yoğun bakım Ünitesinde nozokomiyal alt solunum yolu ... · kloramfenikol ve vankomisine...

Yoğun Bakım Ünitesinde Nozokomiyal Alt Solunum Yolu İnfeksiyon Etkeni Pseudomonas aeruginosa

Kökenlerinde Antimikrobiyal Direnç Genleri

Yrd.Doç.Dr.Burçin Özer

Mustafa Kemal Üniversitesi, Tıp Fakültesi

Tıbbi Mikrobiyoloji AD.

2

Yoğun Bakım Ünitesinde Nozokomiyal Alt Solunum Yolu İnfeksiyon Etkeni Pseudomonas aeruginosa

Kökenlerinde Antimikrobiyal Direnç Genleri

Burçin Özer*, Nizami Duran*, Yusuf Önlen**, Lütfü Savaş*

* Tıbbi Mikrobiyoloji AD.** Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji AD.

Mustafa Kemal Üniversitesi, Tayfur Ata Sökmen Tıp Fakültesi, Hatay

Mustafa Kemal Üniversitesi Araştırma Fonu (BAP 08 T 1701 nolu proje) tarafından desteklenmiştir

Giriş

YBÜ’deki yüksek infeksiyon hızı

Çok sayıda ve geniş spektrumlu antibiyotik

Antibiyotiklere dirençli mikroorganizmalar

Antibiyotik tedavisinde ciddi problemler

P. aeruginosa nozokomiyal infeksiyonlarda

en önemli bakterilerden biridir

Özellikle yoğun bakım ünitesinde kazanılan

nozokomiyal alt solunum yolu

infeksiyonlarında önemli bir patojendir

3

Direnç Mekanizmaları

Antimikrobiyal ajanlara karşı

bir çok mekanizma ile direnç

geliştirirler

İnaktive eden enzimlerin

üretimi

Hedef enzimlerin

mutasyonları

Çoğul ilaç eflüks

pompaları• Dış memran faktör ailesi (OMF)

• Direnç nodül hücresi üst

ailesi (RND)

• Membran füzyon protein ailesi

(MFP)

Çoğul ilaç eflüks

pompaları

4

Direnç nodül hücresi üst ailesine (RND) ait eflüks sistemleri

mexAB-oprM;• Florokinolonlar

• Tetrasiklinler

• Kloramfenikol

• Beta-laktamlar

(karbenisilin,piperasilin,

seftazidim, sefepim,

aztreonam ve meropenem)

mexCD-oprJ;• Florokinolonlar

• Antipseudomonal beta-

laktamlar (piperasilin, sefepim

ve meropenem)

mexEF-oprN;• Florokinolonlar

• Trimetoprim

• Kloramfenikol

mexXY-oprM;• Florokinolonlar

• Aminoglikozidler

• Bazı beta laktamlar

(piperasilin, sefepim,

seftazidim, meropenem,

veya imipenem)

5

6

AMAÇ

Yoğun bakım ünitesinde kazanılan

nozokomiyal alt solunum yolu

infeksiyonlarında izole edilen

P. aeruginosa kökenlerinin

antimikrobiyal direnç genlerinin

saptanması amaçlandı.

7

Gereç ve Yöntem

Şubat 2007-Nisan 2009 tarihleri arasında

Mustafa Kemal Üniversite Hastanesi yoğun bakım ünitesindeki hastalardan

Nozokomiyal alt solunum yolu infeksiyon etkeni

50 P. aeruginosa kökeni çalışmaya dahil edildi.

8

9

14 27

Tr.asp. Bronş lavajı Balgam

P. aeruginosa kökenleri

50 P.aeruginosa kökeni

9

Disk Difüzyon

Mezlosilin (75 g),

Piperasilin/tazobaktam (100/10 g),

Seftazidim (30 g),

Sefepim (30 g),

İmipenem (10 g),

Meropenem (10 g),

Gentamisin (10 g),

Amikasin (30 g),

Tobramisin (10 g),

Siprofloksasin (5 g),

Norfloksasin (10 g) (Oxoid, İngiltere)

Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü’ne (CLSI, 2010) göre değerlendirildi.

