServiço de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia–
UFRN bProntuários do Hospital Dr. Luiz Antônio. Natal-RN
(1)Teste de Mann-Whitney * Diferença estatisticamente significativa a 5,0%
86
Gráfico 7 - Box-plot relativo aos escores da expressão do Ki-67 nos casos de QAs e CELIs. Natal/RN 2015.
A imunoexpressão do IMP-3 entre os casos de QAs e CELIs, não apresentou
diferença estatisticamente significativa entre os grupos (p > 0,05). Os dados
referentes a correlação da imunoexpressão do IMP-3 nos casos de QAs e CELI
estão expressos na Tabela 13 e no Gráfico 8.
87
Tabela 13 - Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância para os escores de expressão do IMP-3 nos casos de QAs e CELIs. Natal/RN 2015.
Variável n Mediana Q25-Q75 Média dos U p(1)
Postos
QAa 33 1 0 – 2 34,15 523,00 0,774
CELIb 33 1 0 – 3 32,85
Fontes : a Serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia–
UFRN. bProntuários do Hospital Dr. Luiz Antônio. Natal-RN
(1)Teste de Mann-Whitney
Gráfico 8 - Box-plot relativo aos escores da expressão do IMP-3 nos casos de QAs e CELIs. Natal/RN 2015.
88
Figura 3. Fotomicrografia evidenciando as características histopatológicas de QA
de baixo risco de transformação maligna (Pannoramic Viewer, H/E; Barra = 100µm).
Figura 4. Fotomicrografia evidenciando as características histopatológicas de QA
de alto risco de transformação maligna (Pannoramic Viewer, H/E; Barra = 100µm).
89
Figura 5. Fotomicrografia evidenciando as características histopatológicas do CELI
de baixo grau de malignidade (Pannoramic Viewer, H/E; Barra = 500µm).
Figura 6. Fotomicrografia evidenciando as características histopatológicas do CELI
de alto grau de malignidade (Pannoramic Viewer, H/E; Barra = 500µm).
500µm
90
Figura 7. Fotomicrografia demonstrando imunoexpressão nuclear do Ki-67
em QA (Pannoramic Viewer, LSAB; Barra = 50µm)
Figura 8. Fotomicrografia demonstrando imunoexpressão nuclear do Ki-67
em CELI (Pannoramic Viewer, LSAB; Barra = 200µm)
91
Figura 9. Fotomicrografia demonstrando imunoexpressão citoplasmática do IMP-3
em QA (Pannoramic Viewer, Envision; Barra = 100µm)
Figura 10. Fotomicrografia demonstrando imunoexpressão citoplasmática do IMP-3
em CELI (Pannoramic Viewer, Envision; Barra = 100µm)
92
Discussão
93
6 DISCUSSÃO
A QA é uma condição patológica que ocorre mais frequentemente no lábio
inferior e tem como principal causa, a exposição crônica e excessiva a radiação
ultravioleta (MARKOPOULOS; ALBANIDOU-FARMAKI; KAYAVIS, 2004; SAVAGE;
MCKAY; FAULKNER, 2010). Possui um potencial de transformação maligna em
torno de 10% a 20% dos casos (SCHUSSEL et al., 2011; ALVES et al., 2014). Os
dados epidemiológicos e características clínicas das QAs descritos em vários
estudos, revelam a predominância desta lesão em indivíduos do sexo masculino, de
meia idade e de pele clara (MARKOPOULOS; ALBANIDOU-FARMAKI; KAYAVIS,
2004; CAVALCANTE; ANBINDER; CARVALHO, 2008; MARTINS-FILHO; DA SILVA;
PIVA, 2011; LUCENA et al, 2012). Estes dados foram confirmados na amostra deste
estudo. A maioria das atividades profissionais relatadas pelos pacientes desta
pesquisa estão relacionadas com a exposição solar, o principal fator etiológico para
o desenvolvimento das QAs, conforme encontrado em vários estudos, tais como o
de Markopoulos, Albanidou-Farmaki e Kayavis (2004), Martins-Filho, Da Silva e Piva
(2011) e Sarmento et al. (2014).
As QAs podem apresentar-se clinicamente como lesões leucoplásicas,
eritroplásicas ou eritroleucoplásicas. Nesta pesquisa, destacou-se a forma
leucoplásica, que também foi a mais prevalente nos estudos de Jadotte e Schwartz
(2011) e Vieira et al. (2012). Porém, a apresentação clínica da lesão prediz a
existência de alterações displásicas nos estudos histológicos (CAVALCANTE;
ANBINDER; CARVALHO, 2008; PIÑERA-MARQUES et al., 2010; JADOTTE;
SCHWARTZ, 2011). Considerando que as QAs apresentam potencial de
transformação maligna, procuramos, neste estudo, classificar os casos da nossa
amostra de acordo com o sistema binário preconizado por Kujan et al (2006), em
baixo e alto risco. Nossos resultados demonstraram que a maioria dos casos
apresentava displasia leve concordando assim com o estudo realizado por Sarmento
et al (2014). Neste mesmo estudo, os autores também não encontraram associação
significativa entre os aspectos clínicos das QAs e a gradação histológica.
O CEO é a neoplasia maligna mais frequente da boca, correspondendo em
torno de 90% de todos os cânceres orais com uma taxa de incidência que varia ao
redor do mundo (PIRES et al., 2013; KHAMMISSA et al., 2014). Esta neoplasia é
derivada do epitélio de revestimento podendo ocorrer tanto na cavidade oral
94
propriamente dita (mucosa jugal, gengiva, palato, língua e assoalho bucal) quanto no
vermelhão do lábio (BATISTA et al., 2010). O CEL corresponde a aproximadamente
25% a 30% de todos os carcinomas orais, acometendo principalmente, o lábio
inferior (HASSON, 2008; SOUZA et al., 2011).
Quanto à sua etiologia, o CELI tem sido relacionado com a exposição
prolongada a radiação UV associada com atividades ocupacionais ao ar livre, cor da
pele, consumo de fumo, de álcool e com condições pré-malignas, como a QA
(SOUZA et al., 2011; SALIHU et al., 2014). Neste estudo, considerando os casos em
que constavam informações referentes a atividade ocupacional, apenas 16 fichas
clínicas continham essa informação e, destas, em 50% dos pacientes havia relato de
realizar atividades expostos a radiação solar.
Com relação aos dados epidemiológicos, os estudos em geral, revelam que
os indivíduos do sexo masculino, com idade acima dos 40 anos e da raça branca
são os mais afetados pela QA (AL-RAWI; TALABANI, 2007; HASSON, 2008;
CZERNINSKI; ZINI; COHEN, 2010; SOUZA et al., 2011; PIRES et al., 2013; SALIHU
et al., 2014). Estas informações também foram evidenciadas nesta pesquisa, a
exceção da raça, a qual prevaleceu a raça parda, embora mais da metade das
fichas clínicas não contivessem esta informação. Alguns estudos justificam estes
achados pela maior exposição dos homens ao sol, devido as atividades realizadas e,
pelas mulheres fazerem uso de proteção solar, principalmente pelo uso do batom
(CZERNINSKI; ZINI; COHEN, 2010; SOUZA et al., 2011).