DNA ekstraksiyonu Kado ve Liu’nun yöntemi modifiye edilerek yapıldı.

Primerler Dumas ve ark. makalesine göre belirlendi.

Kado & Liu. J Bacteriol 1981

Dumas et al. FEMS Microbiol Lett, 2006

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)

Primerler

12

Multipleks PZR

Ürün boyutunu belirleyebilmek için 100-2000 kb

arasında fragmanlar içeren DNA markeri kullanıldı.

2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500,

400, 300, 200 ve 100 bç.

PZR işlemi Bioder/Thermal Blocks xp cycler (Tokyo

Japan) cihazında gerçekleştirildi.

Dört farklı Multipleks PZR grubu oluşturuldu.

13

Multipleks PZR Grupları

mexE (114 bç)

mexR (150 bç)

mexT (216 bç)

MexA (316 bç)

oprD (156 bç)

oprD (232 bç)

oprJ (305 bç)

mexC (164 bç)

mexC (218 bç)

ampC (344 bç)

Multipleks PZR

nfxB (164 bç)

oprN (235 bç)

mexX (326 bç)

14

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)

Toplam 25 μl’lik hacimde hazırlanan PZR

karışımına

2.5 μl 10X PZR tamponu

Deoksinükleotidlerin her birinden 200 μM (AB Gene,

İngiltere)

2 mM MgCl2

0.4 μM primerler

10 ng kalıp DNA

Distile su

1 U Taq polimeraz (Fermentas, USA) eklendi.

15

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)

94°C’de, 1 dk

57°C’de 45 sn

72°C’de 10 dk

Denatürasyon

Bağlanma

Uzama

Son Uzama

72°C’de 45 sn

(mexA, mexT, mexE, mexR genleri için)

Toplam 35 PZR siklusu

Diğer genler için

Toplam 30 PZR siklusu

16

Oluşan ürünler %2 agaroz jelde yürütülerek etidyum

bromid ile boyandıktan sonra jel görüntüleme sisteminde

(Wealtec, Dolphin-View, USA) görüntülendi.

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)

17

Multipleks PZR Grup 1

18

Multipleks PZR Grup 2

19

Multipleks PZR Grup 3

20

Multipleks PZR Grup 4

BULGULAR

22

2524

23

2019

18 18

15

12

98

0

5

10

15

20

25

30

Mezlosilin

Norfloksasin

Siprofloksasin

Meropenem

Gentamisin

Imipenem

Tobram

isin

Seftazidim

Pip/tazo

Sefepim

Amikasin

Mezlosilin

Norfloksasin

Siprofloksasin

Meropenem

Gentamisin

Imipenem

Tobramisin

Seftazidim

Pip/tazo

Sefepim

Amikasin

Antimikrobiyal

Direnç

Direnç Genleri

Yedi kökende (%14) direnç genlerinin hiçbiri

saptanmadı.

43 köken (% 86) bir veya birden fazla direnç

geni içeriyordu.

Sadece dört kökende (% 8) bir direnç geni

bulundu.

23

24

GENLER

32

26 2624

21 21

17

12 119

75

2

0

5

10

15

20

25

30

35

nfxB

(164

bç)

oprN

(235

bç)

mex

E (1

14 b

ç)m

exC

(164

bç)

ampC

(218

bç)

oprD

(232

bç)

mex

R (1

50 b

ç)m

exC

(344

bç)

oprJ

(305

bç)

oprD

(156

bç)

mex

A (3

16 b

ç)m

exT

(216

bç)

mex

X (3

26 b

ç)

nfxB (164 bç)

oprN (235 bç)

mexE (114 bç)

mexC (164 bç)

ampC (218 bç)

oprD (232 bç)

mexR (150 bç)

mexC (344 bç)

oprJ (305 bç)

oprD (156 bç)

mexA (316 bç)

mexT (216 bç)

mexX (326 bç)

25

Beta-Laktamlara Etkili Direnç Genleri

26

27

Beta-Laktamlara Etkili Direnç Genleri

28

Beta-Laktamlara Etkili Direnç Genleri

Kinolonlara Etkili Direnç Genleri

29

Kinolonlara Etkili Direnç Genleri

30

Aminoglikozidlere Etkili Direnç Genleri

31

Sonuçlar

Kökenlerin % 86’sının bir veya birden fazla

direnç geni içerdiği bulundu.