Do ponto de vista clínico, o CELI apresenta um bom prognóstico quando
diagnosticado precocemente, com 90% dos pacientes atingindo sobrevida de 5
anos. No entanto, 5% a 20% dos pacientes apresentam metástase linfonodal
regional no momento do diagnóstico, reduzindo assim a taxa de sobrevida a apenas
30% (HASSON, 2008). Os parâmetros clínicos e histopatológicos têm sido utilizados
para padronizar e classificar os tumores, e assim estabelecer o tratamento e o
prognóstico dos mesmos. Para o CELI, o tamanho do tumor, gradação histológica de
malignidade, metástase em linfonodo regional e recidiva da lesão são os principais
fatores relacionados à sobrevida dos pacientes (SOUZA et al., 2011). Dos indivíduos
que fizeram parte desta amostra, em 60% dos prontuários não havia informação
sobre o comportamento clínico dos CELI, ressaltando a falha no preenchimento
correto da ficha clínica do paciente. Segundo Souza et al. (2011), o CELI está
95
associado com uma baixa incidência de metástase cervical entre todos os cânceres
da cavidade oral, principalmente em lesões de pequeno diâmetro.
A avaliação do comportamento biológico do CELI pode ser obtida a partir da
análise de características morfológicas, através dos vários sistemas de gradação de
malignidade. Nesta pesquisa, utilizou-se o sistema proposto por Bryne (1998) para
classificar os casos e a maioria foi classificada como de alto grau de malignidade.
Avaliando comparativamente as variáveis sexo, idade, comportamento clínico e os
graus de malignidade dos casos de CELI não foi evidenciada relação
estatisticamente significativa. Estes resultados são semelhantes aos relatados por
Silveira et al. (2007).
O comportamento biológico de qualquer lesão é altamente dependente do
equilíbrio entre os níveis de proliferação e morte celular e, alguns marcadores
imuno-histoquímicos podem auxiliar na identificação da dimensão dessa
característica. Sendo assim, este estudo procurou avaliar a expressão imuno-
histoquímica do Ki-67 e IMP-3 em uma série de casos de QAs e CELI.
O Ki-67 tem sido utilizado em diversos estudos imuno-histoquímicos como um
indicador de proliferação celular e entre esses estudos, encontram-se alguns que
avaliaram sua expressão em casos de displasias epiteliais orais e CEOs, mostrando
que o número de células em proliferação pode ou não se apresentar aumentado de
acordo com o grau de displasia.
Kurokawa et al. (2003) avaliaram a expressão do Ki-67, p-53 e sindecan-1
em vários casos de displasia epitelial (leve, moderada e severa), tendo evidenciado
que, tanto o p-53 quanto o Ki-67 apresentaram um mesmo padrão de marcação,
havendo aumento da expressão com o aumento das alterações displásicas. No
mesmo raciocínio do estudo anterior, Martínez et al. (2005), avaliaram a expressão
do Ki-67, p-53, bax e bcl-2 em QAs, comparando com mucosa labial normal e
mucosa intra-oral sendo evidenciado que ocorreu um significativo aumento da
expressão do Ki-67 nos casos de QAs e mucosa labial normal quando comparados
com a mucosa intra-oral.
Birajdar et al. (2014), avaliaram a expressão do Ki-67 em epitélio normal, em
displasias com diferentes graus de alterações e em CEO apresentando diferentes
graus histológicos. As displasias foram subdivididas segundo a classificação de
Kujan et al (2006) em baixo e alto risco de malignização, sendo evidenciado
aumento do índice de proliferação nos casos de alto risco em relação aos de baixo
96
risco. O estudo de Dwivedi et al. (2013) também avaliou a expressão do Ki-67 em
displasias epiteliais orais e em CEO. Segundo os autores a expressão do Ki-67
esteve relacionada com ou aumento da severidade das displasias epiteliais. Os
achados destes autores divergem do que foi evidenciado em nossa pesquisa, na
qual não foi observada diferença estatisticamente significativa na expressão do Ki-67
entre as QAs de baixo risco e as de alto risco de malignidade fato também
evidenciado no estudo de Lameira et al. (2014) que também não encontrou
diferença estatisticamente significativa entre os diferentes graus de displasias.
Quando da análise da expressão do Ki-67 nos casos de CELI esta pesquisa n
encontrou diferença estatisticamente significativa nesta expressão quando
correlacionou com a classificação clínica TNM, sabe-se que esta classificação é um
indicador de prognóstico importante, pois avalia características fundamentais do
câncer, como a extensão local, disseminação regional e metástases à distância. De
acordo com Costa et al. (2002), a localização anatômica da lesão também deve ser
considerada como um indicador de prognóstico ao realizar estudo relacionando a
localização anatômica com a classificação clínica TNM e a gradação histológica de
malignidade em carcinomas orais. Os autores verificaram haver correlação
estatisticamente significativa entre o estadiamento clínico TNM e a localização
anatômica da lesão, pois a maioria dos casos classificados clinicamente como T1
acometeram o lábio inferior enquanto que a maioria dos casos classificados em T4
acometeram a língua, assoalho bucal e palato mole.
Na análise de expressão do Ki-67 nos diferentes graus histológicos dos casos
de CELI também não foi evidenciada diferença estatisticamente significativa entre os
casos de baixo e de alto grau de malignidade. No entanto, no estudo de Salvadori et
al. (2014), foi observada uma associação entre a porcentagem de células que
expressaram o Ki-67 e grau tumoral em casos de CELI, sugerindo que a progressão
de malignidade envolve um aumento do número de células em proliferação.
A proliferação celular nas neoplasias pode alterar significantemente diversas
proteínas do metabolismo celular, entre elas o IMP-3. Esta desempenha um
importante papel nos estágios iniciais da embriogênese, participando do crescimento
e migração celulares e no transporte e estabilização do RNA (JIANG et al., 2008).
Embora a expressão IMP-3 já tenha sido constatada em diversos tipos
tumorais, incluindo CEOs, estudos têm ressaltado que a mesmo não se expressa
em células normais adultas de humanos. Em alguns estudos ele está associado com
97
os estágios avançados e com o comportamento agressivo de alguns tumores (LI et
al, 2011a; YORUKOGLU et al., 2015).
A análise da expressão do IMP-3 nos casos de QAs, nesta pesquisa, não
apresentou uma diferença estatisticacamente significativa entre os grupos de baixo e
alto risco de transformação maligna, sendo caracterizada pela baixa expressão ou
ausência de expressão na maioria dos casos. Porém, alguns estudos têm relatado
variabilidade de expressão nos diferentes graus de displasia epitelial como no
estudo de Riener et al. (2009), que analisou a expressão do IMP-3 em lesões do
trato biliar. Neste estudo, os autores utilizaram tecido normal do ducto biliar, tecido
inflamado e com alterações displásicas no epitélio. Foi analisada também a taxa de
proliferação celular utilizando o Ki-67 e o p53. Os casos do ducto biliar normal, do
inflamado e apresentando baixo grau de displasia foram negativos ou apresentaram
fraca expressão citoplasmática do IMP3 em todos os casos estudados; no entanto
em todos os casos apresentando alto grau de displasia evidenciaram forte e
homogênea positividade para o IMP-3. Os autores também observaram que o IMP-3
foi expresso de forma distinta em diferentes tipos tumorais do trato biliar, havendo
associação com a alta taxa de proliferação celular e com positividade para o p53,
porém não houve associação com nenhum parâmetro clínico. Além disso, os
pacientes com reduzida taxa de sobrevida apresentaram forte expressão ao IMP-3.
LU et al. (2009), avaliaram a expressão do IMP-3 em diferentes lesões do
esôfago sendo evidenciada em adenocarcinomas invasivos, em adenocarcinomas
metastáticos e em displasias de alto grau porém, não foi observada expressão em
displasia de baixo grau e nem em esôfago de Barret. Os autores concluem que o
IMP-3 é um biomarcador altamente sensível e específico para o diagnóstico de
adenocarcinomas esofágicos invasivos e para displasias de alto grau, sugerindo que
esta proteína pode desempenhar um importante papel na transformação maligna em
adenocarcinoma esofágico.