FEP ve PTZ direnci ile mexC geni,

MEZ, PTZ, CAZ ve FEP direnci ile AmpC geni,

CIP ve NOR direnci ile oprJ, oprN ve nfxB

genleri arasında anlamlı ilişki bulundu.

32

Sonuçlar

Çok fazla sayıda direnç geni içermesine rağmen

antibiyotiklerin çoğuna duyarlı olan kökenlerde

bulunmaktaydı.

Bu kökenlerin tedavi sırasında direnç geliştirme

olasılığı çok yüksektir.

Bu sebeple fenotipik yöntemlerle

antimikrobiyallere karşı duyarlılık araştırmak

yerine genotipik olarak antimikrobiyal direnç

genlerinin saptanması daha anlamlıdır.

33

Şükranla anıyoruz…

35

Doğal direnç

Pseudomonas’lar yaygın olarak kullanılan

penisilinlere, birinci, ikinci kuşak

sefalosporinlere, tetrasiklinlere,

kloramfenikol ve vankomisine dirençlidir

36

37

CDC’nin nozokomiyal alt solunum yolu inf. tanı kriterleri

Kriter 1

Hastanın FM’de ralinin olması

En az biri

• Pürülan balgam (yeni başlayan) veya balgamın

karakterinde değişme

• Kan kültüründe mo üremesi

• Transtrakeal aspirat broşial fırçalama veya biopsi

ile elde edilen materyalde etiyolojik ajanın

izolasyonu

38

CDC’nin nozokomiyal alt solunum yolu inf. tanı kriterleri

Kriter 2

AC grafisinde yeni ve ilerleyici infiltrat, konsolidasyon,

kavitasyon veya plevral efüzyon görülmesi

En az biri

• Pürülan balgam (yeni başlayan) veya balgamın karakterinde

değişme

• Kan kültüründe mo üremesi

• Transtrakeal aspirat broşial fırçalama veya biopsi ile elde

edilen materyalde etiyolojik ajanın izolasyonu

• Sol. Sekresyonlarında viral Ag’nin saptanması veya virusun

izolasyonu

• Patojen için tek Ab titresi (IgM) veya 4 kat artmış Ab

• Pnömoninin histopatolojik kanıtının olması

39

DNA Ekstraksiyonu

DNA izolasyonu Kado ve Liu’nun yöntemi modifiye edilerek yapıldı.

Bakteri kültürü L-B buyyonda 37 0C’de 18 saat inkübe edildi.

İnkübasyon sonunda bakteriler 4000 devirde 15 dk santrifüj edildi.

Pellet üzerine 100 μl buffer (20 mM tris-asetat ve 2 mM EDTA, pH 7.9) eklendi.

Sonra 400 μl lysing buffer ilave edildi. (%3 SDS and 50 mM tris, pH 12.6, pH 2N NaOH ile ayarlandı).

Kado & Liu. J Bacteriol 1981

DNA Ekstraksiyonu

65 C’de 90 dk lizis işlemi için tutuldu.

Sıvı fazdaki DNA üzerine eşit miktarda izopropanol koyularak nükleik asit presipitasyonu yapıldı.

Sonra pellet üzerine 50 μl TE (10 mM tris, 1 mM EDTA, pH 8) buffer konarak DNA çözüldü.

Kado & Liu. J Bacteriol 1981

42

Antimikrobiyal Direnç Oranları (Disk difüzyon metodu ile)

43

Antimikrobiyal Direnç Genleri