LI et al. (2011b), avaliando a expressão do IMP-3 em casos de leucoplasia e
em carcinomas de células escamosas em língua e correlacionando com as
características clínicas e patológicas, verificaram que não houve marcação nos
casos de leucoplasia sem displasia; nos casos com displasia leve houve fraca
marcação do IMP-3. No entanto, dos 65 casos de carcinomas de células escamosas
de língua, houve expressão em 50 casos, sendo 33 casos com fraca expressão e 17
98
casos com expressão intermediária. Nenhuma forte expressão foi encontrada nos
casos de carcinomas de língua. Observou-se que a expressão do IMP-3 ocorreu em
todos os casos que apresentaram envolvimento de linfonodos sendo esta expressão
de leve a moderada. Nenhuma correlação foi evidenciada entre a expressão do
IMP-3 e os parâmetros clínicos. Os autores concluíram que a expressão do IMP-3
está relacionada com a carcinogênese e com a progressão tumoral, especialmente
quando ocorre metástase para linfonodos.
Quando foi correlacionado os parâmetros clínicos TNM com a gradação
histológica das lesões, no presente estudo não se evidenciou diferença
estatisticamente significativa na expressão do IMP-3 entre os grupos. No estudo de
Findeis-Hosey et al. (2010), os autores avaliaram a expressão do IMP-3 em
adenocarcinoma de pulmão e correlacionaram com graus histológicos e com o
estadiamento clínico TNM sendo demonstrado que o IMP-3 é expresso mais
frequentemente em tumores pobremente diferenciados. Com relação ao
estadiamento TNM, foi evidenciado que ele foi expresso nos tumores com metástase
linfonodal e com os mais altos estágios clínicos, porém estes achados também não
foram estatisticamente significativos.
Li et al. (2011a), investigaram se o IMP-3 pode ser usado como um
biomarcador de prognóstico para carcinoma de células escamosas orais
correlacionando com os fatores clínico-patológicos tendo evidenciado que a
expressão do IMP-3 foi significativamente associada com os graus histológicos, com
presença de metástase linfonodal, com a classificação tumoral e estágio clínico. O
IMP-3 foi altamente expresso em CCEOs pobremente e moderadamente
diferenciados. A presença de metástase linfonodal foi um importante fator de
prognóstico, sendo a expressão do IMP-3 maior nos tumores que apresentaram
metástase linfonodal. A expressão também foi maior em tumores em estágios mais
avançados, como estágio IV.
Alguns estudos têm sido realizados correlacionando a expressão do IMP-3 e
o emprego de marcadores de proliferação celular, como o Ki-67. Lin et al (2010) por
exemplo, avaliaram a expressão do IMP-3 em adenocarcinoma gástrico (AG),
correlacionando com características clínico-patológicas e com a proliferação celular
através da expressão do Ki-67. Foram avaliados 92 casos de AG e 92 casos de
mucosa adjacente, apresentando displasia e sem displasia sendo evidenciado que
nos casos de mucosa adjacente ao tumor que apresentavam displasia, estas
99
demonstraram fraca expressão do IMP-3 e nos casos sem displasia não foi
evidenciada nenhuma expressão. Dos casos de AG, 82% (n=75) apresentaram
intensidades de expressão variadas, prevalecendo a imunomarcação mais fraca,
porém a expressão do IMP-3 em AG foi significantemente mais forte que na mucosa
normal. O IMP-3 também foi expresso mais fortemente nos casos de AG com
metástase linfonodal. Quanto ao estadiamento TNM, os tumores que apresentaram
os mais altos estágios exibiram expressão mais forte do IMP-3. Não foi evidenciada
correlação significativa com as variáveis idade, sexo e grau histológico. Os autores
observaram que quando havia superexpressão do IMP-3, havia forte associação
com o índice de marcação do Ki-67 relatando ainda que alguns estudos tem
demonstrado a importância do IMP-3 na proliferação e invasão das células tumorais,
indicando que este marcador pode desempenhar um papel importante na
transformação maligna e na progressão tumoral.
Em nosso estudo, procuramos avaliar a presença de correlação entre a
expressão do Ki-67 e IMP-3, sendo evidenciada apenas nos casos de QAs, porém
nos casos de CELI não houve relação estatisticamente significativa. Diferente dos
nossos resultados, no estudo de Yorukoglu et al. (2015), onde eles avaliaram a
expressão do IMP-3, nucleofosmina e Ki-67 em carcinoma papilífero da tireóide
tendo incluído também lesões benignas embora em nenhum dos casos de lesões
benignas foi evidenciada marcação para o IMP-3. Os autores também não
observaram relação estatisticamente significativa entre o IMP-3 e Ki-67 e nem entre
a expressão do IMP-3 com as variáveis sexo, idade, diâmetro do tumor, tipo do
tumor, invasão, metástase de linfonodos ou à distância.
Este estudo avaliou a expressão do Ki-67 e IMP-3 em casos de QAs e CELI,
correlacionando com os dados clinico-patológicos. Apesar de não ter havido
associação entre a expressão dos dois marcadores em ambas as lesões, foi
possível observar que o IMP-3 se expressou tanto nas QAs como nos CELI. Estes
achados nos conduz a sugerir que a expressão do IMP-3 é um evento precoce na
carcinogênese de lábio, porém não sofre influência das alterações epiteliais nas QAs
e da diferenciação tumoral em CELI.
100
Conclusões
101
7 CONCLUSÕES
Diante dos resultados obtidos no presente estudo, pode-se concluir que :
1. As QAs exibem atividade proliferativa maior que CELI evidenciando que antes
da transformação maligna as células epiteliais exibem esta atividade
independente do grau de alteração epitelial.
2. A radiação UV foi capaz de alterar a expressão do IMP-3 nas QAs, mantendo-
a constante nos CELI, sendo assim tal expressão foi um evento precoce na
carcinogênese de lábio independente do grau de alteração epitelial nas QAs e
do grau histológico de malignidade nos CELI.
3. Na amosta analisada, a atividade proliferativa não influenciou a expressão do
IMP-3.
102
Referências
103
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110
Apêndice
111
APÊNDICE A – Ficha para coleta de dados clínicos e histopatológicos para os casos de QAs
Nº de Casos
Nº no prontuário
Sexo Idade Raça Profissão Aspecto Clínico Gradação Histológica
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40. *Aspecto clínico : leucoplásica, eritroplásica, eritroleucoplásica, outro, não relatado.
* Gradação histológica : displasia epitelial leve, moderada ou severa.
112
APÊNDICE B – Ficha para coleta de dados clínicos para os casos de carcinomas de células escamosas de lábio inferior
FICHA CLÍNICA
Nº PRONT:
NOME______________________________________________________________ ENDEREÇO _________________________________ TELEFONE_______________
IDADE: ___________ SEXO: ____________ RAÇA: _______________________
HÁBITOS_________________________TEMPO____________________________
TIPO DE FUMO/ALCOOL ____________________
LOCALIZAÇÃO DO TUMOR: __________________________________
TAMANHO DA LESÃO: _____________________________________
ESTADIAMENTO: T ______ N_____ M______
TRATAMENTO: C ( ) R ( ) Q ( )
RECORRÊNCIA____________________ TEMPO ________________________
DIAGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO: __________________________________
GRADAÇÃO HISTOLÓGICA: _______________________________________
BIÓPISIA: EXCISIONAL ( ) INCISIONAL ( )
Nº DA PEÇA/ BLOCO: ______________
METÁSTASE: SIM ( ) NÃO ( ) LOCALIZAÇÃO _____________________
ÓBITO: SIM ( ) NÃO ( )
DATA DE ENTRADA ___________________________________________________
ÚLTIMA VISITA ______________ ESTADO DO PACIENTE ___________________
OBS:
113
Anexos
114
ANEXO A
115